El complejo de Nitrato Reductasa en

Escherichia coli K-12:

Participa específicamente la Formiato
deshidrogenasa y Citocromo b, Components in
Nitrate Reduction
La participación de distintos formiatos deshidrogenasas y
componentes de citocromo en la reducción de nitrato por
Escherichia coli se estudió. La actividad de formiato
deshidrogenasa presente en extractos preparados a partir de
células inducidas por nitrato de la cepa HfrH estaba activo
con varios aceptores de electrones, incluyendo azul de metileno,
metosulfato de fenazina, y viológeno de bencilo. Ciertos
mutantes que no pueden reducir el nitrato tenían niveles bajos o
indetectables de actividad de formiato deshidrogenasa ensayados
con metileno metosulfato de azul o fenazina como aceptor de
electrones. De nueve de estos mutantes, cinco produjeron gas
cuando se cultivó anaeróbicamente sin nitrato y poseía un
viológeno de bencilo actividad de deshidrogenasa de formiato
ligada, lo que sugiere que las deshidrogenasas de formiato
distintas participan en los sistemas de nitrato reductasa y
formica hidrogenilasa.
Los otros cuatro mutantes formaron poco gas cuando se cultivaron
anaeróbicamente en ausencia de nitrato y carecía de la
deshidrogenasa de formiato unida a bencil viológeno, así como la
azul de metileno o fenazina actividad ligada al metosulfato. El
citocromo b1 presente en las células inducidas por nitrato se
distinguió por sus propiedades espectrales y su genética control
de los principales componentes del citocromo b1 de las células
aeróbicas y de las células cultivadas anaeróbicamente en
ausencia de nitrato. El citocromo bk específico de nitrato fue
completamente y se redujo rápidamente en 1 mm de formiato, pero
no se redujo en 1 mm, se redujo nicotinamida adenina
dinucleótida; el ascorbato redujo solo una parte del citocromo
b1 que fue reducido por el formiato. Cuando se añadió nitrato,
el formato reducido el citocromo b1 se oxidó con cinética
bifásica, pero el citocromo reducido con ascorbato bk se oxidó
con cinética monofásica. Los efectos inhibitorios de n-heptilo
hidroxiquinolina-N-óxido en la oxidación del citocromo b1 por
nitrato proporcionado evidencia de que el citocromo específico
de nitrato se compone de dos componentes que tienen potenciales
redox dife
rentes pero propiedades espectrales idénticas. Concluimos de
estos estudios indican que la reducción secuencial de nitrato en
E. coli está mediada por la operación secuencial de un formiato
deshidrogenasa específica, dos componentes específicos del
citocromo b, y nitrato reductasa.

Una serie de observaciones indican que el nitrato

la reducción en Escherichia coli ocurre principalmente por un
vía que involucra formiato deshidrogenasa, citocromo
bl, y nitrato reductasa. Entre los varios sustratos que son
metabolizados por E. coli, el formiato es el electrón más
efectivo
donante para la reducción de nitrato en células cultivadas
anaeróbicamente en presencia de nitrato (2, 23).
En tales células, formiato deshidrogenasa, citocromo b1, y la
nitrato reductasa se induce a niveles relativamente altos en
comparación con los de las células crecido en ausencia de
nitrato (2, 17, 23). Estas tres componentes están presentes en
la membrana
fracciones (6) y han sido parcialmente purificadas
como una unidad de extractos celulares (8). Finalmente mutantes
de E. coli que no pueden producir nitrito
de nitrato (mutantes NR7) carecen de formato
deshidrogenasa o nitrato reductasa o combinaciones
de estas actividades y citocromo b & (1, 16,
17, 22).

La propuesta que formate deshidrogenasa y

citocromo bi son componentes específicos de la
sistema de reducción de nitrato plantea algunas preguntas
importantes sobre la relación de este
vía con otras vías de transporte de electrones
en E. coli. La deshidrogenasa de formiato debe
también ser un componente del sistema de hidrogenilasa
(15) así como de formiato oxidasa. Estas
Múltiples funciones de la formiato deshidrogenasa
han sido previamente reconocidos, y ha sido
sugirió que al menos dos formiatos distintos
las deshidrogenasas, particuladas y solubles, son
formado por E. coli (4, 5).
