FUNCIONES INDEPENDIENTES DE LA PROTEÍNA VIRAL Y NUCLEICA

ÁCIDO EN EL CRECIMIENTO DEL BACTERIÓFAGO*

El trabajo de Doermaml (1948), Doermann y Dissosway (1949), y Anderson y
Doermann (1952) han demostrado que los bacteriófagos T2, T3 y T4 se multiplican
en la célula bacteriana en una forma no infecciosa. Lo mismo puede decirse del fago
transportado por ciertas bacterias lisogénicas (Lwoff y Gutmann, 1950). Poco más
se sabe sobre la fase vegetativa de estos virus. Los experimentos reportados en
este documento muestran que uno de los primeros pasos en el crecimiento de T2
es la liberación de su capa proteica del ácido nucleico de la partícula del virus,
después de lo cual la mayor parte de la proteína que contiene azufre no tiene más
función.
Materiales y métodos. Fago T2 significa en este trabajo la variedad llamada T2H
(Hershey, 1945); T2h significa uno de los mutantes del rango de huéspedes de T2;
UV-fago significa fago irradiado con luz ultravioleta de una lámpara germicida
(General Electric Co.) a una supervivencia fraccional de 10 -5.
Bacteria sensible significa una cepa (H) de Escherichia coli sensible a T2 y su k
mutante; bacterias resistentes B/2 significa una cepa resistente a T2 pero sensible
a su k mutante; bacterias resistentes B/2h significa una cepa resistente a ambos.
Estas bacterias No adsorber los fagos a los que son resistentes.
"El caldo pobre en sal" contiene por litro 10 ginebra. bactopeptona, 1 g. glucosa y 1
ginebra. NaC1. "Caldo" contiene, además, 3 ginebras. Extracto de bacto-beef y 4
gm. NaCl.
El medio de glicerol-lactato contiene por litro 70 m ~ lactato de sodio, 4 ginebra.
glicerol 5 ginebras. NaC1, 2 ginebras. KCI, 1 ginebra. NI-I_aCI, 1 mm MgC12, 0,1
m~t CaC12, 0,01 gm. gelatina, 10 trapos. P (como ortofosfato), y 10 mg. S (como
MgSO4), a pH 7,0.
El medio de adsorción contiene por litro 4 ginebras. NaC1, 5 gm. K~SO4, 1.5
ginebra. KH~PO,, 3.0 gm. Na~-IP0,, 1 mE MgSO,, 0,1 m_~ CaC12, y 0,01 gm.
gelatina, a pH 7,0.
Tampón Veronal contiene por litro 1 gm. dietilbarbitúrico sódico, 3 mE MgS04, y 1
ginebra. gelatina, a pH 8,0.El HCN al que se hace referencia en este documento
consiste en una solución molar de cianuro de sodio Neutralizado cuando es
necesario con ácido fosfórico.
Esta investigación fue apoyada en parte por una beca de investigación de la Instituto
Microbiológico de los Institutos Nacionales de Salud, Servicio de Salud Pública. Los
isótopos radiactivos fueron suministrados por el Laboratorio Nacional de Oak Ridge
por asignación de la División de Isótopos de la Comisión de Energía Atómica de los
Estados Unidos.
PROTEÍNA VIRAL Y ÁCIDO NUCLEICO Ilq CRECIMIENTO DE BACTERIÓFAGOS
La adsorción del isótopo a las bacterias generalmente se medía mezclando la
muestra en medio de adsorción con bacterias de cultivos de caldo de 18 horas
previamente calentados a 70°C. Durante 10 minutos y lavar con medio de adsorción.
Las mezclas fueron calentadas durante 5 minutos a 37°C, diluido con agua y
centrifugado. Los ensayos fueron Hecho de fracciones de sedimento y
sobrenadante.
