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Manual de microbiología UPIBI_IPN
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL
INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS

ACADEMIA DE BIOLOGÍA
MANUAL DE MICROBIOLOGÍA
ELABORADO POR:
Martha Morales Martínez
Refugia Pérez Sánchez
Miriam Juárez Juárez
María de Lourdes Moreno Rivera
Segunda edición
Refugia Pérez Sánchez
ENERO 2012
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PRÓLOGO
El presente manual de laboratorio de Microbiología tiene la finalidad de dar apoyo a la asignatura con el
mismo nombre, en este manual tenemos las prácticas que se realizarán a lo largo del curso, la cual
contiene los fundamentos mínimos, los materiales, el procedimiento y la bibliografía para ampliar los
fundamentos.
Se presentan algunas técnicas básicas de microbiología, algunas de ellas basadas en la normatividad
de la Secretaria de Salud para que el alumno poco a poco se vaya adentrando a la legislación sanitaria
mexicana.
Uno de los principales objetivos es poner en práctica el método científico para despertar el interés y
seguir estimulando en algunos casos al estudiante por esta rama de la ciencia.
Como una aportación a las estructuras didácticas de este manual, colocamos una serie de imágenes de
lo que esperamos en el experimento y de lo que no esperamos para poderlos comparar.
NOMBRE DEL ALUMNO: ________________________________________________________
PROFESOR DE TEORÍA: ________________________________________________________
PROFESORES DE LABORATORIO: _______________________________________________
________________________________________________
________________________________________________
GRUPO: _____________________
PERIODO LECTIVO: ____________________________________________________________
CARRERA: ___________________________________________________________________
ESCUELA: ___________________________________________________________________
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ÍNDICE
Prologo__________________________________________________________________________ 2
Índice ____________________________________________________________________________3
Instrucciones generales _____________________________________________________________ 4
Practica No. 1 Microscopia __________________________________________________________ 9
Practica No. 2 Preparaciones fijas y en fresco ____________________________________________ 16
Practica No. 3 Métodos de esterilización y reducción de la carga microbiana ___________________ 23
Practica No. 4 Nutrición y cultivo de microorganismos aeróbicos ____________________________ 31
Practica No. 5 Aislamiento y recuento de microorganismos aeróbicos________________________ 46
Practica No. 6 Conservación de microorganismos_________________________________________ 52
Practica No. 7 Identificación de microorganismos (bacterias)________________________________ 63
Practica No. 7 Identificación de microorganismos (mohos y levaduras)________________________ 83
Practica No. 8 Crecimiento microbiano _________________________________________________ 95
Practica No. 9 efecto de los factores fisicoquímicos sobre el crecimiento microbiano _____________104
Practica No. 10 Métodos rápidos para la identificación de microorganismos____________________113
Agares __________________________________________________________________________122
Caldos __________________________________________________________________________125
Medios semisólidos________________________________________________________________ 128
Soluciones y reactivos _____________________________________________________________ 130
Colorantes, decolorantes y mordente_________________________________________________ 133
Nefelómetro de McFarland________________________________________________________ 135
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INSTRUCCIONES GENERALES
I.- EVALUACIÓN
1.- El laboratorio se evalúa como sigue:
a) Trabajo laboratorio 3.4
b) Diagrama de la practica 0.5
c) Examen 1.0
d) Discusión 2.5
e) Reporte de la práctica 2.5
Nota. Solo se promedia el laboratorio si se aprueba la teoría.
2.- El reporte se evalúa:
a) Objetivo y bibliografía 0.5
b) Resultados y cuestionario 1.0
c) Discusión y análisis 0.5
d) Conclusiones 0.5
3.- Para aprobar el curso de laboratorio se requiere haber asistido al 80% de las sesiones prácticas,
aprobar el 80% de las prácticas efectuadas y obtener un promedio mínimo de seis.
4.- La calificación del trabajo práctico se obtendrá promediando las sesiones de las que conste la
práctica. Si el alumno no cumple en alguna de las tres etapas, se le calificará con cero en la parte
correspondiente.
5.- La calificación de laboratorio se obtendrá por cada departamental
6.- Si un alumno no asiste a una sesión tendrá cero en trabajo práctico, si la justifica se mantiene la
calificación, pero no se cuenta la falta para el computo final de asistencias.
7.- Se elige un reporte al azar de cada equipo, revisando que todos los alumnos miembros del
equipo lo hayan elaborado. Si no es así el alumno que no lo presento tendrá cero y para acreditar
el laboratorio deberá entregar el 80 % de prácticas
8.- Cuando a un equipo le toque preparar los materiales para utilizarse en la práctica o bien la
esterilización de material limpio y /o sucio y no lo realice tendrá cero en la práctica.
9.- Cada grupo de 6 equipos deberá traer un candado para su gaveta y cada equipo tendrá una
llave, donde podrá guardar solo material de Microbiología.
II.- ORGANIZACIÓN CON LOS ALUMNOS
10.- Para asistir al laboratorio el alumno deberá traer:
Una bata limpia y con botones Una fotografía tamaño infantil

Manual de laboratorio Colores
Dos asas bacteriológicas Un marcador indeleble de punto mediano
11.- El cuaderno de reporte de prácticas debe ser de tamaño profesional forrado de color blanco
(2LM1), Verde claro (2LM2) Verde obscuro y Morado el grupo (2LV1), en la portada se colocará una
etiqueta con el título de la asignatura, el nombre de los tres alumnos que conforman el equipo,
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colocando en primer término el del dueño del cuaderno, de manera remarcada o con letra más grande
y en la parte superior derecha se pondrá una etiqueta de 5 cm con el número de equipo.
Por equipo deberá traer:
Un rollo de Masking tape Una regla graduada

Papel periódico 5 cm de altura Un metro de franela
Una tijera de punta recta Un jabón para las manos
Una pinza de punta roma Dos frascos de boca ancha de vidrio
Tres botes de lámina Dos frascos de vidrio de aprox. 13x4cm
Una llave del candado Una caja de ligas del número 18
Una esponja Encendedor
Una jeringa de 5 ml 250 ml de alcohol
Una caja de portaobjetos Una brocha de cerdas suaves
Fibra suave para trastes Rollo de papel aluminio de hoja gruesa
Una cuchara sopera y una cafetera de acero
inoxidable
Por sección
Por sección se deberá traer un candado Una caja de cubreobjetos

Dos frascos de 1/2 L de Jabón líquido para trastes Un barniz de uñas transparentes
1 kg de algodón Dos frascos de jabón líquido para manos
Paquete de papel higiénico de 4 rollos suave 1 kg de bolsas de plástico de polipapel con
capacidad de 1kg
Una canastilla
Por grupo
Bolsa de cofias
III.- DEL HORARIO Y COMPORTAMIENTO DE LOS ALUMNOS.

12.- Se impartirán dos sesiones por semana de 3.0 horas cada una.
13.- Cada sesión principiará y terminará a la hora indicada.
14.- Se pasará lista cada día al empezar la práctica.
15.- Se anotarán las faltas y asistencias con todo rigor y por ningún motivo se pondrán retardos.
16.- Cuando el alumno abandone el laboratorio antes de terminar la práctica y sin el consentimiento
del profesor, se considerará que no asistió a la práctica.
17.- Las faltas al laboratorio se calificarán con cero.
18.- La asistencia al laboratorio es obligatoria, ya que uno de los objetivos del trabajo práctico es que
el alumno adquiera habilidades y destrezas. La lista de asistencia se efectuará a la hora indicada
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con una tolerancia de 10 minutos y con la bata debidamente abrochada. En caso de llegar ya no
se le permitirá la entrada a menos que sea discusión con su correspondiente falta.
19.- El reporte se entregará una semana después de realizada la discusión, excepto la práctica que
este cercana al periodo de evaluación y no se permitirá que el reporte se entregue escrito todo o
alguna fracción con lápiz, se sugiere el uso solo de colores negro, azul, rojo y en caso de
esquemas lápices de colores.
20.- El alumno utilizará el Manual de Prácticas de Laboratorio, obligatoriamente en cada sesión,
apegándose a la metodología a seguir, así como a las instrucciones del profesor y corregirá lo
que se vaya cambiando.
21.- El material y equipo roto, deteriorado o extraviado, deberá ser repuesto por el equipo
responsable, para ello tiene como mínimos una semana, de lo contrario el vale se irá al
expediente del alumno.
22.- El alumno revisará el material que reciba y reportará cualquier anomalía antes de iniciar el trabajo
práctico para evitar que se le responsabilice del material deteriorado que se le entregue.
23.- Después de terminada la práctica, el material debe ser entregado limpio por el equipo
responsable a la persona encargada del almacén.
24.- Evitará su permanencia en el laboratorio después de terminada la práctica.
25.- Se debe guardar el comportamiento adecuado para evitar accidentes, ya que el laboratorio es un
lugar de trabajo donde se manejan cultivos y aparatos delicados.
26.- La entrada de los alumnos al laboratorio en horas que no correspondan a la sesión, estará
condicionada a la autorización del profesor responsable de la práctica, y en caso de retirar su
material de la incubadora deberá traer bata, además traerá su material que va a necesitar.
27.- Una vez esterilizado el material que contenga agar se dejará enfriar y posteriormente se
depositará en una bolsa de plástico para su desecho.
28.- Equipo que no traiga el material biológico solicitado en la práctica no se le permitirá la entrada.
IV BREVES REGLAS DE SEGURIDAD PARA UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
1.- Las reglas de seguridad son para TODAS las personas que estén en el laboratorio.
2.- Uso de bata de laboratorio. Las batas protegen de contaminaciones químicas o biológicas, por
ello se recomienda su cambio al salir de laboratorio.
3.- Lavarse las manos al inicio y al final cada práctica: Recordar que se manejan microorganismos
patógenos.
4.- El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Cualquier material que no se
utilice en la realización de la práctica debe estar apartada del área de trabajo. Antes de comenzar
desinfectar la superficie de trabajo.
5.- Prohibido comer, beber, fumar y mascar chicle. Cuando se manipulan microorganismos hay
que evitar llevarse las manos a la boca, nariz ojos u oídos.
6.- No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre pipeteadores o pipetas automáticas.
7.- Evitar generar aerosoles que contengan microorganismos, ya que son fácilmente
inhalados. Todas las operaciones bruscas como el manejo rápido de las asas pueden generar
microparticulas que pueden ser inhaladas por el analista. Los microorganismos deben manejarse
siempre alrededor de la flama del mechero en un área de 15 cm o en una campana de seguridad.
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8.- Evitar desplazarse en el laboratorio.

9.- Las ventanas deben estar cerradas, ya que las corrientes de aire originan contaminaciones en
los cultivos.
10.- El transporte y almacenamiento de placas y recipientes que contengan cultivos. Se debe
realizar con una canastilla y si se saca de la incubadora o refrigerador, sacar dicho material de una sola
vez y siempre colocar el material de forma segura para evitar que se caigan.
11.- Bajo ningún concepto se deben sacar muestras contaminadas del laboratorio.
12.- El material contaminado debe esterilizarse antes de procesarlos como residuos. El
material de vidrio debe esterilizarse para luego lavarse, secarse y volverse a emplear.
13.- El material de vidrio roto depositarlo en los contenedores específicos y designados en el
laboratorio
14.- El botiquín de primeros auxilios está en el interlaboratorio
15.- La mesa de trabajo se debe limpiar con una esponja que contenga benzal como desinfectante,
este proceso se hace antes y después de terminar la sesión de laboratorio.
16.- En caso de accidente. Avisar inmediatamente al profesor, en caso de derrame del cultivo se
deberá cubrir con un desinfectante y dejar actuar por cinco minutos, para luego limpiar con la esponja.
17.- Tomar las precauciones necesarias en el suministro de gas, evitar la presencia de sustancias
inflamables, revisar periódicamente las instalaciones y la flama del mechero beberá estar en azul, para
ello el mechero cuenta con una entrada de la cantidad de aire con el que se obtiene una mezcla de aire-
gas, de forma que la llama tenga oxigeno suficiente.
18.- Incendio de disolventes. En el caso de que se produzca un accidente al incendiarse un
solvente, nunca soplar, se deberá emplear una franela mojada para cubrir el recipiente. Si el fuego se
extiende, usar el extintor dirigiéndolo a la base de las llamas.
19.- Durante el desarrollo de la práctica, queda prohibida la entrada de personas ajenas al grupo que
visiten a los alumnos y a profesores.
20.- Los alumnos con el pelo largo se lo recogerán, no se permite el uso de flecos.
21.- Queda prohibido el uso de celulares y aparatos electrónicos durante el desarrollo de la práctica.
22.- Al entrar al laboratorio evitar, traer chamarra, bufanda, guantes y la bata deberá estar
abrochada.
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Actividades:
I.- Lectura de Normas Oficiales Mexicanas (NOM)
A. Norma oficial mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental - Salud ambiental -
Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo.
B. Norma oficial mexicana NOM-026-STPS-2008, Colores y señales de seguridad e higiene, e
identificación de riesgos por fluidos conducidos en tuberías
a. Desinfección del área de trabajo
b. Código de colores (instalaciones de gas)
c. Uso del contenedor para punzocortantes
d. Botiquín
e. Extinguidores
C. Norma oficial mexicana NOM-120-SSA1-1994, bienes y servicios. Prácticas de higiene y sanidad
para el proceso de alimentos, bebidas no alcohólicas y alcohólicas.
II.- Conocimiento del material básico de laboratorio
a. Material de cristalería
b. Uso del mechero
III.- Equipo de laboratorio
a. Cuarto de incubación
b. Cuarto de refrigeración
c. Incubadoras
d. Balanza de dos platillos, granataria, digital y analítica
e. Campana de flujo laminar
f. Campana de extracción
IV.- Material para la gaveta
a. Frasco con benzal
b. Frasco con alcohol
c. Frasco con torundas
d. Frasco con benzal para pipetas
e. Varilla acodada y base de caja de Petri
f. Frasco con benzal para material de desecho
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PRÁCTICA No. 1
MICROSCOPÍA
UNIDAD: II Microscopia y tinciones
1. OBJETIVOS:
1.1 Objetivo general
1.1.1. El alumno aprenderá a enfocar correctamente una preparación para ser observada en el
microscopio compuesto, así como la forma correcta de utilizarlo.
1.2 Objetivos específicos
1.2.1 El alumno manejará correctamente el microscopio compuesto.
1.2.2 El alumno realizará correctamente la técnica de iluminación de Köhler
2.- INTRODUCCIÓN
El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño. Es el

instrumento que más se usa en los laboratorios que estudian los microorganismos. Mediante un sistema
de lentes y fuentes de iluminación se puede hacer visible un objeto microscópico. Los microscopios
pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamaño original. Los diversos elementos que
existen en la naturaleza, presentan tamaños, formas y composiciones distintas, la mayoría de ellas
pueden verse, algunas a simple vista, y otras mediante instrumentos.
Para poder observar a la célula es necesario recurrir a equipos como el microscopio, de este existen
diversas variedades, los cuales están diseñados a lo que pretendemos observar y como ejemplo
tenemos a:
Microscopio óptico
Es un instrumento (de un lente o varios lentes), que amplifica una imagen y permite la observación de
mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio más simple es una lente de aumento o
un par de anteojos. El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos
objetos separados estos deben estar como mínimo a esa distancia. El microscopio aumenta la imagen
hasta el nivel de la retina, para captar la información. La resolución depende de la longitud de onda de
la fuente luminosa, el espesor del espécimen, la calidad de la fijación y la intensidad de la coloración.
Teóricamente la máxima resolución que se puede alcanzar es de 0,2 µm dada por una luz con longitud
de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y con objetos
condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero no puede
aumentar la resolución. Existen distintos microscopios ópticos generales y de investigación que se
diferencian en factores tales como la longitud de onda de la iluminación del espécimen, la alteración
física de la luz que incide en la muestra y procesos analíticos que se aplican a la imagen final.
El microscopio compuesto está formado por tres sistemas: 1. Sistema de iluminación; 2. Sistema óptico
y 3. Sistema mecánico.
El sistema de iluminación corresponde a la fuente de luz y sus aditamentos para iluminar eficazmente
la preparación y está formado principalmente por la lámpara (6V), el diafragma de campo y el
condensador (lente frontal, diafragma de iris y lente auxiliar)
El sistema óptico está formado por una serie de lentes de vidrio en los objetivos y oculares que
permiten agrandar la imagen y está formado por los objetivos, tubo y el ocular.
El sistema mecánico está formado por una serie de engranes y botones que permiten realizar el
movimiento y cambio de las lentes así como el enfoque de la preparación y está formado por la base,
estativo, tornillos macrométrico y micrométrico, platina, revolver y porta-revolver.
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Función básica de cada parte del microscopio:
a.- Sistema mecánico

