Curso Basico de HPLC Semipresencial - Módulos 1 y 2

CURSO BASICO DE HPLC
Curso básico de HPLC
CURSO BASICO DE HPLC
Alcance:
• El presente curso está orientado para alumnos con conocimientos de

Química Analítica Cuali/Cuantitativa
Objetivos del curso:
• Introducir al alumno en los conceptos básicos de la cromatografía y en

particular de la cromatografía líquida de alta performance. Tipos de
cromatografía, puntos en común.
• Desarrollar un estudio detallado del instrumental centrándose en las

características principales y los parámetros mas utilizados de cada uno de
los módulos que componen un cromatógrafo líquido.
• Citar el alcance de la HPLC y sus usos en la industria.
• Realizar experiencias en el laboratorio con el instrumental para fijar los

conceptos estudiados.
Contenido del curso:
1. Historia y Conceptos básicos. Cromatografía. Formas de cromatografía

líquida.
2. Instrumental.
Bomba: distintos tipos. Sistemas isocráticos y de gradiente de solventes
Inyector: manual y automático. Diagramas.
Detector: parámetros principales. Detectores generales y selectivos.
Sistema de procesamiento de datos: graficadores, integradores,
software.
3. Bases de la separación. Parámetros estudiados a partir de un

cromatograma. Procesos de ensanchamiento de banda intracolumnar y
extracolumnar.
4. Solventes. Propiedades físicas y químicas. Usos.. Modificadores y aditivos.

Preparación de fases móviles
Lic. Pablo Gonzalez 1

5. Cromatografía de fase ligada. El material de relleno. Características.

Ejemplos. Cromatografía en fase reversa. Fase móvil. Mecanismo de
retención. Distintas formas de fase reversa.
6. Cromatografía en fase normal. Materiales de relleno. Fase móvil.

Modificadores. Mecanismo de la separación.
7. Cromatografía de intercambio iónico. Generalidades. Materiales de

relleno. Fase móvil.
8. Cromatografía de exclusión molecular. Generalidades. Mecanismos de

separación. Fases estacionarias. Fase móvil.
9. Ejemplos y aplicaciones.
10. Experiencia práctica.

CAPITULO 1
Historia y Conceptos
básicos

1. Historia y Conceptos básicos:
Historia:
El botánico ruso Mikhail Tswett fue el primero en desarrollar la técnica

cromatográfica en el año 1903. Siguiendo las etapas del método científico y
recopilando toda la información de sus predecesores y contemporáneos, realizó
una revisión completa de los principales períodos, métodos de estudio y
descripciones de la clorofila. Su primera conclusión fue que los métodos de
obtención y purificación de este pigmento que implicaban extracciones sobre las
hojas de las plantas con reactivos químicos para purificar el compuesto en
estado sólido eran procedimientos agresivos y generaban derivados de la
clorofila o clorofila impurificada. Los
esfuerzos de Tswett se encaminaron a
eliminar las razones que podrían hacer
cambiar la naturaleza del pigmento verde,
por lo que utilizó hojas frescas y eliminó la
calefacción. Durante sus experimentos,
disgregó un pool de hojas verdes con éter
de petróleo con el agregado de pequeñas
cantidades de alcohol etílico y demostró que
por un fenómeno de adsorción, cuando el
solvente pasaba por un sólido
empaquetado, se producía la separación de
las distintas sustancias existentes en el
preparado. Esta idea de generar una
competencia de adsorción entre las
propiedades del solvente y la fase sólida lo
llevaron a desarrollar un estudio detallado
de la identificación de materiales capaces de
adsorber pigmentos existentes en las hojas
verdes, desorbiendo de forma diferencial los componentes de la mezcla. En la
actualidad bajo el término adsorción se combinan varios fenómenos, que,
aunque posiblemente son diferentes en su naturaleza, corresponden a la
siguiente definición básica: concentración de gases, vapores, líquidos o
compuestos disueltos sobre la superficie de cuerpos sólidos.
En su primera experiencia, el botánico empaqueta una columna de vidrio con
carbonato de calcio finamente dividido y al verter el solvente sobre el mismo
obtiene bandas coloreadas a distintas alturas del adsorbente. Al eluirlas en
forma diferencial, obtiene una serie de pigmentos puros e inalterados.
La técnica se bautiza con el nombre cromatografía derivado de dos palabras

griegas, khroma (color) y grafein (escritura). Los químicos orgánicos de su
época se opusieron a esta nueva metodología ya que argumentaban que no se
podía considerar purificación a un proceso que no se basaba en la cristalización
para dar lugar a un compuesto sólido. Consideraban que era imposible purificar
una sustancia sin hacer uso de las técnicas utilizadas por la química orgánica.

Por su lado, Tswett explicaba que su técnica era suficiente para separar y
purificar los pigmentos. La polémica se profundizó cuando R. Willstater, el
principal defensor de la purificación con
reactivos químicos, gana el premio Nobel
en 1905 y su prestigio internacional, opaca
la técnica cromatográfica. Como si esto no
fuera suficiente, Rusia entra en un período
de revolución, luego participa de la primera
Gran Guerra y todos los trabajos de Tswett
desaparecen. Finalmente muere en 1919
en la absoluta pobreza y la técnica es
prácticamente olvidada. El estudio de la
clorofila es monopolizado por la escuela de
Willstater. En 1970 Synge afirmó: “... el
peso de la autoridad científica de Willstater
hizo que la sociedad científica ignorara las
ideas de Tswett...”
Pero en los comienzos de los años 30,
afortunadamente, la cromatografía es
redescubierta en Alemania por Winterstein
y Stein y usada para separar distintos
carotenoides de las plantas. A partir de ese
momento la cromatografía toma un impulso
que la posiciona, aun en estos días, como
una de las técnicas analíticas más usadas y
confiables.
Varios años después de la muerte de
Tswett, a su lápida se le añadió el siguiente epitafio: “Destinado a descubrir
la cromatografía, la ciencia que separa moléculas y une personas” .
Conceptos básicos:
La Cromatografía
La cromatografía es un método utilizado para separar los componentes de una
muestra (o matriz) que se distribuyen entre dos fases, una estacionaria y la
otra móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido, un líquido retenido sobre
un sólido o un gel, mientras que la fase móvil puede ser un líquido o un gas.
Modalidades cromatográficas
Se puede clasificar las modalidades cromatográficas en función de los
siguientes parámetros:
• Clasificación según la naturaleza de la fase móvil: si la fase móvil es

un gas, la cromatografía se denomina Cromatografía gaseosa (GC) y se
emplea para separar los componentes orgánicos volátiles de una matriz. Los

inconvenientes principales de este tipo de cromatografía son las matrices

cuyos componentes no son volátiles o los componentes se degradan con las
altas temperaturas o poseen alto peso molecular.
Las bases de la separación cromatográfica son considerablemente

comparables con los de la Cromatografía líquida (LC) que es aquella en la
cual, la fase móvil utilizada es un solvente o una mezcla de solventes.
Dentro de ésta ultima podemos citar la cromatografía en capa delgada
(TLC), la cromatografía en columna abierta y la cromatografía líquida de
alta performance (HPLC).
La diferencia fundamental entre GC y HPLC radica en el tipo de detección y