La precipitación del isótopo con antisuero se midió mezclando la muestra en 0,5 por
ciento de solución salina con aproximadamente 1011 por ml. de fago no radiactivo
y ligeramente más de la menor cantidad de suero antifago (dilución final 1:160) que
causar precipitación visible. La mezcla se centrifugó después de 2 horas a 37°C.
Las pruebas con DNasa (desoxirribonucleasa) se realizaron calentando muestras
diluido en tampón veronal durante 15 minutos a 37°C. con 0,1 trapo. por ml. de
cristalino enzima (Laboratorio Bioquímico de Worthington).
El isótopo soluble en ácido se midió después de precipitar la muestra refrigerada
con un 5 % de ácido tricloroacético en presencia de 1 mg./ml, de albúmina sérica, y
centrifugado.
En todos los fraccionamientos que impliquen centrifugación, los sedimentos no se
lavaron, y contenía alrededor del 5% del sobrenadante. Se analizaron ambas
fracciones.
Radioactivity was measured by means of an end-window Geiger counter, using dried
samples sufficiently small to avoid losses by self-absorption. Para mediciones
absolutas, soluciones de referencia de P~ obtenidas de la Oficina Nacional de
Normas, así como un estándar simulado permanente. Para mediciones absolutas
de S s5 nos basamos en los ensayos (4-20 por ciento) proporcionados por el
proveedor del isótopo (Laboratorio Nacional de Oak Ridge).
El medio de licerol-lactato se eligió para permitir el crecimiento de bacterias sin
cambios indeseables en el pH a bajas concentraciones de fósforo y azufre, y se
demostró útil también para ciertos experimentos descritos en este documento.
Cultivos sensibles de 18 horas Las bacterias cultivadas en este medio contienen
aproximadamente 2 × 109 células por ml., que crecen exponencialmente sin retraso
o cambio en la dispersión de la luz por célula cuando se subcultivan en el mismo
medio de semillas grandes o pequeñas. El tiempo de generación es de 1,5 horas a
37°C. Las células son más pequeñas que las cultivadas en caldo. T2 muestra un
período latente de 22 a 25 minutos en este medio. El rendimiento del fago obtenido
por lisis con cianuro y el fago UV (descrito en contexto) es uno por bacteria a los 15
minutos y 16 por bacteria a los 25 minutos. El tamaño final de la ráfaga en cultivos
diluidos es de 30 a 40 por bacteria, alcanzada a los 50 minutos. A 2 × l0 s células
por ml., el cultivo se lisa lentamente, y produce 140 fagos por bacteria. El
crecimiento de bacterias y fagos en este medio es tan reproducible como el del
caldo.
Para la preparación de fagos radiactivos, P= de actividad específica 0,5 mc./mg, o
S 35 de actividad específica 8,0 mc./mg, se incorporó al medio glicerol-lactato, en
el que se permitió que las bacterias crecieran al menos 4 horas antes de sembrar
con fagos. Después de la infección con fagos, el cultivo se aireó durante la noche,
y el fago fue aislado por tres ciclos de alternancia lenta (2000 6") y rápida (12.000
G) Centrifugación en medio de adsorción. Las suspensiones se almacenaron en
una concentración no superior a 4 i.tc./ml.
Las preparaciones de este tipo contienen 1.0 a 3.0 × 10-" gg. S y 2.5 a 3.5 × 10-1~
TTG. P por partícula de fago viable. Preparaciones ocasionales que contienen
cantidades excesivas de azufre se puede mejorar por absorción con bacterias
muertas por calor que no adsorben el fago. La pureza radioquímica de los
preparados es algo incierta, debido a la posible presencia de partículas de fagos
inactivos y membranas de fagos vacías. La presencia en nuestras preparaciones de
azufre (alrededor del 20 por ciento) que es precipitado por suero antifago (Tabla I)
y adsorbido por bacterias resistentes a los fagos, o no adsorbido por bacterias
sensibles a los fagos (Tabla VII), indica contaminación por material de membrana.
