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Laboratorio de Zoología General Embriogénesis del pollo

PRÁCTICA N ° 05
ESTUDIO DEL DESARROLLO EMBRIONARIOS DEL POLLO

1. OBJETIVOS:
 Identificar las estructuras que constituyen un huevo o telocito de un ave.
 Observar y reconocer las estructuras que se forman en el proceso de
organogénesis en el desarrollo embrionario del pollo.

2. INTRODUCCION:
Un cultivo sin cáscara, donde un embrión de pollo se toma de una cáscara de
huevo y se cultivaron en un entorno artificial, es una técnica importante para la
generación de pollos transgénicos que producen sustancias útiles en sus
huevos, así como para diversas manipulaciones embrionarias (Kamihira et al.,
2005; Kyogoku et al., 2008). Además, esta técnica podría ser útil para la
conservación de aves raras, si se puede aplicar a salvar los huevos dañados. Sin
embargo, la de ventanas de una cáscara de huevo para facilitar la introducción
de genes y otras manipulaciones reduce significativamente la capacidad de
eclosión (Andacht et al., 2004). La técnica de cultivo sin cáscara de embriones
de pollo también puede desempeñar un papel importante en la educación de
los niños en edad escolar en ciencias de la vida, a través de la observación
directa del desarrollo embrionario. Perry (1988) informó de un método de
cultivo para embriones de pollo utilizando una cáscara de huevo sustituto como
un recipiente de cultivo para la ex ovo la cultura de un óvulo fecundado etapa
unicelular tomado del oviducto materno. Este método se compone de tres
sistemas: sistema de I para los embriones de la etapa de célula única a la etapa
blastodermo, sistema II para los embriones después de la Blasetapa toderm
hasta el día 3, y el sistema III para los embriones de día 3 hasta la eclosión. El
embrión se cultivó en los tres sistemas y transferido desde un recipiente a otro.
Una gran cáscara de huevo de pollo se usó como recipiente de cultivo en el
sistema III. Sin embargo, la capacidad de eclosión fue de aproximadamente 7%
con este método, que se mejoró a aproximadamente 50% en Naito et al.
( 1990). Se han reportado algunos métodos de cultivo utilizando cáscaras de
huevo sustitutos de la codorniz (Ono huevo sustitutos de la codorniz (Ono
huevo sustitutos de la codorniz (Ono huevo sustitutos de la codorniz (Ono
huevo sustitutos de la codorniz (Ono huevo sustitutos de la codorniz (Ono
huevo sustitutos de la codorniz (Ono et al., et al., et al., et al., et al., et al., et al.,
1994; Kamihira 1994; Kamihira 1994; Kamihira 1994; Kamihira 1994; Kamihira
1994; Kamihira 1994; Kamihira et al., et al., et al., et al., et al., et al., et al., 1998;

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Ono 1998; Ono 1998; Ono 1998; Ono 1998; Ono 1998; Ono 1998; Ono et al., et
al., et al., et al., et al., et al., et al., 2005; Kato et al., 2013). Kamihira et al.
( 1998) informaron de un método de cultivo sin cáscara para los embriones de
codorniz utilizando un recipiente artificial hecho de una membrana de
politetrafluoroetileno permeable a los gases (PTFE). En su método, más del 43%
de embriones de codorniz tramado cuando el lactato de calcio se complementó
en el cultivo. Este sistema correspondió a sistema III de la Perry y el método de
cultivo se aplicó también a embriones de pollo (Kamihira et al., 2004). Se han
notificado varias mejoras en el cultivo de embriones de pollo. Sin embargo,
muchos de estos métodos implicados la sustitución de cáscaras de huevo
sustitutas derivadas de diferentes especies de aves ponedoras relativamente
huevos grandes, tales como Aigamo pato y pavo (Borwornpinyo et al., 2005). Sin
embargo, los métodos de cultivo utilizando cáscaras de huevo sustitutos tienen
desventajas tales como la preparación de cáscaras de huevo, las diferencias
entre lotes de cáscaras de huevo, la incapacidad de uso de reciclaje, y la baja
capacidad de funcionamiento durante la manipulación de embriones.
3. MATERIALES Y REACTIVOS
REACTIVOS
 Lactato de calcio
 Cloruro de benzalconio 0.01%
MATERIALES
 Huevo fertilizado
 Vaso de plástico poliestileno
 Tubo de plástico de diámetro 2mm
 Alcohol 96%
 Algodón
 Rollo film
 Regla
 Tijera
 Pistola de silicona
 Agua destilada
 Pipeta
 La incubadora

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4. PROCEDIMIENTOS

Se formó subgrupos de cuatro integrantes con los cuales cada subgrupo tenía una
comisión.