en la influencia de la fase móvil en la separación. En GC los sistemas de
detección son muy sencillos ya que no existe gran dificultad para diferenciar
la muestra de la fase móvil (gas inerte). Por ello, cualquier detector que
mida una propiedad física del analito es apropiado (detector de ionización de
llama (FID), detector de captura electrónica (ECD), detector de
conductividad térmica (TCD), etc). En HPLC, en cambio, la fase móvil no es
inerte por lo tanto los detectores deben diferenciar el soluto en solución de
la fase móvil (detector UV, detector de fluorescencia, detector de índice de
refracción, detector electroquímico, etc).
La segunda diferencia entre GC y HPLC está relacionada con la influencia de
la fase móvil. En GC la fase móvil es un gas inerte comúnmente denominado
carrier cuyo objetivo es transportar el analito a través del sistema
cromatográfico, siendo fundamental la elección de la columna
cromatográfica adecuada que garantice la separación de los componentes
de la muestra en cuestión. En cambio, en HPLC la fase móvil es el pilar
fundamental de la separación, y puede ser ajustada o modificada para
mejorar la resolución (separación) de las sustancias estudiadas. Frente a
esto se puede concluir lo siguiente: en GC es necesario contar con un gran
número de columnas cromatográficas, mientras que en HPLC se pueden
resolver sistemas diversos con una sola columna e interactuando sobre la

fase móvil. Por supuesto existe una gran variedad de columnas para cada
tipo de cromatografía que contribuyen a obtener mejores resultados.
• Clasificación según la naturaleza de la fase estacionaria:

En las modalidades cromatográficas siempre la nomenclatura define en
primer lugar la naturaleza de la fase móvil y en segundo lugar la naturaleza
de la fase estacionaria. Se citan los cuatro tipos de cromatografía:
Cromatografía Gas-Líquido (GLC) (Gas – Liquid Chromatography)

Cromatografía Gas-Sólido (GSC)
Cromatografía Líquido-Sólido (LSC)
Cromatografía Líquido-Líquido (LLC)
• Clasificación según el fenómeno que ocurre dentro de la columna:

Se clasifica en cromatografías por afinidad en las cuales el analito
interactúa directa o indirectamente, a través del solvente, con la fase
estacionaria o por tamaño molecular en donde no existe dicha interacción
y la separación de los componentes de la muestra se produce por la
diferencia de sus pesos moleculares . Dentro de las cromatografías por
afinidad podemos citar la cromatografía en fase reversa, en fase normal, de
intercambio iónico, etc. Para cromatografía por tamaño molecular podemos
mencionar la cromatografía de filtración por geles (GFC) y la cromatografía
de permeación por geles.
• Clasificación según la cantidad de muestra aplicada:

Si el tipo de cromatografía no destruye la muestra (TLC, HPLC) podemos
recuperar el analito separado de su matriz al final de la corrida
cromatográfica. En función de las cantidades de muestra podemos definir:
En el rango ng-µg (10-9 a 10-6 gramos/mL): cromatografía analítica. Es la

que nos ocupa en este curso y solo está destinada a realizar
determinaciones analíticas.
En el rango µg-g: cromatografía semipreparativa. Es un tipo de

cromatografía que también se utiliza en el laboratorio pero cuando se quiere
purificar una sustancia y se quiere recuperar al final de la columna. Algunos
cromatógrafos líquidos están preparados para trabajar en cromatografías
analíticas y semipreparativas.
Mayor al gramo: cromatografía preparativa. Es utilizada principalmente

en los dapartamentos de manufactura o producción. El equipamiento
utilizado es completamente diferente al usado en el laboratorio.

Formas de cromatografía líquida:
• Cromatografía líquido-sólido (LSC) o de adsorción.

Este tipo de cromatografía emplea una fase estacionaria sólida polar
(generalmente sílica gel) y una fase móvil líquida no polar o poco polar (por
ejemplo hexano con algún aditivo que provee selectividad). Ejemplos: HPLC
fase normal, TLC, cromatografía en columna. La separación de las
sustancias en la fase estacionaria se lleva a cabo por un fenómeno de
adsorción. Adsorción se define como un fenómeno de superficie en el
cual las distintas sustancias se “pegan” y “se despegan” de la fase
estacionaria a medida que avanza el solvente. Los términos correctos son
“se adsorben” y se “desorben”
• Cromatografía líquido-líquido (LLC) o de partición.

En este tipo de cromatografía, el analito se distribuye entre dos líquidos, la
fase móvil y la fase estacionaria que se encuentra dispersa en forma
homogénea sobre un soporte sólido finamente dividido. En esta modalidad
de cromatografía, la separación de las sustancias se lleva a cabo por un

equiibrio de partición o reparto entre dos líquidos. Esto significa que cada
sustancia establece un equilibrio de afinidades por cada solvente, a mayor
afinidad por la fase móvil menor retención mientras que a mayor afinidad
por la fase estacionaria (también líquida) mayor retención. Se establece
entonces la partición de cada analito por ambas fases líquidas. Ejemplos:
HPLC fase reversa, Cromatografía en papel.
En la cromatografía en papel, la fase estacionaria no es el papel

propiamente dicho, sino el agua contenida en la celulosa. Por lo tanto la
fase estacionaria es un líquido y debemos hablar de cromatografía líquido-
líquido o de partición.

• Cromatografía de fase ligada (BPC)

El 90% de las separaciones en cromatografía se realizan utilizando una fase
estacionaria químicamente unida o ligada a su soporte a través de uniones
covalentes o sea una fase estacionaria permanente y perdurable. Este
material puede ser químicamente modificado de tal manera que podemos
encontrar en el mercado fases altamente hidrofóbicas o altamente
hidrofílicas con una alto grado de polaridad y de selectividad: octadecilo,
octilo, ciano, fenilo, amino, amonio cuaternario, resto sulfónico, etc. A partir
del surgimiento de esta cromatografía, se amplio considerablemente el
número de aplicaciones en cromatografía. Los fabricantes de fases fijas
comenzaron a ligar distintas sustancias orgánicas a las fases fijas
tradicionales y dieron lugar a una variedad tan rica de fases estacionarias
que en la actualidad, todo se puede resolver con algún tipo de
cromatografía.
• Cromatografía de intercambio iónico (IEC).

En este caso se usan fases estacionarias químicamente modificadas de tal
forma que poseen como grupos funcionales aniones o cationes. En general
para el intercambio catiónico se usan grupos típicamente sulfónicos y para
intercambio de aniones grupos amonio cuaternarios. La selección del grupo
funcional permite escoger entre intercambiadores fuertes o débiles. N este
tipo de cromatografías, la separación no está gobernada por equilibrios de
polaridades sino por intercambios de cargas entre las especies iónicas a
separar y las fases (móvil y estacionaria) también iónicas.

• Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).

