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2. Descripción de la actividad
Momento 1.
Materiales:
- Botella plástica o de vidrio de boca ancha (pueden ser frascos de mayonesa
o salsas grandes). El material tiene que ser completamente transparente
para visualizar todos los fenómenos.
- Lodo negro (provenientes de una Planta de Tratamiento de Aguas
Residuales).
- Agua de charca, estancada de varios días o de lago.
- Papel periódico picado, materia orgánica, hojas secas de árboles.
- Plástico de Vinipel o bolsa plástica transparente.
- Puntilla de hierro o hierro rallado.
Procedimiento:
1. En el recipiente deben colocar en el fondo una mezcla del fango o lodo
recolectado, junto con las tiras de papel periódico, las hojas secas,
procurando que quede una capa compacta de lodo (sin formación de
burbujas). La mezcla debe ser homogéneo y alcanzar una altura de 10 cm.
2. Agregar la puntilla de hierro o el hierro rallado.
3. Agregar cuidadosamente el agua de charca hasta que quede casi lleno el
frasco, dejando un espacio de 4 cm aproximadamente de aire. Nota: Al
agregarlo contra la pared del plástico evita el levantamiento del lodo.
4. Disponga el plástico de Vinipel para tapar el recipiente y dejar en un sitio
donde reciba abundante luz solar. Puede acelerar el proceso colocando una
fuente de luz amarilla, pero tenga en cuenta que esta luz es de alto consumo
energético y puede repercutir en la cuenta de la luz. Ver Figura a
continuación:
Momento 2.
1. Alistar los elementos de protección personal (bata, guantes desechables de
nitrilo y cofia) y demás implementos que sean requeridos en este documento y
por el tutor asignado.
a. Una bolsa transparente (puede ser de sello hermético).
b. Una tajada de pan blanco o integral, preferiblemente casero.
c. Cinco gramos de azúcar (un cubo o unidades para cafetería).
d. Levadura de pan.
e. Un empaque de yogurt con pro-bióticos sin limpiar.
f. Cincuenta mililitros de agua de charco o cuerpo de agua natural
(aproximadamente un vaso tintero).
g. Diez gramos de suelo.
h. Tres semillas de girasol, ajonjolí o marihuana. Nota: Las semillas no
pueden estar tostadas o quemadas.
i. Una hoja sana de cualquier planta ornamental que presente textura lisa.
j. Un lápiz marcador de vidrio (ej. Sharpie).
k. Cinta adhesiva transparente.
2. Asistir a la primera sesión práctica de laboratorio de acuerdo al lugar, fecha y
hora pre-establecidos en la inscripción.
3. Observar video sobre bioseguridad que será colocado por el tutor o el asistente
de laboratorio.
4. Presentar cuestionario corto (qüiz) sobre bioseguridad (preparado por el tutor
asignado).
5. Reconocer los implementos facilitados por el tutor de prácticas y técnico de
laboratorio.
a. Por estaciones:
- Dos vasos de precipitado de 50-100 mL con 20 mL de agua
destilada estéril. X5
- Agitador de vidrio o espátula. X5
- Gotero estéril. X5
- Portaobjetos y cubreobjetos. X5
- Asa bacteriológica de punta redonda. X5
- Mechero de alcohol o gas. X5
- Azul de lactofenol (reactivo). X5
- Microscopio de luz. X5
b. Por todo el grupo:
- Un vaso precipitado de 100 mL con 90 mL de agua destilada
estéril.
- Un recipiente de plástico o vidrio con 20 mL de etanol al 70 %.
- Un recipiente de plástico o vidrio con 20 mL de hipoclorito de sodio
(o clorox) al 3 %.
- Cuatro tubos de ensayo con 9 mL de agua destilada estéril.
- Cinco pipetas de vidrio de 1 mL estériles.
- Azul de metileno (reactivo).
- Metanol o etanol (reactivo).
- Incubadora ajustada a 25 °C.
- Incubadora ajustada a 37 °C.
- Balanza gramera o analítica.
