Protocolo de Validacion de Un Metodo Analítico Hplc-1-1 Final¡¡¡¡¡¡¡

PROTOCOLO DE VALIDACIÓN POR
LA TÉCNICA ANALÍTICA DE HPLC

PARA ALBENDAZOL
(SUSPENSIÓN ANTIPARASITARIA)
INGENIERÍA EN QUÍMICA
FARMACÉUTICA
VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS
RESPONSABLES:
PROFESOR:
SAN JUAN DEL RÍO, QRO. AGOSTO DE 2019
“La mejor Universidad para los mejores alumnos”

Código PDV.01.19.01
Protocolo de Validación HPLC
Fecha de Emisión Agosto 2019
Contenido
1. Objetivo....................................................................................................................................... 2
2. Motivo del estudio...................................................................................................................... 3
3. Justificación ................................................................................................................................ 3
4. Abreviaturas/Definiciones ......................................................................................................... 4
5. Información general................................................................................................................... 6
6. Responsabilidades .................................................................................................................... 7
7. Fundamento de la técnica analítica ......................................................................................... 8
8. Recursos (Material, equipos, reactivos y métodos) ............................................................... 9
9. Plan de pruebas de los parámetros a evaluar...................................................................... 10
10. Criterios de aceptación ............................................................................................................ 12
11. Cálculos..................................................................................................................................... 14
12. Historial de cambios................................................................................................................. 15
13. Autorizaciones .......................................................................................................................... 15
1. Objetivo
Establecer un protocolo de validación para el método analítico por HPLC para el control de
la calidad de albendazol suspensión antiparasitaria
REALIZÓ: REVISÓ: SUPERVISÓ AUTORIZÓ
_______________ _______________ ________________ _____________

J. ORTIZ R. JIMÉNEZ I.MENTADO S.GALICIA
Pagina 2 de 18
2. Motivo del estudio
La validación del método se realiza para para verificar que el método cumpla con las
especificaciones de linealidad del sistema, precisión del sistema, linealidad del método,
exactitud, precisión del método, especificidad, robustez, etc. Y que este sea reproducible
3. Justificación
La validación es el proceso para la obtención de pruebas documentadas de que el método

es lo suficientemente fiable para producir el resultado esperado.
Se realiza la validación con el objetivo de cumplir la normatividad en la que aplique como la
NOM-059 SSA1.2015, NOM 241-SSA1, FEUM, entre otros.
_______________ _______________ ________________ _____________

Pagina 3 de 18
4. Abreviaturas/Definiciones
SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS
Buenas prácticas de
BPL Sm Solución de la muestra
laboratorio
RU Requerimientos de usuario SRef Sustancia de referencia
VA Validación Hplc Cromatografía de líquidos
CV Coeficiente de variación IC Intervalo de confianza
mL Mililitro L Litro
mg Miligramo g Gramo
Farmacopea de los estados

FEUM n.a No aplica
unidos mexicanos
%
±
Porcentaje. Más menos
> Mayor que. < Menor o igual que.
°C
> Mayor o igual que. Grado Celsius
Buenas prácticas de laboratorio: al conjunto de reglas, procedimientos operacionales y

prácticas establecidas para asegurar la calidad e integridad de las actividades realizadas
en el laboratorio y de los datos analíticos obtenidos de ensayos o pruebas.
Calidad: al cumplimiento de especificaciones establecidas para garantizar la aptitud de uso.
Criterio de aceptación: a las especificaciones, estándares o intervalos predefinidos que
deben cumplirse bajo condiciones de prueba preestablecidas.
Cromatógrafo de líquidos (HPLC): es un equipo de laboratorio que permite separar las
diversas sustancias que están presentes en una muestra.
_______________ _______________ ________________ _____________

Pagina 4 de 18
Desviación o no conformidad: al no cumplimiento de un requisito previamente establecido