Los contaminantes de origen bacteriano son probablemente insignificantes para
presentar los fines indicados por los datos que figuran en la Tabla I. Para probar
que nuestros principales hallazgos reflejan propiedades genuinas de partículas de
fagos viables, nos basamos en algunos experimentos con fagos inactivados citados
al final de este artículo. La morfología química de los fágos en reposo partides. --
Anderson (1949) encontró que el bacteriófago T2 podría inactivarse suspendiendo
las partículas en altas concentraciones de cloruro de sodio, y diluyendo rápidamente
la suspensión con agua. Dado que no se produjo ninguna inactivación si la dilución
fue lenta

Atribuyó la inactivación al choque osmótico, e infirió que las partículas poseían una
membrana osmótica. Herriott (1951) encontró que el choque osmótico liberó en
solución el ADN (ácido nucleico desoxipentosa) del fago partícula, y que los
fantasmas podrían adsorber a las bacterias y lisarlas. Señaló que esto fue un
comienzo hacia la identificación de funciones virales con sustancias virales.
Hemos plasmolizado isotópicamente marcado T2 suspendiendo el fago (1011 por
ml.) en cloruro de sodio 3 M durante 5 minutos a temperatura ambiente, y vertiendo
rápidamente en la suspensión 40 volúmenes de agua destilada. El fago
plasmolizado, que contiene no más del 2 por ciento de sobrevivientes, se analizó
para detectar fósforo y azufre de las diversas formas que se muestran en la Tabla
I. Los resultados confirman y amplían los hallazgos anteriores de la siguiente
manera:
1. La plasmólisis separa el fago T2 en fantasmas que contienen casi todos los
azufres y una solución que contiene casi todo el ADN de las partículas intactas.
2. Los fantasmas contienen los antígenos principales de la partícula del fago
detectables por nuestro antisuero. El ADN se libera como ácido libre, o posiblemente
vinculado a sustancias libres de azufre, aparentemente no antigénicas.
3. Los fantasmas son específicamente adsorbidos a bacterias susceptibles a los
fagos; el ADN no lo es.
4. Los fantasmas representan capas de proteínas que rodean el ADN de las intactas
partículas, reaccionan con antisuero, protegen el ADN de la DNasa
(desoxirribonuclasa) y llevan el órgano de unión a las bacterias.
5. Los efectos observados se deben al choque osmótico, porque el fago suspendido
en la sal y diluida lentamente no se inactiva, y su ADN no se expone a DNasa.

Fago adsorbido a bacterias durante 5 minutos a 37°C. en medio de adsorción,

seguido de lavado.
Bacterias calentadas durante 10 minutos a 800C. en medio de adsorción (antes de
la infección) o en tampón veronal (después de la infección).
Fago no adsorbido calentado en tampón veronal, tratado con DNasa y precipitado
con ácido tricloroacético. Todas las muestras fraccionadas por centrifugación 10
minutos a 1300 G.
La estructura de la partícula del fago en reposo descrita anteriormente sugiere a la
vez la posibilidad de que la multiplicación del virus esté precedida por la alteración
o eliminación de las protectoras de las partículas. Se podría esperar que este
cambio se muestre como sensibilización del ADN del fago a la DNasa. Los
experimentos descritos en la Tabla II muestran que esto sucede. Los resultados
pueden resumirse de la siguiente manera:
1. El ADN del fago se vuelve en gran medida sensible a la DNasa después de la
adsorción a bacterias que matan el calor.
2. Lo mismo ocurre con el ADN del fago adsorbido a bacterias vivas, y luego
calentado a 80 ° C. durante 10 minutos, a cuya temperatura se obtiene el fago no
adsorbido no sensibilizado a la DNasa.
3. El ADN del fago adsorbido a bacterias no calentadas es resistente a la DNasa,
presumiblemente porque está protegido por estructuras celulares impermeables a
la enzima.