- Medio gramo de peptona pancréatica de caseína (reactivo).
- Ocho cajas de Petri con agar nutritivo (AN).
- Un rastrillo de plástico estéril.
- Unas pinzas metálicas estériles.
- Láminas para cortar o bisturí.
- Una caja de Petri estéril vacía.
- Dos cajas de Petri con Agar Sabouraud y dextrosa (ASD).
- Embudo estéril.
- Papel filtro.
- Dos escobillones estériles.
- Dos tubos de ensayo con agua destilada estéril.
- Dos asas micológica de punta recta.
- Cristal violeta para Gram (reactivo).
- Lugol para Gram (reactivo).
- Alcohol acetona para Gram (reactivo).
- Fuscina para Gram (reactivo).
6. El tutor asignado distribuirá el grupo en 5 estaciones (integrado por mínimo 2
estudiantes). En caso de presentar un grupo pequeño, el tutor se encargará de
distribuir equitativamente las actividades segmentadas por estaciones.
7. Realizar práctica de laboratorio:
a. Crecimiento de mohos en el pan. Nota: todas las estaciones realizan esta
actividad.
i. Disuelva los 2.5 g de azúcar de mesa en 20 mL de agua destilada
(Nota: Puede preparar una disolución única para todo el grupo de
laboratorio).
ii. Adicione 20 gotas de esta disolución en diferentes partes del pan
tajado.
iii. Introduzca la muestra que acaba de tratar en la bolsa
transparente, y ciérrela.
iv. Incube a temperatura ambiente en un lugar oscuro (Nota: Si se
encuentra en un ambiente de clima frío, utilice una incubadora de
18-25 °C)
b. Observación de levaduras. Nota: todas las estaciones realizan esta
actividad.
i. Disuelva 2.5 g de azúcar de mesa y aproximadamente 5 g de
levadura de pan en 20 mL de agua destilada (Nota: Puede
preparar una disolución única para todo el grupo de laboratorio).
ii. Incube la disolución anterior a 37 °C por 15 min.
iii. Tome una muestra de esta disolución y dispóngala sobre un
portaobjetos. Puede asistirse de un asa bacteriológica de punta
redonda estéril o un agitador de vidrio estéril.
iv. Adicione una gota de azul de metileno, deje actuar por 3 min y
disponga un cubreobjetos sobre esta muestra (Nota: Puede limpiar
el exceso con la asistencia de papel toalla, si se evidencia
alrededor del cubreobjetos).
v. Observe en el microscopio utilizando los 4 objetivos: 4x, 10x, 40x
y 100x. Dibuje y señale estructuras celulares (gemas, pared y
núcleo).
c. Observación de bacterias probióticas. Nota: todas las estaciones realizan
esta actividad.
i. Tome una gota de yogurt y mézclela con una gota de agua
destilada estéril sobre un portaobjetos. Puede asistirse de un asa
redonda.
ii. Extienda la muestra y séquela completamente. Puede asistirse del
calor del mechero, evitando sobrecalentar la muestra.
iii. Cubra la muestra con metanol o etanol durante 10 s para limpiar
la parte grasa.
iv. Escurra el alcohol adicionado y deje secar a temperatura ambiente.
No vaya a utilizar el mechero.
v. Cuando la muestra esté completamente seca, cúbrala con azul de
metileno y deje actuar por 2 min.
vi. Elimine el exceso de azul de metileno y deje secar nuevamente.
vii. Observe en el microscopio utilizando los 4 objetivos: 4x, 10x, 40x
y 100x. Dibuje y señale los diferentes grupos bacterianos (cocos y
bacilos).
d. Actividades segmentadas por estaciones:
i. Estación 1: Bacterias en el suelo.
1. Pese 10 g de suelo y mézclelos con 90 mL de agua destilada
estéril. Adicione 0.1 g de peptona pancréatica de caseína.
Agite gentilmente por 10 minutos e incube a 37 °C por 30 min.
Nota: Esta preparación corresponderá a la dilución 100.