Base. Pieza metálica que sostiene a todo el aparato
Estativo. Lugar de donde se debe tomar para trasladar al microscopio
Platina. Es una plancha cuadrada y gruesa de metal con un orificio central en donde descansa la
preparación, la cual es fijada por dos pequeñas pinzas, se puede mover hacia arriba y hacia abajo con
los tornillos macrométrico y micrométrico por medio de un sistema de engranes. Posee escalas
numéricas que permiten ubicar fácilmente la posición de lo que se observa y, al mismo tiempo, deslizar
la preparación en forma de cruz (ejes X y Y) para su localización.
Pinzas. Sirve para sujetar al portaobjetos.
Tornillo macrométrico. Permite el enfoque mayor.
Tornillo micrométrico. Permite el enfoque con precisión.
Tubo del ocular. Sostiene el lente del ocular.
Revolver: Es un dispositivo giratorio en donde se atornillan las lentes de los objetivos de distinto
aumento.
Tubo binocular. Cada uno de los tubos contiene en el interior un sistema de prismas y espejos que
dividen el haz de luz en dos haces, cada uno de los cuales se envía por separado a cada tubo, estos
tubos se deslizan hacia los lados para ajustar la distancia interpupilar ya que cada persona posee una
diferente separación entre sus ojos. Los microscopios binoculares tienen entre los tubos una escala
grabada para poder ajustar la distancia y cada persona debe memorizar su valor de apertura
interpupilar; uno de los tubos tiene el ocular fijo y el otro tiene un sistema mecánico que sube o baja.
Para realizar el enfoque de cada ojo primero se enfoca con el tornillo micrométrico el tubo que tiene el
ocular fijo y después se enfoca el que tiene el ocular móvil, pero en este caso sin mover el tornillo
micrométrico, girando el ocular móvil hasta encontrar el foco.
b.- Sistema de iluminación
Lámpara. Es la encargada de proporcionar los haces de luz y tiene las siguientes características: 6V, 5-
15 W ó 12 V, 50-100 W
Diafragma de campo. Está situada en la base del microscopio y su función es la de regular el diámetro
de la emisión de la luz a fin de que se ilumine solo el área de campo visual, es decir controla la cantidad
de luz que atraviesa la preparación.
Condensador. Es un sistema de tres lentes convergentes que concentran los rayos luminosos sobre el
objeto a observar, el condensador utilizado es capaz de agrupar todos los rayos que provienen del foco
y permite aprovechar toda la luz posible que inciden sobre él y los dirige hacia el plano focal del objeto.
c. Sistema óptico
Oculares
El ocular es la parte óptica final externa, situados en el tubo a través de los cuales se obtiene la imagen
final, el ocular tiene aumento propio (los aumentos son denominados con la letra X), en nuestro caso es
de 10X. El ocular consta de una lente cercana al ojo, collar, tubo del ocular y una lente cercana al
objetivo.
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Tubo
El tubo es la parte óptica – mecánica, situada en la parte superior del microscopio, este puede ser
monocular o binocular, además está adaptada para poderle colocar una cámara fotográfica ó una
cámara de televisión. El tubo generalmente está diseñado para trabajar a una distancia mecánica fija
entre ellos y este valor puede ser de 160 mm, el factor del tubo del microscopio a utilizar en el
laboratorio es de 1,25X, dato que nos sirve para calcular el aumento total.
Objetivos.- Son lentes que captan la imagen a observar, están construidos de cristal o fluorita, poseen
aumento propio, apertura numérica y está diseñada para trabajar con diferentes campos. Todos los
objetivos tienen anillos de colores y números grabados sobre el tubo metálico, que nos permite saber a
detalle cuáles son sus ventajas, la disposición de estos caracteres es la siguiente:
1.- El anillo de color superior indica los aumentos (tabla 1)
2.- El lado superior izquierdo indica el número de aumentos
3.- El lado superior derecho la apertura numérica.
4.- El lado inferior la distancia mecánica
5.- El lado inferior derecho el espesor del cubreobjetos
6.- El anillo de color inferior indica en qué medio se hace la inmersión del objetivo (tabla 2)
En ocasiones el objetivo puede traer en lugar de 0.17, el número 1, el cual indica que:
Acepta cubreobjetos desde 0,17 a 0,22 mm de espesor,
10= No requiere cubreobjetos ó
0,11 – 0,27 = Es ajustable a diferentes espesores de los cubreobjetos, desde 0,11 mm hasta 0,27 mm.
Anillo superior
Los anillos de color cerca del anillo moleteado facilitan el reconocimiento del coeficiente de aumento:
Tabla 1. Correspondencia entre los

aumentos y los anillos de colores
Tabla 2. Colores para el anillo inferior que
grabados indican en qué medio se debe hacer la
Aumentos Color anillo superior inmersión del objetivo
1.0X Negro Índice de
Carácte Sustanci Color del
2.5 X Pardo refracció
r a anillo
4.0 X Rojo n
6.3 X Anaranjado Oil Aceite 1,515 Negro
10 X Amarillo W Agua 1,333 Blanco
16 X Verde claro Glyz Glicerina 1,455 Anaranjad
25 X Verde oscuro o
40 X Azul claro Metilen Yoduro 1,740 Amarillo
63 X Azul oscuro o de
100X Blanco metileno
Aumentos totales:
El número total de aumentos que se puede lograr en un microscopio se obtiene multiplicando el número
de aumentos que tiene el ocular por el número de aumentos que tiene el tubo y por el número de
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aumentos que tiene el objetivo con el que se está observando.

Distancia mecánica:
Se llama distancia mecánica a la distancia que recorre a luz por el interior del microscopio desde que
penetra por el objetivo, pasando por los tubos y espejos, hasta llegar al ocular, la distancia mecánica se
mide desde la superficie de la rosca del objetivo hasta la base del ocular, esta distancia en el caso de
nuestro microscopio es de 160 mm.
Poder de resolución:
El poder de resolución de una lente se define como la capacidad que tiene para discernir entre dos
puntos muy cercanos entre sí y que puedan verse separada.
El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm, el microscopio óptico de 0,2 µ y el microscopio
electrónico de 6 Ángstrom.
Apertura numérica:
Es una medida de la amplitud del cono luminoso que se forma por las lentes del microscopio, ya sea del
condensador o del objetivo.
Microscopio de contraste de fase

Permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas.
Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una
célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor índice de
refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de
luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de
anillos ópticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de fase inicial del
haz de luz y produce un contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a
las porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos
densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar células vivas, tejidos vivos y cortes
semifinos no coloreados.
La resolución de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo oscuro porque
emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo puede detectar partículas individuales más
pequeñas en las imágenes de campo oscuro, debido al contraste creado. Es útil para observar
autorradiografías, cristales en la orina y para detectar espiroquetas en particular el Treponema pallidum
microorganismo causante de la sífilis.
Cada uno de los microscopios tiene una función determinada, en este y en este caso este tipo de
microscopio utiliza un microscopio auxiliar y un filtro verde, además en este tipo de microscopio también
se realiza la técnica de iluminación de Köhler.
3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS
3.1 MATERIAL POR EQUIPO
Microscopio compuesto Preparaciones fijas de bacterias

Papel seda
3.2 REACTIVOS
Aceite de inmersión Atomizador con benzal
3.3 MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ALUMNO
Colores
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4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
a) Acudir con el profesor al cuarto donde están los microscopios.
b) Transportar el microscopio de forma vertical tomándolo del brazo con una mano y en la otra la base.
c) Colocar el microscopio sobre la mesa de trabajo, y observar si presenta alguna irregularidad en caso
de presentarla informar al profesor (cable en mal estado, falta de un objetivo, etc.)
d) Con una perilla retirar el polvo de la parte mecánica y de la parte óptica.
e) Limpiar la parte mecánica del microscopio con una brocha de cerdas suaves.
f) Limpiar la parte óptica del microscopio con papel seda, nunca hacerlo con la bata.
g) Se dará la clasificación del microscopio según el sistema mecánico, óptico y el de iluminación.
h) Conectar el microscopio a la toma de corriente
i) Bajo las instrucciones del profesor realizar la técnica de Köhler.
4.1 Cuidado y limpieza del microscopio

Un proceso de limpieza debe considerar los siguientes aspectos:
a) Para limpiar la parte óptica, se elimina primero las partículas de polvo, ya sea con un bulbo inyector
de aire, un pincel o soplando fuertemente sobre la lente.
b) Algunos solventes como la acetona disuelven los revestimientos de barniz, la pintura y aún el
cemento de las molduras y los objetivos compuestos, por lo que no se deben usar.
c) Las partes mecánicas se deben lubricar y se limpian por fuera con una brocha de cerdas suaves.
Se enlistan algunos compuestos recomendados sólo para ciertas partes del microscopio.
d) Espuma de jabón suave.- Solo para remover lo sucio de la superficie de instrumentos
e) Agua destilada con algún detergente sin aditivos alcalinos.- para un prelimpiado de la óptica.
f) Solución para limpiar la óptica.- etanol al 40 %, éter al 20 %, para limpiar superficies de la óptica o
remover residuos de aceite de inmersión.
4.2 TÉCNICA DE ILUMINACIÓN DE KÖHLER
A fin de evitar toda serie de inconvenientes y poder utilizar lámparas de filamento espirilado, Köhler
propone un método que actualmente es utilizado. Su iluminación se forma de dos diafragmas: un
diafragma denominado de campo, situado generalmente a nivel de la lámpara colectora y un diafragma
llamado de abertura, situado generalmente debajo del condensador.
Pasos a seguir para la iluminación de Köhler.
1.- Luz amarilla (bajo voltaje)
2.- Ajustar la distancia interpupilar
3.- Ajustar las dioptrías
4.- Abrir el diafragma de campo e iris
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Pasos a seguir para la iluminación de Köhler en un microscopio
5- Subir completamente el condensador con la 6.- Enfocar la preparación con el objetivo 4X

lente frontal introducida o 10X y utilizando los tornillos macro y
micrométrico
7.- Observar y cerrar el diafragma dispuesto en 8.- Bajar algo el condensador, hasta obtener
el pie del microscopio máxima nitidez de la imagen del diafragma
9.- Centrar el diafragma de campo luminoso en 10.- Abrir el diafragma de campo luminoso
el campo visual, recurriendo a los dos tornillos casi hasta el borde del campo visual,
el condensador centrando con exactitud y abrirlo hasta que
desaparezcas detrás del borde del campo
visual.
11.- Regular el contraste de la imagen con 12.- Insertar el filtro azul, regular la intensidad
ayuda del diafragma del condensador. de la luz con el control del voltaje.
13.- A cada cambio de objetivo: enfocar con el 14.- Al utilizar objetivos panorámicos de bajo
micrométrico y contrastar con el diafragma del aumento rebatir la lente frontal del
condensador. condensador sin alterar su altura.
4.3 OBSERVACIONES DE UNA PREPARACIÓN FIJA.
a) Tomar una preparación y enfocarla a 10 y 40 X.

b) Adicionarle aceite de inmersión y observarlo a 100 X
c) Observar la preparación que contiene una bastante muestra y realizar el esquema biológico
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d) Ahora mover la preparación en la periferia donde hay poca cantidad de muestra y realizar un
esquema, en donde se anote el aumento real
e) Ahora colocar el filtro azul y observar nuevamente
f) Compara y analiza lo realizado y concluye lo más conveniente.
5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO
Esquematiza la preparación observada a 40 y 100X, anota el nombre de la muestra (etiqueta):

_____________________
40x 100x
5.1 Consulta la bibliografía y llena la siguiente tabla

Tipo de microscopio Poder de resolución Aplicaciones
Compuesto
Contraste de fase
Electrónico
5.2 En la siguiente tabla resume la función de cada una de las siguientes partes:
Parte del microscopio Función Sistema al que pertenece

(mecánico, óptico de iluminación)
Condensador
Diafragma
Objetivo
Filtro azul
Lámpara
Ocular
Platina
Revolver
Tornillo macrométrico
6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
6.1 Discutir las ventajas y desventajas de utilizar la iluminación de Köhler.
6.2 Discutir las ventajas y desventajas de un microscopio óptico, así como la cantidad de muestra que
presente una preparación.
7.- CONCLUSIONES
Elabora tus conclusiones tomando en consideración los objetivos de la práctica, los resultados
obtenidos y la bibliografía consultada.
8.- BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA PARA LA ELABORACIÓN DE ESTA PRÁCTICA
8.1 Barrera E. Héctor El Microscopio Óptico 1ª edición. 1997. Editores Plaza y Valdez, S.A. de C.V.
8.2. Freifelder, D. Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular. Reverté Mexicana, S.A. de C.V. 1991.
8.3 Locquin Marcel, Manual de Microscopía I 1° edición, 1985. Ed. Labor S.A.
8.4 Rincón-Sánchez A.R.y Reyes–Ortiz N. Manual de Microscopía Óptica 1ª edición. 1991. Editado por
la Asociación de Químicos del INN.
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PRÀCTICA No. 2
PREPARACIONES FIJAS Y EN FRESCO
UNIDAD II: Microscopia y tinciones.
1. OBJETIVOS
1.1.1 El alumno realizará preparaciones en fresco y fijas para ser observadas en el microscopio óptico
I.2 Objetivo específicos
Al término de la sesión el alumno:
1.2.1 Realizará una preparación en fresco de una muestra líquida de agua.
1.2.2 Realizará una preparación en fresco de mohos con azul de algodón lactofenol.
1.2.3 Realizará un frotis para una preparación fija.
1.2.4 El alumno realizará preparaciones fijas y tinciones simples y diferenciales.
2. INTRODUCCIÓN
La gran mayoría de los microorganismos no son visibles para el ojo humano, por lo que el uso del
microscopio resulta indispensable para observar a estos seres vivos. Para lograr una buena
observación microscópica es necesario tomar en cuenta la preparación de la muestra, debido a que los
objetos deben tener un cierto grado de contraste con el medio circundante para poder ser percibidos a
través del microscopio, además de que los microorganismos carecen de una coloración natural, hay que
teñirlos previamente para hacerlos resaltar de manera artificial del fondo de la imagen. Una forma de
conseguir este contraste consiste en realizar tinciones simples con un colorante o tinciones
diferenciales.
Las bacterias no teñidas muestran pocos detalles morfológicos, el diagnóstico bacteriológico
generalmente se basa en las diferentes afinidades tintoriales de las bacterias para identificarlos más
adecuadamente, Sin embargo, también resultan útiles las preparaciones no teñidas en la determinación
de la movilidad.
Las preparaciones fijadas y teñidas son de uso casi universal, tanto a partir de especimenes recibidos
como de colonias cultivadas. En general una muestra del espécimen original puede ser colocada
directamente sobre el portaobjetos o bien ser recogida con un asa, recordando siempre tener una
preparación delgada y homogénea. Una colonia puede ser examinada haciendo con ella una
suspensión tenue en una gota de solución salina, y luego extendiéndola con un asa sobre un
portaobjetos. Las películas secadas al aire son fijadas con calor suave sobre la flama de un mechero y
luego pasadas a través de ella. Debe tenerse cuidado para evitar el calor excesivo, que puede alterar la
forma bacteriana. El calor deseable es aquel en el que el portaobjetos sea apenas caliente para ser
colocado sobre el dorso de la mano.
Aunque cuando tenemos la necesidad de observar preparaciones en fresco podemos utilizar el
microscopio de contraste de fases, en donde la característica más importante de este tipo de
microscopio es que nos permite ver a los microorganismos sin la necesidad de teñirlos.
3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO
3.1 EQUIPO
Microscopio óptico
Microscopio de contraste de fases
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3.2 MATERIAL
Portaobjetos Frasco gotero con solución de cristal violeta