Este tipo de cromatografía emplea materiales de porosidad controlada que
funcionan como tamiz molecular y separan los analitos de la matriz en orden
decreciente de tamaño molecular (las moléculas de mayor peso molecular
eluyen primero). En el mercado existen columnas que abarcan distintos
rangos de pesos moleculares.
Conclusiones:
Como se ha visto, existe una amplia variedad de tipos de cromatografía que

pueden clasificarse según la naturaleza de la fase fija, la fase móvil, la cantidad
de muestra aplicada, según el fenómeno separativo, etc. Pero para
cromatografía líquida, cualquiera de estas formas puede desarrollarse en un
equipo HPLC (High Liquid Performance Chromatography) por la gran
versatilidad del mismo y por la posibilidad de combinaciones de variables
existentes en la configuración del instrumental y en cada uno de sus módulos.
De esta forma, el campo de acción de un HPLC abarca aplicaciones en
industrias como la química, petroquímica, farmacéutica, biológica, alimenticia,
etc.

CAPITULO 2
Instrumental

2. Instrumental:
Basándonos en la definición de cromatografía, es evidente que debe existir una

interacción de una fase móvil líquida con una fase estacionaria para que se
pueda desarrollar la cromatografía. También es evidente que es necesario
aplicar o sembrar la muestra en el sistema para que puedan separarse sus
componentes. Y por último, es necesario también, contar con un sistema que
sea capaz de determinar la presencia de cada sustancia y de ser posible, su
concentración final.
El esquema básico de un cromatógrafo líquido de alta performance puede
dividirse en 4 partes:
Sistema de bombeo.
Inyector
Detector
Sistema de registro de datos
El sistema de bombeo es el primer módulo y es el que dosifica la fase móvil a

un caudal constante hacia la fase fija . El segundo módulo es el inyector que
nos posibilita incorporar la muestra a estudiar dentro del flujo de fase móvil que
avanza hacia la estacionaria. Por lo tanto debe intercalarse entre la bomba y
dicha fase. La columna, si bien no es parte del equipo, es fundamental para el
análisis ya que contiene a la fase estacionaria. El detector es el tercer módulo y
es el encargado de “leer” cada una de las sustancias que salen de la columna
cromatográfica (ya separadas entre sí) y proporcionar una señal que nos
permita cuantificar cada analito. El último módulo es el sistema de registro de
datos (comúnmente denominado integrador) que nos proporciona un reporte
gráfico y numérico de cada una de las señales emitidas por el detector
(denominado cromatograma).
Cabe aclarar que el diagrama anterior sólo representa un equipo HPLC básico,
existiendo módulos adicionales y configuraciones diferentes para aplicaciones
más específicas o para automatizaciones del instrumento.

Los cromatógrafos líquidos pueden clasificarse en integrados o modulares.

En los cromatógrafos integrados el sistema de bombeo, el inyector y el detector
forman parte de un solo módulo. Permiten un mejor aprovechamiento del
espacio físico en el laboratorio, poseen menos cables y tuberías expuestas. Son
en general menos complejos que los modulares pero como los módulos forman
parte de un todo, el mal funcionamiento de cualquier parte del instrumental,
inhabilita el total funcionamiento del mismo.
En un equipo modular, cada uno de los órganos es un instrumento diferente, de

esta manera es posible adicionar módulos o reemplazar fácilmente alguno
defectuoso y son una excelente defensa contra el síndrome de la caja
negra. Esto es; es muy fácil determinar de existir una falla, cual es el módulo
que la origina y subsanar el inconveniente con relativa facilidad.

Sistema de Bombeo
Las bombas son las encargadas de impulsar el solvente de los reservorios que
contienen la fase móvil hacia el resto del sistema cromatográfico. Existen
bombas capaces de entregar caudales del orden del µL/minuto (entre 10 y 500
µL/minuto) para cromatografías denominadas microbore, otras capaces de
entregar caudales del orden del mL/minuto (entre 0,1 y 10 mL / minuto) para
cromatografías convencionales y bombas que entregan caudales superiores
para cromatografías semipreparativas y preparativas.
Las características fundamentales de una bomba para cromatografía líquida son

los siguientes:

SISTEMA DE BO MBEO
Impulsan la
Materiales
fase móvil
inertes
al sistema
Caudales Sistemas
variables de
y exactos corte
Mínimo Mínima
ruido deriva
• Materiales inertes: Las bombas están construidas en su mayoría de acero

inoxidable y poseen piezas de rubí, zafiro, teflón, oro y polímeros especiales.
Dado que es posible utilizar una gran variedad de solventes en HPLC, la
bomba y sus materiales de construcción deben ser resistentes e inertes para
no sufrir modificaciones durante su uso y para no contaminar a los solventes
usados. Para aplicaciones biológicas también existen bombas con cuerpo de
titanio.
• Caudales variables y exactos: las bombas deben entregar un caudal

homogéneo y constante durante todo el ensayo cromatográfico y el caudal
establecido no debe diferir considerablemente del realmente entregado. La
exactitud del caudal garantiza cromatografías reproducibles. Cuando se
desarrolla un análisis cromatográfico, uno de los parámetros útiles para
chequear el funcionamiento de la bomba es el denominado tiempo de
retención. El mismo se define como el tiempo en el cual una sustancia es
detectada contando como tiempo cero, el momento preciso en que es
inyectada en el sistema. Si se inyecta repetidamente la misma sustancia, el
tiempo de retención no debería modificarse en absoluto. Por tal motivo, el
caudal de fase móvil que entrega la bomba debe ser constante y exacto. Y
considerando que los caudales de trabajo mas habituales están
comprendidos entre 0.5 y 1.5 mL/minuto, es claro que la precisión de la
bomba debe ser adecuada para estos fines. La variabilidad del caudal solo
explica que pueden programarse distintos caudales de trabajo para distintas
determinaciones cromatográficas siempre y cuando, estas modificaciones no
influyan en la exactitud del mismo.
• Sistemas de corte: consiste en un sistema que corta el suministro de

solvente en forma automática cuando detecta presiones superiores o

inferiores a los límites establecidos por el usuario. Las columnas

cromatográficas contienen a la fase fija finamente dividida y compacta. Son
las causantes de las altas presiones en el sistema ya que la fase móvil debe
vencer esta resistencia. Pero las columnas cromatográficas típicamente
soportan presiones máximas de 350 bares. En una bomba HPLC puede
programarse un corte por baja presión y un corte por alta presión. Si
nuestro sistema cromatográfico ya en equilibrio trabaja con una presión, de
por ejemplo, 150 bares; es muy útil programar los cortes en 100 bares
(corte por baja presión) y 200 bares (corte por alta presión). Cualquier
anomalía en el sistema que impacte sobre la presión y la modifique más allá
de los límites establecidos, origina el corte inmediato del caudal. Causas que
originan bajas presiones son fugas de solvente o burbujas. Causas que
originan altas presiones son tapaduras en capilares o en la misma columna o
caudales demasiado altos.
• Mínimo ruido: el ruido se refiere a las “pulsaciones” existentes

principalmente en las bombas de tipo reciprocantes que generan
variaciones de caudal en cortos períodos de tiempo y consecuentemente
variaciones en los tiempos de retención. Estas pulsaciones se originan por
los movimientos típicos de los órganos móviles del sistema de bombeo
durante la detención (movimiento de pistones, apertura/cierre de válvulas,
etc) y es incrementado por deficiencias en el sistema como existencia de
burbujas, sellos defectuosos, precipitación de sales o válvulas tapadas. Las
bombas cuentan con atenuadores de pulsos para minimizar el nivel de
ruido.
• Mínima deriva: es un cambio continuo (positivo o negativo) en la entrega

de caudal que se produce durante tiempos largos y genera variaciones en
los tiempos de retención y en la línea de base.