Especificación de requerimientos de usuario (RU): es el documento que define
claramente las funciones que debe realizar y las especificaciones que debe cumplir un
sistema crítico, un equipo, servicio, área o sistema computarizado antes de su diseño,
adquisición, modificación, construcción, ampliación, actualización e implementación.
Especificidad: capacidad del método para cuantificar el analito sin interferencia de los
demás componentes de la muestra
Exactitud: Concordancia entre un valor obtenido empleando el método y el valor real
Linealidad: habilidad para asegurar que los resultados obtenidos directamente o por medio
de una transformación matemática son proporcionales a la concentración del analito en un
intervalo determinado.
Placebo: Muestra que contiene todos los componentes de una muestra a excepción del
analito.
Placebo adicionado: muestra de placebo a la cual se le adiciona una cantidad conocida
de analito para observar el comportamiento del método en presencia del placebo
Precisión: Grado de concordancia entre los resultados analíticos individuales
Protocolo: al plan de trabajo escrito que establece los objetivos, procedimientos, métodos
y criterios de aceptación, para realizar un estudio.
Registro: al documento que presenta evidencia de las acciones realizadas para demostrar
el cumplimiento de actividades o instrucciones.
Requisito: a la circunstancia o condición necesaria para el cumplimiento de una obligación.
Validación: evidencia documentada generada por recopilación y evaluación científica
obtenida en la calificación y de las pruebas específicas a lo largo de todo el ciclo de vida de
un producto.}
Validación de un método analítico: es el proceso por el cual se demuestra a través de
estudios de laboratorio que una metodología analítica cumple con los requisitos y
características necesarias para una aplicación analítica particular
_______________ _______________ ________________ _____________

Pagina 5 de 18
5. Información general
Estructura química del fármaco
Fármaco compuesto por dos anillos fusionados de un benceno y un imidazol con un radical
carbamato en posición dos y un sustituyente en posición propilsulfonil.
Propiedades fisicoquímicas del fármaco
Propiedades físicas y químicas Especificación

Metil N-(6-propilsulfonil-1H-benzoimidazol-2-il)
Nomenclatura (IUPAC)
carbamato
Formula C12H15N3O2S
Peso molecular 265.34 g/mol
Estado físico Sólido
Punto de fusión 208-210°C
Fácilmente soluble en ácido fórmico anhidro, muy

Solubilidad poco soluble en éter dietílico y cloruro de metilo,
casi insoluble en agua y alcohol
Coeficiente de extensión y espectro UV-

Coeficiente de extinción 3.88 (Dicloroetano)
Vis
La absorbancia se mide aproximadamente a 295
Absorbancia nm en una solución equivalente de ácido acético
(1.05 mol/L-1), concentración 1.0 g/ml
_______________ _______________ ________________ _____________

Pagina 6 de 18
Forma farmacéutica
Solución antiparasitaria
Uso:
El albendazol es un fármaco antiparasitario perteneciente al grupo de los bencimidazoles

que posee tanto acción local como sistémica. Fue aprobado para uso en humanos en 1982
bajo el nombre comercial de ZENTEL®. En la Latinoamérica el albendazol es el fármaco de
elección para el tratamiento de ascariasis, enterobiasis, uncinariasis, tricocefalosis, teniasis,
estronguiloidosis, himenolepiasis, así como para el tratamiento de la neurocisticercosis.
El albendazol es un medicamento cuya acción farmacológica lo define como un
antihelmíntico, de amplio espectro, con efecto adulticida, herbicida y ovicida, sobre
nemátodos gastrointestinales (Haemonchus, Ostertagias, Trichostrongylus,
Nematodirus, Cooperia, Bonustomun, Strongyloides, Anpillaria, Chavertias,
Neoascaris vitailorum, Teuchuris y Oesophagostomum), nemátodos pulmonares
(Dictyocaulus viviparus) y cestodos (Fasciola hepática). Los enfermos de sida, deben
combatir la criptosporidiosis producida por un protozoo del género Eimeria, el cual se
encuentra asociado generalmente a esta enfermedad y para lo cual este medicamento es
eficiente.
6. Responsabilidades
Departamento de Validaciones
 Emitir y/o actualizar el Protocolo de validación.
 Entregar para su revisión el presente Protocolo de validación
 Ejecutar el presente Protocolo de validación
 Solicitar a las áreas involucradas la información documental y técnica de soporte
 Revisar y firmar el presente protocolo de validación
 Verificar y dar seguimiento a acciones correctivas, controles de cambios
 Departamento de calidad
 Generar documentación necesaria