Cubreobjetos Frasco gotero con solución de lugol
Pipeta Pasteur Frasco gotero con solución de alcohol – acetona
Gradilla Frasco gotero con solución de safranina
1 tubo de ensaye de 13 X 100 mm Frasco gotero con solución de fucsina fenicada
Asa bacteriológica Frasco gotero con solución de alcohol ácido
Mechero Frasco gotero con solución de azul de metileno
Asa y porta asa Frasco gotero con solución de verde de malaquita
Puente de coloración Solución salina o agua de la llave
Gradilla metálica Lámpara de alcohol
3.3 CEPAS MICROBIANAS
Staphylococcus aureus Rhizopus sp

Saccharomyces cerevisiae Aspergillus niger
Escherichia coli Lodos activados,
Bacillus subtilis Micrococcus sp
3.3 MUESTRA BIOLÓGICA

Muestra de agua estancada o producto en descomposición (tortilla)
4.1 Preparación de Frotis:
Método A
4.1.1 Limpiar el portaobjetos con una torunda de algodón y que contenga alcohol.
a. Etiquetar la preparación, solo sobre la superficie superior del portaobjetos, la etiqueta será
preferentemente pegada a la izquierda de la preparación, si con una etiqueta no basta colocar otra del
lado derecho, la etiqueta llevará el nombre del microorganismos, el nombre de la tinción, el equipo, el
grupo y la fecha.
b. En la gradilla se tiene un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 2 ml de agua, de ahí tomar con el asa
una pequeña gota de agua y colocarla en el centro de la superficie de un portaobjetos.
c. En el mechero, flamear el asa al rojo vivo y en un radio de 20 cm de la flama del mechero, abrir el
tubo de ensaye y flamearlo, tomar la muestra con el asa, volver a flamear la boca del tubo y taparlo.
d. Dejar el tubo sobre la gradilla y con la mano izquierda tomar el portaobjetos y con la mano derecha
en la que tenemos el asa extender el inoculo aproximadamente un cm 2 para obtener una película
delgada de microorganismos. Flamear el asa para esterilizarla.
e. Dejar secar el frotis a temperatura ambiente.
f. Fijar el frotis con calor, es decir pasarlo rápidamente por la flama del mechero, luego colocarlo en el
dorso de la mano, si soportamos el calor pasarlo nuevamente, realizar esta operación una vez más. El
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calor deseable es aquel en que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado en
el dorso de la mano. Dejar enfriar el portaobjetos antes de teñir.
Nota: Procurar no tomar una gran cantidad del inóculo de lo contrario quedará un frotis grueso, la luz no
pasará y no observaremos; en caso de haber ocurrido esto entonces, observa en la periferia del frotis
Método B
a. Si se proporciona un tubo con una suspensión bacteriana, entonces encender el mechero.

b. En un radio de 20 cm abrir el tubo, flamearlo y con el asa tomar un inóculo de la suspensión.
c. Flamear la boca del tubo de ensaye, cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla
d. Colocar el inóculo en el centro de un portaobjetos limpio. Extender el inóculo por lo menos 1 cm 2, y
flamear el asa. Dejar secar el frotis y fijarlo al calor.
4.2 Examen en fresco de una muestra de agua estancada
a. De la muestra de agua estancada que se ha traído al laboratorio, colocar una gota en un portaobjetos
limpio
b. Con la ayuda de una pipeta Pasteur colocar en el centro una gota de la muestra y cubrirla con un
cubreobjetos.
c. Al colocarle el cubreobjetos evitar dejarla caer bruscamente, ya que se formaran burbujas.
d. Observar al microscopio óptico o de contraste de fases con el objetivo de 10 X y 40 X.
4.3 Preparación de una muestra en fresco de mohos con azul de algodón lactofenol
a. Colocar una gota del colorante azul de algodón lactofenol

b. Colocar el inoculo y hacer una pequeña extensión
c. Colocarle el cubreobjetos sin realizar burbujas
d. Observar la preparación al microscopio con el objetivo 10 X y 40 X. Si se requiere que la preparación
dure un poco más se sellar los bordes del cubreobjetos con barniz de uñas transparentes.
4.4 Tinción simple
a. Tomar la preparación fija de Staphylococcus aureus y colocarla el colorante que previamente les ha
tocado
b. Tomar el tiempo por 1 minuto
c. Enjuagar el portaobjetos en el recipiente que contiene el agua
d. Dejar secar la preparación y observarla al microscopio con el objetivo de 40 y 100 X.
4.5 Tinción de Gram:
a. Colocar los frotis correspondiente de cada uno de los microorganismos Bacillus subtilis, Escherichia
coli, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus y Saccharomyces cerevisiae, en el puente de
coloración.
b. Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.
c. Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.
d. Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto.
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e. Lavar los frotis con agua de la llave.

f. Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (hasta eliminar el exceso de colorante).
g. Lavar inmediatamente con agua de la llave.
h. Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos
i. Lavar los frotis con agua de la llave.
j. Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio con el
objetivo de 100X. (Previamente realizar la técnica de iluminación de Köhler y enfocar a 10 y 40X)
Para demostrar cómo afecta la decoloración con el alcohol cetona (paso f, se realizarà la técnica de
gran, pero danto un exceso al tiempo de decoloración (90 segundos).
4.6 Tinción de Gram (con exceso de decoloración):
a. Colocar un frotis fijado de Bacillus subtilis y de Escherichia coli en el puente de coloración.
b. Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.
c. Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.
d. Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto.
e. Lavar los frotis con agua de la llave.
f. Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 90 segundos.
h. Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos
i. Lavar los frotis con agua de la llave.
j. Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio con el
objetivo de 100 X.
4.7 Tinción de Gram de una mezcla de microorganismos:
a. Colocar un frotis fijado de una mezcla de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
b. Cubrir el frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.
c. Lavar el frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.
d. Cubrir el frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto.
e. Lavar el frotis con agua de la llave.
f. Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (hasta eliminar el exceso de colorante).
h. Cubrir el frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos
i. Lavar el frotis con agua de la llave.
j. Dejar secar el frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio con el
objetivo de 100 X.
4.8 Tinción de Ziehl-Neelsen.
a. Colocar el frotis correspondiente en el puente de coloración
b. Cubrir los frotis con fucsina-fenicada y calentar con una lámpara de alcohol, hasta que emita
vapores, aplicar calor periódicamente durante cinco minutos sin que se seque la preparación y esperar
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a que se enfríe.
c. Enjuagar con agua de la llave.
d. Cubrir los frotis con alcohol ácido por un minuto.
e. Enjuagar con agua de la llave.
f. Cubrir los frotis con azul de metileno por un minuto
g. Enjuagar y dejar secar los frotis y observarlos con el microscopio utilizando lente de inmersión
4.9 Tinción de Shaeffer–Fulton
a. Cubrir el frotis correspondiente con verde de malaquita y calentar con una lámpara de alcohol, hasta
que emita vapores, aplicar calor periódicamente durante cinco minutos, sin que se seque la preparación.
b. Dejar que el frotis se enfríe.
c. Lavar con agua de la llave.
d. Cubrir el frotis con safranina por un minuto.
e. Enjuagar, dejar secar y observar con el microscopio utilizando lente de inmersión.
5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO
5.1 Examen en fresco de una muestra de agua estancada
Realiza un esquema de lo observado en el microscopio
5.2 Preparación de una muestra en fresco de mohos con azul de algodón lactofenol
Realiza un esquema de lo observado en el microscopio
5.3 Tinción simple

a) De la muestra que se te ha proporcionado anota el nombre de microorganismo (etiqueta) y realiza un
esquema.
Resultados de la sección
Equipo / microorganismo Colorante a utilizar Color Agrupación
1y7 Azul de metileno
2y8 Safranina
3y9 Cristal violeta
4 y 10 Verde de malaquita
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5.4 Tinción de Gram:

a) Realiza un esquema de cada una de las preparaciones de Bacillus subtilis, Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus y Saccharomyces cerevisiae.
Escherichia coli Escherichia coli Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus

40x 100Xx 40X 100X
Aumento real______ ________ Aumento real_______ Aumento real_______
Forma: __________ Agrupación_________ Forma: ____________ Agrupación_________
Micrococcus luteus Micrococcus luteus Bacillus subtilis Bacillus subtilis

40x 100X 40X 100X
Aumento real______ ________ Aumento real_______ Aumento real________
Saccharomyces cerevisiae
40x 100X
Aumento real______ ________
Forma: __________ Agrupación_________
Resumen de la sección
Microorganismos Gram Color Forma Agrupación Resultado del Gram
1.Bacillus subtilis
2. Escherichia coli
3.Staphylococcus aureus
4.Micrococus luteus
5 Saccharomyces cerevisiae
5.5 Tinción de Gram (con exceso de decoloración)

Escherichia coli Bacillus subtilis
40x 100X 40X 100X
Aumento real______ ________ Aumento real_______ Aumento real_______
Tipo de Gram: ________________________ Tipo de Gram:
_______________________________
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5.6 Tinción de Gram (mezcla de un Gram + y un Gram -)

Mezcla de: _______________________________________________________________________
Aumento real (40X) _______ (100X) _______

a.- Forma: ________ Agrupación_______ Color adquirido_______ Gram ______
b.- Forma: ________ Agrupación_______ Color adquirido_______ Gram ______
5.7 Tinción de Ziehl-Neelsen.
Agua residual
Aumento real (40X) _______ (100X) ____________
Color de una BAAR positiva ____________ Color de una BAAR negativa ____________
5.8 Tinción de Shaeffer - Fulton

Bacillus sp.
Aumento real (40X) _______ (100X)_______________
Color adquirido de la espora _________ Color adquirido de la célula vegetativa_____________
5.9 ¿Cuales son los inconvenientes al realizar un frotis con una gran carga microbiana?
5.10 ¿Cual es la finalidad de observar una muestra en fresco?
5.11 ¿Por qué se coloca un cubreobjetos sobre la muestra en una preparación en fresco?
5.12 ¿Cuál es el propósito de fijar los frotis con calor?
5.13 ¿Cómo afecta la edad del cultivo en la técnica de Gram?
5.14 ¿Por qué la tinción de Gram no se emplea para teñir mohos?
5.15 ¿Cuándo es recomendable utilizar una preparación simple y que colorante utilizarías?
5.16 ¿Cuál es el fundamento de la tinción de Gram, Ziehl Neelsen y Shaeffer y Fulton.
5.17 Por medio de un esquema representa la composición de la pared celular de bacterias Gram
positivas, Gram negativas y bacterias acido alcohol resistentes (BAAR.
5.18 Dibuja una espora y menciona su composición química.
6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
6.1 Discutir los cuidados que se tienen que tener al realizar una preparación en fresco y una fija, cuales
son las ventajas de de cada una de ellas, el tiempo que dura dicha preparación para su correcta
observación y los resultados obtenidos en cada tinción realizada.
7. CONCLUSIONES
7.1 Elaborar las conclusiones con base al análisis y discusión de las ventajas y desventajas en la
realización de preparaciones en fresco y fijas, así como a la bibliografía consultada y los objetivos de la
práctica.
8 BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA PARA LA ELABORACIÓN DE ESTA PRÁCTICA
8.1 Lynch, M.J.; S.S. Raphael: L. D. Mellor; D.D. Spare, M. J., Inwood. Métodos de Laboratorio. 2ª
Edición. Interamericana. México. 1140 págs.
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PRÁCTICA No. 3
MÈTODOS DE ESTERILIZACIÓN Y REDUCCIÒN DE LA CARGA MICROBIANA
UNIDAD I: Introducción y técnicas de aplicación en microbiología
1. OBJETIVOS
El alumno preparará material de uso común en un laboratorio de microbiología para su esterilización y
analizará los diferentes métodos para seleccionar el más adecuado acorde a la naturaleza del material
1.2 Objetivo específicos
1.2.1 Preparará el material de vidrio e instrumental para ser esterilizado por calor seco y calor húmedo.
1.2.2 Esterilizará el material e preparado, por calor seco y calor húmedo, haciendo uso de controles de
esterilización.
1.2.3 Realizará el proceso de filtración a través de membrana.
2. INTRODUCCIÓN
La esterilización se conoce como un proceso de destruir a todos los microorganismo de una superficie,
existen varios métodos físicos y químicos de esterilización, para seleccionar el más adecuado es
necesario conocer la naturaleza del material, aunque algunos pueden tener varias formas de
esterilización.
1 Métodos físicos
Calor húmedo:
La aplicación de calor húmedo es el método más simple para esterilizar un material, a condición de que
no sufra daño en sí mismo. Una temperatura de 100 °C matará a todas las formas vegetativas, pero no
las esporas, para matar a estas es necesario una temperatura de 121 °C, 15 minutos y 15 libras de
presión en una autoclave. La muerte microbiana se produce por la desnaturalización de las proteínas,
generalmente se utiliza vapor, tanto porque las bacterias se mueren más rápidamente cuando se
encuentran húmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente
en todas las partes del recipiente.
Calor seco:
Para esterilizar materiales que deben permanecer secos se dispone de hornos eléctricos por los que
circula aire caliente, en vista de que el calor es menos eficaz en materiales secos, se aplica una
temperatura de 160 –170 °C durante una h.
El calor como método de esterilización actúa desnaturalizando las proteínas y los ácidos nucleicos de la
célula y fragmentando las membranas celulares.
Flameo:
La llama es un agente esterilizador eficaz, y el más simple de todos. Es frecuentemente utilizado para
esterilizar el asa bacteriológica para sembrar o resembrar un cultivo. Al flamear el asa, debe evitarse de
ser posible, que dicha asa lleve grandes cantidades de material biológico, pues éste podría “saltar”
diseminándose partículas infectantes.
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A veces para instrumentos como tijeras, hojas de bisturí o pinzas, se puede esterilizar el material
mojándolo con alcohol y encendiéndolo éste. Se debe repetir varias veces para lograr una esterilización
completa. El método es rápido pero produce carbonización y pérdida del filo.
Radiaciones ionizante y no ionizante:
La radiación ultravioleta provoca daño en el DNA, la luz ultravioleta induce el entrecruzamiento entre
pirimidinas adyacentes en una u otra de las dos tiras de polinucleótidos, formando dímeros
pirimidínicos, las radiaciones ionizantes producen roturas en las tiras sencillas y en las dobles.
Pueden emplearse también ondas supersónicas o ultrasónicas para romper o desintegrar a la célula.
Filtración a través de Membranas
Algunas sustancias no pueden ser esterilizadas por calor húmedo o seco pues son termolábiles, es
decir que se desnaturalizan o que pierden alguna propiedad deseable, en tal caso se utilizan sistemas
de filtración de membranas para retener a los microorganismos. Aquí debemos de conocer las
dimensiones del microorganismo a eliminar para poder utilizar el filtro adecuado (diámetro).
Los filtros utilizados son fabricados con porcelana, cuarzo, tierra de diatomeas, vidrio pulverizado,
asbesto o esteres de celulosa, para el caso de los filtros de la marca Millipore se utiliza como
bioindicador a Pseudomonas diminuta para filtros con un diámetro de poro de 0,45 µm
2 Métodos químicos Gases (oxido de etileno) y líquidos (formaldehído y propiolactona)
Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógeno lábiles como los que tiene grupos
carboxilos, amino, sulfhidrilos e hidroxilos. Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la
industria farmacéutica, sirve para esterilizar material termosensible como el plástico, equipos
electrónicos, bombas cardiorrespiratorias. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo y
además cancerígeno, por lo que se suministra normalmente con una concentración entre el 10 y el 20 %
de CO2. La concentración de óxido de etileno, la humedad y la temperatura influyen sobre la velocidad
de esterilización. Un objeto limpio puede esterilizarse si se trata de 5 a 8 h a 38 °C o de 3 a 4 h a 54°C,
cuando la humedad relativa se mantiene entre el 40 y el 50 % y la concentración de oxido de etileno es
de 700 mg/L. Una vez esterilizado el material es necesario airear para eliminar el oxido de etileno
residual porque es muy tóxico.
La -propiolactona se emplea para esterilizar vacunas y suero, se degrada hasta una forma inactiva
después de varias horas y, por ello, no es tan difícil de eliminar. Destruye a los microorganismos más
rápidamente que el oxido de etileno, pero no penetra tan bien en los materiales y puede ser
cancerígena.
3 Métodos bacteriológicos para verificar las técnicas de esterilización (Pruebas de esterilidad).
En todo lugar en donde se realice esterilización se debe de contar con indicadores de calidad que
manifiesten que la esterilización se ha llevado correctamente y que dicho material se encuentra estéril,
para ello existen en el mercado varios indicadores que se introducen con el material a esterilizar y
posteriormente se verifica un cambio de color o turbidez de la ampolleta.
Método de la tira de papel
Existen en el mercado tiras impregnadas con esporas de Geobacillus stearothermophilus se presentan
en una envoltura con dos compartimientos. En el primero está la tira testigo, que se ha esterilizado
(testigo negativo) y en el otro compartimiento se encuentran dos tiras, una de las tiras se saca
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(problema y testigo positivo) y se coloca en un recipiente que se va a esterilizar en la forma habitual.