2. Agite la dilución 100. Tome 1 mL y mézclelo en 9 mL de agua
destilada estéril. Nota: Esta corresponderá a la dilución 10-1.
3. Repita el paso anterior utilizando la dilución 10-1 como partida
para preparar la dilución 10-2. Realice el mismo procedimiento
hasta obtener la dilución 10-4. Nota: siempre utilice una pipeta
de vidrio diferente para cada dilución, y agite gentilmente
antes de tomar la respectiva muestra.
4. Tome 0.1 mL de la dilución 10-4 y dispénsela en una caja de
Petri con agar nutritivo (AN). Realice un duplicado.
5. Utilizando la misma pipeta, tome 0.1 mL de la dilución 10-3 y
dispénsela en una caja de Petri con AN. Realice un duplicado.
6. Utilizando la misma pipeta, tome 0.1 mL de la dilución 100 y
dispénsela en una caja de Petri con agar nutritivo. Realice un
duplicado.
7. Disperse cada gota sobre la superficie completa del medio de
cultivo. Asista esta labor con un rastrillo de plástico estéril
para todas las cajas de Petri utilizadas. Nota: disperse
primero aquellos montajes correspondientes a la dilución
mayor. Primero las dos cajas de 10-4, luego las dos de 10-3 y
finalmente las dos de 100.
8. Marque las tapas de las cajas de Petri e incube a 37 °C por 2
días. Nota: el docente a cargo o el técnico de laboratorio se
encargará de sacarlas de la incubadora y ponerlas en
refrigeración hasta la segunda sesión.
ii. Estación 2: Recuperación de hongos acuáticos verdaderos.
1. Limpie las semillas que trajo con agua destilada estéril
durante 30 s, puede asistirse de unas pinzas estériles.
Manténgase cerca de un mechero.
2. Realice un segundo lavado con etanol durante 30 s y
rápidamente elimine el exceso con agua. Manténgase cerca
de un mechero.
3. Realice cortes de las semillas utilizando láminas o bisturí
estéril. Manténgase cerca de un mechero.
4. Disponga las semillas en una caja de Petri vacía y coloque 20
mL de la muestra de agua que trajo. Las semillas servirán
como cebo para los hongos acuáticos, que presentan flagelo
y por quimiotaxis se desplazan y colonizan la semilla.
5. Incube a temperatura ambiente en un lugar oscuro por una
semana (Nota: Estos hongos son altamente sensibles a los
cambios de temperatura, asegúrese de incubar en
condiciones similares al de la muestra).
iii. Estación 3: Recuperación de hongos transitorios por filtración.
1. Disponga el papel filtro en un embudo estéril y permita fluir
la muestra de agua que trajo a través del mismo. Nota: No
es necesario utiliza un sistema de filtración al vacío, pero es
recomendable usarlo si tiene uno a su disposición.
2. Transfiera cuidadosamente el papel filtro sobre una caja de
Petri con ASD. Nota: Si al extender el filtro se observa que
éste presenta un tamaño mayor que el diámetro de la caja
de Petri, realice cortes asistiéndose de una lámina o un
bisturí (estéril).
3. Incube a 25 C por una semana.
iv. Estación 4: Aislamiento de bacterias habitantes de la piel.
1. Marque una división en una caja de Petri con AN.
2. Humedezca un escobillón estéril en una solución de agua
destilada estéril.
3. Pase el escobillón por toda la mano, sin lavar. Manténgase
cerca de un mechero.
4. Extienda el escobillón sobre la primera mitad de la caja de
Petri con AN. Manténgase cerca de un mechero.
5. Lávese la misma mano con jabón.
6. Realice el mismo procedimiento anterior en esta mano y
realice el extendido en la segunda mitad del medio de
cultivo. Manténgase cerca de un mechero.
7. Incube a 37 ºC por 2 días.
v. Estación 5: Aislamiento de microorganismos endófitos.
1. Marque una división en una caja de Petri con AN, y en una
caja de Petri con ASD.
2. Limpie la hoja de planta que trajo con agua durante 30 s
para remover polvo y tierra, puede asistirse de unas pinzas
estériles. Manténgase cerca de un mechero.
