Universidad Santo Tomás

PROTOCOLO PARA EXTRACCIÓN DE ADN DE SANGRE TOTAL
Luis Colihuinca Llancapan

Paso 1. En un tubo eppendorf de 1,5 ml. ppendorf Añadir 900ul solución lisis celular 300ul sangre con EDTA

Paso 4. Vortear hasta resuspender el pellet formado. Luego…
Agregar 300ul sol. Lisis nuclear

Incubar a Tº ambiente por10 min. Invirtiendo 2 a 3 veces el tubo. Paso 2. Centrifugar a 14000rpm por 30s.

Mezclar bien e incubar el tubo a 37º C ncubar por 15 min. Paso 5. (Paso opcional)
Agregar 1,5ul de solución RNasas

Invertir 3 a5 veces el tubo e incubar a 37ºC por 15 min. Paso 3. Paso 6. Descartar el máximo de sobrenadante. Tratando de no remover el pellet formado en el fondo del tubo.
Añadir 100ul de solución precipitación de proteínas

Vortear vigorosamente 10 10-20 seg.

Diagnóstico molecular

Página 1

Paso 9. Añadir 300ul etanol al 70% Paso 8. de rehidratación Paso 10. Descartar el sobrenadante y dejar escurrir boca abajo sobre papel absorbente hasta secar. Paso 11 Descartar el sobrenadante.Universidad Santo Tomás Paso 7.5 ml Añadir 300ul de isopropanol Paso 12. Centrifugar a 14000rpm por 3 min. Paso 14 Añadir 100ul de sol. Mezclar por inversión hasta soltar el pellet. Paso 13. Hebra de ADN. Transferir 300ul del sobrenadante de del paso 7 y mezclar gentilmente hasta ver la hebra de ADN. Se incuba a 60ºC por 60min. En un nuevo tubo eppendorf de 1. muestr Diagnóstico molecular Página 2 . Finalmente se guarda la muestra. Centrifugar a 14000rpm por 3 min. Centrifugar a 14000 rpm por 3 min.

Centrifugar 14000 rpm por 1 min. En un tubo eppendorf de 1. Paso 7. Paso 3. y 200ul de muestra. Paso 5. Traspasar la columna a otro tubo colector Tubo Nº 2 Paso 6. Paso 2. Añadir 450ul de buffer de lavado (Wash buffer) Centrifugar 14000 rpm por 1 min.Universidad Santo Tomás PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN VIRAL DE PLASMA A TRAVÉS DE COLUMNAS SÍLICA. Luis Colihuinca Llancapan Paso 1. Agregar 500ul de buffer 1 de lavado (Inhibitor buffer) Centrifugar 14000 rpm por 1 min.5ml. Añadir 100ul de buffer lisis Traspasar la columna a otro tubo colector Tubo Nº3 Paso 8. Paso 4. Incubar a 72ºC por 10 min. Montar columna sobre un tubo colector. Añadir 200ul buffer lisis + 4ul de poli-A + 50ul de proteinasa K. 4000 Diagnóstico molecular Página 3 .

Centrifugar 14000 rpm por 1 min. Diagnóstico molecular Página 4 . Para extraer todo el buffer en la columna. Agregar 50ul de buffer de elusión (Elution Buffer) Tubo Nº 4 Paso 10. Paso 12. Paso 13.Universidad Santo Tomás Paso 9. Traspasar la columna a otro tubo colector. Descartar la columna y guardar el eluído. Paso 11. Añadir 450ul de buffer de lavado (Wash buffer) Centrifugar 14000 rpm por 1 min. Colocar la columna en otro tubo eppendorf. Traspasar la columna a un nuevo tubo eppendorf ADN o ARN Centrifugar 14000 rpm por 1 min.

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