Luego las tiras se vuelven a su compartimiento correspondiente y se incuban por 7 días a 55 °C en
caldo de soya y tripticaseína. Las esporas sobre las tiras testigos se desarrollan, pero si la esterilización
no fue la correcta habrá desarrollo en la tira testigo.
Método de la ampolleta:
Son ampolletas que contiene una suspensión de Geobacillus stearothermophilus en medio de cultivo.
La temperatura óptima para el desarrollo de este microorganismo se encuentra entre 50 y 65°C; dentro
del medio líquido se encuentra un indicador que es el púrpura de bromocresol. Al utilizarla se debe
colocar la ampolleta en el interior del compartimiento que va a esterilizar el material, después de
terminar la esterilización, las ampolletas (sin abrir) se incuban entre 55 y 65 °C durante 24 h, el
enturbamiento y la aparición de un color amarillo indica una esterilización defectuosa, en cambio si el
color permanece igual durante varios días de incubación el equipo está funcionando bien. Debe llevarse
el control constituido por una ampolleta que no se pone en el equipo, incubada en las mismas
condiciones, debe mostrar desarrollo bacteriano y el medio se vuelve amarillo.
Métodos físicos para esterilizar:
A veces, para instrumentos como hojas de bisturí, tijeras o pinzas, se puede esterilizar el material
mojándolo con alcohol y encendiendo éste. Se debe repetir varias veces para lograr una esterilización
completa. El método tiene la ventaja de ser rápido peor se produce carbonización y perdida de filo.
Pueden emplearse ondas supersónicas o ultrasónicas de 9000 ciclos / s, para romper y desintegrar las
células. Se cree que las bacterias se dañan y destruyen por la formación de pequeñas burbujas de gas
en la suspensión a consecuencia de las ondas sonoras.
3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO
3.1 EQUIPO
Autoclave a 121° C Incubadora a 35° C

Autoclave a 110 ° C Baño María a 55°C
Horno a 170 ° C Termómetros de 150 y 200 °C
3.2 MATERIAL (Material para demostración del profesor por sección)
Dos botes de lámina Una jeringa de 5 ml
Un cilindro pipetero Una pinza de disección
Un cilindro para cajas de Petri Una tijera de disección
Dos filtros estériles swinnex con empaque Un matraz con 50 ml de suspensión de
Escherichia coli (suspensión turbia)
Tres matraces de 125 ml con 50 ml de
Frasco con benzal
Caldo nutritivo (CN) estéril
Contenedor para punzocortantes
Material por equipo
Tres cuadros de papel aluminio de 8X8 cm Una tira de 3 X 0,5 cm impregnada con
para tapón de tubo esporas de Geobacillus stearothermophilus
Tres cuadros de papel aluminio de 20X20 Dos tubos de 16 X 150 mm sin tapón.
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cm para envolver pinza o tijera Cuatro cajas de Petri limpias

Tres cuadros de papel aluminio de 12X12 Tres pipetas de 10 ml limpias
cm para tapón de matraz
Un clip o aguja de disección
Tres cuadros de papel Kraf de 18X14 cm
Cuatro matraces de 125 ml
para gorro de matraz
Tres cuadros de papel Kraf de 15X25 cm Un matraz de 250 ml.
para gorro de matraz Algodón suficiente para tapones de matraces
Tres cuadros de papel Kraft de 20 X 20 cm Tres tubos de ensaye de 13 X 100 mm sin
para cubrir un bote de lámina. tapón
Tres cuadros de papel Kraf de 6 X 60 cm Un tubo de ensaye de 13 x 100 sin tapón
para envoltura de pipeta de 10 ml.
Dos tubos de ensaye con 3 ml de caldo
Tres cuadros de papel Kraf de 33 X 40 cm nutritivo sin esterilizar (se preparan el día de la
para caja de Petri práctica)
Tres cuadros de papel Kraf de 22x22 cm Tres tubos de ensaye con 3 ml de caldo
para envoltura de pinza o tijera. nutritivo estéril
Tres cuadros de gasa doble de 12X20 cm Un frasco con alcohol
para tapón de matraz.
Tres matraces con 50 ml de caldo nutritivo
Tres cuadros de gasa doble de 15 X 25 cm estéril
para tapón de matraz.
Tres cuadros de gasa doble de 7 X 15 cm para
tapón de tubo
3.3 MEDIOS DE CULTIVO

Caldo nutritivo
Reactivos comerciales (esporas indicadoras de esterilización). Ampolletas con un disco con esporas.
Un matraz con 50 ml de una suspensión microbiana de Escherichia coli
PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN
.1 Lavado de material de vidrio e instrumental
a) Utilizando escobillones para pipetas, tubos y matraces y una fibra suave para las cajas de Petri, el
material plano y el instrumental metálico lavar el material que se va a esterilizar, utilizando de
preferencia extran.
b) Enjuagar suficientemente con agua de la llave
c) Enjuagar con agua destilada, escurrir y secar en el horno o dejarlos secar a temperatura ambiente.
4.2 PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO
4.2.1 TUBOS DE ENSAYO

a. Tapar 2 tubos de 16 x 150 mm con tapones de algodón siguiendo las indicaciones del profesor
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b. Colocar los tubos en un bote de lámina, taparlos con papel Kraft y asegurarlos con una liga, anotar
fecha, equipo, grupo, medida de los tubos y cantidad preparada.
4.2.2 CAJAS DE PETRI
a) Envolver 8 cajas de Petri con papel Kraft siguiendo las indicaciones del profesor. Anotar en el papel,
la cantidad de cajas envueltas, fecha, equipo, número de equipo de laboratorio y grupo.
4.2.3 PIPETAS
a. Colocar en la boquilla de cada una de las pipetas un tapón de algodón cuidando que no quede muy
compactado, utilizar para ello una aguja de disección o un clip
b. Flamear en la flama del mechero las boquillas de las pipetas a fin de eliminar el exceso de algodón
c. Envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft, fijar el extremo
con masking-tape y anotar sobre el papel la capacidad de la pipeta, la fecha, el grupo y el número de
equipo de laboratorio. Con una fecha indicar el sentido de la punta de la pipeta.
4.2.4 MATRACES
a. Colocar en la boca de cada matraz un tapón compacto de algodón, envuelto con gasa, siguiendo las
instrucciones del profesor.
b. Con papel Kraft, elaborar un gorro ligeramente más grande que el tapón de algodón.
c. En una tira de Masking-tape anotar la fecha, grupo y equipo, adherir el Masking-tape al matraz. No
anotar los datos sobre el gorro de papel.
4.2.5 PINZAS Y TIJERAS
a. Envolver con papel Kraft una pinza o tijera y con lápiz señalar con una flecha la punta.
b. Anotar en el papel la pieza de que se trate, la fecha, grupo y equipo.
4.3 PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO
4.3.1 TUBOS DE ENSAYE
a. Colocar en 2 tubos de ensaye, una cubierta de papel aluminio y colocarlos en una canastilla metálica.
b. Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, grupo y equipo, sujetar el papel con masking-tape.
c. Los tubos o frascos con tapa de baquelita, nunca deben cerrarse completamente.
4.3.2 CAJAS DE PETRI
a. Colocar en el interior de un cilindro de acero inoxidable para cajas de Petri dos cajas en posición
invertida perfectamente secas. (NUNCA ESTERILIZAR POR ESTE MÉTODO MATERIAL
CONTAMINADO)
b. Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, el número de cajas que contiene el cilindro, el grupo y la
fecha. Colocar la tira de papel entre la tapa del cilindro.
4.3.3 PIPETAS
a. Poner en la boquilla de cada una de las pipetas un tapón de algodón cuidando que no quede muy
compactado.
b. Flamear las boquillas en la flama a fin de eliminar el exceso de algodón.
c. Colocar en el interior de un cilindro pipetero, las pipetas preparadas.
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d. Anotar en una tira de papel Kraft la cantidad de pipetas, su capacidad, fecha, grupo y equipo. Fijar la
tira entre la tapa del cilindro pipetero.
4.3.4 MATRACES
a) Colocar en la boca de un matraz de 125 ml una tapa de papel aluminio.
b) En una tira de papel Kraft anotar fecha, grupo y equipo. Fijar la tira al cuello del matraz sujetándolo
con masking-tape o etiquetar con un marcador indeleble.
4.3.5 PINZAS Y TIJERAS
a) Envolver en papel aluminio una pinza o una tijera.
b) En una tira de masking-tape, anotar fecha, grupo y equipo. Fijar el masking-tape a la envoltura.
4.4. REDUCCIÓN DE LA CARGA MICROBIANA (PROCEDIMIENTO DE ESTERILIZACIÒN POR
CALOR HUMEDO)
a. En un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo estéril etiquetarlo. (Etiqueta con la
siguiente información, grupo, equipo, temperatura efectuada y fecha) y colocarle una tira de esporas de
Geobacillus stearothermophilus.
b. Someterlo a una presión de 10 libras por 10 minutos.
c. Sacar el tubo e incubar el tubo a 55 oC 2°C durante 5 días en baño maría y observar diariamente
durante el tiempo señalado. Anotar en la bitácora de laboratorio cualquier cambio en cuanto a la
aparición de turbidez.
4.5 ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO
a) Tomar un tubo de de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo estéril y etiquetarlo
b) En un tubo de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo colocar una tira de esporas de Geobacillus
sthearothermophilus, cerrar el tubo y esterilizarlo a 121 °C, 15 min y 15 lb.
c) Sacar el tubo e incubarlo a 55 oC 2°C por 5 días en baño maría y observar diariamente. Anotar en
la bitácora cualquier cambio en cuanto a la aparición de turbidez.
Pasos para realizar una buena esterilización:
-Tener cuidado de eliminar todo el aire del autoclave.
-Colocar agua suficiente hasta el nivel de la rejilla o en la marca de la autoclave vertical
- -Observar que el manómetro registre la presión
-Si se está utilizando la autoclave vertical utilizar agua destilada.
-Al terminar de esterilizar dejar el autoclave sin agua
4.6 ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO
a. Encender el horno una hora antes y colocar el material para esterilizar por calor seco, cuando la
temperatura este a 170 oC tomar el tiempo de 1 h, verificando que la temperatura sea la indicada.
b. En un tubo de ensaye sin esterilizar y vacío, colocar una tira de papel filtro que contenga esporas de
Bacillus subtilis var. niger, cubrir el tubo con papel aluminio y colocarlo junto con el material a esterilizar.
Esterilizar a 170 oC/1 h, etiqueta el tubo de preferencia con un marcador indeleble.
29
c. Después de transcurrido el tiempo de esterilización, apagar el horno y esperar a que el termómetro

indique la temperatura ambiente. Abrir, retirar el material y el tubo de ensaye con la tira de esporas.
d. Con ayuda de la pinza estéril (flamear con alcohol) y bajo condiciones de esterilidad, colocar la tira
de papel filtro conteniendo las esporas de Bacillus subtilis a un tubo de ensaye que contenga 3 ml de
caldo nutritivo estéril y etiquetado. Incubar a 55 2oC durante 5 días. Observar diario y anotar cualquier
cambio en cuanto a la aparición de turbidez.
4.7 CONTROL POSITIVO Y CONTROL NEGATIVO
a) Colocar un tubo con 3 ml de caldo nutritivo estéril con una tira de esporas de Geobacillus
stearothermophilus como testigo positivo del procedimiento.
b) Colocar un tubo con 3 ml de caldo nutritivo estéril sin tira de esporas, es el testigo (-).
4.8 PROCESO DE FILTRACIÓN A TRAVÉS DE MEMBRANA
Sistema de filtración Swinnex marca Millipore

a. Colocar 10 ml de la sustancia a filtrar en una jeringa desechable, remover el swinnex estéril del
empaque de papel al que previamente se le ha colocado la membrana y ensamblar la jeringa.
b. Filtrar gota a gota y recibir el filtrado en un matraz con caldo nutritivo estéril, la jeringa y el filtro
colocarlo en un bote de lámina para su esterilización. Incubar el filtrado a 35 2 oC de 48 a 72 h.
c. Observar diariamente y anotar en la bitácora del laboratorio cualquier cambio en cuanto a la
aparición de turbidez durante 3 días.
d. El bioindicador utilizado en la filtración a través de membrana es Pseudomonas diminuta, para
membranas con un diámetro de poro de 0,2 m
Esterilización de material de desecho
-El material (pipetas o cajas de Petri) utilizado con suspensiones microbianas o con medio de cultivo,
nunca se esterilizan por calor seco
-5. CUESTIONARIO
5.1 ¿Cuál es la finalidad de utilizar agua destilada en el enjuagado del material?
5.2. ¿Por qué utilizamos el papel Kraft para envolver el material?
5.3 Completa el siguiente cuadro, anotando la presencia o ausencia de turbidez en los tubos
Método Tratamiento Calor húmedo Calor seco Filtración a través Control Control
110°C/10´10 lb de membrana negativo
121°C/15´/15lb 170°C/2 h positivo
Resultado
(turbidez)
5.4 Explicar por qué utilizamos un tapón de algodón en las pipetas, en matraces y tubos de ensaye
5.5 Qué explicación darías si después de la esterilización, el tubo que contiene la tira de esporas hay
crecimiento después de la incubación.
5.6 ¿Cómo afecta a la bacteria el proceso de esterilización por calor seco, calor húmedo y filtración?
30
5.7 Anota 10 productos que se puedan esterilizar por calor seco, calor húmedo y filtración.