Graham y colaboradores (comunicación personal) fueron los primeros en descubrir
la sensibilización del ADN del fago a la DNasa por adsorción a la muerte por calor.
gérmenes.
El ADN en las células infectadas también se hace accesible a la DNasa por
alternancia congelación y descongelación (seguida de fijación de formaldehído para
inactivar las enzimas celulares), y en cierta medida por fijación de formaldehído
solamente, como se ilustra en el siguiente experimento.
Las bacterias se cultivaron en caldo a 5 × 10 ~ células por ml., centrifugadas,
resuspendidas en medio de adsorción, e infectado con aproximadamente dos fagos
marcados con P = por bacteria. Después de 5 minutos para la adsorción, la
suspensión se diluyó con agua que contenía litro 1.0 mxs MgSO4, 0.1 m ~ CaCI ~
y 10 trapo. gelatina, y recentrifugada. Las células fueron resuspendidos en el último
líquido mencionado a una concentración de 5 × 10 por ml. Esta suspensión se
congeló a -15 ° C. y se descongeló con un mínimo de calentamiento, tres veces
seguidas. Inmediatamente después de la tercera descongelación, las células fueron
fijadas por la adición de 0,5% (v/v) de formalina (35% HCHO). Después de 30
minutos a temperatura ambiente, la suspensión se dializó libre de formaldehído y
se centrifugó a 2200 g durante 15 minutos. Muestras de fagos marcados con P~,
congelados-descongelados fijados, y dializadas, y de células infectadas fijadas sólo
y dializadas, fueron transportadas como mandos.
El análisis de estos materiales, dado en la Tabla III, muestra que el efecto de
congelación y descongelación es hacer que el ADN intracelular sea lábil a la DNasa,
sin, sin embargo, causar que gran parte de ella se filtre de las células. Congelación
y la descongelación y la fijación de formaldehído tienen un efecto insignificante
sobre la fijación no adsorbida la fijación de fagos y formaldehído sola tiene solo un
efecto leve sobre las células infectadas.
Tanto la sensibilización de la p3~- intracelular a la DNasa, como su incapacidad
para lixiviar fuera de las células, son características constantes de experimentos de
este tipo, independientemente de lisis visible. En el experimento que acabamos de
describir, la suspensión congelada se despejó durante el período de diálisis. La
microscopía de contraste de fase mostró que las células consistían en gran parte
de membranas vacías, muchas aparentemente rotas. En otro experimento,
muestras de bacterias infectadas de un cultivo en caldo pobre en sal fueron
repetidamente congelados y descongelados en varios momentos durante el período
latente de crecimiento de fagos, fijado con formaldehído, y luego lavado en la
centrífuga. El aclaramiento y la lisis microscópica ocurrieron solo en suspensiones
congeladas durante la segunda mitad del período latente, y ocurrió durante el primer
o segundo deshielo. En este caso, las células lisadas consistían enteramente en
membranas celulares intactas, aparecer vacío, excepto por unos pocos cuerpos
refractiles pequeños y bastante característicos. Aparentemente unido a las paredes
celulares. El comportamiento de p32 intracelular hacia la DNasa, ya sea en las
células lisadas o no lisadas, no fue significativamente diferente de que se muestra
en la Tabla III, y el contenido de Pa fue solo ligeramente menor después de lisis. El
fago liberado durante la congelación y descongelación también se instaló en este
experimento. La lisis ocurrió sin liberación apreciable del fago en suspensiones
congeladas hasta e incluyendo el minuto 16, y la muestra de 20 minutos produjo
solo cinco por bacteria. Otra muestra de la cultura formalizado a los 30 minutos, y
centrifugado sin congelación, contenía 66 Porcentaje de la AP en forma no
sedimentable. El rendimiento del fago extracelular a los 30 minutos era de 108 por
bacteria, y el material sedimentado consistía en gran parte de escombros sin forma,
pero contenía también muchas células aparentemente intactas. Membranas.