Se preparó un extracto para estudiar la función de una proteína.

El buffer de extracción
contenía PMSF y ditioeritritol, así como polivinilpolipirrolidona. El extracto crudo fue
centrifugado a 10 mil gravedades. Se tomó el sobrenadante y se agregó sulfato de amonio
hasta alcanzar una concentración de 40% de saturación. Se centrifugó a 3 000 rpm y se
dializó el precipitado durante 24 horas a baja temperatura y se eluyó en una columna de
Sephadex G-100, se adicionó a esta fracción del extracto ATP sulfurilasa, con PM de
440 000.

1. ¿Por qué razón se añadió PMSF?

2. ¿Qué efecto tiene la adición de ditioeritritol?

3. ¿Cuál es la razón de haber agregado PVPP?

4. ¿Podrías señalar si la proteína en estudio se encuentra en la membrana, en

algún organelo o en el citoplasma?

5. ¿Qué efectos tiene la adición de sulfato de amonio?

6. ¿Qué consideras que sedimenta y que se mantiene en el sobrenadante al

centrifugar a 10 mil gravedades y qué efecto tiene la centrifugación a 3000 rpm?

7. ¿Por qué se habrá dializado el precipitado?¿Qué otro procedimiento se podría

utilizar con el mismo fin?
8. ¿Con base en cuáles características separará esta columna?

9. ¿Por qué se dializó a baja temperatura?

10. ¿Revisa el Peso Molecular de la ATP sulfurilasa e indica cuál es la razón de

usarla?

La columna constó de un volumen total de 21 ml, el 52% de éste lo ocupaban las partículas
del gel.

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3
 Se indica el número de tubo contra la absorbencia a 280 nm. Cada
tubo contenía 0.95 ml. El primer pico corresponde a la ATP
Sulfurilasa

11. ¿Cómo se puede calcular V0?

12. ¿Cómo se puede estimar el PM a partir de los datos derivados de la

cromatografía por exclusión molecular?

13. ¿Cuál es el PM de las proteínas eluidas de la fracción obtenida por precipitación

con sulfato de amonio?

Se evaluó la unión de un aminoácido marcado con Tritio en cada fracción, los resultados se
muestran en la tabla. Cada fracción fue mezclada con la solución que contenía el aminoácido
marcado, agitada durante 30 minutos y precipitada con sulfato de amonio. El precipitado fue
analizado en el contador.

Fracción obtenida de la columna de Desintegraciones por minuto

Sephadex registradas en el contador de centelleo
Tubo 17 27
Tubo 23 482

Se tomó el contenido del tubo 23 y se procedió a someterlo a diálisis al equilibrio. El

procedimiento y los resultados de este estudio fueron:
Se colocó una solución conteniendo 0.45 mg/ml de la proteína purificada en un
compartimiento del equipo para diálisis en equilibrio. Se añadió un volumen equivalente de
solución buffer conteniendo 4 x 10 -5 M de sustrato marcado con tritio en el otro
compartimiento. La membrana selectivamente permeable que separaba a ambos
compartimientos dejaba pasar libremente al sustrato, pero no a la proteína. Una vez
alcanzado el equilibrio, el compartimiento que contenía la proteína alcanzó una
concentración de sustrato de 2.3 x 10 -5 M (unido más libre). El compartimiento no proteico
contuvo 1.7 x 10-5 M del sustrato.
 14.-Con el PM calculado a partir de la cromatografía de exclusión molecular, y con
los siguientes resultados, calcula la constante de disociación.

Figura 2. Diálisis al equilibrio, posible representación de relación entre sustrato y proteína.

Sustrato libre

Sustrato
Sutrato-proteína

El pico obtenido en los tubos 15-18 fue tratado con SDS y fue corrido en electroforesis en
geles de poliacrilamida revelándose dos bandas proteicas que contenían microgramos de
proteína.

15.- ¿Cuál es el reactivo o reactivos que permiten revelar la presencia de proteínas

en este sistema?

16.- ¿Cuál es el modo de acción de cada uno?

17.- ¿Cuál es su sensibilidad?

18.- ¿Cómo se puede lograr un gel con poros más pequeños y en qué condiciones
se obtienen geles con mayor poro?

