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Tincin de gran

OBJETIVO Conocer la tcnica de tincin de Gram., conocer el procedimiento y observar las bacterias en microscopio clasificndolas en Gram. Positivas y Gram. Negativas. Utilizar correctamente los materiales en esta tcnica de tincin. Practica: 6 tincin de Gram. MATERIALES Mesa de trabajo Frotis ya realizado Soluciones de, cristal violeta, yodo lugol, acetona, safranina. Microscopio 2 mecheros de bunsen Aceite de inmersin Asas bacteriolgicas Agua destilada Vaso de precipitado de 50 ml Cajas petri con medio de cultivo Campo de esterilizacin Papel secante Torundas de algodn INVESTIGACION DE TINCION DE GRAM: El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas bacterianas (tanto Gram. positivas como Graham negativas). El lugol est formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual est presente para solubilizar el yodo. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta. La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos s lo hacen. Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules. La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer una tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al trmino del protocolo, las Gram positivas se vern azul-violceas y las Gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina) Esta importante coloracin diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. En este mtodo de tincin, la extensin bacteriana se cubre con solucin de uno

de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se aade luego una solucin de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; despus se lava el portaobjetos con alcohol hasta que ste no arrastre ms colorante. Sigue a tal tratamiento una coloracin de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita. Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, an despus de tratarlos con un decolorante, y el color no se modifica al aadir ste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta, se califican de grampositivos, y los que pierden la primera coloracin y retienen la segunda, de gramnegativos. Basndonos pues, en la reaccin Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. PASOS PARA LA TECNICA DE TINCION DE GRAM: prepara el frotis y fijar a calor colocar la preparacin con la solucin de cristal violeta sumergirla durante(1mn) lavar con solucin yodada (lugol) cubrir el frotis durante con solucin lugol durante (1mn) escurrir y decolorar con alcohol hasta que no arrastre mas cristal violeta lavar con agua corriente contrastar con la solucin safranina lavar con agua corriente y secar al aire observar con el microscopio con una gota de aceite de inmersin en objetivo (100x) DESARROLLO: Los materiales como las asas bacteriolgicas no tienen nada que ver con la tincin de Gram., solo se volvieron a poner ala mesa por que algunos de los alumnos no pudieron completar la prctica a su tiempo y si haba algn error en la tincin se tena la oportunidad de volver hacer el frotis e intentar de nuevo la tincin. Se llevo el portaobjetos al lavamanos, se colocaron recipientes con las soluciones de (acetona, yugol, cristal violeta, safranina), se tomo el portaobjetos y se sumergi en el recipiente donde contena el cristal violeta durante 1mn, despus se sumergi en el yodo lugol durante 1mn, se lavo con la acetona hasta que ya no escurriera mas cristal violeta, posteriormente se sumergi en la safranian durante 1mn y finalmente se lavo con agua corriente, se seco al aire libre y sle coloco una gota de inmersin para fijarlo en el microscopio con objetivo 1000x. Desarrollo grafico

Cristal violeta durante 1mn.

Yodo lugol durante 1mn

Se vaco acetona para limpiar el cristal violeta hasta que ya no escurriera ms de este.

Se vaco safranina durante 1mn

Se lavo con agua corriente para limpiarlo de la safranina y se seco al aire libre.

Sle acho una pequea gota de aceite de palo (aceite de inmersin) para su vista en el microscopio.

Se observo atravs del microscopio.

Se observaron bacilos, de color rojo y por lo tanto los microorganismos son gramnegativos.