El grupo uno realizo las medidas correspondientes para realizar el agujero (se hizo
el agujero con la ayuda de la pistola de silicona) en el cual se insertó el tubo de
plástico de 2mm y también se hizo la desinfección de los huevos fecundados y
también se de los vasos.

El grupo dos se encargó de cortar el film midiendo con el vaso y dándole forma con
un huevo y los 6 vasos tenían que estar listos para el siguiente procedimiento.

Por otro lado, el grupo tres se encargo de calcular a pulso el lactato de calcio para
los seis vasos tres de ellos con una medida de 150 mg y tres con medida de 200 mg.

A cada vaso se nombró de la siguiente manera:

 Tres vasos con 200 mg de lactato de calcio, 30 ml de cloruro de besalconio.


Dos vasos con giro y uno sin giro.
 Tres vasos con 150 mg de lactato de calcio, 20 ml de cloruro de besalconio.
Dos vasos con giro y uno sin giro.

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA

Se añadió a los tres primeros vasos 150 mg de lactato de calcio, añadiendo 1.5 ml de
agua destilada y los tres restantes se añadió 200 mg de lactato de calcio y 2 ml de
agua destilada.

Continuamos con el procedimiento empezando a romper la cascara del huevos en


cada uno de los vasos cuidando que no se rompa la yema, y también se cuidó que el
lactato de calcio no se esparza por la superficie y se quede en su lugar.

Posteriormente se hizo 10 huecos alrededor de vaso en el rollo del film y se cubrió


con el film. Luego se hizo huecos en la superfiecie del film y se tapó.

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Se colocó los vasos en la incubadora a una temperatura de 34º C junto con los
huevos del otro grupo ya incubados anteriormente.

5. RESULTADOS:
Se mostraran los días en los que hubo alguna modificación ( retirar los huevos por
infección, deshidratación, etc) o algún cambio.
3ro DÍA: En el vaso 1 apareció de una mancha roja en forma de c, los vasos del 2 al 7
siguen iguales.
4toDÍA: Todos los vasos están iguales a T=30° C, eliminación de vasos, número 1 con
200mg de lactato de calcio 25ml de cloruro de benzalconio, el 29/05/19 se eliminó
otro vaso por tener agujero día 31/05/19 se eliminó 2vaso número 7 y 13 el primer
con 250mg de lactato de calcio y 35 ml de cloruro de benzalconio y el segundo por
top tura de yema en la yema con 150mg lactato de calcio y 20ml de cloruro de
benzalconio.
5to DÍA: Los vasos no presentan ningún cambio, siguen iguales que el día anterior.
6to, 7mo, 8vo, 9vo DÍA: En los vasos hubo ausencia de cambios.
10mo DÍA: Eliminación de vaso 3 por contaminación.
Eliminación de vaso 8 por deshidratación.
Se adicionó a los vasos agua destilada de 0.5 ml aproximadamente.
Solo quedaron cuatro vasos con giro y cuatro vasos sin giro y un vaso con el huevo
que posee caparazón.
11vo DÍA: Los vasos no presentan ningún cambio.
12vo DÍA: En los vasos no se observó ningún cambio.
Estaba en una temperatura de 38°C.
13vo y: Los vasos no presentan ningún cambio, en una temperatura de 38°C
14vo DÍA Solo con 5 vasos en la incubadora, el vaso que había desarrollado un
embrión y que estaba creciendo sufrió contaminación. Se retiraron todos los vasos,
finalizando el experimento

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Día uno Aparición de una mancha Eliminación del vaso 3 por


roja en forma de C contaminación

No presenta cambios Eliminación de vasos por Yema rota, eliminación de


deshidratación todos los vasos

6. DISCUSIÓN:

En el presente estudio, hemos desarrollado un sistema de cultivo sin cáscara para embriones
de pollo utilizando una película de plástico. Se examinaron las condiciones requeridas para
la eclosión embrionaria mediante la comparación de factores tales como la adición de
lactato de calcio y la presencia o ausencia de un suministro de oxígeno. En lugar de una
membrana de PTFE permeable a los gases, se utilizó envolturas de alimentos, que son de
bajo costo, fácil de procesar, y fáciles de obtener como recipientes de cultivo. Aunque