3. Realice un segundo lavado con etanol al 70 % (v/v) durante
30 s y rápidamente elimine el exceso con agua. Manténgase
cerca de un mechero.
4. Realice un tercer lavado con hipoclorito de sodio al 3 % (v/v)
durante 15 s y rápidamente elimine el exceso con abundante
agua. Manténgase cerca de un mechero.
5. Realice 6 cortes de la hoja de 1 cm x 1 cm. Manténgase
cerca de un mechero.
6. Realice una impresión de los 3 cortes sobre la primera mitad
de la caja de Petri con AN, y luego dispóngalas en la segunda
mitad.
7. Realice el mismo procedimiento con los otros 3 cortes en la
caja de Petri con ADS.
Momento 3.
1. Asistir a la segunda sesión práctica de laboratorio de acuerdo al lugar, fecha y
hora pre-establecidos en la inscripción.
2. Continuar con la práctica de laboratorio:
a. Crecimiento de mohos en el pan. Nota: todas las estaciones realizan esta
actividad.
i. Disponga un trozo de cinta adhesiva de los extremos entre los dedos
pulgar y corazón, exponiendo el lado adhesivo hacia afuera.
ii. Utilice el lado adhesivo de la cinta sobre el moho que creció en el
pan, asístase del dedo índice presionando suavemente sobre el lado
no-adhesivo.
iii. Agregue una gota de azul de lactofenol extendida sobre un
portaobjetos, y disponga suavemente la cinta sobre este extendido.
iv. Observe en el microscopio utilizando los 4 objetivos: 4x, 10x, 40x y
100x. Dibuje y señale estructuras celulares (hifa, septo y
esporas/conidios).
b. Actividades segmentadas por estación.
i. Estación 1: Bacterias en el suelo.
1. Realice conteo de unidades formadoras de colonia (UFC) y
repórtelos en el siguiente cuadro:
Dilución Conteo Reporte
10-1
10-4
10-5
Notas: Tenga en cuenta que la técnica utilizada de siembra
disminuye un grado el factor de dilución, de esta manera el
conteo que realice para la caja 10-4, corresponderá a la
dilución 10-5. Cuando el conteo es incontable se coloca >1600
UFC. El reporte se realiza multiplicando el conteo por el factor
de dilución (el número inverso de la dilución).
2. Informe sus resultados al grupo de clase.
ii. Estación 2: Recuperación de hongos acuáticos.
1. Revise el crecimiento micelial blanco observado alrededor de
las semillas.
2. Realice un corte pequeño y dispóngalo sobre una gota de azul
de lactofenol en un portaobjetos, asístase de un asa
micológica de punta recta. Deje actuar por 3 min y coloque un
cubreobjetos.
3. Observe en el microscopio utilizando los 4 objetivos: 4x, 10x,
40x y 100x. Dibuje y señale estructuras celulares (hifa, septo
y estructuras reproductivas).
4. Informe sus resultados al grupo de clase.
iii. Estación 3: Recuperación de hongos transitorios por filtración.
1. Revise el crecimiento micelial observado sobre el papel filtro.
2. Realice un conteo de morfotipos (colonias similares).
3. Tome una muestra pequeña de micelio del morfotipo más
abundante, asístase de un asa micológica de punta recta.
4. Disponga la muestra sobre una gota de azul de lactofenol en
un portaobjetos, asístase de un asa micológica de punta recta.
Deje actuar por 3 min y coloque un cubreobjetos.
5. Observe en el microscopio utilizando los 4 objetivos: 4x, 10x,
40x y 100x. Dibuje y señale estructuras celulares (hifa, septo
y estructuras reproductivas).
6. Informe sus resultados al grupo de clase.
iv. Estación 4: Aislamiento de bacterias habitantes de la piel.
1. Revise el crecimiento bacteriano observado en las dos
mitades.
2. Realice un conteo de morfotipos (colonias similares).
3. Tome 1-2 colonia(s) del morfotipo más abundante, asístase
de un asa bacteriológica de punta redonda.
