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PROTOCOLO PARA EXTRACCIÓN de ADN

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03/16/2015

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Universidad Santo Tomás

PROTOCOLO PARA EXTRACCIÓN DE ADN DE SANGRE TOTAL
Luis Colihuinca Llancapan

Paso 1. En un tubo eppendorf de 1,5 ml. ppendorf Añadir 900ul solución lisis celular 300ul sangre con EDTA

Paso 4. Vortear hasta resuspender el pellet formado. Luego…
Agregar 300ul sol. Lisis nuclear

Incubar a Tº ambiente por10 min. Invirtiendo 2 a 3 veces el tubo. Paso 2. Centrifugar a 14000rpm por 30s.

Mezclar bien e incubar el tubo a 37º C ncubar por 15 min. Paso 5. (Paso opcional)
Agregar 1,5ul de solución RNasas

Invertir 3 a5 veces el tubo e incubar a 37ºC por 15 min. Paso 3. Paso 6. Descartar el máximo de sobrenadante. Tratando de no remover el pellet formado en el fondo del tubo.
Añadir 100ul de solución precipitación de proteínas

Vortear vigorosamente 10 10-20 seg.

Diagnóstico molecular

Página 1

Mezclar por inversión hasta soltar el pellet. Paso 9. Paso 14 Añadir 100ul de sol. de rehidratación Paso 10. Finalmente se guarda la muestra. Se incuba a 60ºC por 60min. Descartar el sobrenadante y dejar escurrir boca abajo sobre papel absorbente hasta secar. Centrifugar a 14000rpm por 3 min. Transferir 300ul del sobrenadante de del paso 7 y mezclar gentilmente hasta ver la hebra de ADN. Centrifugar a 14000rpm por 3 min. Paso 13. muestr Diagnóstico molecular Página 2 . En un nuevo tubo eppendorf de 1. Centrifugar a 14000 rpm por 3 min. Hebra de ADN. Paso 11 Descartar el sobrenadante.Universidad Santo Tomás Paso 7. Añadir 300ul etanol al 70% Paso 8.5 ml Añadir 300ul de isopropanol Paso 12.

Añadir 450ul de buffer de lavado (Wash buffer) Centrifugar 14000 rpm por 1 min. 4000 Diagnóstico molecular Página 3 . Añadir 200ul buffer lisis + 4ul de poli-A + 50ul de proteinasa K. Traspasar la columna a otro tubo colector Tubo Nº 2 Paso 6. En un tubo eppendorf de 1. Añadir 100ul de buffer lisis Traspasar la columna a otro tubo colector Tubo Nº3 Paso 8. Centrifugar 14000 rpm por 1 min. y 200ul de muestra. Paso 4. Paso 2. Paso 7.Universidad Santo Tomás PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN VIRAL DE PLASMA A TRAVÉS DE COLUMNAS SÍLICA. Luis Colihuinca Llancapan Paso 1. Incubar a 72ºC por 10 min.5ml. Agregar 500ul de buffer 1 de lavado (Inhibitor buffer) Centrifugar 14000 rpm por 1 min. Paso 3. Paso 5. Montar columna sobre un tubo colector.

Paso 11.Universidad Santo Tomás Paso 9. Añadir 450ul de buffer de lavado (Wash buffer) Centrifugar 14000 rpm por 1 min. Diagnóstico molecular Página 4 . Agregar 50ul de buffer de elusión (Elution Buffer) Tubo Nº 4 Paso 10. Paso 12. Centrifugar 14000 rpm por 1 min. Colocar la columna en otro tubo eppendorf. Traspasar la columna a otro tubo colector. Paso 13. Descartar la columna y guardar el eluído. Para extraer todo el buffer en la columna. Traspasar la columna a un nuevo tubo eppendorf ADN o ARN Centrifugar 14000 rpm por 1 min.

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