Técnicas para el

análisis de drogas
en el pelo

Kluge, Karen - Martinez, Naila - Tolaba, Natali.

Toxicología y Química Legal
2019
 Aspectos generales y pasos del análisis

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Los análisis hechos en la búsqueda de drogas en el pelo son llevados a cabo

generalmente dentro del contexto de casos forenses. Ello supone grandes
consecuencias a partir de los resultados y su interpretación lo que implica una gran
responsabilidad por parte del analista-operador. Además, el trabajo debe estar
organizado de manera preciso y detallado. Todos los potenciales errores deben ser
reducidos. EJ.: evitar muestrear y realizar el análisis en el mismo lugar donde
aquellas drogas que se quieren detectar estén presentes, como en un depósito o
almacenamiento. Dada la rigurosidad con la que se debe hacer el trabajo, existen
una serie de pasos que se proponen y se destacan como lineamiento a seguir para
performar la investigación.
 Recolección y
almacenamiento de la
muestra
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https://youtu.be/_IJcqVW5cTk

Toda la información relevante para el análisis debe ser bien documentada: breves
resúmenes de la historia del caso, el objetivo de la investigación, presunto tiempo de
ingesta de la droga, fecha de muestreado, las preguntas que debe responder el
análisis y la anticipación en la técnica de uso puede ser también tenida en cuenta.
Respecto de la identificación de la muestra debe ser la adecuada para evitar que se
mezclen con otras y mantener su seguridad así como también se debe asegurar la
cadena de custodia (como en cualquier muestra o levantamiento de rastro que se
efectúe).
Respecto de la toma de muestra, un mechón de pelo de un diamétro de 3 o 4
mm se corta directamente de la superficie de la piel y se sujeta con una cuerda
para su posterior segmentación, priorizando el vértice posterior y las regiones
temporales posteriores. Es recomendable tomar 2 muestras en caso de futuras
objeciones (se dejan por separado y una no se toca). si el pelo está muy corto o
es imposible tomar una muestra de allí pueden tenerse en cuenta otras fuentes
(púbicas, axilares, corporales —> tener en cuenta también que estas muestras
están menos expuestas a tratamientos cosméticos, a la influencia del ambiente
y tienen otro período de crecimiento.
El almacenamiento en bolsas plásticas debe ser evitado en lo posible debido a
la contaminación de los plastificantes que pueden, potencialmente, extraer
sustancias lipofílicas del pelo.
 Segmentación del cabello

A mayor distancia del cuero cabelludo, la concentración de la droga disminuye

porque el pelo estuvo más tiempo expuesto al medio ambiente: radiación UV,
cosmeticos, etc.
Por ejemplo para un cabello de longitud aprox. 45 cm se toman segmentos de medio
cm desde la raiz hasta 10 cm en la punta
La segmentación del cabello puede proveer importante información sobre respecto
de la ingesta temporal de drogas. Review:
https://biomed.papers.upol.cz/pdfs/bio/2005/02/02.pdf chequear luego!
Sección 3.2
 Objetivos de la descontaminación del
cabello

-Effect of four laboratory decontamination procedures on the quantitative determination of cocaine and metabolites
in hair by HPLC-MS. DOI: 10.1093/jat/25.7.490

2 razones: 1) productos para el cabello (residuos de ceras, shampoos, sprays,

cremas, etc.), sudor, sebo (grasa) e incluso el polvo tienden a incrementar el
ruido analítico de fondo. 2) Drogas en el medioambiente se pueden adherir al
cabello (esto es típico de personas involucradas en el manejo de drogas ilegales).
 Descontaminación del cabello

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La elección afecta el resultado analítico!!