La participación del citocromo b, en nitrato
la reducción crea una situación aún más compleja,
dado que el citocromo b1 es uno de los principales citocromos
presente en aeróbico y anaeróbico
células de E. coli y por lo tanto deben funcionar en
otros sistemas de transporte de electrones (3, 10, 18). A
presente no se sabe si el citocromo distinto
Los componentes de b1 están involucrados en diferentes
vías de electrones o en qué medida tales vías
interactuar.
Para definir los componentes de la nitrato reductasa
complejo y su relación con otros
vías metabólicas, estudiamos la bioquímica
eventos involucrados en la reducción de nitrato en el tipo
salvaje
E. coli y en varios mutantes NR-.
Se presenta evidencia de que un formato específico
deshidrogenasa, dos componentes distintos del citocromo b1,
y nitrato reductasa son obligatorios
componentes de un complejo de nitrato reductasa en
E. coli.

MATERIALES Y MÉTODOS
Las cepas de E. coli utilizadas en estos estudios, HfrH
y AB2102, y los mutantes NR- derivados de ellos
fueron descritos anteriormente (17). Todas las cepas fueron
cultivadas
en un medio completo que contiene una base de sal (20),
clorhidrato de tiamina (5, g / mI), 0.4% de nutrientes
-broth (Difco) y 1% de glucosa (esterilizada por separado).
Cuando se indica, el medio se complementa con
Nitrato de potasio al 1% y formiato de sodio al 0,5%.
Para medir actividades, se cultivaron cultivos en
matraces con brazos laterales de tubo Klett a 37 ° C en una
sacudida
baño de agua. Para condiciones aeróbicas, el medio fue
rociado vigorosamente con aire estéril. Para condiciones
anaeróbicas,
el medio se roció con una mezcla estéril
de 95% de N2 más 5% de CO2. Las culturas fueron inoculadas
con un 2 a 5% de inóculo de un cultivo nocturno
cultivado en medio similar y se le permite crecer hasta el
mitad de la fase exponencial. Las células fueron recolectadas
por centrifugación, lavar dos veces con 0,05 M
tampón de fosfato de potasio (pH 6,8 o 7,3), y
resuspendido en el mismo búfer. Esta suspensión fue
utilizado como tal (células enteras) o congelado durante la
noche a
-15 C antes de su uso (células congeladas-descongeladas). Libre
de células
Los extractos se prepararon mediante tres tratamientos de 15
segundos.
cada uno en un Branson Sonifier de 10 kc, seguido de
centrifugación
a 3.000 X g durante 10 minutos para eliminar todo
células.
La deshidrogenasa de formiato se midió con diferentes
aceptadores de electrones utilizando un radioensayo o un ensayo
espectrofotométrico descrito anteriormente (17),
o mediante el siguiente procedimiento manométrico utilizando un
Aparato de Warburg. En el compartimento principal estaban
se colocaron 0.2 ml de cellfs o extracto, 10; umoles de electrón
aceptor y tampón de fosfato de potasio 0.05 / M
(pH 6,8) en un volumen total de 2,7 ml; 30, umoles de
el formiato se colocó en el brazo lateral. Matraces y manómetros
se lavaron con N2 y se equilibraron a
37 C antes de volcar el formiato en el compartimento principal.
La actividad se expresó como microlitros de
El CO2 evolucionó por minuto por miligramo de proteína.
No se produjo CO2 en ausencia de agregado
aceptadores de electrones.
En algunos experimentos, el bencil viológeno específico
la deshidrogenasa de formiato se midió mediante lo siguiente
procedimiento cualitativo En tubos Thunberg, 140 umoles
de tampón de fosfato de potasio (pH 6,8), 1,0, capas de
viilógeno de bencilo, 60; umoles de formiato de sodio, y
Las células o el extracto se mezclaron en un volumen final de
5,0 ml.
Los tubos se enjuagaron con N2 y se redujo la
El viológeno de bencilo fue seguido por el uso de un colorímetro
Klett
con un filtro de 660 nm. El desarrollo del color.
no fue lineal y, por lo tanto, los resultados se expresaron
cualitativamente.
La hidrogenilasa fórmica se ensayó manométricamente.
siguiendo la evolución del hidrógeno del formiato (15).
La producción de gas por cultivos en crecimiento fue evaluada
por
observar la acumulación de gas en viales invertidos
sumergido en tubos del medio de cultivo.
