DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LA SUCCIONATO

DESHODROGENASA
Cuestionario
¿Por qué se utiliza músculo como material biológico de experimentación?

Porque el músculo estimula el consumo de oxígeno en los tejidos animales donde se hallan algunos
ácidos orgánicos dicarboxílicos (ácido succínico, fumárico, málico y oxalacetico), y porque en el
músculo se lleva a cabo la oxidación del piruvato.

Nombra las enzimas del ciclo de Krebs e indica el tipo de reacción que cataliza para una. ¿Cuáles
actúan como oxido-reducción y cuál es el cofactor?

• Citrato sintasa: Formación de citrato, condensación.

• Aconitasa: Isomerización del citrato a isocitrato.

• Isocitrato deshidrogenasa: Formación del α-cetoglutarato y CO2, primera oxidación.

• Complejo α-cetoglutarato deshidrogenasa: formación de la Succinil CoA y CO2 segunda

oxidación.

• Succinil CoA sintetasa: Formación del succinato.

• Succinato deshidrogenasa: Formación de fumarato, oxidación ligado a FAD.

• Fumarasa: Formación de L-malato.

• Malato deshidrogenasa: Regeneración del oxalacetato, paso final de oxidación

3. En la reacción en la cual la Succinil.CoA es convertida a succinato, una molécula de GTP es

producida. Es sabido que la producción de GTP es equivalente a la de ATP, ¿Cómo puedes explicar
esto considerando los siguientes cambios?

GTP + ADP = GDP + ATP

La enzima nucleosida fosfato sinasa cataliza la transferencia de un grupo fosfato de GDP a ATP
para dar GTP a ATP.

Este proceso se llama fosforilación a nivel de sustrato para diferenciarlo del tipo de reacción para
producir ATP que se acopla a la cadena transportadora de electrones.

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Introducción

El Ciclo de Krebs empieza y acaba con la combinación del acetil coenzima A (acetil Co A) y el
oxalacetato para formar ácido cítrico. El ciclo es alimentado en su funcionamiento por un número
relativamente reducido de metabolitos, procedentes de la degradación previa de las moléculas de
los alimentos y en las que se producen dióxido de carbono, agua y energía. Los alimentos, antes de
poder entrar en el ciclo del ácido cítrico, deben descomponerse en pequeñas unidades llamadas
grupos acetilo. (Alberto, 2012) Cada grupo acetilo (CH3CO) contiene sólo dos átomos de carbono,
junto con hidrógeno y oxígeno. Al comienzo del ciclo, un grupo acetilo se combina con una molécula
con cuatro átomos de carbono llamada oxalacetato, para producir un compuesto con seis átomos
de carbono: el ácido cítrico. En los restantes pasos del ciclo, la molécula de ácido cítrico se
transforma, y pierde dos de sus átomos de carbono, que salen en forma de dióxido de carbono. Así
mismo, se liberan también cuatro electrones. Estos viajan dentro de la célula gracias a una serie de
moléculas transportadoras, la cadena transportadora de electrones, en la que se produce energía
en forma de una molécula rica en energía llamada trifosfato de adenosina, o ATP, antes de
reaccionar con el oxígeno para formar agua. Un producto adicional del ciclo es otra molécula con
gran contenido energético, llamada trifosfato de guanosina, o GTP. La célula utiliza estas moléculas,
el ATP y el GTP, como combustible en muchos procesos. Otra molécula usada como combustible, el
fosfato de creatina, puede servir también para proveer de energía extra a las células del cerebro y
de los músculos. La molécula original de oxalacetato se regenera al final del ciclo. Esta molécula
puede reaccionar entonces con otro grupo acetilo y comenzar el ciclo de nuevo. En cada giro del
ciclo se produce energía. (Álvaro, 2018)

Fundamento

El ciclo de Krebs (también llamado ciclo del ácido cítrico o ciclo de los ácidos tricarboxílicos) es una
ruta metabólica, es decir, una sucesión de reacciones químicas, que forma parte de la respiración
celular en todas las células aeróbicas. En organismos aeróbicos, el ciclo de Krebs es parte de la vía
catabólica que realiza la oxidación de glúcidos, ácidos grasos y aminoácidos hasta producir CO2,
liberando energía en forma utilizable (poder reductor y GTP) (Lehninger, Nelson & Cox, 2006).