-Kintz P, Mangin P. Opiate concentrations in human head, axillary, and pubic hair. J Forensic Sci 1993;38:657–62
-Balikova MA, Habrdova V. Hair analysis for opiates: evaluation of washing and incubation procedures. DOI:
10.1016/s1570-0232(03)00134-x

Se ha demostrado que la elección de la secuencia de lavado afecta el resultado

analitico, aunque no se sabe como lo hace.
Solventes: deben remover tantas impurezas como sea posibles, con alta
eficacia PERO NO extraer drogas de la matriz del pelo. A pesar de ello, no hay
consensos sobre cómo hacer el procedimiento: EJ.: secuencia de lavados en
muestras post mortem: 0.1% laurilsulfato de sodio en agua (detergente)+agua
destilada+acetona. Referencias de la diapo EJ2: 1 o 2 lavados con diclorometano.
EJ3: en un baño ultrasónico (ayuda a despojar los contaminantes y como veremos
después a degradar la matriz para la extracción) usaron una secuencia de solventes
(5 min x c/u): doclorometano-acetona-metanol, isopropanol-acetona-metanol,
hexano-acetona-metanol (20, 15, 15, 10 mL).
Solventes no próticos son ventajosos porque no hinchan el cabello
extrayendo sus materiales mientras que los disolventes próticos
promueven la extracción en el paso de lavado al hinchar el cabello.
Sin embargo, estudios sistemáticos han demostrado (3er paper en epígrafe)
que el análisis se puede ver afectado fuertemente por el procedimiento de
lavado utilizado.
 “Effect of four laboratory decontamination procedures on the
quantitative determination of cocaine and metabolites in hair by
HPLC-MS.”

IZQ: lavados solo con metanol previo tratamiento ácido. DER.: buffer fosfato a
pH 6
 “Effect of four laboratory decontamination procedures on the
quantitative determination of cocaine and metabolites in hair by
HPLC-MS.”

IZQ: lavados con buffer fosfato a pH 8. DER.: isopropanol mas buffer fosfato a
pH 5.5

El lavado con metanol sólo resultó en un aumento muy significativo en las

mediciones de la concentración de cocaina y norcocaína. Los del paper creen
que esto ocurrió debido a una eficaz extracción a partir de una digestion acida
que hicieron luego de haber tratado el pelo con metanol pero no en los otros
casos.
 Separación de drogas de la matriz del cabello

Como no existen métodos directos para la detección de drogas en la matriz del

cabello, éstas deben ser extraídas por solubilización o digestión. La elección
dependerá de la estructura química de la droga y su sensibilidad a los agentes
utilizados en la preparación de la muestra. Tengamos en cuenta que en el pelo se
testea una gran ventana de sustancias (no sólo las ilegales) y dicha preparación
debe ser aplicable a todas ellas.
Antes de la extracción, el cabello es cortado, típicamente, en segmentos de 1-3
mm de longitud. Como alternativa, el cabello puede ser procesado por
molienda o “grinding” aunque implica pérdida de muestra y no hace más eficaz
la extracción.
Extr x metanol: alta compatibilidad con casi todas las drogas, dura 5-18 hs,
baño ultrasonico debilita la estructura del pelo x degradación. Se hincha el
cabello y la droga sale de la matriz x difusion. Clean up con extracción liq-liq
sucesivas o Extracc en fase sólida
Para las drogas que son susceptibles a hidrólisis no se pueden usar soluciones
acuosas:
-extracción con metanol. Ej: THC, heroína
-extracción con fluidos supercríticos
 Separación de drogas de la matriz del cabello

Las drogas básicas como cocaína y sus metabolitos, metadona, opiáceos son bien
extraídos con soluciones ácidas o buffer fosfato.
Para las drogas estables en condiciones alcalinas es conveniente la extracción con
NaOH
se utiliza [HCl]=hasta 0.5M o buffer fosfato a pH=6.4 o 7.6 ya que se protonan.
los extractos acuosos son mucho más limpios que aquellos obtenidos a partir
de la extracc con metanol pero puede ocurrir parcial hidrólisis de la cocaína (a
benzoilecgonina).
La digestión con NaOH es x 1 hr a 80°C (1mol/L) y la recuperación es
cuantitativa (alto rendimiento). También pueden obtenerse neurolépticos (como
haloperidol)
 Separación de drogas de la matriz del cabello

“Influence of bleanching on stability of benzodiazepines in hair”

DOI: 10.1016/s0379-0738(99)00152-8

Desnaturalización de keratina: ruptura de puentes hidrógeno y disulfuro.

Extracción en el paper mencionado: aquí ellos en particular utilizaron 2 muestras
de cabello (30 mg), la extraída post mortem (x sobredosis) normal y otra que
luego decoloraron. Se observa que las concentraciones en el pelo decolorado
es mucho menor que aquellas no tratadas y confirma que la cocaína y opiáceos
incorporados son afectados en su estabilidad x esto. de rebote encontraron
que les pasa lo mismo a las benzodiacepinas. Moraleja: these results reconfirm
that it is very important to consider the cosmetic history of a hair sample in the
interpretation of hair analysis results
 Separación de drogas de la matriz del cabello

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 Limpieza del extracto

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Excepto para extracciones con metanol y fluidos supercríticos, se debe eliminar las
impurezas presentes en el extracto o solución de la digestión antes de la inyección
en CG-masa. Existen distintos métodos pero el que proporciona más ventajas es
SPME: miniaturización y automatización
 Limpieza del extracto

● HS-SPME

➢ Útil para drogas lipofílicas que son estables en

soluciones acuosas.
➢ La sustancia se adsorbe en la fibra: la elección de esta
dependerá de la lipofilia y volatilidad de la droga.
➢ Se puede inyectar directamente en el CG donde
ocurre la desorción Permite la reutilización.

Apto para sustancias lipofílicas incluso aquellas con baja volatibilidad (lidocaína,
metadona y sus metabolitos, antidepresivos tricíclicos). Recuperaciones de hasta
17% fueron reportadas.
Con adecuadas derivatizaciones, anfetaminas y THC pueden ser determinadas con
este método.
 Limpieza del extracto

Metodo “espacio cabeza”: Las sustancias lipofílicas, incluso las que tienen una
volatilidad relativamente baja (antidepresivos, metadona y sus metabolitos, etc), se
pueden extraer directamente por una fibra SPME desde el espacio cabeza por
encima de la solución de digestión o extracto.
Primero se eleva la temperatura. Hay sustancias que se van a volatilizar y otras que
son transportadas a la fibra a través de pequeñas gotas de agua. La sustancia se
adsorbe en la fibra, por lo que la elección de esta dependerá de la lipofilia y
volatilidad de la droga. Como ventaja, puede realizarse sin llevar a cabo solventes
orgánicos.
La fibra se puede colocar directamente en el CG donde ocurrirá la desorción. Esto
permite la reutilización de la misma
 Limpieza del extracto

● DI-SPME

Como la extracción se hace por

inmersión directa de la fibra, una
desventaja importante es el
tiempo de vida corto de la misma.

Alto costo!!
 Limpieza del extracto
“Use of SPME for the determination of methadone and its
metabolite in plasma by CG-MS”

DOI: 10.1093/jat/24.1.66

Este paper compara las técnicas de extracción líq-líq con la de DI-SPME, siendo esta
última más eficiente como alternativa a la extracción. sus ventajas son el pequeño
volumen de muestra, menor tiempo de proceso, no hay necesidad de utilizar
solventes orgánicos.
 Detección y cuantificación
Técnicas instrumentales
deben permitir
Cuantificación e identificación inequívoca
Problema
Difícil de generar métodos generales de detección de drogas
causa

● Baja concentración
● Tamaño de muestra insuficiente
 Detección y cuantificación

● Técnicas inmunoquímicas.
➢ Interacción antígeno-anticuerpo
➢ Se agrega una sustancia tal que la
enzima vinculada al anticuerpo
2rio la pueda convertir en una
señal detectable.
➢ Presencia de color: Resultado +

El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) detecta la presencia de un

anticuerpo o un antígeno en una muestra. Una cantidad desconocida de antígeno se
fija a una superficie, y luego se aplica un anticuerpo específico (lo que se obtuvo de
la limpieza del extracto que por desorción desde la fibra se une al antígeno) sobre la
superficie para que pueda unirse al antígeno. El anticuerpo está vinculado a una
enzima, y en el paso final se agrega una sustancia que la enzima puede convertir en
alguna señal detectable, como el cambio de color en un sustrato químico.
 Técnicas inmunoquímicas

❖ Desventajas.
➢ Disponibles para un número
limitado de fármacos
➢ En general no son reacciones
específicas (no confirmatorio)
➢ Interferencias con la matriz
❖ Ventajas.
➢ Ensayo rápido, barato y
automatizado
https://doi.org/10.1016/S0379-0738(99)00168-1
 Detección y cuantificación
● CG capilar-MS Técnica más utilizada

❖ Ventajas
➢ Alta resolución del CG
➢ Alta especificidad del MS (huella dactilar)
➢ Identificación de varias sustancias en una misma corrida.
➢ Intermedio nivel de detección (0,03 ng/mg)
➢ CG-MS/MS aumenta sensibilidad y especificidad.
❖ Desventajas
➢ Derivatización previa necesaria (volatilidad)

el segundo acoplamiento MS hace que el ión o fragmento molecular del primero MS

aplicado, se exponga a una segunda fragmentación con un gas de colisión. también
es separado y detectado nuevamente.
 Detección y cuantificación
● LC-MS
❖ Ventajas
➢ No hay dependencia de la volatilidad ni estabilidad de los
compuestos.
➢ No necesita derivatización previa.
➢ Detección de más de 100 fármacos por corrida.
➢ Límite de detección bajo (≃ 1 pg/mg).
❖ Desventajas
➢ Baja resolución frente a CG (uso de LC-MS/MS)
➢ Alto costo (LC-MS/MS)
 Detección y cuantificación
● Otros métodos de detección

❖ GC con detector de nitrógeno-fósforo (GC-NPD)

❖ GC con detector de captura de electrones (GC-ECD)
❖ HPLC-UV
❖ HPLC con arreglo de diodos
❖ HPLC-ECD
❖ HPLC-fluorescencia

Concentraciones de los fármacos > 1 ng/mg LODMS 0,03 ng/mg

El análisis de LSD con HPLC-fluorescencia es una excepción. LOD < 50 pg

- El NPD es similar a un detector de ionización de llama y utiliza una llama de

hidrógeno/aire a través de la cual se pasa la muestra. Sin embargo, un NPD utiliza un
cordón alcalino de cloruro de cesio o de rubidio calentado por una bobina sobre la
cual pasa el gas portador mezclado con el hidrógeno. El cordón caliente emite
electrones por emisiones termoiónicas que son recogidas por el ánodo y proporciona
la corriente de fondo. Cuando un componente que contiene nitrógeno o fósforo sale
de la columna, los materiales de nitrógeno y fósforo parcialmente combustionados
son adsorbidos en la superficie del cordón. Esto aumenta la emisión de electrones y
la corriente que se mide entonces.

- La cromatografía de gases con detector de captura de electrones, o GC-ECD, es una

técnica empleada para analizar compuestos halogenados y se utiliza principalmente
en los mercados medioambiental, forense y farmacéutico. Cuando determinadas
moléculas atraviesan el detector, capturan algunos de los electrones de la muestra, lo
que reduce la corriente medida. La compensación por esta reducción se registra
como un pico positivo.
 Detección y cuantificación
“Analysis of LSD in human body fluids and hair samples applying
InmunElute columns”

DOI: 10.1016/s0379-0738(99)00162-0
 Gracias
por
escucharnos!

El análisis de LSD con HPLC-fluorescencia es una excepción. LOD < 50 pg.

Cromatografía por inmunoafinidad.

- El NPD es similar a un detector de ionización de llama y utiliza una llama de

hidrógeno/aire a través de la cual se pasa la muestra. Sin embargo, un NPD utiliza un
cordón alcalino de cloruro de cesio o de rubidio calentado por una bobina sobre la
cual pasa el gas portador mezclado con el hidrógeno. El cordón caliente emite
electrones por emisiones termoiónicas que son recogidas por el ánodo y proporciona
la corriente de fondo. Cuando un componente que contiene nitrógeno o fósforo sale
de la columna, los materiales de nitrógeno y fósforo parcialmente combustionados
son adsorbidos en la superficie del cordón. Esto aumenta la emisión de electrones y
la corriente que se mide entonces.

- La cromatografía de gases con detector de captura de electrones, o GC-ECD, es una

técnica empleada para analizar compuestos halogenados y se utiliza principalmente
en los mercados medioambiental, forense y farmacéutico. Cuando determinadas
moléculas atraviesan el detector, capturan algunos de los electrones de la muestra, lo
que reduce la corriente medida. La compensación por esta reducción se registra
como un pico positivo.