La nitrato reductasa se ensayó con formiato o
Viológeno de metilo reducido como donador de electrones, como
anteriormente
descrito (17). Con otros donantes de electrones el
Se siguió el procedimiento utilizado con formiato, sustituyendo
El donante de electrones para el formiato.
* Los espectros de absorción de los citocromos fueron
determinado con un espectrofotómetro de grabación de un solo haz
construido y amablemente disponible
por Warren Butler en la Universidad de California, San
Diego Luz monocromática de medio ancho de banda de 1.0 nm
fue proporcionado por una rejilla de Bausch & Lomb
monocromador La salida del fotómetro y un
potenciómetro orientado al tambor de longitud de onda
proporcionado
las señales de entrada a un Moseley 7000 AM X-Y
grabadora. Para la medición de espectros reducidos absolutos
a temperatura de nitrógeno líquido, una muestra de 1.0 ml fue
colocado en una celda de absorción de metal, reducido con
ditionito de sodio sólido, mezclado con 500 mg de Al203
(1, um de diámetro), congelado en N2 líquido y colocado en un
Matraz Dewar que contiene N2 en el compartimento celular de
el instrumento. Para la medición de reducción absoluta
espectros a temperatura ambiente, el mismo procedimiento general
fue seguido, omitiendo el líquido N2. por
determinar los espectros diferenciales, un archivo adjunto
que proporcionó un haz dividido fue utilizado. En este caso,
Se colocaron muestras idénticas de 3.0 ml en absorción de vidrio
células (camino de luz de 10 nm). El contenido de uno
la cubeta se oxidó enjuagando con aire durante 30 segundos,
y el otro se redujo con ditionito de sodio sólido
para obtener el espectro reducido menos oxidado.
Los niveles de citocromo se calcularon de la siguiente manera.
UN
la línea basal se dibujó entre 540 y 570 nm, y el
la altura del pico de la banda a se midió a partir de
Esta línea de base. Las unidades de densidad óptica fueron
calculado, y el nivel de citocromo se expresa como óptico
unidades de densidad por miligramo de proteína. La cinética de
se siguió la reducción y oxidación del citocromo b1
con una longitud de onda doble de Aminco-Chance
espectrofotómetro a 35 ° C o temperatura ambiente.
La proteína se determinó por el procedimiento de
Lowry y col. (12)
RESULTADOS
Las propiedades generales de la reducción de nitrato.
sistema presente en las cepas de tipo salvaje utilizadas
en estos estudios correspondió a los anteriores
reportado (2, 6, 8). En células inducidas por nitrato de
cepas HfrH, el formiato fue más efectivo
donante de electrones para la reducción de nitrato que la
glucosa
(Tabla 1). En células congeladas y descongeladas o en extractos
celulares,
varios reactivos actúan como donantes de electrones
para reducción de nitrato (Tabla 1). Metilo reducido
viológeno, que transfiere electrones directamente a
la nitrato reductasa (21), fue la más efectiva
donante de electrones, pero el formato fue del 30 al 40% como
activo como metil viológeno reducido en congelado
células. Reducción de nitrato con formiato como
el donante de electrones fue completamente inhibido por
N-heptil hidroxiquinolina-N-óxido 0.01 mM
(HOQNO), mientras que un aumento de 100 veces en el
la concentración del inhibidor no afectó el
reducción de nitrato con metil viológeno reducido
o ascorbato como donante de electrones.
El formiato deshidrogenasa presente en nitrato inducido
Las células de la cepa HfrH utilizaron varias
aceptores de electrones (Tabla 2). Azul de metileno y
el metosulfato de fenazina fue el más efectivo
aceptores, mientras que el ferricianuro de potasio, bencilo
viológeno y cloruro de trifeniltetrazolio fueron
Mucho menos eficaz. Hemos medido rutinariamente
formiato deshidrogenasa siguiendo la reducción
de diclorofenol indofenol (DCPIP)
en presencia de cantidades catalíticas de fenazina
metosulfato (17). Aunque DCPIP es solo
reducido lentamente por una mezcla de extracto crudo
y formiato, en presencia de pequeñas cantidades
de metosulfato de fenazina se reduce a un ritmo
que corresponde a la tasa observada con
azul de metileno. Este ensayo no implica un
flujo indirecto de electrones a través del citocromo
b1, ya que el citocromo bi reducido no se oxida
por metosulfato de fenazina en nuestras preparaciones
y la formiato deshidrogenasa se puede analizar mediante
este procedimiento en mutantes que carecen de citocromo
bi.