4. Extienda la(s) colonia(s) sobre una gota de agua en un
portaobjetos y seque completamente. Puede asistirse del calor
del mechero, evitando sobrecalentar la muestra.
5. Realice tinción de Gram
a. Cubra la muestra con cristal violeta y deje actuar por 1
min. Elimine el exceso y lave con agua.
b. Aplique lugol a la muestra y deje actuar por 1 min.
Elimine el exceso y lave con agua.
c. Adicione alcohol acetona y deje actuar por 30 s. Elimine
el exceso y lave con agua.
d. Finalmente cubra con fuscina o safranina y deje actuar
por 15 s. Elimine el exceso y lave con agua.
6. Observe en el microscopio utilizando los 4 objetivos: 4x, 10x,
40x y 100x. Dibuje y señale estructuras celulares (forma de
cocos o bacilos, y Gram).
7. Informe sus resultados al grupo de clase.
v. Estación 5: Aislamiento de microorganismos endófitos.
1. Revise el crecimiento observado alrededor de los cortes
foliares.
2. Realice el procedimiento estipulado en la estación 3 o 4
dependiendo del crecimiento que haya obtenido. Solamente
tome morfotipos que provienen del corte foliar y evite aquellos
que se repiten en la mitad donde se hizo la impresión (Estos
aislamientos corresponden a microorganismos epífitos y no
endófitos).
3. Informe sus resultados al grupo de clase.
3. Consolide todos los resultados y presente un informe de acuerdo a la fecha
estipulada por el docente a cargo.
El informe debe contener lo siguiente:
a. Dibujos de “Crecimiento de mohos en el pan” y “Observación de
levaduras”, “Observación de bacterias probióticas”, “Recuperación de
hongos acuáticos”, “Recuperación de hongos acuáticos transitorios por
filtración”, “Aislamiento de bacterias habitantes de piel” y “Aislamiento de
microorganismos endófitos”. Debe señalar y nombrar las estructuras
indicadas.
b. Reporte de conteo de “Bacterias en el suelo”. Análisis del reporte en
relación a las diluciones y a la naturaleza de la muestra tratada.
c. Análisis de diversidad fúngica encontrada en relación a la naturaleza de
las muestras de agua tratadas.
d. Análisis de bacterias habitantes de piel en relación al estado anterior y
posterior del lavado de manos.
e. Análisis de microorganismos endófitos en relación a la impresión foliar y
la disposición final de la hoja en el montaje (Endófitos Vs. Epífitos).
f. Requerimientos adicionales estipulados por el docente a cargo.
4. El tutor dispondrá de diferentes espacios durante esta sesión para realizar la
sustentación de la Columna de Winogradsky. Aunque la presentación y la
defensa deben fundamentarse en las preguntas orientadoras dispuestas en el
Momento 1, el tutor podrá basar su calificación en preguntas que puedan
relacionar los Momentos 2 y 3, y demás contenidos del curso que pueda tener
relación con la fisiología de los microorganismos presentes en la columna, y su
potencial aislamiento.
Entorno para su
Entorno de componente práctico.
desarrollo:
Productos a
Sustentación de Columna de Winogradsky.
entregar por el
Informe de laboratorio.
estudiante:
Tipo de No se entrega ningún
Individual X Colaborativo X
producto: producto
Individual:
La sustentación debe realizarse en el Momento 3 como se describe en la sección de
“Actividades a desarrollar”. La presentación debe contener fotografías del desarrollo
de la columna en las cuatro semanas y debe responder a las preguntas orientadoras
estipuladas.
Colaborativo
Informe de laboratorio.
• Portada.
• Resultados obtenidos (fotografías, dibujos y tablas).
• Discusión de resultados (deben tener relación con el origen de la muestra, por
lo que se recomienda establecer hipótesis de carga microbiana esperada;
también deben contener soporte bibliográfico).
• Referencias (Formato APA). Nota: recuerde que debe citar también.
• Se entrega un producto PDF al correo del tutor en la fecha estipulada por él o
ella.