6.1 Discutir cuales son los inconvenientes o riesgos de preparar el material con papel aluminio y papel
Kraf para su esterilización por calor seco y húmedo.
7. CONCLUSIONES
7.1 Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de estos, así
como a la bibliografía consultada y los objetivos de la práctica.
8. BIBLIOGRAFÍA
8.1 Enlistar la bibliografía consultada
31
PRÁCTICA No. 4
NUTRICIÒN Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS AERÓBICOS
No. DE UNIDAD: III Nutrición y Cultivo Microbiano
1.- OBJETIVOS
1.1 Objetivo General.
El alumno preparará diferentes medios de cultivo en base a sus componentes, uso y consistencia,
utilizando la NOM-065 SSA1-1993 Que establece las especificaciones sanitarias de los medios de
cultivo y los utilizará para cultivar microorganismos.
2.1 El alumno preparará medios de cultivos complejos, diferenciales, enriquecidos, indicadores y
sintéticos de acuerdo a la NOM–065-SSA-1993, a las necesidades nutricionales de un microorganismo,
los esterilizará y vaciará para su uso.
2.2 Utilizará los medios de cultivo de acuerdo a su presentación final para cultivar microorganismos y
comparará el crecimiento de acuerdo a la clasificación.
2.- INTRODUCCIÓN
Las células están formadas por grandes cantidades de pequeñas moléculas como agua, iones
inorgánicos, carbohidratos y aminoácidos y contienen un número todavía más pequeño de moléculas
grandes, los polímeros de las células, siendo los más importantes las proteínas y los ácidos nucleicos.
La célula puede obtener la mayoría de las moléculas pequeñas de su medio ambiente de manera
preformada, mientras que las grandes moléculas son sintetizadas dentro de ellas. Existen complejas
interrelaciones entre los compuestos incorporados por la célula y los que son sintetizados.
Nutrición.
A las sustancias en el medio ambiente utilizadas por los organismos para el catabolismo y el
anabolismo se les llama nutrientes, y pueden dividirse en dos clases:
a.- Nutrientes necesarios, sin los cuales la célula no podría crecer.
b.- Nutrientes útiles pero no indispensables, que se emplean si están presentes pero no son esenciales.
Algunos nutrientes son monómeros a partir de los cuales las células forman las macromoléculas y otras
estructuras, mientras que otros nutrientes sirven solo para la obtención de energía sin ser incorporados
directamente en las sustancias celulares, aunque en ocasiones un nutriente puede desempeñar ambas
funciones. Las sustancias pueden dividirse en dos grupos: macronutrientes y micronutrientes,
dependiendo de si son necesarios en cantidades grandes o pequeñas respectivamente y factores de
crecimiento como compuestos orgánicos, vitaminas, ácidos orgánicos etc. Es fácil detectar cuando se
requiere un macronutriente, simplemente porque se necesita en gran proporción. Frecuentemente los
micronutrientes son necesarios en cantidades tan pequeñas que es imposible determinar cuánto se
requiere; muchas veces ni siquiera se sospecha que un micronutriente esté presente en el medio en
que un microorganismo está creciendo, debido a que los componentes del medio pueden contener tales
micronutrientes en pequeña cantidad como contaminantes.
Los microorganismos se desarrollan a partir de sustancias nutritivas que obtienen del medio que las
rodea. Los microorganismos se desarrollan en medios de cultivo que contienen los nutrimentos
adecuados para cada uno y requeridos para la síntesis de sus constituyentes celulares, además estos
medios proporcionan las condiciones de pH, osmolaridad y humedad que le permiten crecer.
32
Existe una gran diversidad de sustancias que pueden utilizarse en la preparación de medios de cultivo,
formulado con un fin específico, y el cual deberá contener:
a) Fuente de carbono
b) Fuente de nitrógeno
c) Fuente de azufre
d) Factores de crecimiento (que actúan como cofactores, oligoelementos como aminoácidos o
vitaminas que no pueden sintetizar)
e) Fuente de enriquecimiento para microorganismos exigentes (huevo, sangre, suero etc).
f) Inhibidores de crecimiento microbiano como los colorantes, sales biliares, detergentes, antibióticos
o metales pesados.
g) Indicadores de potencial oxido-reducción.
h) Agar como el agente gelificante o soporte.
Medios de cultivo: Según la NOM-065-SSA-1993. Que establece las especificaciones sanitarias
de los medios de cultivo. Generalidades.
Medios selectivos.
Son medios que contienen sustancias que impiden el desarrollo de algunos microorganismos, pero en
una flora mixta permiten el aislamiento y recuperación del germen o grupo de gérmenes de interés.
Medios selectivos de enriquecimiento.
Son medios líquidos que estimulan la multiplicación de algún germen determinado e impiden o inhiben
la reproducción de otros.
Medios diferenciales.
Son aquellos que contienen indicadores de ácido base, redox o sustancias que detectan cambios en el
medio o en las características típicas de las colonias.
Medios para cultivar gérmenes anaeróbicos.
Son medios de cultivo para aquellos gérmenes que requieran condiciones de anaerobiosis o de
microaerofilia.
Medios de transporte.
Sirven para transportar los especímenes que contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del
producto hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio.
Estos medios impiden que se altere la proporción original de la flora microbiana en los especímenes.
Medios para filtración a través de membrana.
Pueden ser líquidos o sólidos. En el primer caso, se preparan a la concentración usual y permiten el
crecimiento de microorganismos presentes en la membrana.
Los medios sólidos tienen un contenido mínimo de agar para favorecer la difusión de nutrientes del
medio de la membrana.
Medios especiales para cultivo de hongos y levaduras.
En el caso de los hongos, el medio de cultivo que más se utiliza es el agar de papa y dextrosa, ya que
tiene un pH de 3,5 lo que inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias. Este medio puede ser
más selectivo al adicionarle ciertos antibióticos tales como: cloranfenicol, eritromicina o gentamicina;
para eliminar los hongos filamentosos de rápido crecimiento se adiciona cicloheximida (este medio se
llama mycosel o micobiótico). Se emplea también el medio de agar extracto de malta y el agar rosa de
bengala se emplea para inhibir el crecimiento radial de hongos con micelio cenocítico.
33
En la formulación de un medio de cultivo deben considerarse, no sólo el tipo de microorganismo, y el

objetivo final que se persiga: aislamiento, recuento, identificación u obtención de masa celular.
Por otro lado, es de suma importancia los cuidados que deben observarse en la preparación de los
medios de cultivo como son:
a. La calidad del agua utilizada (que se prefiere libre de sales)
b. Los materiales que deben encontrase en condiciones de limpieza
c. Si se debe aplicar calor y cuánto para no incurrir en problemas de homogeneidad,
desnaturalización, caramelización o pérdida de actividad nutricional.
d. pH final del medio que deberá ajustarse según indicaciones del fabricante
e. Esterilidad del medio de cultivo de acuerdo a indicaciones del fabricante si es una formulación
comercial, o en otras condiciones si los componentes lo requieren.
Cultivo microbiano.
Los microorganismos obtenidos a partir de suelo, aire, alimentos se encuentran en consorcio y en raras
ocasiones se encontrará un solo tipo de microorganismo. A partir del cultivo inicial de una muestra, se
encontrará una variedad de tipos de colonias y posteriormente se pretenderá lograr un cultivo puro. Un
cultivo puro es aquel que está constituido por microorganismos de la misma especie. El cultivo de
microorganismos se puede realizar en medio sólido, semisólido o líquido.
Se conoce como cultivo en medio sólido al que se hace en una caja Petri con el medio de cultivo
gelificado (agar). Las variantes del cultivo en caja son diversas pero todas se centran en la formación de
estrías sobre la superficie del medio de cultivo con el asa en el caso de bacterias y por picadura
(introduciendo el asa en el agar) si se trata de hongos filamentosos.
Las siembras en tubos con medio sólido, por lo general se emplean para la conservación de un cultivo
proveniente de una placa.
Existen dos variedades de cultivo en tubo:
a) Por estrías: se utilizan los medios de cultivo inclinados, se toma una muestra de alguna colonia
inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se arrastra el asa en forma zigzagueante en el medio
por la superficie inclinada del agar.
b) Por picadura: se utilizan los medios de cultivo en un tubo solidificado ó semisólido en forma
inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se introduce en el medio picándolo longitudinalmente.
La siembra en tubos de cultivo en medio líquido se realiza tomado el inóculo con el asa y se introduce
en el medio líquido agitando suavemente el asa.
a) Desarrollo en medio sólido inclinado. Se siembran los microorganismos por estría en tubos con
agar inclinado
b) Desarrollo en medio líquido. Las características que se observan en el cultivo son: turbidez, un
sedimento, una película superficial, o combinados.
c) Desarrollo en medio semisólido por picadura hasta ¾ partes del tubo
Mediante la evaluación de las características de las colonias descritas y la acción en el medio, se puede
hacer una identificación preliminar de los diferentes microorganismos aislados en un cultivo primario.
Estas características son útiles para seleccionar otros medios y pruebas diferenciales apropiadas para
completar la identificación de los microorganismos, aunque cabe señalar que la identificación de
microorganismos por el estudio de sus características de cultivo es solo parcial ya que se requiere otras
pruebas bioquímicas, fisiológicas e inmunológicas.
34
Agar bacteriológico
El agar utilizado en bacteriología es un medio que está libre de metales, compuestos nitrogenados,
sales insolubles, azúcares libres, microorganismos muertos, bacterias termófilas y pigmentos.
El agar es una sustancia coloidal desecada que se extrae de algunas especies marinas de algas rojas,
particularmente de los géneros Gelidium, Gracilaria, Pteroclaida y Acanthopeltis, químicamente el agar
es una mezcla de dos polisacáridos: agarosa y la agaropectina, cuyas estructuras se revelan como
polímeros de la galactosa en sus distintas formas. La proporción de agarosa y agaropectina es variable,
con valores extremos de 75 % de agarosa y 25 % de agaropectina, según la clase de algas utilizadas.
El agar con agua destilada fría tiene un poder de hinchamiento superior a veces al 3000%, en agua
hirviendo el agar se disuelve totalmente en pocos minutos. La tendencia a la unión de sus partículas,
que en frío se mantienen independientes producen un gel limpio y transparente que al enfriarse, ya no
cede el exceso de agua absorbida. La viscosidad del gel aumenta paulatinamente a medida que la
solución disminuye en su temperatura, gelificando a los 35 – 40 °C.
Los ácidos diluidos en frío, no alteran sensiblemente el agar, desde que se introdujo el agar a los
medios de cultivo como agente gelificante ha resultado muy bueno debido a que:
a) Su estructura le confiere gran estabilidad frente a las enzimas microbianas, muy pocas bacterias
marinas son capaces de hidrolizar como Pseudomonas carragenomora.
b) Su estabilidad química, le permite mantener el medio en estado sólido.
c) Su punto de fusión, superior a 80 °C, permite cultivar en medio sólido bacterias termófilas que se
incuban hasta temperaturas de 65 °C.
d) Su temperatura de gelificación, inferior a los 39 °C, permite mezclarlos en forma líquida.
e) Su elevado poder gelificante permite su utilización a muy bajas concentraciones, generalmente al
1,5 % (m/v) permitiendo obtener geles muy firmes, lo que permite sembrar microorganismos.
f) Su empleo en concentraciones muy bajas permiten la obtención de medios semisólidos en los
cuales se pueden realizar pruebas de movilidad.
Clasificación de medios de cultivo
I Los medios de cultivo por su estado de agregación pueden ser: líquidos, semisólidos y sólidos
a) Medios líquidos. Este medio no contiene agar y se emplea para obtener grandes cantidades de
microorganismos o bien para la producción de algún metabolito.
b) Medios semisólidos. Se utiliza para determinar si un microorganismo tiene movilidad.
c) Medios sólidos. Se utiliza para obtener colonias aisladas de microorganismos.
II.- Por su uso se clasifican en:
a) Medios selectivos.- Son medios que contienen sustancias que inhiben el crecimiento de algunos
microorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperación del microorganismos o
grupo de microorganismos de interés.
b) Medios de enriquecimiento. Son medios que estimulan la multiplicación de algún microorganismo.
c) Medios selectivos de enriquecimiento.- Son medios que estimulan la multiplicación de algún
germen determinado e impiden la reproducción de otros.
d) Medios diferenciales.- Son aquellos que contienen indicadores ácido base y de redox para detectar
cambios en el medio o en las características típicas de la colonia.
35
e) Medios para cultivar gérmenes anaeróbicos.- Son medios de cultivo para aquellos gérmenes que
requieran condiciones anaeróbicas o de microaerofilia. Incluyendo medios reductores como el caldo
tioglicolato y el uso de jarras de anaerobiosis.
III. Por su composición

a) Si a un medio se le conoce completamente su formulación química se denomina medio sintético
como el caldo glucosa sales.
b) Si un medio de cultivo no conocemos su composición química se le denomina un medio complejo
como el agar base sangre.
Acorde a la presentación de un medio, podemos tener cultivos líquidos en matraz, en tubo medios
semisólidos y en placa medios sólidos.
IV.- Medios de cultivo para medir la actividad antimicrobiana (antibiograma).
Los medios para realizar antibiogramas o para medir los halos de inhibición de sustancias
desinfectantes o antisépticas generalmente son medios que no contienen inhibidores como el agar
Mueller Hinton, agar cuenta estándar y agar de soya y tripticaseína.
Para cada medio de cultivo se deben de introducir controles, por ejemplo para el Agar de papa y
dextrosa se siembran las siguientes cepas de referencia.
Microorganismo Cepa Resultado
Candida albicans ATCC 10231 Bueno
Saccharomyces cerevisiae ATCC9763 Bueno
Trichophyton mentagrophytes ACTT9533 Bueno
Para el agar con eosina y azul de metileno los controles de actividad son:
Microorganismos Cepa Resultado