La disponibilidad de una serie de mutantes que
falta de deshidrogenasa de formiato en nitrato inducido
las celdas (17) nos permitieron probar directamente la
posibilidad
que las distintas deshidrogenasas de formiatos son
involucrado en el metabolismo de E. coli. A pesar de que
actividad de formiato deshidrogenasa que utiliza
azul de metileno o metosulfato de fenazina como
los aceptores de electrones no pudieron ser detectados o fueron
muy bajo en tales mutantes, algunos de los mutantes
todavía formó gas cuando se cultivó bajo condiciones
que conducen a la formación de la hidrogenilasa fórmica
sistema en la cepa de tipo salvaje (Tabla
3) Cuando el viológeno de bencilo se usó como un electrón
aceptor, la evolución del CO2 del formiato
o la reducción del tinte en presencia de
el formato no era lineal con el tiempo y, por lo tanto, es
expresado cualitativamente.
Estos resultados apoyan la hipótesis de que dos
deshidrogenasas de formiatos bioquímicamente distintas
están involucrados en la reducción de nitrato e hidrógeno
formación en E. coli. Sin embargo, el formiato deshidrogenasas
puede no ser genéticamente distinto
ya que, en algunos de los mutantes NR-, ambos
formiato deshidrogenasa específica de nitrato y el
formiato deshidrogenasa involucrada en el fórmico
el sistema de hidrogenilasa se pierde (Tabla 3) a medida que
resultado de mutaciones que parecen ser solteras,
mutaciones puntuales sobre la base de las tasas de reversión
(17)
Cuando E. coli se cultiva anaeróbicamente, el
la adición de nitrato provoca un aumento en el nivel del
citocromo bi (17, 23). El siguiente espectral
El análisis demuestra que el bi citocromo
componentes formados en presencia y ausencia
de nitrato también son cualitativamente distintos. Absoluto
espectros de células congeladas-descongeladas reducidas con
ditionito se muestra en la Fig. 1. Las células crecidas
en presencia de nitrato exhibió solo dos
picos principales entre 500 y 600 nm. Estas
eran 526 nm (3 bandas) y 555 nm (una banda) a
temperaturas de nitrógeno líquido y 528 y 558 nm
a temperatura ambiente. Por otro lado, el
células cultivadas en ausencia de nitrato exhibidas
picos principales a 528 y 558 nm, un hombro a
549 nm (citocromo c) a temperatura de nitrógeno líquido,
y picos a 530 y 560 nm en la habitación
temperatura. La distinción entre estos b55a
y componentes b558 (identificados por su una banda
picos a temperatura de nitrógeno líquido) era claro
en algunos mutantes NR que tenían niveles reducidos
del citocromo b1. Cuando tales mutantes eran
cultivado en condiciones anaerobias en presencia
de nitrato, ambos componentes fueron evidentes en el
espectros reducidos (Fig. 2, mutante TW-15). Además,
un segundo tipo de mutante, que no formó
componente detectable del citocromo b555 cuando
cultivado anaeróbicamente con nitrato (Fig. 2, cepa
RB-12), formaron niveles normales de los componentes b558
cuando se cultiva anaeróbicamente en ausencia
de nitrato (no se muestra, cf. no inducido de tipo salvaje
espectro, Fig. 1).
Cuando las cepas de tipo salvaje se cultivaron aeróbicamente,
las bandas del citocromo b mayor
los componentes estaban a 555 y 562 nm (a líquido
temperatura de nitrógeno). Sobre la base de lo siguiente
observaciones con NR- mutantes, el b555
componentes encontrados en anaerobios, inducidos por nitratos
las células parecerían ser distintas de la b5a5
componente en células aerobias. NR- mutantes, que
han alterado los niveles del componente b555 cuando
cultivado anaeróbicamente con nitrato, formó un
distribución normal de componentes del citocromo,
incluyendo un componente b555, cuando eran
cultivado en condiciones aeróbicas (Fig. 2). los
los espectros absolutos que se muestran para las células
aeróbicas son
idéntico al que se encuentra en las células aeróbicas de tipo
salvaje
crecido bajo estas condiciones, mostrando picos
a 555 y 562 nm.
Por lo tanto, el componente principal del citocromo b
encontrado en células cultivadas anaeróbicamente en presencia
de nitrato parece ser fisiológicamente y
genéticamente distinto de los componentes del citocromo b
encontrado bajo otras condiciones de crecimiento.