El metabolismo oxidativo de glúcidos, grasas y proteínas frecuentemente se divide en tres etapas,

de las cuales, el ciclo de Krebs supone la segunda. En la primera etapa, los carbonos de estas
macromoléculas dan lugar a moléculas de acetil-CoA de dos carbonos, e incluye las vías catabólicas
de aminoácidos (p. ej. desaminación oxidativa), la beta oxidación de ácidos grasos y la glucólisis. La
tercera etapa es la fosforilación oxidativa, en la cual el poder reductor (NADH y FADH2) generado
se emplea para la síntesis de ATP según la teoría del acoplamiento quimiosmótico. El ciclo de Krebs
también proporciona precursores para muchas biomoléculas, como ciertos aminoácidos. Por ello se
considera una vía anfibólica, es decir, catabólica y anabólica al mismo tiempo.

Cumple funciones tanto catabólicas como anabólicas, es anfibólico. Como ruta catabólica da
comienzo a la “oxidación final” de los sustratos de energía. Muchas rutas metabólicas desembocan
en productos intermedios del ciclo de Krebs o liberan metabolitos tales como piruvato o acetil-CoA
que pueden formar parte asimismo del ciclo. Una vez allí, los átomos de carbono son oxidados y
transformados en CO2. Los equivalentes de reducción obtenidos son empleados luego en la
fosforilación oxidativa, es decir para la producción aeróbica de ATP (Lehninger, Nelson & Cox, 2006).

En las mitocondrias, los niveles de concentración de productos intermedios del ciclo Krebs son
extremadamente bajos. Si bien durante la oxidación de acetil-CoA a CO2 éstos se regeneran
continuamente, su nivel de concentración permanece generalmente constante. Las rutas
metabólicas anabólicas que toman productos intermedios del ciclo de Krebs consumirían en poco
tiempo las pequeñas cantidades presentes en las mitocondrias en caso de que no ingresen más
metabolitos al circuito para reemplazar a las sustancias ya consumidas. Las transformaciones que
nutren al ciclo de Krebs obedeciendo a este mecanismo son denominadas reacciones anapleróticas.
La contrapartida está constituida por reacciones catapleróticas, es decir reacciones que extraen del
ciclo los metabolitos superfluos. En esta categoría se encuentran las transaminaciones, reacciones
que consumen oxalacetato y 2-oxoglutarato (Voet, Voet & Prat, 2016).

La degradación de la mayoría de los aminoácidos es de carácter anaplerótico, ya que de ella

surgen intermediarios del ciclo de Krebs o piruvato). Es por ello por lo que se puede afirmar que
este proceso constituye la base de la gluconeogénesis. Uno de los pasos anapleróticos más
importantes del metabolismo animal consiste en la transformación de piruvato en oxalacetato.
Esta reacción consume ATP y es catalizada por medio del piruvato carboxilasa (Gullans, 2018). Así
es que sustancias como los aminoácidos liberadores de piruvato y lactato son empleadas en el
proceso de gluconeogénesis.

El ciclo de Krebs no sólo absorbe acetilCoA resultante de la degradación de ácidos grasos, sino que
también aporta el material necesario para la biosíntesis de ácidos grasos e isoprenoides. La acetil-
CoA, producida en la matriz de las mitocondrias gracias a la acción del piruvato deshidrogenasa, es
incapaz de atravesar la membrana mitocondrial interior. Esto ocasiona que el resto acetilo y el
oxalacetato se condensen por medio del citrato sintasa y se conviertan en citrato, que es luego
expulsado de la mitocondria al tiempo que ingresa malato por medio de un antiportador. Una vez
en el citoplasma, el citrato se divide en acetil-CoA y oxalacetato por medio del citrato liasa, una
enzima que consume ATP. La malato deshidrogenasa del citoplasma reduce el oxalacetato a malato,
que es transportado de regreso al interior de la mitocondria a través del antiportador mencionado
anteriormente. El malato también puede ser oxidado y transformado en piruvato mediante la
“enzima malato” (Gullans, 2018), en un proceso de descarboxilación. El NADPH resultante es
utilizado asimismo en la biosíntesis de ácidos grasos.

Succinato deshidrogenasa

Espinoza (2015), menciona que el succinato deshidrogenasa es una enzima clasificada dentro del
grupo de las oxidorreductasas, cataliza una reacción muy importante en el metabolismo oxidativo
de la célula: la conversión de succinato en fumarato.

Esta se localiza en células eucariontes en la membrana mitocondrial interna. El H2 cedido por el

succinato puede ser transferido del FADH2 a un colorante susceptible como el azul de metileno que
al cambiar su estado redox pasa de coloreado a incoloro o viceversa.
El succinato deshidrogenasa remueve 2H+ y 2 electrones del succinato para formar fumarato y la
coenzima reducida FADH2. La enzima está sujeta a una poderosa inhibición competitiva por partes
de reactivos como el fenol lo cual constituye una manera de inhibir la actividad de la enzima a
nivel del laboratorio.

El azul de metileno tiene la función de ser receptor o el aceptor de electrones del complejo
succinato FADH2. El ácido succínico tiene la función de reducir al azul de metileno, ya que este es
reducido en lugar del succinato (Bravo, 2018).