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hemos probado varias envolturas, que incluyen polietileno y cloruro de polivinilideno,


preferimos usar una película polimetilpenteno debido a su alta permeabilidad al oxígeno
(8,0 × 10- 10 mol / m 2 spa; datos de Riken Technos). Es importante eliminar las arrugas
cuando se produce un recipiente de cultivo debido a la presencia de arrugas de la película
conduce a menores tasas de supervivencia (datos no mostrados). En nuestro estudio, los
embriones se incubaron previamente en el interior de la cáscara del huevo hasta el día 3 y
luego la cáscara del huevo estaba roto para transferir los embriones al recipiente artificial.
El periodo de preincubación hasta que la transferencia de los embriones al recipiente de
cultivo influyó en la viabilidad, aunque La transferencia de embriones en el recipiente de
cultivo se considera que es óptimo en el día 3, aun así, se corren riesgos como que se dañe
la membrana vitelina, el rompimiento de una yema, como en nuestro caso, al transferir el
huevo al vaso quedándonos 6 vasos para continuar con el experimento.

Un estudio anterior de Kamihira et al. ( 1998) utilizando codornices menciona que el


lactato de calcio fue altamente eficaz en cultivos de embriones aviares exitosos. En nuestro
sistema de cultivo, la adición de lactato de calcio también fue eficaz para el desarrollo
embrionario, y la viabilidad de los embriones se convirtió en el más alto cuando se añadió
150-200g de lactato de calcio. Por lo tanto, la suplementación de calcio a los embriones es
esencial, porque los embriones de pollo normales dentro de las cáscaras de huevo se
proporcionan mayoría de calcio de la cáscara del huevo durante el desarrollo embrionario
para salir del cascarón (Rowlett y Simkiss, 1987; Kamihira et al., 1998). Puede ser que la
cantidad de lactato de calcio suministrado a los embriones en el cultivo no fue suficiente
para el desarrollo embrionario hasta la eclosión, aunque más estudios son todavía
necesarios para entender la disponibilidad embrionaria de calcio, solo es una suposición el
suministrar menor cantidad de lactato de calcio.

Nos preocupaba que la aireación del vaso artificial podría causar la pérdida de humedad de
embriones por transpiración. En consecuencia, primero agregamos 1.5-2m l de agua
destilada esterilizada al recipiente de cultivo.

Los resultados revelaron que el uso del recipiente de cultivo descrito en el presente estudio,
logrando la más alta capacidad de eclosión con 55-56 h de preincubación de huevo. En el

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caso nuestro, contando el tercer día desde la incubación en un vaso se observó la aparición
de una mancha en forma de C.

Borwornpinyo et al. ( 2005) Embrión de pollo. Se utilizó otros medios como cáscaras de
huevo de pavo, como recipientes de cultivo, mostró 81,1% de eclosión cuando el número
de embriones que sobreviven en el día 3 se tomó como 100%. Aunque nuestro método de
cultivo no utiliza cáscaras de huevo sustitutas, se logró una alta capacidad de eclosión de
más de 50%. Este método no requiere ninguna operación complicada, materiales especiales,
o técnicas. También elimina las incertidumbres tales como la disponibilidad y la calidad
diferencia de cáscaras de huevo, lo que causó problemas con frecuencia en los métodos
anteriores utilizando cáscaras de huevo sustitutas. Además, el uso de una película de
plástico transparente permite no sólo la observación fácil de la morfología embrionaria
desde todos los ángulos, sino también de fácil acceso para el embrión para la manipulación
mediante la eliminación de la cubierta de plástico.

Sim embargo al recrear este experimento no se logró el objetivo esperado, retirando así
todos los vasos sobrantes, el día 14 de incubación, que no mostraron cambio y uno que
había desarrollado el embrión ya que estaba contaminado.

7. CONCLUSIONES:

 Se logró identificar las estructuras que constituyen el huevo de un ave.

8. CUESTIONARIO:

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a) Funciones de las diferentes estructuras del huevo de gallina:

 Yema (óvulo). Es la parte central y anaranjada del huevo. Supone de un 30 a


un 33% del peso del huevo y está constituida por múltiples capas de vitelo blanco
y amarillo, un disco germinal, una membrana vitelina y látebra. Contiene las
células germinales, donde se produce la fecundación y después el desarrollo
embrionario. Este es posible gracias a la gran riqueza de nutrientes de la yema.