 Asegurar el seguimiento y aplicación de los sistemas de calidad.
 Participar en la administración de la documentación BPF.
 Examinará y aprobará el protocolo y el informe de la validación del proceso.
_______________ _______________ ________________ _____________

Pagina 7 de 18
 supervisar el estudio
 comprobará que estén completos los registros y redactar el informe.
7. Fundamento de la técnica analítica
En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna
que contiene a la fase estacionaria. La separación cromatográfica en HPLC es el resultado
de las interacciones específicas entre las moléculas de la muestra en ambas fases, móvil y
estacionaria
A diferencia de la cromatografía de gases, la cromatografía de líquidos de alto rendimiento

(HPLC, de high-performance liquid chromatography) no está limitada por la volatilidad o la
estabilidad térmica de la muestra.
La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales

lábiles, materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos poli funciónales de alto
peso molecular. Con una fase móvil líquida interactiva, otro parámetro se encuentra
disponible para la selectividad, en adición a una fase estacionaria activa.
La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama
de estas interacciones selectivas y más posibilidades para la separación.
Aplicaciones
Campos de Aplicación de HPLC
 Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides, analgésicos

 Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos
 Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas,
aditivos
 Productos de la industria química: Aromáticos condensados, tenso-activos,
propulsores, colorantes
 Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB
 Química forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcóticos
 Medicina clínica: Ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina,
estrógenos.
Funcionamiento del servicio
_______________ _______________ ________________ _____________

Pagina 8 de 18
Las muestras deben ir acompañadas de la hoja de solicitud de servicios generada en esta

página web una vez realizado el registro en la misma. El usuario debe rellenar todos los
campos de la solicitud de servicios que conozca, con el fin de obtener el mejor resultado
posible.
Equipos
HPLC
 Bomba cuaternaria
 Detector de longitud de onda variable
 Detector de diodo y de longitud de onda variable
 Detector de índice de refracción
 Detector de fluorescencia
8. Recursos (Material, equipos, reactivos y métodos)
 Documentación técnica de cromatógrafo de líquidos marca Shimadzu

 Sustancias de referencias de albendazol
 El producto terminado en forma de suspensión
 Todos los reactivos utilizados deben ser de calidad analítica.
 En el ensayo se empleara un cromatógrafo (KNAUER) con detector UV/VIS
(KNAUER) ajustado a 298 nm,
 Un inyector con un rulo de 20 µL e integrador (SHIMADZU CR 8 A).
 Columna Lichrosorb RP-18 (5 µm) (250 mm x 4 mm), a una temperatura de 35 o C
y un flujo de 1,0 mL/min.
 La fase móvil óptima, consistió en una mezcla desgasificada de acetonitrilo:buffer
acetato de amonio pH 6,6 (70:30); como diluente se empleó metanol.
 Baño ultrasónico
 Matraz volumétrico de 100 Ml
 Espátula
 Baño ultrasónico
 Parrilla de agitación y calentamiento
 Balanza analítica
 HPLC
 Matraces volumétricos
 Pipetas volumétricas
 Vasos de precipitado
 Perillas
 Agua des ionizada
_______________ _______________ ________________ _____________

