Universidad Santo Tomás

PROTOCOLO PARA EXTRACCIÓN DE ADN DE SANGRE TOTAL
Luis Colihuinca Llancapan

Paso 1. En un tubo eppendorf de 1,5 ml. ppendorf Añadir 900ul solución lisis celular 300ul sangre con EDTA

Paso 4. Vortear hasta resuspender el pellet formado. Luego…
Agregar 300ul sol. Lisis nuclear

Incubar a Tº ambiente por10 min. Invirtiendo 2 a 3 veces el tubo. Paso 2. Centrifugar a 14000rpm por 30s.

Mezclar bien e incubar el tubo a 37º C ncubar por 15 min. Paso 5. (Paso opcional)
Agregar 1,5ul de solución RNasas

Invertir 3 a5 veces el tubo e incubar a 37ºC por 15 min. Paso 3. Paso 6. Descartar el máximo de sobrenadante. Tratando de no remover el pellet formado en el fondo del tubo.
Añadir 100ul de solución precipitación de proteínas

Vortear vigorosamente 10 10-20 seg.

Diagnóstico molecular

Página 1

Paso 14 Añadir 100ul de sol. En un nuevo tubo eppendorf de 1. Mezclar por inversión hasta soltar el pellet. Paso 9.Universidad Santo Tomás Paso 7. Se incuba a 60ºC por 60min. muestr Diagnóstico molecular Página 2 . Finalmente se guarda la muestra. Transferir 300ul del sobrenadante de del paso 7 y mezclar gentilmente hasta ver la hebra de ADN. Hebra de ADN. Centrifugar a 14000rpm por 3 min.5 ml Añadir 300ul de isopropanol Paso 12. Descartar el sobrenadante y dejar escurrir boca abajo sobre papel absorbente hasta secar. de rehidratación Paso 10. Paso 11 Descartar el sobrenadante. Centrifugar a 14000rpm por 3 min. Paso 13. Añadir 300ul etanol al 70% Paso 8. Centrifugar a 14000 rpm por 3 min.

Traspasar la columna a otro tubo colector Tubo Nº 2 Paso 6.Universidad Santo Tomás PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN VIRAL DE PLASMA A TRAVÉS DE COLUMNAS SÍLICA. Luis Colihuinca Llancapan Paso 1.5ml. Incubar a 72ºC por 10 min. Paso 5. Paso 7. En un tubo eppendorf de 1. 4000 Diagnóstico molecular Página 3 . Añadir 450ul de buffer de lavado (Wash buffer) Centrifugar 14000 rpm por 1 min. Agregar 500ul de buffer 1 de lavado (Inhibitor buffer) Centrifugar 14000 rpm por 1 min. y 200ul de muestra. Añadir 100ul de buffer lisis Traspasar la columna a otro tubo colector Tubo Nº3 Paso 8. Paso 3. Centrifugar 14000 rpm por 1 min. Paso 4. Paso 2. Añadir 200ul buffer lisis + 4ul de poli-A + 50ul de proteinasa K. Montar columna sobre un tubo colector.

Diagnóstico molecular Página 4 . Colocar la columna en otro tubo eppendorf. Centrifugar 14000 rpm por 1 min. Traspasar la columna a un nuevo tubo eppendorf ADN o ARN Centrifugar 14000 rpm por 1 min. Paso 11. Agregar 50ul de buffer de elusión (Elution Buffer) Tubo Nº 4 Paso 10. Paso 12. Paso 13. Traspasar la columna a otro tubo colector.Universidad Santo Tomás Paso 9. Para extraer todo el buffer en la columna. Descartar la columna y guardar el eluído. Añadir 450ul de buffer de lavado (Wash buffer) Centrifugar 14000 rpm por 1 min.

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