 Clara o albumen. Supone un 60% aproximadamente del total del peso del


huevo. Se compone de 4 capas que forman el llamado “saco albuminoideo”, cuya
función es proteger a la yema:
o Capa fina interior fluida
o Capa intermedia densa
o Capa gruesa fluida
o Capa fina exterior densa

 Membranas testáceas (interna y externa).Están en la cara interna de la


cáscara, y son un 3% aproximadamente del peso del huevo. Son parte de las
barreras defensivas del huevo contra la contaminación. La membrana interna es
más fina que la externa.

 Cáscara. Supone un 9% del peso del huevo y se compone de carbonato


cálcico (94%), carbonato magnésico (1%), fosfato cálcico (1%) y materia orgánica
(4% de proteína). Su color depende de la presencia de un pigmento compuesto por
ovoporfirinas, ligado a la raza de la gallina. En su superficie hay numerosos poros
(entre 7.000 y 15.000) que facilitan el intercambio gaseoso entre el interior y el
exterior del huevo.

 Cutícula. Capa proteica de queratina que cierra los poros, aunque permite el


intercambio gaseoso (salida de CO2 y de vapor de agua y entrada de O2).

 Cámara de aire. Espacio que se forma por contracción del albumen tras la


puesta y fuerza la separación de las membranas. Aumenta con la edad del huevo,
las pérdidas de CO2 y de vapor de agua.

b) Semejanzas y diferencias entre las observaciones del embrión del pollo a 18


horas con la gástrula del embrión:

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Huevo: Después de que se produzca la ovulación, se produce la fertilización. A lo


largo del recorrido del huevo por el oviducto se efectúan las fases iniciales de la
gastrulación y la segmentación, durante este proceso las glándulas que se en
cuentran en las paredes segregan sustancias albuminosas que se adhieren al huevo y
forman la clara o albúmina. Como el oviducto tiene una configuración retorcida
presenta en su interior paredes con pliegues en forma de espiral, donde el huevo
gira, la albúmina se tuerce y se forma las chalazas. Durante este recorrido se
forman otras capas de sustancias orgánicas que reciben el nombre de las membranas
de la cáscara y al final se forma la cáscara o Capa cálcarea que es la que en vuelve
al huevo. Después de que el huevo termina de recorrer el oviducto cae en la cloaca,
para luego ser expulsado al exterior. El tiempo que tarda el huevo en formarse desde
el momento de la ovulación hasta la final de los oviductos es más o menos de 16 a
20 horas
Primer día:
Durante las primeras 24 horas de incubación, en la incubadora hay varios procesos
embrionarios
4 horas: se inicia el desarrollo del corazón y de los vasos sanguíneos.
12 horas: el corazón comienza a latir. La circulación de la sangre con la unión de los
vasos sanguíneos del embrión al vaso vitelino.
16 horas: el primer signo de semejanza y un embrión de pollo a través del desarrollo
del segmento del mesodermo, la estructura de la forma que se integra en ambos
lados de la médula espinal. A partir de esto, se incluyó el hueso y el músculo.
18 horas: aparece el aparato digestivo.

Anfioxo:

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c) Membranas extraembrionarias que se forman en el desarrollo del pollo:


Un grupo de células rodea al embrión después de la gastrulación y forma 4 hojas
extraembrionarias. Todos los reptiles, aves y los mamíferos actuales poseen
estas membranas.
 La membrana extraembrionaria más externa es el corion. Evita la
evaporación excesiva de agua a través de la cáscara.
 Una segunda membrana, el amnios, rodea al embrión por todas
partes menos por la ventral. Delimita la cavidad amniótica, llena
del líquido amniótico, que baña al embrión y representa el sustituto del
medio acuoso en el que se desarrollaban las larvas de otros animales menos
evolucionados y de hábitos más ligados al medio acuático. Además, este
líquido amniótico protege al embrión de golpes y otros accidentes.
 Inmediatamente debajo del corion se extiende el alantoides, que es
la estructura respiratoria del embrión. El intercambio gaseoso se produce
entre numerosos vasos sanguíneos del alantoides y el aire exterior. También
sirve para acumular los desechos metabólicos hasta el momento de eclosión
del huevo.
 La membrana de la parte ventral es el saco vitelino, que va
disminuyendo de tamaño a medida que es consumido por el crecimiento del
embrión.

d) Órganos que derivan de las tres capas embrionarias:

Derivados del ectodermo: El ectodermo origina: (1) sistema nervioso central y


periférico; (2) epitelio sensorial del ojo, nariz, oído; (3) epidermis; (4) glándulas
subcutáneas y mamarias, hipófisis y esmalte dental. El sistema nervioso se
origina tras aparecer la notocorda, a partir del ectodermo suprayacente a ésta. En
el embrión de 19 días el sistema nervioso es un engrosamiento redondeado del
ectodermo en la región cefálica denominado placa neural. Hacia el día 21 el
engrosamiento se alarga y extiende hacia la lámina primitiva. Después los
bordes se elevan formando los pliegues neurales; en el centro queda el surco
neural. Los pliegues se fusionan en dirección cefálica y caudal y forman el tubo
neural. Luego éste se dilata en la porción cefálica, originando las vesículas
encefálicas; mientras que, en la porción caudal, permanece cilíndrico formando
la médula espinal.
Derivados del mesodermo: Del mesodermo derivan: el tejido conjuntivo, el
cartílago, el hueso, el corazón, la sangre y vasos sanguíneos, los músculos
estriados y lisos, los riñones, las gónadas, la corteza de la glándula suprarrenal y
el bazo. Hacia el 17o día, a ambos lados de la línea media, se forma un cordón
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engrosado: el mesodermo paraxial. A ambos lados, el mesodermo sigue siendo


delgado y constituye las láminas laterales, con una hendidura entre ellas (la
cavidad celómica). Cada lámina lateral se une al mesodermo paraxial por el
mesodermo intermedio. La lámina lateral se divide en dos hojas: (1) la hoja
somática o parietal que se aplica contra el ectodermo; y la hoja esplácnica o
visceral que se aplica contra el endodermo. Entre ambas hojas queda una
cavidad: el celoma intraembrionario que se continúa con el extraembrionario o
cavidad coriónica. Al final de la 4ª semana desaparece la comunicación. Hacia
el día 20 o el mesodermo paraxial comienza a dividirse en pares de bloques (de
somitas). Se van formando unos tres pares por día desde la región cefálica en
dirección cráneo-caudal. Hacia el comienzo de la 4ª semana las células de las
paredes ventral y media de los somitas proliferan y emigran hacia la notocorda,
constituyendo el esclerotomo que da lugar al mesénquima. Éste origina
fibroblastos, condroblastos y osteoblastos incluyendo la columna vertebral. La
pared dorsal de los somitas forma el dermatomo, que se extiende bajo el
ectodermo para formar la dermis. De la superficie interna del dermatomo se
origina el miotomo, que forma la musculatura de cada segmento. El mesodermo
intermedio origina acumulaciones celulares de disposición segmentaria que 4
formarán el riñón primitivo o mesonefros. El mesodermo somático y el
ectodermo suprayacente forman las paredes laterales y ventrales del cuerpo. El
mesodermo esplácnico y endodermo forman la pared del intestino y los órganos
respiratorios. La cavidad celómica queda revestida por células mesoteliales.
Hacia la mitad de la 3ª semana, células del mesodermo esplácnico situadas a
cada lado de la línea media y por delante de la lámina procordal se convierten en
células que originan vasos sanguíneos (angioblastos) y el corazón. Estos vasos
comunican con los del mesodermo extraembrionario y del pedículo de fijación
(formados unos días antes). Así quedan conectados el embrión y placenta
estableciéndose la circulación fetal. De este modo, la sangre materna y fetal no
se mezclan, intercambiándose sustancias a través de la barrera placentaria.
Derivados del endodermo: Del endodermo derivan: (1) el epitelio del tubo
digestivo y el árbol respiratorio; (2) el parénquima de amígdalas, glándula
tiroidea, las paratiroides, el timo, el hígado y el páncreas; (3) el epitelio de la
vejiga urinaria y de parte de la uretra; (4) el epitelio del tímpano y de la trompa
de Eustaquio. En el embrión tiene lugar un encorvamiento céfalo-caudal y otro
lateral que hacen que el tubo digestivo se forme de un modo pasivo a partir del
saco vitelino. Queda una comunicación entre ambos mediante el conducto
onfalomesentérico o vitelino. El intestino se denomina anterior, medio y
posterior (caudal). Al intestino medio le corresponde el conducto vitelino. En el
extremo cefálico, la lámina procordal limita el intestino anterior y forma la
membrana buco-faríngea, que se rompe al final de la tercera semana y, de este
modo, se comunican el intestino y la cavidad amniótica. En el extremo caudal
está la membrana cloacal que se divide en membrana urogenital y membrana
anal. Ambas membranas cloacales se rompen mucho más tarde. El alantoides

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forma la cloaca en el extremo caudal del embrión y se continúa en forma de


tubo hacia el otro lado, dentro del pedículo de fijación. Al final de la 4ª semana
el saco vitelino y el pedículo de fijación se fusionan y forman el cordón
umbilical.

e) Órganos que forman el desarrollo embrionario del pollo:

Tercer dia
60 horas: se empieza a formar la nariz
62 horas: se inicia el desarrollo de las piernas.
64 horas: empieza la formación de las alas. El embrión empieza a rotar para
que da recostado sobre su lado izquierdo. El sistema circulatorio aumenta
rápidamente durante este día.

Cuarto día
En este periodo ya se encuentran todos los órganos del cuerpo y se empieza a
formarla lengua. El sistema vascular es claramente visible

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Quinto día
Los órganos reproductores se diferencian y se desarrollan el sexo. El corazón
comienzaa tomar su forma definitiva y el área vascularizada del saco vitelino
cubre dos terceraspartes de la yema. Las partes de la cara y las fosas nasales se
presentan en el mismo momento en que se presentasu apariencia definitive.

f) Formación de la placenta:

Al comienzo de la 3ª semana, hay abundantes troncos de las vellosidades


primarias. Cada una consiste en citotrofoblasto cubierto de sincitiotrofoblasto.
Posteriormente, células del mesodermo extraembrionario se introducen en el
centro de las vellosidades primarias que pasan a ser vellosidades secundarias.
Al final de la 3ª semana, en el mesodermo de las vellosidades se han formado
vasos sanguíneos y células sanguíneas. Es el tronco de las vellosidades
terciarias. Durante la 4ª semana se advierten estas vellosidades en toda la
superficie del corion. Los capilares de las vellosidades se ponen en contacto con
los capilares que se desarrollan en el mesodermo extraembrionario o capa
coriónica y en el pedículo de fijación. A su vez, estos vasos comunican con 3 el
sistema circulatorio intraembrionario, conectando así la placenta y el embrión.
Cuando el corazón empieza a latir en la 4ª semana, el sistema de vellosidades
está preparado para proporcionar al embrión los nutrientes y el oxígeno
necesario. Hasta entonces estas necesidades se satisfacen por difusión. Entre
tanto, las células del citotrofoblasto se introducen en el sincitiotrofoblasto
suprayacente lo atraviesan hasta ponerse en contacto con el endometrio. Allí
establecen continuidad unas vellosidades con otras, adheridas por el
citotrofoblasto al endometrio, formando así la envoltura citotrofoblástica, que
une firmemente el saco coriónico al tejido materno-endometrial. Para el día 19-
20, el embrión está unido a la envoltura trofoblástica por el pedículo de fijación,
que consiste en mesodermo extraembrionario, continuo con el de la placa

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coriónica, unido al embrión por el extremo caudal de éste. Después el pedículo


se convertirá en el cordón umbilical, que comunica la placenta con el embrión.

g) Etapas del desarrollo embrionario del hombre

BIBLIOGRAFÍA:

 Yukata Tahara, Katsuya Obara. Un sistema de cultivo sin cascara para embriones de pollo.
JPSA. 03/07/19. Disponible en:

file:///C:/Users/HP/Downloads/A%20novel%20shell-less%20culture%20system%20for
%20chick%20embryos%20using%20a%20plastic%20film%20as%20culture
%20vessels.en.es.pdf

 http://www.muticus-pina.com/subm/huevo.pdf

 https://www.academia.edu/7587099/DESARROLLO_EMBRIONARIO_DEL_POLLO
http://www3.uah.es/benito_fraile/embrion-humano.pdf

 http://www.csicenlaescuela.csic.es/proyectos/moleculas/experiencias/corella/pdf/incubaci
onhuevos1.pdf

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