Escherichia coli ATCC 25922 Colonias moradas con brillo metálico azul verdoso
Enterobacter aerogenes ATCC 13048 Colonias mucoides con centro oscuro por lo general sin brillo metálico
Salmonella typhimurium ATCC 14028 Colonias incoloras y transparentes
Shigella flexneri ATCC 12022 Colonias incoloras y transparentes
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Crecimiento parcialmente inhibido o colonias puntiformes
Candida albicans ATCC 10231 Colonias plumosas de color rosa pálido.
Esto se realiza para garantizar que el medio de cultivo funciona adecuadamente y puede ser utilizado,
además es parte del control de calidad de los medios de cultivo.
3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS

3.1 MATERIAL POR GRUPO Sesión I
●Balanza granataria ●Potenciómetro

●Autoclave ●Algodón
●Horno 170° C ● Gasa
Papel Kraf Refrigerador
36
Incubadora a 28° C Incubadora a 37° C

3.2 MATERIAL POR EQUIPO (Sesión I)
●Un mechero Fisher ●Una pipeta de 10 ml
●Un espátula ●Cinco tubos de ensaye de 13 x 100 mm
●Seis matraces de 250 ml ● ●Una probeta de 100 ml
●Siete tubos de ensaye de 16 x 150 mm ●Un termómetro
●Dos matraces de 125 ml Seis cajas Petri
Sesión II
Tres tubos con 3 ml de medio SIM Un matraz con 50 ml de caldo glucosa sales
Tres cajas con agar EMB Un matraz con 50 ml de caldo nutritivo
Tres tubos con agar PDA Tres tubos con agar nutritivo
Tres cajas con agar nutritivo Tres cajas con un medio enriquecido
3 tubos con 3 ml de caldo glucosa sales 3 tubos de caldo nutritivo
3.3 REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO
●Agar nutritivo (AN) ●(NH4) 2SO4
●Agar eosina azul de metileno (EMB) ●K2HPO4
●Agar de papa y dextrosa (PDA) ●MgSO4 7H2O
●Medio SIM ●MnSO4 4H2O
●Glucosa ●Agar bacteriológico
Agar base sangre Agar rosa de bengala
Escherichia coli Penicillum sp.
Bacillus sp. Aspergillus sp.
4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL
Recomendaciones generales para la preparación de los medios de cultivo.
a) Preparar el volumen de medio que se vaya a utilizar en el período recomendado para su
empleo.
b) Utilizar agua destilada y material de vidrio libre de detergentes.
c) Pesar la cantidad del medio que marca el fabricante (en la etiqueta)
d) El medio de cultivo en polvo debe de guardarse en su frasco y en un lugar fresco.
e) Emplear recipientes con el doble de capacidad al volumen que se va a preparar para evitar la
proyección en el momento de la ebullición.
f) Añadir una pequeña cantidad de agua para permitir la disolución y después completar el volumen.
37
g) En general los medios se mezclan hasta disolución completa para aclararse, pero debe evitarse que
se derramen. Nunca deben calentarse a la flama directa del mechero para evitar que se proyecten.
h) El pH de los medios debe ajustarse antes de la esterilización y a una temperatura de 25° C.
i) Es conveniente evitar el sobrecalentamiento durante la esterilización por calor para evitar la pérdida
de materiales nutritivos y agua que puedan cambiar la consistencia del medio.
j) Los medios de cultivo ya preparados y esterilizados deben mantenerse en refrigeración (4° C) y
protegidos de la luz. Antes de emplearlos verificar que no exista contaminación, precipitación, cambio
de color o de consistencia etc.
k) Un medio contenido en un matraz y que ya contenga sustancias de enriquecimiento ó ácido tartárico
no puede ser esterilizado una segunda ocasión.
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
4.2 MEDIO SINTÉTICO (glucosa-sales caldo y agar)
a) Preparar 100 ml de caldo o la cantidad que indique el profesor.
b) Pesar cuidadosamente los componentes del medio de acuerdo a la siguiente formulación:
Reactivo Cantidad
Glucosa 5.0
(NH4) 2SO4 2.0
KH2PO4 0.05
K2HPO4 0.05
MgSO4 7H2O 0.25
MnSO4 4H2O 0.001
Agua destilada 100 ml
c) Disolver los componentes por separados y colocarlos en un matraz de 250 ml, adicionar en primer
lugar los metales, luego los fosfatos, el amonio y finalmente la glucosa. Ajustar el pH a 7.0 ± - 0.2 si
fuera necesario, para ello utilizar el potenciómetro.
d) Una vez disueltos los componentes transferir 30 ml a un matraz Erlenmeyer de 125 ml,
colocarle el tapón de algodón su gorro de papel Kraf y colocarlo en el autoclave.
e) Tomar 3 tubos y colocarles 3 ml de caldo glucosa sales, taparlos y colocarlo en un bote de
lámina
f) Medir el volumen que sobra del caldo y realizar la operación matemática, de tal forma que la
concentración de agar a adicionarle sea 1.5 g de agar bacteriológico/ 100ml de medio.
g) Calentar a ebullición hasta que se haya fundido completamente.
h) Tomar 3 tubos de ensaye y colocarle aproximadamente 3 ml, taparlos y colocarlos en el bote de
lámina para su esterilización.
i) El medio que ha sobrado colocarle el tapón y su gorro e introducirlo a la autoclave.
j) Esterilizar todo el material anterior en autoclave a 110° C durante 15 minutos. Una vez que se ha
llevado a cabo la esterilización, inclinar los tubos que tienen agar.
k) Enfriar el matraz hasta 45° C y en condiciones asépticas transferir del matraz de 15 a 20 ml de
medio en cajas de Petri estériles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.
38
l) Etiquetar con los datos correspondientes cada caja (en la base de la caja) colocar el masking tape o
con marcador indeleble Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas en posición invertida.
m) Dejar una muestra para control de esterilidad por 5 días y el resto de material conservarlo en
refrigeración para su uso.
4.3.1 MEDIO COMPLEJO (agar nutritivo para placas de Petri)
a) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad de
medio indicada por el profesor.
b) Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua necesaria.
c) Calentar suavemente hasta disolverlo completamente.
d) Tapar el matraz que contiene el medio con un tapón y gorro de papel Kraft.
e) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase.
f) Enfriar el matraz hasta 45° C y en condiciones estériles transferir del matraz de 15 a 20 ml de medio
en cajas de Petri estériles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.
g) Etiquetar con los datos correspondientes cada caja (en la base de la caja) colocar el masking tape o
4.3.2 MEDIO COMPLEJO (agar nutritivo para preparar tubos de ensaye)
d) En un tubo colocar 3 ml de agua para ser utilizado como tubo de comparación y no usar una pipeta.
e) Vaciar aproximadamente 3 ml de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm limpios
y etiquetados, taparlos con un tapón de algodón-gasa y colocarlos en un bote
f) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase, al término de
esta y calientes inclinar los tubos con el agar y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.
g) Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas.
4.3.3 MEDIO COMPLEJO (caldo nutritivo en matraz y tubo de ensaye)
a) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar 60 ml de medio.
c) Calentar solo si es necesario hasta disolverlo completamente.
d) Medir con una probeta 50 ml y colocarlo en un matraz de 125 ml, colocarle su tapón y gorro
e) Vaciar 3 ml de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm limpios y etiquetados,
taparlos con un tapón de algodón-gasa y colocarlos en un bote de lámina.
f) Esterilizar a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase y guardar en refrigeración.
4.4 MEDIO DIFERENCIAL Agar Eosina Azul de Metileno (EMB)
a) Pesar cuidadosamente la cantidad que dice el envase para preparar la cantidad que se indique.
39
b) Colocar el medio en un matraz con el doble del volumen y adicionarle el agua necesaria.
c) Calentar suavemente hasta disolución completa.
d) Tapar el matraz con un tapón de algodón-gasa y gorro de papel Kraft.
e) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del frasco
f) Enfriar el matraz hasta 45° C y en condiciones asépticas transferir del matraz de 15 a 20 ml de
medio en cajas de Petri estériles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.
4.5.1 MEDIO SELECTIVO (Agar Papa y Dextrosa para preparar cajas de Petri)
d) Tapar el matraz que contiene el medio con un tapón y gorro de papel Kraft.
e) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase.
f) Enfriar el matraz hasta 45° C y en condiciones estériles transferir del matraz de 15 a 20 ml de medio
en cajas de Petri estériles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.
4.5.2 MEDIO COMPLEJO (Agar Papa y Dextrosa para preparar tubos de ensaye)
d) En un tubo colocar 3 ml de agua para ser utilizado como tubo de comparación y no usar una pipeta.
e) Vaciar aproximadamente 3 ml de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm limpios
y etiquetados, taparlos con un tapón de algodón-gasa y colocarlos en un bote
f) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase, al término de
esta y calientes inclinar los tubos con el agar y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.
g) Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas.
4.5.3 MEDIO SELECTIVO (Agar Papa y Dextrosa para preparar matraces con 80 ml)
h) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar 80 ml del medio.
i) Colocar el medio en un matraz de 125 ml y adicionar el agua necesaria.
j) Calentar suavemente hasta disolverlo completamente.
k) Tapar el matraz previamente etiquetado que contiene el medio con un tapón y gorro de papel Kraft.
l) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase.
40
m)Este medio se utilizará para la realización de la técnica de vaciado en placa y para ello será
necesario fundir el medio y cuando este a 45 °C se le adicionará 1.4 ml de ácido tartárico al 10%
estéril por cada 100 ml de medio preparado y homogeneizar.
4.6 MEDIO INDICADOR medio SIM (Sulfur Indol Motility).
a) Pesar con cuidado la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad que
indique el profesor.
b) Colocar el medio en un matraz del doble de capacidad y adicionarle agua necesaria.
c) Calentar suavemente hasta disolución completa y colocar 3 ml en tubos de 13 x 100 mm.
d) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase
e) Dejar los tubos en el bote y dejar que estos solidifiquen en posición vertical.
4.7a.-MEDIO ENRIQUECIDO AGAR SANGRE

a) Pesar la cantidad indicada para preparar cuatro placas según la etiqueta del frasco.
b) Fundir el medio con agua destilada, hasta que el medio este claro y sin grumos.
c) Colocar el tapón de algodón y el gorro y esterilizar, según indica el frasco.
d) Una vez esterilizado el medio, enfriarlo hasta que este a 45°C.
e) Cuando este a esa temperatura, adicionar 5 % de sangre estéril desfibrinada.
f) Mezclar bien la sangre y vaciar rápidamente en las placas previamente esterilizadas y etiquetadas.
g) Dejar solidificar el medio y colocarlas en una bolsa de plástico nueva en posición invertida y
guardarlas en el refrigerador.
4.7.b.- MEDIO COMPLEJO Y ENRIQUECIDO (Agar Baird-Parker, medio que se utilizará en

aislamiento)
Este medio de cultivo contiene cloruro de litio y telurio para la inhibición de la flora acompañante, en
tanto que el piruvato y la glicocola actúan favoreciendo selectivamente el crecimiento de
Estafilococos.Sobre el medio de cultivo, opaco por su contenido en yema de huevo, las colonias de
Estafilococos muestran dos características diagnosticas por la lipólisis y proteolisis, se producen halos y
características y, debido a la reducción del telurio a teluro, se desarrolla una colonia negra. La reacción
con al yema de huevo y la reducción del telurio se presentan con notable paralelismo con la coagulasa-
positividad, y por tanto, pueden utilizarse como índice de esta última.
Formula
Ingredientes Cantidad
Medio base 95,0 ml
Solución de telurito de potasio 1,0 ml
Emulsión de yema de huevo 5,0 ml
Preparación
a.- Cuando el medio base esté a 45ºC, agregar los demás ingredientes y mezclar.
b.- Colocar de 15 a 20 ml del medio completo, enfriar y dejar solidificar.
c.- Las placas pueden almacenarse por 48 h a temperatura de 0 a 5ºC.
41
Preparación del medio base de Baird-Parker

a.- Disolver los ingredientes o el agar base en agua y calentar con agitación constante y hervir durante 1
min. Esterilizar a 121ºC ±1 durante 15 min, enfriar y mantener el medio a 45ºC.
Preparación de la solución de telurito
a.- Disolver el telurito de potasio en agua y esterilizar. La solución puede ser almacenada por varios
meses a temperatura de 0 a 5ºC.
Preparación Emulsión de yema de huevo
a.- Lavar con agua y jabón los huevos frescos que sean necesarios y limpiarlos con una solución de
tintura de yodo (solución alcohólica al 2%) o sumergirlos en solución de cloruro mercúrico (1:1000).
Enjuagar con agua estéril y secar con gasa estéril.
b.- En campana de flujo laminar o en condiciones asépticas, abrir los huevos y vaciarlos en un
separador de claras estéril. Transferir las yemas a una probeta hasta un volumen de 60 ml y completar
a 90 ml con solución salina isotónica.
c.- Verter la emulsión a un matraz Erlenmeyer con perlas de vidrio estéril y agitar fuertemente para
formar la emulsión y filtrar a través de gasa.
d.- En tanto que el medio de cultivo basal puede aguardarse de 1 a 2 meses a 4 º C, el medio de cultivo
completo, vertido en placas, ha de ser utilizado dentro de las 24 horas siguientes a su preparación.
4.8 AGAR ROSA DE BENGALA

a) Pesar la cantidad indicada para preparar cuatro placas según la etiqueta del frasco.
b) Fundir el medio con agua destilada, hasta que el medio este claro y sin grumos.
c) Colocar el tapón de algodón y el gorro y esterilizar, según indica el frasco.
d) Una vez esterilizado el medio, enfriarlo hasta que este a 45°C y vaciar en placas estériles
e) Dejar solidificar el medio y colocarlas en una bolsa de plástico nueva en posición invertida y
guardarlas en el refrigerador.
4.9 CONTROL DE ESTERILIDAD

a) Tomar una muestra de cada uno de los medios preparados para el control de la esterilización e
incubarlos a 35 °C durante 3 a 5 días.
b) Verificar que no presente crecimiento, cambio de color o precipitación.
NOTA: ESTOS MEDIOS SE UTILIZARAN PARA LA SIGUIENTE SESIÓN QUE ES CULTIVO DE MICROORGANISMOS.
SESIÓN II
4.1 Revisar los medios de cultivo que se prepararon
4.2 CULTIVO EN MEDIO SÓLIDO EN PLACA (ESTRÍA CRUZADA, SIMPLE, POR PUNTO Y
MASIVA)
Se utilizarán cajas con agar EMB o Agar sangre para la realización de la estría cruzada.
a) Tomar el asa y esterilizarla al rojo vivo en la flama del mechero.
b) Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la boca del tubo por la flama del mechero.
c) Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar con ella el inóculo.
42
d) Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del mechero y colocarle el tapón .
e) Destapar la caja de EMB y sembrar al microorganismo por estría cruzada como se indica en el
esquema y esterilizar el asa cada vez que se realiza una estría.
f) Una vez sembrado el microorganismo incubar la caja sembrada a 37° C, durante 24 horas.
g) Observar el crecimiento a las 24 h y anotar las características del crecimiento en el medio cultivo.
4.3. CULTIVO DE MICROORGANISMOS POR ESTRÍA SIMPLE EN PLACA

a) Tomar el asa y esterilizarla en la flama.
b) Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la boca del tubo por la flama.
c) Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar con ella el
inóculo.
d) Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del
mechero y colocarle el tapón.
e) Destapar la caja de Agar nutritivo y sembrar como se
indica en el esquema
f) Esterilizar el asa al terminar de efectuar la estría e
incubar la caja sembrada a 37° C, durante 24 h.
g) Observar el crecimiento a las 24 h y anotar las características del crecimiento en el medio cultivo.
4.4. CULTIVO DE MICROORGANISMOS POR PUNTO (generalmente para mohos)
a) Tomar la placa y dividirla en cuatro fracciones que

corresponden una para cada alumno y testigo
b) Tomar el asa y esterilizarla al rojo vivo en la flama.
c) Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la
boca del tubo por la flama del mechero.
d) Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar el inóculo.
e) Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del mechero y colocarle el tapón.
f) Destapar la caja de agar de papa y dextrosa y sembrar como se indica en el esquema.
g) Esterilizar el asa al terminar de efectuar la estría e incubar la caja sembrada a 28° C, de 3 a 5 días.
h) Observar el crecimiento a las 24h, 48h, 72h y 5 días, anotar las características del crecimiento.
4.5. CULTIVO DE MICROORGANISMOS POR ESTRÍA MASIVA
43
a) Tomar un hisopo estéril.