Las siguientes observaciones implican directamente
El componente b555 en el sistema de reducción de nitrato
y proporcionar evidencia de que está compuesto por dos
citocromos distintos que poseen idénticos
Características espectrales.
Cuando la cinética de reducción y oxidación
del citocromo b1 fueron seguidos en un Aminco-
Espectrofotómetro de grabación de doble longitud de onda,
se encontró que adiciones repetidas
de 1 mm de nicotinamida adenina dinucleótido reducido
(NADH) no causó la reducción de la
componente citocromo b1 presente en congelado
preparaciones de células inducidas por nitrato
(Fig. 3). Al aumentar la concentración de NADH
a 100 mM, fue posible efectuar una reducción
del citocromo bi, pero consideramos esto como un
nivel no fisiológico de NADH. Similar
Los resultados se obtuvieron utilizando extractos crudos.
Cuando se añadió formiato de 1 mm, un inmediato
reducción del citocromo b, ocurrió. El posterior
la adición de nitrato causó la completa
oxidación del citocromo, pero con peculiar
cinética (Fig. 3). Solo parte del citocromo
fue inmediatamente oxidado, siendo el resto
oxidado después de un lapso de tiempo definido. Con algo
retraso de tiempo, el ascorbato también causó la reducción de
citocromo bi. Sin embargo, en este caso el reducido
el citocromo se oxidó por completo en un solo
paso tras la adición de nitrato (Fig. 4A). Aparentemente
solo se redujo parte del citocromo b1,
ya que la posterior adición de formiato causó
la reducción de más citocromo, y en esto
caso se observó la cinética bifásica para
oxidación por nitrato. Esta diferencia en la medida
de reducción del componente citocromo causado
por formiato y ascorbato fue verificado por el
experimento mostrado en la Fig. 4B, en el que la adición
de formiato inmediatamente después del ascorbato
provocó un incremento adicional de citocromo
reducción. Estos resultados sugirieron que dos citocromos
b, los componentes se redujeron por formiato,
uno de los cuales se reduce con ascorbato, y que
nitrato oxidó ambos componentes del citocromo
pero uno de ellos solo después de un lapso de tiempo definido.
Los efectos de HOQNO en la oxidación de
componente citocromo bi proporcionado adicional
evidencia de que dos citocromos distinguibles
fueron reducidos y oxidados en estos experimentos.
Cuando se agregó 0.01 mm HOQNO después
La reducción completa del citocromo (Fig.
4B), solo parte del citocromo se reoxidó
por nitrato y la oxidación tuvo lugar inmediatamente
en un solo paso Resultados idénticos fueron
obtenido cuando se redujo el citocromo
solo por formiato, es decir, el segundo paso de la
la cinética bifásica fue completamente inhibida por
HOQNO. Además, la reducción de nuevo de
se evitó el citocromo oxidado por el formiato
por HOQNO (Fig. 4B). En contraste, eso
porción de citocromo b1 que se redujo
por ascorbato no fue impedido por HOQNO
de ser oxidado por nitrato (Fig. 4C). los
la adición de más nitrato no tuvo más efecto
y, en este caso, HOQNO no impidió
formato de reducir al menos parte del citocromo.
Para demostrar que estos resultados se debieron
específicamente al comportamiento del citocromo b555,
un conjunto similar de experimentos se llevó a cabo en
qué espectros se determinaron a temperatura ambiente
con el accesorio de haz dividido para el
espectrofotómetro (Fig. 5A). El formato reducido
el citocromo b exhibió una banda ca, en
558 nm a temperatura ambiente, que corresponde
al componente b555 (ver Fig. IB). Nitrato
reoxidó completamente el citocromo, pero cuando
HOQNO se agregó al formato reducido
preparación, el nitrato causó la oxidación de
solo una parte del citocromo, dejando un reducido
citocromo con una absorción máxima idéntica.