Tipos de bombas: Bombas reciprocantes y bombas de desplazamiento

continuo.
Bombas reciprocantes
Son las más utilizadas y versátiles. Consisten en el movimiento recíproco de dos
pistones (en general) que se encuentran en cámaras independientes
conectadas a sistemas de válvulas de apertura y cierre. Cuando un pistón
dosifica solvente, el otro carga con fase móvil su cámara. El movimiento
sincronizado y recíproco de los pistones garantiza un caudal contínuo,
homogéneo y sin fluctuaciones importantes. Durante el bombeo se accionan las
válvulas de apertura y de cierre en forma automática ya sea por presión o en
forma electrónica. Cuando un pistón retrocede en su cámara para cargarla con
solvente, las válvulas de
entrada permanecen abiertas
mientras se cierran las válvulas
de salida. Cuando el pistón
avanza dosificando el solvente,
se cierran las válvulas de
entrada y se abren las de
salida. En general las válvulas
están conformadas por esferas
de rubí sobre un asiento de
teflón o zafiro y son fácilmente
reemplazadas en caso de
necesidad.
Las bombas reciprocantes

permiten variar el caudal
entregado variando el recorrido
del pistón o variando la velocidad del pistón en la cámara. El volumen de la
cámara del pistón es pequeño, en general entre 35 y 400 µL. Esto permite

cambiar rápidamente la fase móvil y disminuye el tiempo de demora para hacer

efectivo un cambio de composición del solvente durante un gradiente de
solventes. Cuando se bombean fases móviles con sales disueltas es conveniente
lavar el sistema durante el análisis. Por ello algunas bombas cuentan con un
sistema de lavado de sellos que humecta los sellos con soluciones
hidroalcohólicas para evitar la precipitación de sales que puede dañar los
pistones.
Es evidente que en este tipo de bomba (figura anterior) con un solo pistón el
caudal de solvente se interrumpirá cada vez que el pistón retrocede para llenar
su cámara con solvente. Este inconveniente se soluciona con:
• Atenuadores de pulso que consisten en una cámara flexible que se llena de

solvente y lo entrega durante el retroceso del pistón funcionando como
acumulador de fase móvil.
• Empleo de engranajes excéntricos para que la velocidad de llenado de la
cámara sea mayor a la velocidad del pistón durante el bombeo.
• Empleo de dos o más pistones de funcionamiento sincrónico como se

muestra a continuación.

El diagrama anterior muestra un sistema de bomba reciprocante de dos

pistones. En este caso particular, las cámaras de los pistones tienen distinto
tamaño y cada pistón se mueve a distinta velocidad. Cuando el pistón I avanza
envía solvente hacia la columna y hacia el pistón II que tiene una carrera más
corta o sea menor volumen en su cámara. El pistón II comienza a avanzar
cerrando la comunicación con el pistón I que en forma sincrónica comienza a
retroceder para llenar su cámara. Este tipo de bomba trabaja con pistones en
serie minimizando el nivel de ruido. En una bomba con pistones en paralelo es
inevitable el ruido generado por la alternancia de los pistones.
Los sistemas de bombeo de pistón y diafragma constan de una bomba de baja

presión que llena una cámara flexible (generalmente de acero inoxidable) a
través de una válvula de entrada. Por otro lado, un pistón adicional bombea
aceite que presiona sobre el diafragma generando la presión suficiente como
para que la cámara entregue solvente a la columna y cierre automáticamente la

válvula de entrada. Cuando la presión comienza a decaer, se abre la válvula de

entrada y la bomba de baja presión llena la cámara cerrando el ciclo.
a: Bomba
reciprocante de
un solo pistón
b: bomba
reciprocante de
dos pistones de
funcionamiento
sincrónico
Bomba de jeringa:
La bomba de jeringa, a diferencia de las bombas reciprocantes, es un sistema

de desplazamiento continuo. El solvente contenido en un cilindro es impulsado
hacia el inyector con un movimiento continuo. El recorrido del pistón y el
volumen que se impulsa deberán ser suficientes para la totalidad de la
determinación. Es evidente que este sistema de bombeo se aplica a
cromatografías microbore o capilares en las cuales se usan caudales en el orden
de µL/minuto. La principal ventaja radica en la eliminación de pulsaciones de
bombeo, mientras que como desventajas podemos citar la duración limitada del
bombeo y el tiempo elevado de recarga de la cámara.

Sistemas de gradiente
Definimos como cromatografía isocrática aquella en la cual la separación de los

analitos de una matriz la realizamos con una fase móvil única (mezcla de
solventes) que no se altera durante toda la corrida cromatográfica. Para
muestras sencillas de pocos componentes y de polaridad similar es un método
bastante apropiado.
Por ejemplo:
En el cromatograma siguiente se muestra una mala separación de los analitos,
sobre todo los que eluyen con tiempos de retención menores. Para este
ejemplo se utilizó una mezcla de un solvente A y un solvente B en la
siguiente proporción: A : B (25 : 75).
El cromatograma que se muestra a continuación se realizó con una proporción

diferente de los solventes A y B para intentar una mejoría en la separación de
los analitos. A : B (50 : 50).

Puede observarse que existe una mejoría en la separación de los picos que
eluyen primero aunque todavía no existe buena resolución. Pero por otro lado
también puede observarse que los picos que eluyen al final de la serie se
retrasan considerablemente y por ende, se ensañan demasiado
comprometiendo su separación.
Evidentemente ninguno de los dos sistemas es apto para la resolución total de

las sustancias estudiadas. Y aunque se probaran otras proporciones diferentes
de estos solventes o de otros solventes, muy probablemente no podría llegarse
nunca a una separación total. Para estos casos complejos existen dos
alternativas. La primera alternativa consiste en realizar dos o más análisis
HPLC isoctráticos cuantificando las sustancias de a grupos. Obviamente, esto
representa un costo mayor para el análisis e implica tiempos hombre y tiempos
equipo mayores también. La segunda alternativa consiste en la utilización de
un gradiente de solventes si se cuenta con el sistema de bombeo adecuado.
Este último no utiliza una única proporción de solventes sino, muy por el
contrario, nos permite modificar lentamente la proporción de cada solvente a
medida que se desarrolla el análisis. Esto significa que a distintos tiempos del
análisis, por la columna cromatográfica estará fluyendo una proporción
diferente de solventes. Al trabajar con un gradiente de solventes, logramos
separar sistemas complejos ya que en algún momento cada sustancia
encontrará la proporción de solventes adecuada para eluir de la columna. A
continuación se muestra una cromatografía de gradientes la cual comienza con
una proporción A : B (55:45) que al cabo de 10 minutos se transforma en la
proporción A : B (5:95). Tal vez la resolución de las sustancias no es aún la
adecuada pero el método es más que aceptable si se considera que tan sólo en
poco más de 12 minutos eluyen prácticamente separadas todas las sustancias.
Para realizar un gradiente de solventes se utilizan bombas más complejas que

tienen la capacidad de mezclar proporciones exactas de 2 o más solventes

(generalmente hasta 4 solventes) durante un período determinado de tiempo.