Pagina 9 de 18
 Pizeta
 Metanol
9. Plan de pruebas de los parámetros a evaluar
Método por HPLC
Cromatógrafo (KNAUER) con detector UV/VIS (KNAUER) ajustado a 298 nm
Inyector con un rulo de 20 µL e integrador (SHIMADZU CR 8 A).
Columna Lichrosorb RP-18 (5 µm) (250 mm x 4 mm)
Temperatura de 35 o C y un flujo de 1,0 mL/min.
Fase móvil óptima, que consista en una mezcla des gasificada de acetonitrilo:
buffer acetato de amonio pH 6,6 (70:30)
Diluente mezcla de metanol ácido acético (99:1)
Preparación de la muestra. Pesar 50 mg de muestra; pasar a un volumétrico de 100 ml

adicionándose una mezcla de metanol ácido acético (99:1); colocar la muestra en un baño
ultrasónico por 5 min y completar a volumen con metanol ácido acético (99:1). Tomar 1 ml
de la solución anterior y trasvasar a un volumétrico de 100 ml adicionándose una mezcla
de metanol ácido acético (99:1), aplicar ultrasonido por 3 min y aforar a volumen con
metanol (concentración de trabajo 10 µg/ml de albendazol).
Preparación de la sustancia de referencia química albendazol. Colocar 10 mg de

sustancia de referencia química de albendazol en un volumétrico de 100 ml y adicionar una
mezcla de metanol ácido acético (99:1); se aplicó ultrasonido por 5 min y se completó
volumen con metanol ácido acético (99:1).
Linealidad del sistema. Para el análisis de la linealidad, realizar los modelos de tres
determinaciones para cinco concentraciones diferentes de la sustancia de referencia
química:(2ML)60, (3ML)80, (4ML)100, y(ML)120 del principio activo a cuantificar
(albendazol). Determinar la ecuación de la recta, así como los demás datos que definen la
linealidad.
_______________ _______________ ________________ _____________

Pagina 10 de 18
Precisión del sistema. Para los estudios de la precisión; se sugieren los modelos de
repetibilidad seis réplicas para la cuantificación del principio activo (albendazol) Con ellas
determinar los valores medios, la desviación estándar y el coeficiente de variación.
Límite de detección. Preparar 6 muestras de placebo disolviendo, en 6 matraces aforados

de 10 mL, 50mg (albendazol) y aforar con fase móvil, someter a condiciones de ultrasonido
en un baño de agua durante 5 minutos, filtrar e inyectar 5 µL de cada muestra.
Independientemente, preparar 3 curvas con 3 concentraciones de placebo adicionado a
concentraciones de 4, 8 y 10 g/mL.
Límite de cuantificación. Con los datos obtenidos de la linealidad del sistema, obtener los
valores teóricos de las concentraciones utilizadas, por medio de la interpolación en la curva.
Linealidad del método. Para el análisis de la linealidad, realizar los modelos de tres
determinaciones para cinco concentraciones diferentes de la sustancia de referencia
química: (3mL + placebo)60, (4mL + placebo)80, (5mL + placebo)100, (5.5mL +
placebo)110 y (6mL + placebo)120 del principio activo a cuantificar (albendazol).
Determinar la ecuación de la recta, así como los demás datos que definen la linealidad.
Precisión del método. Para los estudios de la precisión; se sugieren los modelos de
repetibilidad seis réplicas para la cuantificación del principio activo (albendazol) Con ellas
determinar los valores medios, la desviación estándar y el coeficiente de variación.
Exactitud del método. Para el análisis de exactitud; realizar los modelos de tres réplicas
de placebo cargado para tres concentraciones diferentes: (3mL)80, (4mL)100, y(mL)120,
para el albendazol empleando el método de recuperación; obtener los % de recuperación,
las desviaciones estándar y los coeficientes de variación.
Especificidad del método. Para el estudio de especificidad, analizar la sustancia de

referencia de albendazol, el placebo sin albendazol y las muestras de producto terminado.
Reproducibilidad. Realizar 6 repeticiones con la muestra de referencia, en dos días

diferentes con diferente analista cada día. La concentración del material de referencia debe
ser constante para los dos días, hasta la lectura en el cromatógrafo líquido de alta
resolución.
Selectividad del método. Preparar tres muestras que contengan placebo (50 mg de
albendazol), una muestra blanco (fase móvil), y una muestra de placebo adicionado (50 mg
de albendazol aforar a 10 mL, sonicár por 5 minutos, filtrar y colocar en viales. Inyectar
volúmenes de 50 L de cada vial.
_______________ _______________ ________________ _____________