Discusión.

Se llevó a cabo la práctica “Determinación de la actividad del succinato deshidrogenasa” con la

finalidad de comprender el funcionamiento del Ciclo de Krebs por medio de la actividad de esta
enzima involucrada en el ciclo.

El succinato deshidrogenasa es una enzima clasificada dentro del grupo de las oxidorreductasas,
cataliza una reacción muy importante en el metabolismo oxidativo de la célula: la conversión del
succinato en fumarato. (Espinosa, 2015). En esta práctica se realizó la determinación de la
actividad del succinato deshidrogenasa, exponiendo diferentes tejidos con la disolución de ácido
succínico, ácido tricloroacético y azul de metileno para observar los cambios producidos por la
enzima en cada tejido.

La función del ácido succínico ayuda reducir el azul de metileno en lugar del succinato. (Alberto,
2012). En cambio, el fenol ayudo a inhibir la actividad de la enzima ya que ocurre una
desnaturalización (Espinosa, 2015). Se adicionó el ácido succínico y posteriormente se separó la
sustancia en dos partes iguales, a ambas se les agrego ácido tricloroacético para su
desnaturalización.
Cuando el azul de metileno se encuentra en contacto con el oxígeno del aire, se oxida tomando la
coloración azul y formando peróxido de hidrógeno, por esta razón el sistema se aísla mediante una
capa de aceite mineral (Bravo, 2018). Para evitar esta oxidación, se administró un mililitro de
aceite a cada tubo.

La enzima succinato deshidrogenasa remueve 2 protones y 2 electrones del succinato para dar
origen al fumarato, oxidación asociada a la coenzima FAD, que transfiere los electrones a la
cadena de transporte de electrones (Bravo, 2018). El H2 cedido por el succinato puede ser
transferido del FADH2 a un colorante susceptible como el azul de metileno (C16H18ClN3S) que al
cambiar su estado redox pasa de coloreado a incoloro (reducido) o azul (oxidado) (Sánchez, 2016).
Algunos de los tejidos empleados mostraron viraje azul posteriormente al agregar el azul de
metileno y llevar a baño maría. Los tejidos que mostraron viraje azul fueron el muslo de pollo y
músculo de cerdo, lo que nos muestra una oxidación, en cambio el corazón de pollo, hígado de
pollo, músculo de res, hígado de res, e hígado de cerdo mostraron una reducción.

El hígado regula la concentración de glucosa que hay presente en la sangre circulante. Llevando a
cabo: 1) Almacenamiento de glucosa (glucogenolisis/génesis): proceso mediado por la insulina
almacena una cantidad limitada de glucógeno (10% del peso del hígado). 2) Gluconeogénesis se da
cuando las reservas hepáticas de glucógeno se han terminado, el hepatocito forma nueva glucosa
a partir de los intermediarios del ciclo de Krebs y la glucólisis (Albaladejo, 2012). En el hígado de
res, cerdo y pollo se observa una diferencia considerable ya que en los dos primeros se puede
observar una coloración mediana en cambio el ultimo muestra una mayor presencia de succinato
deshidrogenasa, lo que nos dice que las reservas hepáticas del glucógeno se terminaron entrando
así esta enzima para producir glucosa.

En el músculo cardiaco son tres los elementos fundamentales que involucran su metabolismo: 1)
utilización de sustrato, consistente en la captación celular de ácidos grasos libres de cadena corta y
glucosa, su metabolización por β-oxidación, glicólisis y la incorporación de los metabolitos
resultantes al ciclo de Krebs. 2) Síntesis de ATP mediante fosforilación oxidativa por la cadena
respiratoria mitocondrial. 3) Transferencia de energía desde el ATP a la molécula “reservorio”
cretina, mediante la creatina quinasa mitocondrial (Castro, 2010). Se observó mayor presencia de
succinato deshidrogenasa en el corazón de pollo, lo que nos muestra que este es uno de los
metabolitos del ciclo de Krebs que se utiliza en su metabolismo.

En el músculo rojo (fibras tipo I y IIA), pueden remover el lactato de la sangre y oxidarlo para la
producción de energía, mientras que el músculo blanco (fibras tipo IIB) puede tener la capacidad
de sintetizar glucosa a partir del lactato. Los principales reguladores hormonales de la actividad
enzimática en el músculo esquelético, son la insulina, la cual permite la captación de glucosa y su
posterior conversión a glucógeno, y la epinefrina, que estimula la producción de AMP cíclico
(cAMP) (Friedman, 2002). Dado que en musculo no se da el ciclo de Krebs, se observó la nula
presencia del succinato deshidrogenasa en los músculos analizados