En general se empieza la elución con un solvente débil en mayor proporción, y
esta proporción va disminuyendo según un perfil lineal, cóncavo o convexo
hasta una proporción mayoritaria del solvente fuerte. Un ejemplo podría ser el
siguiente:
Proporción inicial Agua:Metanol 90:10.
Proporción final Agua:Metanol 10:90
Perfil lineal
Tiempo de gradiente 15 minutos.
Es importante diferenciar el gradiente de solventes que involucra una variación
en las propiedades de la fase móvil y un gradiente de caudales que sólo
modifica el caudal de trabajo.
Se pueden describir principalmente dos sistemas formadores de gradientes: los

de baja presión y los de alta presión.
• Sistema de gradiente de baja presión: emplean sólo una bomba y

válvulas solenoides (una por cada canal) que entregan cada solvente a una
cámara de mezclado de poco volumen. La fase móvil instantánea de la
cámara es bombeada hacia el inyector. La ventaja de este sistema es su
bajo costo (sólo usa una bomba), y la precisión obtenida en los extremos
del gradiente ya que todo los solventes son impulsados por la misma
bomba. La desventaja principal de este sistema es que necesita un sistema
de desgasificación continuo e individual para cada canal o reservorio de
solvente ya que la solubilidad de los gases en cada solvente difiere en la
mezcla generada en la cámara. Es típica la formación de burbujas en
mezclas de metanol agua por ejemplo por lo que es necesaria la constante
desgasificación de ambos reservorios, el de agua y el de metanol.

• Sistema de gradiente de alta presión: utilizan una bomba de alta

presión para cada solvente individual y cada una es comandada en forma
independiente por un programa y el solvente entregado se mezcla a alta
presión en una cámara de bajo volumen y luego dirigido hacia el inyector.
La principal ventaja de este sistema es que el gradiente se realiza a alta
presión minimizando la posible formación de burbujas y las principales
desventajas son el costo del sistema y la necesidad de contar con bombas
exactas y precisas que garanticen la repetibilidad del gradiente durante todo
el ensayo.
Problemas típicos en gradiente de solventes
Los cromatogramas con gradiente son el general menos PROLIJOS que los
isocráticos por variaciones en la línea de base que se agrupan en:
Deriva: es generalmente lineal y más pronunciada a bajas long. de onda.
Mid gradient hump: es una JOROBA en la línea de base y no corresponde

linealmente al gradiente. Es más pronunciada a mayores long. de onda.
Picos artificiales o FANTASMA: suelen aparecer en distintas zonas del

cromatograma en muestras y blancos.

Inyectores
El inyector es el segundo módulo de un equipo HPLC. Inyector manual: el

inyector es un dispositivo que nos permite introducir la muestra en solución al
sistema cromatográfico sin interrumpir el caudal de la bomba. Debe ser inerte,
preciso en cuanto a la cantidad de muestra introducida y no debe provocar
diluciones importantes de la solución inyectada. En general funcionan como una
válvula que al ser accionada permite que la fase móvil arrastre la solución
almacenada en un capilar de volumen fijo (loop) que es llenado con una
jeringa. El accionamiento de dicha válvula se realiza en forma manual. Este loop
es intercambiable y existen de distintas capacidades del mismo.
Las válvulas manuales están
constituidas por un cuerpo de acero
inoxidable, un sello rotor y un loop de
muestra externo e intercambiable que
nos permite modificar el volumen a
inyectar entre 5 y 2000 µL. La válvula
más utilizada consta de seis vías. Una
vía para la entrada de fase móvil, dos
vías para el loop, dos vías de descarte
y una vía que lleva el caudal hacia la
columna cromatográfica. La válvula
acciona entre dos posiciones: carga e
inyección.
En el modo carga (load) la fase móvil
a alta presión, proveniente de la
bomba, ingresa a la válvula por la posición 2 y migra directamente hacia la
columna por la posición 3. En este modo, la válvula está preparada para recibir
la muestra que se alojará en el loop a presión atmosférica. Para cargar el loop
es necesario dosificar lentamente con una jeringa al menos 5 volúmenes
nominales para evitar los errores debidos al flujo turbulento.

El volumen excedente se
descartará a través de una
cañería conectada a la posición
6 de la válvula. El loop que se
encuentra conectado a las
posiciones 1 y 4 de la válvula,
en esta etapa, no recibe fase
móvil, por lo tanto la solución
con la muestra permanecerá en
el mismo hasta tanto la válvula
no se mueva a la posición
inject. En general las
inyecciones en cromatografía
líquida se realizan a loop lleno. Cuando realizamos inyecciones a loop parcial lo
conveniente es utilizar volúmenes de inyección no inferiores al 50% de la
capacidad nominal del loop, corrigiendo los errores de inyección con un
standard interno.
En el modo inyección (inject) la fase móvil a alta presión, proveniente de la

bomba, ingresa a la válvula por la misma posición que el modo carga (posición
2), pero se dirige a alta presión hacia la posición 1 arrastrando la muestra
alojada en el loop hacia la posición 4 y posteriormente hacia la posición 3
conectada a la columna cromatográfica. La fase móvil pasará por el loop hasta
tanto no se cambie la posición de la válvula a la posición carga, esto garantiza
la completa eliminación de la muestra alojada en el loop.

Inyectores automáticos: las válvulas de inyección de seis vías pueden

accionarse en forma electrónica o neumática garantizando desviaciones
standard relativas inferiores
que en los inyectores
manuales ya que no
dependen de la habilidad del
operador. Por otro lado la
dosificación de la muestra se
realiza también en forma
automática a través de una
jeringa accionada
mecánicamente o a través
de un pistón accionado por
un motor a pasos. Para
automatizar totalmente el
proceso de inyección, estos
instrumentos cuentan con
un carrusel que aloja una
gran cantidad de viales con cada una de las muestra a estudiar. A partir de una
secuencia de inyección, se puede programar el volumen de inyección, los viales
a inyectar y la cantidad de inyecciones por vial.
La secuencia de carga e inyección es exactamente la misma explicada
anteriormente para un inyector manual.

En modo carga (load), el solvente proveniente de la bomba avanza

directamente hacia la columna cromatográfica. En esta etapa la aguja asciende
y el vial se posiciona sobre el asiento de la aguja. Posteriormente, la aguja
desciende perforando el septum del vial y tomando el volumen indicado por el
operador. La solución se alojará en el loop hasta el próximo paso de inyección.
El remanente de volumen tomado por la jeringa se descartará.
En la etapa de inyección, se produce el switch de la válvula, la fase móvil

proveniente de la bomba avanza hacia el loop arrastrando la solución que éste
contiene hacia la columna cromatográfica.