La distancia que fue recorrida en el gel por el azul de bromofenol fue de 9 cm a partir de la
línea que separa al gel concentrador del gel separador. La primera de las bandas se movió
5.67 cm y la segunda 3.42 cm.

Al recortar estas bandas del gel (banda pesada = 3.42 cm, banda ligera = 5.67 cm),
homogeneizar y agregar un reactivo ligador, se identificaron bandas que recorrieron las
siguientes distancias realizando la electroforesis en las mismas condiciones en las que se
corrió la muestra sin reactivo ligador,
 Banda Pesada Banda ligera
3.42 cm 5.67 cm
0.21 cm 3.42 cm
1.71 cm

La proteína contenida en los tubos 15-18 demostró actividad catalítica. La banda pesada no
mostró actividad y tampoco la ligera. Se prepararon mezclas con las bandas derivadas de la
banda pesada y la banda ligera, encontrándose la mayor actividad al combinar la banda de
0.21 cm obtenida de la banda pesada y la banda de 3.42 cm obtenida de la banda ligera. Se
encontró que la banda pesada contenía Fe y el contenido de Fe fue de 1.4 g de hierro/mg
de proteína.
19.- ¿Cuáles son los pesos moleculares de las unidades monoméricas de la
holoenzima?

20.- ¿Cuántos monómeros contienen hierro?

21.- ¿Cuál es el PM de la enzima completa?

la proteína nativa obtenida de los tubos 15-18 fue tratada con p-cloromercuribenzoato, y se
perdió la actividad. Cuando la proteína no se extrajo en presencia de ditioeritritol también
perdió actividad. Al tratar la proteína nativa con SDS separar la banda pesada y la ligera y
dializar, se recuperó de la fracción ligera una fracción que consumió la misma cantidad de
pcloromercuribenzoato que la proteína nativa. Después de aminoetilación, se perdió la
capacidad para reaccionar con el pCloromercuribenzoato.

22. ¿Qué residuo consideras esencial en la catálisis?

23.¿En cuáles monómeros reside el sitio activo?

24. ¿Están expuestos?

Dada la constante de disociación que puede obtenerse de este estudio,

25. Calcula el porciento de saturación del receptor proteico cuando se agrega el
aminoácido a una concentración 0.20 micromolar.
Aminoácido libre + aminoácido enlazado = 0.20 M.

Se digirió uno de los monómeros de la banda ligera con tripsina, y se buscó analizar un
segmento que se supuso podía encontrarse cerca del sitio activo, y se procedió a estudiar su
composición y la estructura primaria.

Para el análisis de la composición se hidrolizó en ácido clorhídrico y en hidróxido de bario. El

PM del péptido se estimó por su osmolaridad y correspondió a 970 Daltones. El péptido
contenía aminoácidos que tuvieron la siguiente absorción una vez que reaccionaron con
ninhidrina.

Aminoácido Área bajo la curva

 ala 0.7
gli 0.68
Trp 0.35
Cis 0.35
Asp 0.34
Tyr 0.31
Phe 0.37

Al tratar este péptido con quimotripsina, se obtuvieron los fragmentos cuya hidrólisis arrojó la
siguiente composición:
a)2ala, trp
b)tyr, gli
c)cys, phe, asp
d)gli
El reactivo de Sanger identificó dinitrofenilalanina
El tratamiento con aminoetilación seguida por tripsina desprendió dos péptidos con la
siguiente composición.
a)2 ala, trp, tyr, gli, asp, AEcys
b)gli, phe

26. ¿Cuál es el residuo amino terminal?

27. ¿Qué prueba determinaría cuál aminoácido está ubicado en el extremo

carboxilo terminal del péptido?

28. ¿Qué provocó la aminoetilación?

29. ¿Cuál es la secuencia de aminoácidos del péptido?

30. ¿Cuál es el número máximo de residuos aminoácidos que pueden ser

secuenciados por el reactivo de Edman en un péptido?

31. ¿Qué innovación se requirió en el espectrómetro de masas para evitar que al

vaporizar los péptidos a secuenciar se destruyeran?

32. ¿Qué aminoácidos no se puede distinguir mediante la secuenciación por

espectrometría de masas?