b) Destapar el tubo que contenga la suspensión del microorganismo y
pasar la boca del tubo por la flama del mechero.
c) Tomar un hisopo estéril y humedecerlo en la suspensión.
d) Pasar la boca del tubo por la flama y colocarle el tapón.
e) Destapar la caja de agar de soya y tripticaseína y sembrar como se
indica en el esquema
f) Colocar el hisopo en el benzal para su desinfección e incubar la caja sembrada a 37 °C/24 h, y
observar el crecimiento.
4.6 CULTIVO EN TUBO EN MEDIO SÓLIDO INCLINADO
a) Se utilizarán tubos con agar nutritivo y agar papa dextrosa inclinada y AGS
b) Tomar una asada de la bacteria proporcionada y sembrar por estría en “S” la
superficie del medio inclinado de agar nutritivo.
c) Tomar una asada del (micelio y esporas) proporcionada y sembrar por estría en
“S” la superficie del medio inclinado de agar de papa y dextrosa.
d) Esterilizar el asa una vez realizada la siembra e Incubar los tubos sembrados a 37° C para bacterias
y a 28° C para hongos, durante 24 y 48 h respectivamente
e) Observar los cultivos a las 24 y 48 horas y anotar las características del cultivo.
4.7 CULTIVO EN MEDIO LÍQUIDO (Se emplearán tubos y matraz con caldo nutritivo y glucosa sales)
a) Tomar el inóculo de bacterias con el asa y disgregar éste

“agitándolo” en las paredes del tubo o matraz, evitar la
formación de grumos.
b) Tomar el inóculo de hongos con el asa en forma de L y
sembrarlo en el matraz o en tubo, procurando tomar esporas
y micelio para disgregarlo en el medio.
c) Esterilizar el asa una vez realizada la siembra.
d) Incubar los tubos y matraz con bacterias a 35° C/24 h, y
el matraz con hongos a 28° C/ 5 días en agitación a 120 rpm
e) Observar los cultivos a las 24 y 48 h y anotar las características observadas.
f) Los equipos designados por el profesor dejarán su matraz con moho o bacterias sin agitación.
4.8 CULTIVO EN MEDIO SEMISÓLIDO (Se emplearán tubos con medio SIM)
a) Tomar un inóculo de bacterias con el asa recta.

b) Sembrar por picadura, sumergiendo el asa hasta ¾ partes del medio SIM sin tocar el
fondo y sacar el asa verticalmente. (El crecimiento debe de darse en la línea de trazo en el
caso de que la bacteria sea no móvil, cuando es móvil el crecimiento se difunde a través
del medio). Esterilizar el asa una vez realizada la siembra.
c) Incubar los tubos a 37° C/ 24 h.
d) Observar los cultivos a las 24 h y anotar las características del cultivo.
44
4.9 MORFOLOGÍA COLONIAL
Morfología colonial en placa para bacterias y levaduras

Una vez sembrada la placa la descripción de cada una de las colonias SEPARADAS debe incluir:
a. Tamaño: Diámetro en mm, La mayoría de los microorganismos forman colonias de tamaño limitado
al tiempo de incubación.
b. Forma: Es la apreciación general de su figura la cual puede ser:
c.- Elevación: Que puede ser:
d. Borde: Se refiere al contorno de las colonias y puede ser: Entero, ondulado, Lobulado, crenado,
filamentoso o rizado.
e. Color: Blanco, amarillo, negro, marrón, anaranjado, etc.

f. Aspecto: Húmedo o seco
g. Consistencia: Suave (butirosa), viscosa, membranosa o dura. Esta prueba se realizar con el asa.
Morfología colonial en placa para mohos:
Tiempo de crecimiento: Los mohos filamentosos, tienen colonias de 2-3 cm de diámetro y va de 3 a 5 días.
Aspecto: puede ser: aterciopelado, pulverulento, velloso y algodonoso.
Pigmentación: Al reverso de la colonia se observa el pigmento del micelio y puede ser de color olivo,
verde claro, grises, blancas, rojas, amarillas.
45
5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO

5.1 En un cuadro anota los medios de cultivo que se prepararon, sus condiciones de esterilización, el
aspecto final del medio y cuál es su clasificación en base a su consistencia y composición.
Medio de cultivo Condiciones de Clasificación por su Clasificación por su Presentación del

esterilización consistencia composición medio
Caldo Glucosa sales 110°C /10 ´ Líquido Simple /sintético Tubo y matraz
Ejemplo
Agar Glucosa sales
Agar Nutritivo
EMB
PDA
SIM
Agar sangre
Agar rosa de bengala
5.2 ¿Qué cuidados deben tenerse al preparar un medio de cultivo sólido en caja de Petri?
5.3- De los siguientes medios, mencionar en qué consiste su capacidad diferencial o selectiva y qué
tipos de microorganismos crecen en ellos? Agar Rosa de Bengala y Agar Papa Dextrosa.
5.4 ¿Cuál es la función de los colorantes e indicadores en los medios de cultivo?
5.5 De los medios usados indica cuáles son específicos para mohos y cuáles para bacterias y ¿por
qué?
5.6 Cuando se siembran hongos en medio líquido, describe cómo es el crecimiento con y sin agitación.
5.7 ¿En qué casos se siembra en medio semisólido y cuáles son las precauciones que se deben tomar?
5.8 Anota la morfología colonial de un moho y de una bacteria, indicando de que medio lo obtuviste.
6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Discutir con base a la Norma Oficial Mexicana la clasificación de los medios y a las características de la
morfología colonial (macroscópica) para cada especie microbiana.
7.- CONCLUSIONES
Elabora tus conclusiones utilizando los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, la
bibliografía consultada y al objetivo de la práctica.
8. BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA PARA LA ELABORACIÓN DE ESTA PRÁCTICA
Edición. Interamericana. México. 140 p.
8.2 Manual de medios de cultivo Bioxon parte 1 y 2
8.3 NOM-065-SSA1-1993, Bienes y servicios. Que establece las especificaciones sanitarias de los
medios de cultivo. Generalidades.
8.4 Schiegel, G. Microbiología General. Edición. Omega. 1997. España. 654 p.
46
PRACTICA No 5
AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS
UNIDAD IV: Cultivo y crecimiento microbiano
1. OBJETIVOS:
El alumno practicará las técnicas de aislamiento y cuantificación de microorganismos de muestras
biológicas siguiendo las recomendaciones de las Normas Oficiales Mexicanas.
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
1.2.1 El alumno practicará las diferentes técnicas de aislamiento y recuento de microorganismos.
1.2.2 Aplicará la técnica de las diluciones para disminuir la carga microbiana de las muestras con base
en las normas oficiales, NOM-109-SSA1-1994 Procedimientos para la Toma, Manejo y Transporte de
Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico y NOM-110-SSA1-1994 Preparación y Dilución
de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico, 092 NOM-092-SSA-1994, Método para la
cuenta de bacterias aerobias en placa y NOM-111-SSA1–1994, Bienes y servicios. Método para la
cuenta de mohos y levaduras en alimentos
2. INTRODUCCIÓN
Se entiende por aislamiento, al proceso que permite separar uno o más microorganismos presentes en
una muestra, forzándolos a crecer en medios de cultivos. No todos los microorganismos pueden
cultivarse en medios de cultivo como el caso de los organismos biotróficos y consorcios microbianos
difíciles de separar (parásitos obligados), los cuales se desarrollan sobre tejido vivo de su hospedante
(virus, rickettsias, hongos).
En el estudio microbiológico, el primer paso es la separación de la población mixta a un cultivo puro y
luego su posterior identificación (familia, género y especie).
-Cultivo puro: es aquel que contiene una sola especie o tipo de microorganismo y que presumiblemente
se ha obtenido a partir de una sola célula. En un cultivo puro, no necesariamente todas las células que
lo componen tienen que ser exactamente iguales, ya que es factible que algunas de ellas sufran
mutaciones y se diferencien de las restantes. Cada uno de los cultivos puros que com ponen una
especie se denomina cepa.
Las diferentes técnicas de aislamiento son la estría cruzada, el vaciado en placa y la extensión con
varilla, pero en ocasiones la muestra tiene gran cantidad de microorganismos que tenemos que recurrir
a la realización de:
Realización de diluciones (NOM-110-SSA1–1994, Bienes y servicios. Preparación y dilución de
muestras de alimentos para su análisis microbiológico)
La dilución primaria tiene por objeto obtener una distribución lo más uniforme posible de los
microorganismos contenidos en la muestra destinada para el análisis.
La preparación de diluciones decimales adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el
número de microorganismos por unidad de volumen, para permitir, después de la incubación, la
observación de la prueba en el caso de tubos o matraces y la cuenta de colonias en el caso de placas.
Dilución primaria, es la suspensión o emulsión obtenida después de pesar o medir una cantidad del
producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporción de diluyente.
47
Diluciones decimales adicionales, las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un determinado

volumen de la dilución primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que por repetición de
esta operación con cada dilución así preparada, se obtiene la serie de diluciones decimales adecuadas
para la inoculación de medios de cultivo.
Estría cruzada en placa:
Esta técnica consiste en establecer un gradiente de diluciones por medio de las estrías cruzadas sobre
la superficie de un medio sólido, para separar a los microorganismos, dando origen a colonias
separadas que generalmente corresponden a un cultivo puro, aquí no se puede hacer un recuento.
TÉCNICA DE VACIADO EN PLACA:
El fundamento de la técnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio de elección
después de un cierto tiempo y temperatura de incubación, presuponiendo que cada colonia proviene de
un microorganismo de la muestra bajo estudio. El método admite numerosas fuentes de variación,
algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores.
En la lectura seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250 UFC, para disminuir el error
en la cuenta en caso contrario seguir las indicaciones de la NOM 092
Unidades Formadoras de Colonias (UFC), término que debe utilizarse para reportar la cuenta de
colonias en placa, las cuales pueden surgir de una célula o de un cúmulo de células.
TÉCNICA DE EXTENSIÓN EN PLACA CON VARILLA ACODADA
Esta técnica se utiliza para el aislamiento y recuento de microorganismos, donde el inóculo se distribuye
con la varilla, previamente esterilizada. La cantidad de inóculo utilizado puede ser de 0,1 o 0,5 ml.
En algunos casos el aislamiento lo podemos hacer directamente en un medio selectivo, pues lo que
deseamos es ver la producción de un metabolito, por ejemplo para el aislamiento de microorganismos
productores de amilasas se utiliza el medio denominado agar almidón.
El aislamiento nos sirve para obtener la morfología colonial, microscópica y observar alguna
característica como hidrólisis o hemólisis.
3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS
3.1 MATERIAL POR EQUIPO
Cuatro Cajas de Petri estériles Cuatro cajas de Petri con Agar Nutritivo
Cajas de Petri con EMB o medio selectivo Cilindro con pipetas de un ml estériles
Matraz con 100 ml de ACS o PDA Seis frascos de dilución con 90 ml de
solución salina al 0.85%
Balanza granataria
3.2 MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ALUMNO
3.2.1 Muestra de queso, agua de sabor, leche en punto de venta, helado, etc.
4.1 Realizar diluciones de la muestra como lo indique el profesor y según el siguiente esquema.
4.1.1 DILUCIONES
a. Para muestras líquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la distribución de
microorganismos es homogénea o fácilmente homogeneizable por medios mecánicos (agitación, etc.).
48
b. Para muestras congeladas de un alimento originalmente líquido o licuable, fundir por completo en
baño de agua de 40 a 45°C un tiempo máximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente.
c. Para la parte líquida de una muestra heterogénea la cual sea considerada suficientemente
representativa de la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales).
d. Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm
efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 10 ml de la muestra si es muestra líquida y 10 g si es
muestra sólida y diluir con 90 ml del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a ésta,
evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente (todo en condiciones de esterilidad).
e. Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas que se hayan
seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la
pipeta.
f) La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, dependen
del número esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de análisis previos y
de la información que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado. En ausencia total
de información, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.
4.2 AISLAMIENTO Y RECUENTO POR LA TÉCNICA DE VACIADO EN PLACA. Agar cuenta

estándar (ACS) o agar de papa y dextrosa (PDA)
NOM-092-SSA-1994, Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa y NOM-111-SSA1–1994,