Los resultados presentados en la Fig. SB también confirmaron
los resultados obtenidos con ascorbato como
donante de electrones y demostró que un cito- el resto del
citocromo reducido no fue
oxidado, incluso después de 8 minutos de burbujeo continuo
con aire (curva c). Cuando la concentración de
el formato fue menor (5 X 10-4 M), HOQNO hizo
no inhibe la oxidación del citocromo
5605mpzm6 ~ 0 ~~~~~~ l (iAcguraviens, d, te, hefs) e. los
resultados pueden ser interpretados por 540 mpt suponiendo la
existencia de dos citocromos en
I______I______I______I_____ células inducidas por nitrato que
pueden reducirse mediante
2 3 4 5 6 formiato y oxidado por oxígeno (Fig. 7). los
El tiempo (min) de presencia de HOQNO inhibiría el electrón
fluir entre ambos citocromos, permitiendo solo
un citocromo para oxidarse rápidamente en el
presencia de exceso de formato, ya que el formato
continuar reduciendo el citocromo antes de
bloquear. El hecho de que HOQNO no tuvo ningún efecto sobre
oxidación de citocromos cuando un bajo nivel de
se utilizó formiato sugiere que ambos citocromos
son autooxidable.
DISCUSIÓN
KNO3 La participación de formiato deshidrogenasa,
citocromo b1 y nitrato reductasa en nitrato cromo con una
absorción máxima de 558 nm
a temperatura ambiente está involucrado. La cinética
cambios observados, por lo tanto, reflejan cambios
que ocurre específicamente en el citocromo b555
componentes.
Estos resultados pueden explicarse suponiendo que
participación en la reducción de nitrato de dos citocromos
con espectros idénticos que difieren solo en
sus potenciales redox (ver Fig. 7).
La evidencia adicional para tal hipótesis fue
obtenido mediante el análisis de la autooxidación del citocromo
b1 en células inducidas por nitrato (Fig. 6).
Formate a una concentración de 8.3 X 103 M
redujo rápidamente el citocromo bi (curva a). Después
se burbujeó aire a través de la suspensión celular durante
1 min, el citocromo se oxidó por completo
(curva b). Cuando 8.3 X 10 M HOQNO era
añadido, burbujeando con aire durante 1 minuto causó rápido
la oxidación de solo la mitad del citocromo y la reducción por
E. coli ha sido propuesta por un
número de investigadores (6, 8, 17, 23). Los resultados
presentado aquí, junto con los resultados de los estudios en NR-
mutantes (17), indican que distintas
formas de estos componentes están involucrados en el
sistema de reducción de nitrato y que hay poco
interacción con otras cadenas de transporte de electrones,
es decir, la reducción de nitrato ocurre principalmente por
operación secuencial de formiato deshidrogenasa,
citocromo b555 y nitrato reductasa. Severla
Los investigadores han demostrado que NADH
puede servir como donante de electrones para la reducción de
nitrato
en extractos sin células de E. coli (2, 5, 6, 13).
Sin embargo, NR- mutantes que carecen de formiato
deshidrogenasa pero posee nitrato reductasa
ni formar nitrito ni eliminar nitrato del
medio durante el crecimiento (datos no publicados). Cuando
tales mutantes alcanzan la fase estacionaria, sin embargo,
el nitrito comienza a acumularse, lo que sugiere que
NADH puede servir como donante de electrones para
reducción de nitrato solo en células de fase estacionaria.
Por el contrario, el padre de tipo salvaje se acumula
grandes cantidades de nitrito durante el crecimiento bajo el
mismas condiciones, y esta acumulación continúa
durante la fase estacionaria. En ninguno de estos
casos de nitrito se reduce aún más, presumiblemente
porque usamos 1% de nitrato, una condición que
suprime la formación de la nitrito reductasa
sistema en E. coli (2). El papel específico de la
Actividad de nitrato reductasa ligada a NADH y su
relación con la actividad de nitrato reductasa asociada
con formiato deshidrogenasa es, en la actualidad,
desconocido.
El formiato deshidrogenasa involucrado en nitrato
la reducción parece ser distinta del formato
deshidrogenasa implicada en el formiato hidrogenilasa
sistema. Esta distinción se basa
en parte en la especificidad del aceptador de electrones de la
formiato deshidrogenasa asociada con estos
dos sistemas (5), pero está más claramente demostrado
por la existencia de un formiato funcional
sistema de hidrogenilasa y un específico de bencil viológenos
formiato deshidrogenasa en mutantes NR-
que carecen del específico de metosulfato de fenazina
formiato deshidrogenasa asociada con nitrato
reducción. El hecho de que algunos mutantes NR
carecen de estas dos deshidrogenasas de formiato, ya que
mostrado aquí y por otros (14, 22), sugiere que
ambas actividades dependen de una genética común
elemento, quizás el gen estructural para el formiato
deshidrogenasa Si ambos están especificados por el mismo
gen, las variaciones genéticas y fisiológicas
observado para las dos formiato deshidrogenasas
debe ser el resultado de una interacción y asociación
del producto génico con transporte de electrones distinto
componentes. Una interpretación alternativa
es que ambas actividades se pierden como resultado de
alteración pleiotrópica que afecta la membrana
componentes de la célula (1). En cualquier caso, un claro
comprensión de las variaciones genéticas observadas
para el formiato las deshidrogenasas requerirán un
análisis genético y bioquímico detallado de este
enzima y su participación en distintas vías.