Pagina 11 de 18
Determinar si el ABC obtenida a partir de la muestra de placebo adicionado en el tiempo de

retención de alguna sustancia, o a la interacción con alguno de los componentes del
placebo.
Estabilidad de la muestra. Preparar por triplicado, tres placebos adicionados a una

concentración de 50 g/mL, Colocar por cinco minutos, filtrar y colocar en viales.
Ocho viales de cada muestra colocar a cuatro temperaturas diferentes (22ºCbajo cero, 5ºC,
20ºC y 30ºC respectivamente) e inyectar a las 0, 1, 2, 4, 6, 20 y 24 horas. De los valores de
ABC obtenidos, calcular las diferencias absolutas entre las muestras y un análisis de
varianza de un factor para determinar la condición y tiempo máximo de almacenamiento de
las muestras.
Robustez del método.
Cambio de la preparación de la solución buffer pH 6.6
Buffer acetato de amonio pH 6.6: Disolver en 400 mL de agua, 2.3 gramos de acetato de
amonio. Filtrar la solución y sónicar por 30 minutos.
Cambio en la longitud de onda de lectura de las muestras
Preparar 6 muestras independientemente a 50 g/ mL, inyectar 50 L y leer con una

diferencia de 10 nm del método cromatográfico a 298 nm.
Cambio en la proporción de la fase móvil
Cambiar la proporción de la fase móvil establecida mezcla des gasificada de acetonitrilo:

buffer de acetato de amonio pH 6.6 a una proporción de 70:30 respectivamente.
A partir de las ABC de estos experimentos, Calcular los efectos, las varianzas de efecto y
los errores estandarizados del efecto, y posteriormente calcular t de Student de cada efecto
(proporción de la fase móvil y preparación de la solución buffer).
10. Criterios de aceptación

PARAMETROS DE DATOS EVALUADOS CRITERIOS
DESEMPEÑO
LINEALIDAD DEL SISTEMA Coeficiente de correlación
Coeficiente de determinación
coeficiente de variación de f
(x,y)
_______________ _______________ ________________ _____________

Pagina 12 de 18
Prueba T-Student
LINEALIDAD DEL METODO coeficiente de correlación
coeficiente de determinación
coeficiente de variación de f
(x,y)
prueba T-Student
EXACTITUD recuperación promedio
test G Cochran
test estadístico t de Student
PRECISION Repetibilidad del sistema
Repetibilidad del método
Precisión intermedia
_______________ _______________ ________________ _____________

Pagina 13 de 18
11. Cálculos
_______________ _______________ ________________ _____________

Pagina 14 de 18
12. Historial de cambios
No. estudio / Emisión Motivo

01-01 Implementación Inicial de nuevo documento
13. Autorizaciones
Nombre Firma Fecha
Sergio Galicia Chavarría

Químico de Validación
Rey ángel Jiménez Navarrete

Jefe de Validación
José Lisandro Ortiz Reséndiz

Jefe de control de calidad
Imelda mentado moreno

Supervisor de calidad
_______________ _______________ ________________ _____________

Pagina 15 de 18

Protocolo de Validacion de Un Metodo Analítico Hplc-1-1 Final¡¡¡¡¡¡¡

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Protocolo de Validacion de Un Metodo Analítico Hplc-1-1 Final¡¡¡¡¡¡¡

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

PROTOCOLO DE VALIDACIÓN POR

LA TÉCNICA ANALÍTICA DE HPLC

SAN JUAN DEL RÍO, QRO. AGOSTO DE 2019

“La mejor Universidad para los mejores alumnos”

REALIZÓ: REVISÓ: SUPERVISÓ AUTORIZÓ

_______________ _______________ ________________ _____________

2. Motivo del estudio

La validación es el proceso para la obtención de pruebas documentadas de que el método

REALIZÓ: REVISÓ: SUPERVISÓ AUTORIZÓ

_______________ _______________ ________________ _____________

RU Requerimientos de usuario SRef Sustancia de referencia

VA Validación Hplc Cromatografía de líquidos

CV Coeficiente de variación IC Intervalo de confianza

Farmacopea de los estados

> Mayor que. < Menor o igual que.

Buenas prácticas de laboratorio: al conjunto de reglas, procedimientos operacionales y

REALIZÓ: REVISÓ: SUPERVISÓ AUTORIZÓ

_______________ _______________ ________________ _____________

Desviación o no conformidad: al no cumplimiento de un requisito previamente establecido

REALIZÓ: REVISÓ: SUPERVISÓ AUTORIZÓ

_______________ _______________ ________________ _____________

Estructura química del fármaco

Propiedades fisicoquímicas del fármaco

Propiedades físicas y químicas Especificación

Fácilmente soluble en ácido fórmico anhidro, muy

Coeficiente de extensión y espectro UV-

REALIZÓ: REVISÓ: SUPERVISÓ AUTORIZÓ

_______________ _______________ ________________ _____________

El albendazol es un fármaco antiparasitario perteneciente al grupo de los bencimidazoles

 Generar documentación necesaria

REALIZÓ: REVISÓ: SUPERVISÓ AUTORIZÓ

_______________ _______________ ________________ _____________

7. Fundamento de la técnica analítica

A diferencia de la cromatografía de gases, la cromatografía de líquidos de alto rendimiento

La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales

Campos de Aplicación de HPLC

 Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides, analgésicos

Funcionamiento del servicio

REALIZÓ: REVISÓ: SUPERVISÓ AUTORIZÓ

_______________ _______________ ________________ _____________

Las muestras deben ir acompañadas de la hoja de solicitud de servicios generada en esta

8. Recursos (Material, equipos, reactivos y métodos)

 Documentación técnica de cromatógrafo de líquidos marca Shimadzu

REALIZÓ: REVISÓ: SUPERVISÓ AUTORIZÓ

_______________ _______________ ________________ _____________

9. Plan de pruebas de los parámetros a evaluar

Método por HPLC

Cromatógrafo (KNAUER) con detector UV/VIS (KNAUER) ajustado a 298 nm

Inyector con un rulo de 20 µL e integrador (SHIMADZU CR 8 A).

Columna Lichrosorb RP-18 (5 µm) (250 mm x 4 mm)

Temperatura de 35 o C y un flujo de 1,0 mL/min.

buffer acetato de amonio pH 6,6 (70:30)

Diluente mezcla de metanol ácido acético (99:1)

Preparación de la muestra. Pesar 50 mg de muestra; pasar a un volumétrico de 100 ml

Preparación de la sustancia de referencia química albendazol. Colocar 10 mg de

REALIZÓ: REVISÓ: SUPERVISÓ AUTORIZÓ

_______________ _______________ ________________ _____________

Límite de detección. Preparar 6 muestras de placebo disolviendo, en 6 matraces aforados

Especificidad del método. Para el estudio de especificidad, analizar la sustancia de

Reproducibilidad. Realizar 6 repeticiones con la muestra de referencia, en dos días

REALIZÓ: REVISÓ: SUPERVISÓ AUTORIZÓ

_______________ _______________ ________________ _____________

Determinar si el ABC obtenida a partir de la muestra de placebo adicionado en el tiempo de

_______ _ ___

_______ _ ___

_______ _ ___

_______ _ ___

_______ _ ___

_______ _ ___

_______ _ ___

_______ _ ___

_______ _ ___

_______ _ ___

_______ _ ___

_______ _ ___

_______ _ ___

_______ _ ___