Todo el sistema está conformado por capilares para minimizar la difusión del
analito en el solvente.
La ventaja de un sistema de inyección es que se logra la independencia

absoluta del analista en el volumen inyectado. Esto quiere decir que se una
determinada metodología analítica sembrar o inyectar en el sistema un volumen
de 25 µL, es suficiente con seleccionar el loop de esa capacidad e instalarlo en
la válvula inyectora. El analista sólo deberá inyectar un volumen mínimo de por
lo menos 3 veces ese volumen (75 µL ó más) para asegurarse de que el loop
está completamente lleno y bajar la válvula para que comience la corrida
cromatográfica. Claro está, sólo ingresará al sistema el volumen
correspondiente al loop, 25 µL mientras que el excedente se descartará.
Detectores
El tercer módulo del equipo es el sistema de detección. Es el componente del

cromatógrafo que nos permite evaluar cada uno de los componentes de una
matriz en forma cualitativa y
cuantitativa. En general utilizan
alguna propiedad química o
física de la muestra para
generar una señal que pueda
ser registrada por un
instrumento especialmente
diseñado para tal fin.
Los detectores se acoplan a la
salida de la columna que es la
encargada de separar los
analitos de la matriz. Cada
componente llega al detector a un tiempo determinado (tiempo de retención) y

es cuantificada en forma independiente, por ello, la cromatografía líquida es

una metodología de análisis de increíble versatilidad.
Los detectores deben reunir una serie de características a saber:
• Rango dinámico de respuesta: deben poseer un amplio rango dinámico,

esto significa que un mínimo cambio en la concentración del analito en
estudio debe generar una variación ponderable en la señal. La mínima
concentración detectable de un instrumento (diferenciable del ruido de
fondo) bajo las condiciones experimentales establecidas se denomina límite
de detección (LD). La mínima concentración de analito de una matriz que
puede ser determinada con aceptable precisión y exactitud bajo las
condiciones experimentales establecidas se denomina límite de
cuantificación (LQ). Un amplio rango dinámico de respuesta nos permitirá
analizar microcomponentes en presencia de macrocomponentes en una
determinada matriz.
• Respuesta lineal: el detector debe leer alguna propiedad del analito que
refleje un aumento
lineal de la señal con
un aumento lineal de la
concentración del
mismo. Se denomina
rango lineal de un
detector al rango de
concentraciones que
produce una respuesta
lineal en la señal. El
rango lineal está
contenido en el rango dinámico de respuesta.
• Ensanchamiento de banda extracolumnar: el ensanchamiento de

banda extracolumnar se define como la pérdida de eficiencia no adjudicable
a la columna
cromatográfica y se refleja
en los gráficos como un
ensanchamiento del pico
sobre la línea de base. La
causa principal del
ensanchamiento de banda
es la celda del detector y
el diámetro interno de las
tuberías. Para evitarlo, el
diámetro de las tuberías
debe ser el recomendado por el fabricante y el volumen interno de la celda
debe ser el menor posible sin que ello perjudique la sensibilidad de la
detección. Es evidente que el ensanchamiento en las bases de los picos en
un cromatograma compromete seriamente la separación de los mismos.

• Selectividad: bajo las condiciones experimentales empleadas, el

instrumento debe poseer la capacidad de separar las señales de todos los
analitos presentes en la matriz con una resolución adecuada. Esto no
siempre puede lograrse por la dificultad de separar la respuesta del
instrumento del soluto y del solvente en el que se encuentra disuelto.
Obviamente existe una gran variedad de detectores que obtienen
respuestas a partir de distintas propiedades físicas o químicas del analito.
• Sensibilidad apropiada: habitualmente esta propiedad se contrapone con

la universalidad de la detección. Detectores que responden a gran cantidad
de analitos poseen sensibilidades inferiores que aquellos específicos para un
conjunto reducido de analitos. Dentro de la sensibilidad podemos incluir el
tiempo de respuesta ante las variaciones instantáneas de la concentración
del analito. El detector más sensible será aquel que nos permitirá la
cuantificación de soluciones mucho mas diluidas.
• Estabilidad frente a la temperatura: la señal de un detector no debería

cambiar con la temperatura a excepción de aquellos en los que la
temperatura es un parámetro de trabajo. Algunos detectores poseen
intercambiadores de calor o termostatos para regular la temperatura en la
óptima de trabajo.
• Buena relación señal/ruido:

el ruido de un detector se
define como pequeñas
alteraciones en la línea de base
generadas por la electrónica,
variaciones de temperatura,
variaciones en la tensión de
línea o variaciones en el caudal
del sistema. Un detector con
buena relación señal/ruido
puede leer bajas concentraciones sin afectar la respuesta por el ruido de
fondo. Dicho en otras palabras poseen bajos límites de detección. En
algunos detectores, el envejecimiento de sus lámparas ocasiona líneas de
base ruidosas.
• No debe ser destructivo: esta propiedad es fundamental cuando se desea

recolectar cada fracción que sale del detector (cromatografía preparativa).
La mayoría de los detectores para HPLC no son destructivos de la muestra,
como excepciones pueden citarse el detector electroquímico y el detector de
masas. En el primero las muestras sufren un proceso de óxido-reducción,
mientras que en el segundo se produce la lisis de la molécula en distintas
fracciones.

CLASIFICACION DE LOS DETECTORES
Pueden clasificarse en generales y selectivos. Los detectores generales son

aquellos que miden el cambio de alguna propiedad física de la fase móvil que
contiene el analito en comparación con la fase móvil “pura”. Por ejemplo,
detector de índice de refracción y detector de conductividad. Los detectores
selectivos son aquellos sensibles a alguna propiedad propia del soluto. Por
ejemplo detector UV, de fluorescencia, electroquímico, etc.
DETECTORES GENERALES
Detector de índice de refracción: mide la diferencia del índice de refracción

entre el solvente puro y el solvente que
contiene la muestra. Es un detector universal y
no destructivo. Como desventajas podemos
citar que es poco sensible, se ve muy afectado
por las variaciones de temperatura y no acepta
gradiente de solventes (variación constante del
índice de refracción). Una conformación simple
de un detector de índice de refracción consta
de una fuente luminosa que emite luz hacia
dos celdas de vidrio (una con la fase móvil y la
otra con el solvente y el analito) en las que se
produce la refracción. Los ángulos de refracción dependerán por supuesto del
índice de refracción del solvente de cada celda. La luz refractada es conducida
hacia un fotomultiplicador a través de un sistema óptico.

DETECTORES SELECTIVOS
Detector UV: es el más empleado en HPLC. Posee buena sensibilidad, rango

lineal y permite detectar analitos en el orden de los nanogramos. No es
destructivo y puede emplearse con gradiente de solventes (siempre que éstos
sean transparentes a la longitud de onda de trabajo). Es un detector muy poco
sensible a los cambios de caudal y temperatura y poseen celdas de distintos
volúmenes (de 1 a 12 µL) según el tipo de cromatografía empleada. Trabaja en
un rango de longitud de onda de 190 a 690 nm por lo que comúnmente se lo
denomina detector UV/visible. La concentración del analito en la muestra se
determina por aplicación de la ley de Beer: A= a*b*C, donde A es la
absorbancia, a es la absortividad molar del analito, b es el camino óptico de la
celda en cm y C es la concentración de la muestra expresada en moles/L.
Existen dos tipos de detectores UV: los de longitud de onda variable y los de
arreglo de diodos.
Detector de longitud de onda variable: es un simple espectrofotómetro, en

el cual se reemplaza la cubeta de cuarzo por una celda de flujo. Cuentan con
una fuente de energía o lámpara de Deuterio o Xenón que irradia un
fotocromador (prisma o red de difracción) que separa el haz de luz en un
abanico de longitudes de onda. De esta manera podemos seleccionar aquella
longitud de onda de máxima absorción del analito para aumentar la
sensibilidad. La luz incide en la celda de flujo y de allí a un fotomultiplicador.
Cuando el analito atraviesa el camino óptico, se produce una diferencia de
absorción de la luz que se traduce en un impulso eléctrico capaz de ser
registrado por un integrador o una computadora.
Detector de arreglo de diodos: en un detector de longitud de onda variable,

la red de difracción se ubica entre la fuente luminosa y la celda de flujo. Por lo
tanto, la celda recibe luz monocromada que es colectada por un único
fotodiodo. En un detector de arreglo de diodos, la red de difracción se ubica a
continuación de la celda, o sea, que la celda es irradiada por todo el espectro
de luz y la radiación emergente de la misma incide sobre la red de difracción

que dispersa los rayos monocromados. Los equipos más modernos cuentan con
un fotodiodo para cada longitud de onda por lo que es posible obtener la señal
del analito en todo el abanico de longitudes de onda en forma simultánea.
Estos tipos de detectores son los más utilizados en los departamentos de
desarrollo analítico ya que permite evaluar la pureza de los picos.
Mientras en un detector variable podemos graficar en dos dimensiones

Absorbancia vs tiempo, en un detector de arreglo de diodos podemos agregar
una tercera dimensión: longitud de onda. De esta manera podemos visualizar el
espectro de absorción ultravioleta del analito a cada longitud de onda. La
presencia de una impureza podrá ser fácilmente detectada por la existencia de
un espectro ultravioleta extraño o no similar al correspondiente al analito en
estudio.
Por ejemplo, si realizamos una determinación cromatográfica de una mezcla de
analitos a una determinada longitud de onda (254 nm) podríamos obtener
algo así:
DAD1 A, Sig=254,4 Ref=350,80 (E:\ABRIL2~3\DSN2504\SIG10002.D)
9.611
mAU
5.051
350
8.076
300
6.239
250
17.068
15.785
200
150
100
2.221
50
2.123
2.498
0 5 10 15 20 min

Con este mismo detector podríamos obtener fácilmente el barrido

espectrofotométrico de cada uno de los picos:
DAD1, 5.096 (298 mAU, - ) of SIG10002.D DAD1, 6.249 (351 mAU, - ) of SIG10002.D
mAU mAU
250 300
250
200
200
150
150
100
100
50
50
0 0
200 225 250 275 300 325 350 375 nm 200 225 250 275 300 325 350 375 nm
mAU mAU
1600
800 1400
1200
600
1000
800
400
600
400
200
200
0 0
200 225 250 275 300 325 350 375 nm 200 225 250 275 300 325 350 375 nm
mAU mAU
160
200
140
175
120
150
100
125
80
100
60
75
50 40
25 20
0 0
200 225 250 275 300 325 350 375 nm 200 225 250 275 300 325 350 375 nm

Cada gráfico corresponde al barrido espectral de cada uno de los seis picos del
cromatograma. En la parte superior se puede observar el tiempo de retención.
Estos barridos nos permiten seleccionar la mejor longitud de onda para realizar
la corrida HPLC. Por ejemplo, si se seleccionara como longitud de onda 280
nm, los picos correspondientes a 6.2, 8.0 y 17.2 minutos no se verían en
absoluto en el cromatograma y el de 17.7 prácticamente no se vería.
Obviamente, esto no significa que el método no es lo suficientemente eficiente
como para separar los distintos analitos. Muy por el contrario, sabemos que los
analitos están separados entre si pero no todos son detectados. A 280 nm el
cromatograma sería el siguiente:
DAD1 B, Sig=280,4 Ref=500,80 (E:\ABRIL2~3\DSN2504\SIG10005.D)
9.607
mAU
350
5.053
300
250
200
150
100
15.771
50
0 5 10 15 20 min
Con un detector de arreglos de diodos, se puede visualizar simultáneamente el

cromatograma y cada uno de los barridos espectrales en un gráfico
tridimensional. Este gráfico es útil para determinar en forma clara y rápida, cual
sería o serían las mejores longitudes de onda para setear en el detector a las
cuales se obtendría un cromatograma con señal significativa para cada uno de
los picos.
En la práctica, si no se cuanta con un detector de este tipo, es muy útil realizar
en forma individual un barrido espectrofotométrico de cada sustancia pura en
solución en un espectrofotómetro UV-visible convencional. Una vez evaluados
los barridos se determina la longitud de onda adecuada. Si no existe una
longitud de onda que nos permita obtener una buena lectura para cada
sustancia, se puede realizar lo que se denomina corte de longitud de onda.
El mismo consiste en cambiar la longitud de onda en distintas zonas de la
corrida HPLC para que cada pico pueda ser evaluado en un máximo de
absorbancia.

Detector de fluorescencia: se utiliza para analitos que presentan

fluorescencia natural o es conferida por alguna reacción de derivatización con
un reactivo fluorogénico. Su alta sensibilidad y selectividad lo convierten en una
herramienta
fundamental para
el análisis de
trazas. La
selectividad puede
explicarse ya que
no existe un gran
número de
sustancias con
fluorescencia
nativa y por otro
lado, sólo se
utilizan dos
longitudes de
onda: una para la
excitación y la
otra para la
emisión. Al excitar
la muestra con
una determinada

longitud de onda, varios componentes de la muestra podrían absorber energía

pero sólo unos pocos tienen la capacidad de emitir a la longitud de onda
seleccionada.
La luz emitida por la lámpara de Xenón se dirige al monocromador de
excitación G1 por medio de un espejo cóncavo M1 a través de la ranura de
entrada S1. El haz monocromado sale por la ranura S2, se focaliza en un
espejo esférico M2 e incide en un separador de ondas (BS). De aquí, casi la
totalidad del haz luminoso entra en la celda de medida y un 7% incide en un
fotomultiplicador PM1 para el control de la intensidad. La emisión del haz
luminoso que sale de la celda pasa al monocromador de emisión, formado por
la ranura de salida S3 y un espejo plano S3, una red de difracción cóncava G2
y una ranura de salida S4 siendo detectado por el fotomultiplicador PM2 que
va a generar la señal de salida. La lámpara de Xenón es la fuente de emisión
más ampliamente difundida por producir un espectro continuo en el rango 260
a 660 nm y de muy alta intensidad.
Los compuestos que no presentan fluorescencia nativa pueden derivatizarse
con reactivos específicos para dar compuestos fluorescentes
Detector electroquímico: es 1000 veces más sensible que el detector UV y

altamente selectivo. La selectividad se debe por un lado a que sólo detecta
compuestos capaces de oxidarse o reducirse y además se pueden ajustar los
potenciales del instrumento para que los procesos redox sean más específicos.
La detección de compuestos electrooxidables o electrorreducibles ocurre en la
superficie de un electrodo interpuesto en el paso del eluído de la columna. Este
detector emplea tres electrodos: el electrodo de trabajo, el electrodo de
referencia y el electrodo auxiliar. La reacción redox es inducida en el electrodo
de trabajo, mientras que el electrodo auxiliar provee la carga de neutralización
complementaria. Entre estos electrodos se fija el voltaje apropiado para la
detección. El electrodo de referencia produce un potencial fijo y estable. Se
genera una diferencia de potencial entre el electrodo de trabajo y el electrodo
auxiliar que se monitorea con el electrodo de referencia. Un amplificador de
corriente de nanoamperes produce una señal de salida, proveniente del flujo de
corriente entre los
electrodos auxiliar y de
referencia, causada por
la transferencia de
electrones del proceso
de óxido-reducción.
Su principal limitación es
que sólo pueden
utilizarse fases móviles
conductivas (fase
reversa, intercambio
iónico) y por otro lado es
evidente la naturaleza
destructiva de este
instrumento. Para la
construcción de los