Se propone el esquema de la Fig. 7 para explicar
la interacción del citocromo específico de nitrato
b, con los diferentes donantes de electrones, su oxidación
por nitrato y los efectos del inhibidor
HOQNO en estos procesos. Varios de los hechos
presentado aquí sugiere que dos citocromos distintos
Los componentes de b555 se oxidan con nitrato.
(i) El nitrato provoca una oxidación bifásica del formato
reducido
citocromo b555. (ii) Ascorbato, un
donante de electrones de potencial redox moderadamente alto,
reducido solo una parte (alrededor del 50%) de la
citocromo b555 específico de nitrato que ditionito
o reducir el formiato. (iii) HOQNO inhibe el
oxidación de solo una parte (aproximadamente 50%) del formiato
reduce el citocromo b555 por nitrato pero lo hace
no inhibe la oxidación de ascorbato reducido
citocromo b555 por nitrato. Estas observaciones
junto con el hecho de que HOQNO completamente
inhibe la reducción de nitrato por formiato, son
explicado más fácilmente por la propuesta en la Fig. 7
que dos componentes del citocromo b555 con
función de diferentes potenciales de oxidación-reducción
secuencialmente en la transferencia de electrones de
formato a nitrato. Mientras que ditionito y
formiato (a través de formiato deshidrogenasa)
reducir ambos componentes, ascorbato haría
reducir solo el segundo componente del citocromo.
Los efectos selectivos de HOQNO resultarían
de su inhibición de la transferencia de electrones
entre los dos componentes del citocromo. los
cinética bifásica de oxidación por nitrato haría
ser debido a la capacidad del formato, siempre que
está presente, para mantener el citocromo reducido incluso
en presencia de citocromo oxidado II.
Tal modelo podría explicar por qué muchos NRmutantes
que carecen de nitrato reductasa o
la formiato deshidrogenasa también exhibe disminución
pero niveles intermedios del citocromo b555
(17) yo. e., uno u otro de los dos citocromos
Los componentes pueden no estar formados. Además,
los informes de que el citocromo bi está asociado
ambos con formiato deshidrogenasa (7, 11) y con nitrato
reductasa (9) después de estas enzimas
había sido resuelto el uno del otro puede ser
explicado asumiendo que un bi citocromo
componente permanece asociado con formiato
deshidrogenasa y la otra con nitrato reductasa
durante los procedimientos de purificación.
Está claro que el citocromo específico de nitrato
Los componentes de b555 son distintos del citocromo
componente b555 formado bajo aerobic
condiciones, ya que NR- mutantes que carecen de la
el citocromo b555 inducido por nitrato todavía se forma normal
Componentes del citocromo b1 en condiciones aeróbicas.
Estas observaciones no establecen
si ese es el mismo citocromo bi asociado
con diferentes componentes o que E. coli
especifica una serie de distintos componentes bi del citocromo
para varios sistemas de transporte de electrones.
En cualquier caso, la formación de componentes del citocromo.
debe estar específicamente regulado por el
otros componentes catalíticos con los que
normalmente están asociados
Esa reducción de nitrato es catalizada por un físico
complejo asociado de enzimas puede ser
establecido solo por el aislamiento del catalizador
unidad. Sin embargo, la asociación de membrana de
los componentes, la existencia de pleiotropic
mutaciones que afectan las actividades y la aparente
falta de interacción de este sistema con
otras cadenas de transporte de electrones defienden la
existencia de tal complejo.

EXPRESIONES DE GRATITUD
Estamos en deuda con William Cramer por su ayuda con el
citocromo.
medidas y sus valiosos consejos y críticas. Esta
el trabajo fue apoyado por una subvención del Servicio de Salud
Pública GM 13200-
04 del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales.