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UNIVERSIDAD DE LA SABANA
INGENIERÍA DE PRODUCCIÓN AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA 2019-II
PRACTICA No. 6: Análisis microbiológico de calidad de aguas
recreacionales

1. Objetivos

 Comprender y valorar la importancia de los análisis microbiológicos de aguas de uso

recreativo.
 Aprender la técnica del Número Más Probable para recuento de microorganismos
coliformes.

2. Introducción

La gran versatilidad metabólica de los microorganismos hace que se puedan encontrar

prácticamente en cualquier entorno. Actualmente no existe una normativa a nivel nacional que
establezca los límites en la concentración de microorganismos en aguas recreativas. Sin embargo
lo que sí no está permitido es la presencia de microorganismos patógenos como E. coli que son
indicadores de contaminación fecal y pueden poner en riesgo la salud de los usuarios.

2.1. Recuento de mesófilos aerobios

La determinación de este grupo de microorganismos (que crecen a temperatura ambiente) da

indicios de la totalidad de la carga microbiana cultivable que contiene la muestra.
No necesariamente se debe relacionar con la presencia de microorganismos patógenos, pues el
agua de una lago o río contienen una carga natural de importancia ecológica.

2.2. Recuento de enterococcus

Este género Gram positivo, si se encuentra en el agua es debido a que habita el tracto gastro-
intestinal (por lo tanto tiene un origen fecal). En muchas regulaciones el recuento de coliformes
se sustituye por el de Enterococcus spp. Enterococcus contiene especies (E. faecalis) que pueden
causar infecciones comprometidas en ambientes hospitalarios o ser importantes ( E. faecalis y E.
faecium) a la hora de transferir resistencia a antibióticos a otros patógenos.

3. Metodología

3.1 Recolección y procesamiento de muestras

Recolectar agua del lago de la Universidad de

“kioskos”

*Materiales y equipos (por grupo):

- 1 Botella shock 400 mL (estériles)

3.2 Siembras microbiológicas

3.2.1. Tratamientos

*Materiales y equipos (por grupo):

- Vaso de precipitados 100 mL
- Clorox 13%
- Lampara ultravioleta

*Procedimiento:

Tratamiento A:
- Servir 100 mL de la muestra en un vaso de precipitados
- Irradiar con U.V, durante 60 minutos
- Procesar (punto 3.2.2.)

Tratamiento B:
- Servir 90 mL de la muestra en un vaso de precipitados
- Añadir 10 mL de Clorox
- Incubar durante 5 minutos
- Procesar (punto 3.2.2.)

Tratamiento C:
- No aplicar tratamientos, procesar (punto 3.2.2.)

3.2.2. Siembra del NMP (Número Más Probable):

*Materiales y equipos (por grupo):

- Tubos caldo brila (60 tubos) con campana de durham

- Tubos solución salina (15 tubos)
- Puntas
- Micropipetas
- Vortex

*Procedimiento:

- Tomar la muestra problema (AGUA) y homogenizarla por 30 segundos en el

vórtex.
- Con una pipeta transferir 1mL de la muestra un tubo con 9mL de agua peptonada estéril
al
0.1%.
- Homogenizar 30 segundos en vórtex.
- Repetir el paso anterior, utilizando una pipeta nueva cada vez, hasta llegar a la dilución 10 -
2
.
- Sembrar 1 mL de cada dilución a cada uno de los caldos Brila (se siembre por
triplicado)
- Verificar que las campanas de Durjhan se encuentren sin burbujas y llevar a incubar a 37°C por
24 Horas.

3.2.3. Filtración a través de membrana.

Un método para determinar el número de coliformes totales presentes en el agua es la filtración

de volúmenes específicos de la muestra en filtros de membrana ya que pueden obtenerse
resultados con prontitud con miras a tomar acciones correctivas respecto a la calidad del
agua evaluada.

*Materiales y equipos (por grupo):

- Placas de PCA, Endo y VRA (1 de cada medio)

- Filtros
- Equipo filtrador
- Probeta de 100 mL
- Pinzas

*Procedimiento:

- Filtrar 100 mL de la muestra de agua en cada filtro (usar 3 filtros)

- Colocar la membrana sobre una placa de agar PCA, Endo y VRE.

Análisis Medio de Cultivo

Recuento de mesófilos aerobios Plate Count Agar
Coliformes Agar Endo
Recuento de Enterococcus VRE

Luego Llevar los cultivos bacterianos a incubar a 30ºC (PCA) y 37 ºC (Endo y VRE) por 24 horas, y
los cultivos de mohos y levaduras a 25ºC de 36 a 48 horas. Luego del periodo de incubación,
realizar el recuento de cada grupo microbiano, reportar los resultados.

TABLA DE NMP (ejemplo)

Número más probable (NMP), también llamada técnica de dilución en tubo, proporciona una
estimación estadística de la densidad microbiana presente en una muestra, con base a que la
probabilidad de obtener tubos con crecimiento positivo disminuye conforme es menor
el volumen de muestra inoculado. La técnica es utilizada principalmente para evaluar la calidad
de alimentos líquidos y aguas. Para realizar el cálculo del NMP, utilice la tabla de McGrady
que presentan los valores de NMP para las posibles combinaciones de tubos positivos, y
ajuste el número de acuerdo a las diluciones hechas en el laboratorio. Utilice la siguiente
ecuación para hacer el cálculo final (debe seleccionar los resultados de las 3 diluciones
mayores donde tenga tubos con crecimiento positivo).

No. microorganismos / mL de agua = NMP x

(1/dilución) Ejemplo:
Dilución R1 R2 R3
-0 1 (t+) 1 (t+) 1 (t+)
10
-1 1 (t+) 1 (t+) 1 (t+)
10
-2 1 (t+) 0 1 (t+)
10
-3 0 1 (t+) 0
10
-4 0 0 0
10
-5 0 0 0
10
Reporte crecimiento positivo (turbidez) y/o formación de gas a las 24 horas. Turbidez (t+) y/o Formación de
gas (g+)

a) Resultado No. característico = 321

b) NMP = 15

c) Cálculo:

No. microorganismos / mL de agua = 15 x (1/10-1) = 1,5 x 102 microorganismos / mL agua

Tabla de McGrady. NMP de 3 réplicas para diluciones sembradas de 1mL, 0.1 mL y 0.01 mL.

Combinación tubos positivos 333 tiene un NMP igual a 140.

Microorganismos Crecimiento Gas

Escherichia coli ATCC 25922 + +*

Enterobacter spp. + +

Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 + +*

Salmonella typhimurium ATCC 14028 + -

Bacterias no fermentadores de lactosa + -

Staphylococcus aureus ATCC 25923 - -

 UNIVERSIDAD DE LA SABANA
INGENIERÍA QUIMICA
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA 2019-II

INFORME No. 6: Análisis microbiológico de calidad de aguas recreacionales

No. del grupo y fecha del laboratorio:

Integrantes:

1. Resultados obtenidos:

1.1. Evaluar el crecimiento bacteriano y realizar el informe de resultados teniendo en cuenta la

tabla de NMP (anexa en este documento). Reporte el crecimiento obtenido para los tratamientos
de la muestra tomada en el lago que fue sembrada en Caldo Brila.

Tabla 1. Recuento del NMP a las 24

horas
Tratamiento A Tratamiento B Tratamiento C
Dilución
RA1 RA2 RA3 RB1 RB2 RB3 RC1 RC2 RC3
-0
10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
Recuento
final
Control 1*
Control 2*
Reporte crecimiento positivo (turbidez) y/o formación de gas a las 24 horas. Turbidez (t+) y/o Formación
de gas (g+)
Control 1 = medio sin incubar. Control 2 = medio inoculado con solución salina.
* Reporte si el medio control se contamino (+) o no se contaminó (-)

Tabla 2. Recuento del NMP a las 48 horas

Tratamiento A Tratamiento B Tratamiento C
Dilución
RA1 RA2 RA3 RB1 RB2 RB3 RC1 RC2 RC3
-0
10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
 Recuento
final
Control 1*
Control 2*
Reporte crecimiento positivo (turbidez) y/o formación de gas a las 48 horas. Turbidez (t+) y/o Formación
de gas (g+)
Control 1 = medio sin incubar. Control 2 = medio inoculado con solución
salina.
* Reporte si el medio control se contamino (+) o no se contaminó
(-)

1.2. Represente en un análisis gráfico los resultados obtenidos en el punto anterior.

1.3. Reporte los resultados obtenidos en la siembra por filtración. Que microorganismos puede
distinguir en cada medio?

2. Análisis de resultados

2.1. Haga el análisis de los resultados obtenidos. El agua es apta para uso recreacional? Es apta
para consumo humano? Consulte las normas vigentes (nacionales e internacionales).

2.2. Los tratamientos son útiles para disminuir los coliformes? Cual es el mecanismo de acción de
cada uno? Discuta.

3. Consulte:

3.1. Cuáles pueden ser los focos de contaminación microbiológica “no deseada” de estás aguas?
Tenga en cuenta que en este tipo de aguas siempre habrá presencia de microorganismos. La
contaminación “no deseada” se refiere a parámetros de salud pública.

3.2. Qué tratamientos se aplican al agua de uso recreacional? Discuta si los considera adecuados
o no. Qué tratamiento propondría ?

3.3. En que consiste la terapía con fagos? Se podría utilizar para elminar microorganismos
coliformes?