electrodos se usa principalmente carbón y en menor proporción platino, oro y

mercurio.
La desgasificación es esencial en el modo reductivo y debe ser continua durante
todo el análisis, ya que la presencia de oxígeno disuelto en la fase móvil origina
un gasto de
potencial de
reducción adicional
consumido para la
reducción de este
oxígeno. En modo
oxidativo se
pueden utilizar los
métodos de
desgasificación
generales.
La presencia de hierro y sus óxidos presentes en la fase móvil en forma de
iones, y proveniente de tuberías metálicas, válvulas, bombas, etc, son
electroquímicamente activos y pueden generar corrientes de fondo y derivas en
la señal. Es estos casos es conveniente adicionar EDTA 0,01 M a la fase móvil
para complejar estos iones.
Sistema de procesamiento de datos
El resultado de un ensayo cromatográfico

es, por un lado, la obtención de
fracciones separadas de los analitos de la
muestra en estudio, y por el otro, la de un
cromatograma, de cuya interpretación
pueden extraerse conclusiones
cualitativas y cuantitativas. Como se
mencionó anteriormente, el detector es el
encargado de generar una señal eléctrica
analógica a partir de alguna propiedad
física del analito que es tomada por el
equipo de registro de datos que la
representa en forma de gráfico X-Y (señal vs tiempo). El registrador que tiene
la capacidad de integrar el gráfico obtenido, es decir, es capaz de obtener el
área bajo la curva y hasta la línea de base es llamado integrador.
Los equipos más sofisticados usan una computadora personal para realizar la
integración de los gráficos obtenidos, pero para ello se interpone una interfase
que convierte la señal analógica del detector a digital. Estas computadoras son
capaces de comandar también cada módulo del instrumento, almacenar
ensayos cromatógraficos, generar reportes automatizados y automatización de
todo el proceso cromatográfico.

Por lo tanto, el integrador evalúa por un proceso de integración entre dos

puntos el área bajo la curva. Esos dos puntos representan el tiempo de inicio y
el tiempo de finalización de cada señal.
Los datos mas importantes en un cromatograma son los siguientes:

0.748
mAU
200
1.025
175
150
125
100
2.580
75
5.875
50
25
3.444
0 1 2 3 4 5 6 7 min
Signal 1: DAD1 A, Sig=254,4

Peak RetTime Type Width Area Height Area
# [min] [min] [mAU*s] [mAU] %
----|-------|----|-------|------------|---------|--------|
1 0.748 BV 0.0448 644.06689 228.97394 29.6952
2 1.025 VB 0.0519 574.38232 167.77222 26.4823
3 2.580 BB 0.1014 386.91208 58.33243 17.8389
4 3.444 BB 0.1189 12.31033 1.51412 0.5676
5 5.875 BB 0.2242 551.25665 36.50248 25.4161
Totals : 2168.92828 493.09519

En el informe se ve:
El número de cada pico
El tiempo de retención en minutos
El tipo de integración. Representa de que manera el registrador realiza la
integración (B: Baseline; V; Valey)
El ancho de cada pico medido en minutos. Siempre los picos más anchos suelen
ser aquellos que más se retienen.
El área
Altura
Porcentaje de áreas

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CURSO BASICO DE HPLC

Curso básico de HPLC

CURSO BASICO DE HPLC

• El presente curso está orientado para alumnos con conocimientos de

Objetivos del curso:

• Introducir al alumno en los conceptos básicos de la cromatografía y en

• Desarrollar un estudio detallado del instrumental centrándose en las

• Citar el alcance de la HPLC y sus usos en la industria.

• Realizar experiencias en el laboratorio con el instrumental para fijar los

Contenido del curso:

1. Historia y Conceptos básicos. Cromatografía. Formas de cromatografía

3. Bases de la separación. Parámetros estudiados a partir de un

4. Solventes. Propiedades físicas y químicas. Usos.. Modificadores y aditivos.

Lic. Pablo Gonzalez 1

5. Cromatografía de fase ligada. El material de relleno. Características.

6. Cromatografía en fase normal. Materiales de relleno. Fase móvil.

7. Cromatografía de intercambio iónico. Generalidades. Materiales de

8. Cromatografía de exclusión molecular. Generalidades. Mecanismos de

10. Experiencia práctica.

Lic. Pablo Gonzalez 2

Lic. Pablo Gonzalez 3

1. Historia y Conceptos básicos:

El botánico ruso Mikhail Tswett fue el primero en desarrollar la técnica

La técnica se bautiza con el nombre cromatografía derivado de dos palabras

Lic. Pablo Gonzalez 4

• Clasificación según la naturaleza de la fase móvil: si la fase móvil es

Lic. Pablo Gonzalez 5

inconvenientes principales de este tipo de cromatografía son las matrices

Las bases de la separación cromatográfica son considerablemente

La diferencia fundamental entre GC y HPLC radica en el tipo de detección y

Lic. Pablo Gonzalez 6

• Clasificación según la naturaleza de la fase estacionaria:

Cromatografía Gas-Líquido (GLC) (Gas – Liquid Chromatography)

• Clasificación según el fenómeno que ocurre dentro de la columna:

• Clasificación según la cantidad de muestra aplicada:

En el rango ng-µg (10-9 a 10-6 gramos/mL): cromatografía analítica. Es la

En el rango µg-g: cromatografía semipreparativa. Es un tipo de

Mayor al gramo: cromatografía preparativa. Es utilizada principalmente

Lic. Pablo Gonzalez 7

Formas de cromatografía líquida:

• Cromatografía líquido-sólido (LSC) o de adsorción.

• Cromatografía líquido-líquido (LLC) o de partición.

Lic. Pablo Gonzalez 8

En la cromatografía en papel, la fase estacionaria no es el papel

Lic. Pablo Gonzalez 9

• Cromatografía de fase ligada (BPC)

• Cromatografía de intercambio iónico (IEC).

Lic. Pablo Gonzalez 10

• Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).

Como se ha visto, existe una amplia variedad de tipos de cromatografía que

Lic. Pablo Gonzalez 11

Lic. Pablo Gonzalez 12

Basándonos en la definición de cromatografía, es evidente que debe existir una

El sistema de bombeo es el primer módulo y es el que dosifica la fase móvil a

Lic. Pablo Gonzalez 13

Los cromatógrafos líquidos pueden clasificarse en integrados o modulares.

En un equipo modular, cada uno de los órganos es un instrumento diferente, de

Lic. Pablo Gonzalez 14

Las características fundamentales de una bomba para cromatografía líquida son

Lic. Pablo Gonzalez 15

• Materiales inertes: Las bombas están construidas en su mayoría de acero

• Caudales variables y exactos: las bombas deben entregar un caudal