Bienes y servicios. Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos
a) Una vez realizadas las diluciones se procede a inocular las placas
b) Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación; la adición de medio
de cultivo y homogenización, se puedan realizar cómoda y libremente. Marcar las cajas en la base de
la misma con los datos pertinentes previamente a su inoculación y correr por duplicado.
c) Se inocula un ml de las dos últimas diluciones según las diluciones que se hayan realizado en las
cajas Petri estériles, agregar de 12 a 15 ml del medio preparado que es agar cuenta estándar,
mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj,
6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una
completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas.
Dejar solidificar.
49
d) Incluir una caja sin inóculo por cada lote del medio preparado como testigo de esterilidad.
e) El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que
finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.
f) Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se
requieran.
g) Para bacterias y levaduras 37°C 24 a 48 horas.
h) Contar todas las colonias en aquellas cajas que tengan entre 25 y 250 colonias
i) Si se cuenta la última dilución y no tiene entre 25 y 250 sino más, y las colonias están bien
distribuidas, dividir la placa en dos y contar solo una mitad, el resultado se multiplica por dos, si aún
tenemos muchas colonias, dividir la placa en cuatro y solo contar un cuadrante y el resultado se
multiplica por cuatro, y si todavía tenemos muchas contar 5 cm 2, sumarlos y sacar un promedio, el
resultado se multiplica por 65, cuando la placa utilizada sea de 100 X 15 mm.
j)Para el aislamiento y recuento de mohos es el mismo procedimiento solo que ahora hay que acidificar
el PDA con 1.4 ml de acido tartárico al 10 % por cada 100 ml de medio, incubar a 28 °C de 3 a 5 días y
contar todas las colonias en aquellas cajas que tengan entre 15 y 150 colonias.
4.3 AISLAMIENTO Y RECUENTO POR LA TÉCNICA DE EXTENSIÓN EN PLACA (Agar Nutritivo)
a. Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación; la adición de medio
de cultivo y homogenización, se puedan realizar cómoda y libremente.
b. Etiquetar las cajas en la base previamente a su inoculación y correr por duplicado.
c. Inocular 0.1 ml de las dos últimas diluciones de las muestras preparadas sobre la superficie del
medio.
d. Humedecer una varilla de vidrio en forma de L con alcohol y pasarla por la flama del mechero.
e. Enfriar la varilla, una vez fría extender el inoculo por toda la superficie del agar nutritivo.
f. Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad.
g. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que
finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.
h. Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se
requieran, según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate.
i. Para bacterias 37°C 24 a 48 horas.
j. Se procede a contar el número de bacterias haciendo los cálculos como en la técnica de vaciado en
placa.
50
4.4 AISLAMIENTO POR ESTRIA CRUZADA (Medio selectivo)
a. Este sistema de siembra en estrías en placas de Petri con medios sólidos y es el procedimiento
habitual para aislar microorganismos. (En caso de duda ver la práctica anterior.)
b. Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se
requieran, según el tipo de producto y/o microorganismo de que se trate.
c. Realizar la morfología colonial de las colonias que estén previamente aisladas.
5 CUESTIONARIO:
5.1 Informe de resultados de la técnica de Vaciado en placa:
Técnica Vaciado en placa ACE/PDA Extensión con varilla (AN)
No. de UFC/ml
5.2 Reportar como: Unidades formadoras de colonias, ___________UFC/g o ml de bacterias aerobias

en placa en agar cuenta estándar, incubadas: ______________horas a _______________°C
Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de mohos en agar papa - dextrosa
acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 5 días.
Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de levaduras en agar papa-dextrosa
acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 5 días.
Reportar como: Unidades formadoras de colonias, ___________UFC/g o ml de bacterias aerobias en
placa en agar cuenta estándar, incubadas: ______________horas a _______________°C.
5.3 Informe de resultados de la técnica de Extensión en con varilla.
5.4 ¿En qué casos aplicarías la técnica de estría cruzada?
5.5 ¿La técnica de estría cruzada permite contar el número de colonias?
5.6 ¿Cuál es el fundamento de la técnica de vaciado en placa?
5.7 ¿Cuál es el fundamento de la técnica de extensión en placa?
5.8 ¿En qué casos aplicarías utilizar diluciones?
6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS.
Discutir las ventajas y desventajas de cada una de las técnicas de aislamiento y analizar los resultados
obtenidos en cada una de las técnicas.
51
7. CONCLUSIONES
Elabora tus conclusiones tomando en cuenta los resultados obtenidos.
8. BIBLIOGRAFÍA
8.1 NOM-109-SSA1-1994 Procedimientos para la Toma, Manejo y Transporte de Muestras de Alimentos
para su Análisis Microbiológico
8.2 NOM-110-SSA1-1994 Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis
Microbiológico
8.3 NOM-092-SSA-1994, Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa
8.4NOM-111-SSA1–1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de mohos y levaduras en
alimentos
8.5 Koneman, Diagnóstico Microbiológico 3ra. Edición, Edit. Panamericana 2003.
52
PRÁCTICA No. 6
CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS
UNIDAD IV: Nutrición y cultivo microbiano.
1. OBJETIVOS:
1.1 El alumno diferenciará cada uno de los métodos de conservación de cepas de acuerdo a las
características de este.
1.2.1 El alumno conocerá los métodos de conservación de cepas y conservará algunas cepas de interés
eligiendo el método más adecuado.
1.2.2 El alumno realizará pruebas de viabilidad microbiana.
2. INTRODUCCIÓN
En un laboratorio de microbiología existen cepas microbianas las cuales hay que preservar, teniéndose
varios métodos para su conservación, aunque necesario tomar en cuenta las características del
microorganismo, los materiales y los recursos con que se cuenta para elegir el mejor método, pues
sucede que nuestra cepa de interés puede en un momento dado sufrir daños como la deshidratación,
cambios genéticos o perdida de la viabilidad.
Las tres condiciones que hay que alcanzar para conservar correctamente las cepas microbianas en un
laboratorio son:
 Que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el
proceso de conservación;
 Que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos del 70-80% de las células, y
 Que estas células permanezcan genéticamente estables.
Las dos primeras condiciones no son muy difíciles de conseguir cuando se conoce bien la técnica
microbiológica, pero el tercero puede presentar dificultades, y este es el motivo por el cual existen varios
métodos de conservación. Los métodos de conservación de cepas se van a agrupar en tres apartados,
que son: Métodos de elección o de conservación a largo plazo, métodos alternativos y métodos
restringidos.
A.- Métodos de elección o de conservación a largo plazo.
Son los mejores porque en ellos se detiene el crecimiento de las células microbianas, pero éstas no han
muerto. Así se garantiza al máximo la estabilidad genética, por evitarse la aparición de generaciones
sucesivas. Aún así no se puede descartar algún cambio originado por el método. Los métodos de
conservación pertenecientes a este grupo son dos: Congelación y liofilización.
Conservación por congelación.
Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y se guardan a
temperaturas inferiores a 0°C, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer las células
de agua en forma líquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las células así
conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor método de conservación desde
todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales. Los cuatro
53
factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las células conservadas por este método es la
edad de las células, velocidad en la congelación y descongelación, temperatura de almacenamiento: y
empleo de agentes crioprotectores.
Conservación por liofilización.
Tampoco se da crecimiento en las células conservadas por este método, puesto que se les ha quitado
el agua mediante la liofilización, que es un proceso suave. Con ello la estabilidad genética es alta, pero
a veces no tanto como en la congelación, porque la liofilización se consigue por sublimación del hielo de
las células. Por lo tanto, primero tenemos que congelar el agua libre de las células y después eliminarla
mediante el vacío, sin que haya necesidad de subir la temperatura, lo que acabaría afectando a la
viabilidad del microorganismo. Para este proceso se emplean los aparatos denominados liofilizadores.
Las células microbianas así conservadas se someten a un tratamiento más complejo que en el caso de
la congelación, pues la liofilización se hace en dos etapas y se añade la sublimación del agua a la
congelación previa. Sin embargo, este es un método muy recomendable por su comodidad para el
almacenamiento y para el envío de las cepas, pues una vez conseguidos los liófilos pueden
almacenarse a temperatura ambiente (18ºC-20ºC), con lo cual su envío es fácil.
Los factores que debemos tener en cuenta para hacer una buena liofilización son los mismos que
influyen en la congelación, a los que hay que añadir otros que surgen como consecuencia de la
deshidratación. La congelación puede hacerse rápida o lentamente, la primera sumergiendo los tubos
en nitrógeno líquido. Respecto a los crioprotectores, se pueden utilizar varios dependiendo del tipo de
microorganismo, pero para liofilizar no se debe utilizar glicerol, debido a su elevado punto de
evaporación y a su higroscopicidad, que provoca que los liófilos queden muy viscosos. Tampoco es
conveniente utilizar el dimetilsulfóxido, porque es algo tóxico, y al concentrarse por la evaporación del
agua puede dañar a las células microbianas. Por lo tanto, para la liofilización se recomiendan como
crioprotectores el inositol para la mayoría de las bacterias y la leche descremada para mohos y
actinomicetos, pero para algunos microorganismos pueden ser más convenientes otros crioprotectores,
como por ejemplo el glutámico-glutamato para las bacterias lácticas y mezclas de glucosa con caldo
hígado (sin carne) para bacterias anaerobias.
Los nuevos factores que influyen específicamente en la eficacia de la liofilización como medio de
conservación son: el tipo de microorganismos, la concentración celular, el grado de deshidratación
alcanzado, la atmósfera de oxígeno en el tubo y las condiciones de almacenamiento.
B.- Métodos alternativos.
Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los métodos de elección, bien por carecer de los
equipos necesarios, o bien porque la cepa microbiana no resiste los tratamientos de la conservación por
estos métodos. Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar un único método alternativo, sino
que se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos métodos.
a).- Conservación por transferencia periódica.
La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que ha crecido. Sin
embargo, estas células no pueden permanecer indefinidamente en el mismo tubo, porque al seguir
activas excretan productos tóxicos del metabolismo que se acumulan, provocando el envejecimiento y
muerte celular, por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo fresco. Este es el
peor método para conseguir la estabilidad genética, puesto que al estar las células creciendo hay una
alternancia de generaciones, y al cabo del tiempo las células que se están guardando serán
54
descendientes lejanas de las células iniciales y es posible que ya no conserven algunas de sus
características. A veces se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite mineral estéril. Con
esto se consigue también evitar en la medida de lo posible la desecación del medio de cultivo, que
podría ser tóxico para las células al aumentar su concentración. Hay que tener en cuenta que los
microorganismos muy aerobios, como por ejemplo los mohos filamentosos, no se pueden guardar en
tubos completamente cerrados. Por último, otro inconveniente que tiene la transferencia periódica es
que la contaminación de los cultivos resulta más fácil al tener que manejar los tubos a lo largo del
tiempo y también por la posibilidad de entrada de ácaros en los mismos.
b).- Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril.
Es un método alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos de
microorganismos, tanto mohos filamentosos como levaduras y algunas bacterias. Consiste en
suspender en agua estéril células del cultivo que se quiere conservar. Se pueden preparar en criotubos,
en este caso la concentración celular no debe ser superior a 10 4-105 células /ml en el caso de bacterias
y levaduras. Para los mohos filamentosos que no esporulan, se pueden poner en suspensión trocitos de
agar con el crecimiento del hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensión se hace en
agua de mar diluida.
C.- Métodos restringidos.
En este grupo se engloban métodos no empleados habitualmente, pero a los que es necesario recurrir a
la hora de conservar grupos de microorganismos muy determinados que no resisten bien la liofilización
o la congelación, como por ejemplo los géneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc.
a).- Desecación en papel de filtro.
Se utiliza un papel bastante absorbente que se impregna con una solución muy densa de células y se
deja secar al aire (en condiciones estériles). También es posible desecarlos por el procedimiento que se
llama desecación líquida porque se utiliza para ello el liofilizador, pero sin que haya habido congelación
previa de las células. El vacío producido por el liofilizador deseca las células, pero hay que evitar que un
vacío excesivo provoque evaporación brusca con ebullición o que la temperatura disminuya demasiado,
ocasionando la congelación incontrolada de las células.
b).- Desecación en suelo, arena, silicagel, etc.
Se añaden las células a estos sustratos que las protegerán al desecar. Los microorganismos
productores de esporas se pueden conservar durante bastante tiempo por este método, este método es
barato y de fácil conservación.
c).- Desecación en bolitas de alginato.
Éste es un procedimiento eficaz, las células se encuentran en una matriz de alginato y la eliminación del
agua se hace por tratamiento con soluciones hipertónicas sucesivas y posterior desecación al aire hasta
que se pierde un 70% de su contenido en agua. Estas bolitas de alginato se pueden conservar en tubos
cerrados herméticamente y a temperaturas de entre 4ºC y 18ºC, pudiéndose guardar incluso a –80ºC
debido al bajo contenido en agua de las células y la protección que suministra el soporte de alginato.
Este es un método que se está utilizando para la conservación de algas y células vegetales.
Para demostrar la eficiencia de un método de conservación en cepas se tiene que determinar el
porcentaje de viabilidad en diferentes periodos, determinar la estabilidad morfológica y fisiológica,
bioquímica, la virulencia y la antigenicidad, para garantizar que l cepa es efectiva.
55

3.1. EQUIPO
Incubadora a 35 ° C Autoclave
Congelador Horno
Refrigerador Balanza digital
3.2. MATERIAL
Cajas de Petri Gasa y algodón para un tapón

Portaobjetos Un tubo eppendorff de dos ml
Pipetas de un ml Una espátula de acero inoxidable
3.3. MEDIOS DE CULTIVO:
Dos tubos de 13 X 100 con TSA inclinado Un matraz con 30 ml de caldo BHI
con tapón de baquelita
Un tubo de 16X150 mm con PDA inclinado
Un tubos con 4 g de arena estéril en tubos con tapón de baquelita (Cosecha
de esporas)
Un matraz con 80 ml de ACS
Dos tubos de 13 X 100 con PDA inclinado
Un tubo de 13 X 100 con TSA o agar base con tapón de baquelita
sangre con tapón de algodón
Un tubo de 13 X 100 con PDA con tapón de
Cinco tubos con 9 ml de solución salina
algodón.
Un matraz con 30 ml de BHI
Un tubo de 13 X 100 mm estéril con tapón de
Un matraz con 80 ml de PDA baquelita
3.4. REACTIVOS:
Glicerol al 60 % estéril Aceite mineral

Acido tartárico Colorantes para tinción de Gram
Colorantes para tinción de esporas Azul de algodón lactofenol
3.5. CEPAS MICROBIANAS Y MEDIOS SELECTIVOS PARA SU IDENTIFICACIÓN COLONIAL

Escherichia coli Agar eosina azul de Rhizopus sp Agar de papa y
metileno dextrosa
Bacillus subtilis Agar nutritivo Aspergillus niger Agar de papa y
dextrosa
Micrococcus luteus Agar nutritivo Penicillium sp Agar de papa y
dextrosa
Staphylococcus aureus Agar de sal y manitol Pseudomonas. aeruginosa Agar cetrimida
Saccharomyces cerevisiae Agar cuenta estándar Lactobacillus delbrueckii Medio MRS
56
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL:
Para la conservación de cepas la distribución será la siguiente:
Equipo Cepa a conservar Equipo Cepa a conservar
1,6 Escherichia coli 4,9 Saccharomyces cerevisiae
2,7 Bacillus subtilis 5,10 Aspergillus niger
3,8 Micrococcus luteus 11 y 12 Lactobacillus delbrueckii
PARA BACTERIASY LEVADURAS:

DÍA 1
1) Realizar una tinción de Gram para verificar la pureza de la cepa, en caso de ser un microorganismo
esporulado, realizar la tinción de esporas.
2) Sembrar un matraz con 30 ml de caldo infusión cerebro y corazón (BHI) estéril con dos asadas del
microorganismo que te ha tocado según el número del equipo, incubarlo a 35 °C durante toda la noche
en agitación a 150 rpm.
DÍA 2
3) A partir del matraz sembrar por estría simple 3 tubos con agar de soya y tripticaseína, e incubarlo a
35 °C y por 24 horas. Recuerda que se te debe proporcionar 2 tubos con tapón de baquelita y uno con
tapón de algodón.
4) Etiquetar cada uno de los tubos, anotando el nombre de la cepa, fecha de siembra, fecha de
conservación y fecha en que se determinará la viabilidad.
DÍA 3 Después de la incubación realizar lo siguiente
Tubo No. 1 que tiene el tapón de algodón Se conservará a temperatura ambiente
Tubo No. 2 que tiene el tapón de baquelita Se conservará a temperatura en refrigeración a 4°C
Tubo No. 3 que tiene el tapón de baquelita Se le adicionará aceite mineral y se conservará a
temperatura de refrigeración de 4 °C
Matraz con 30 ml de BHI y la cepa que te La suspensión es para obtener el número de células / ml
ha tocado
Del matraz realizar lo siguiente:

4) Tomar un ml con pipeta estéril del cultivo del matraz y colocarlo en un tubo eppendorff previamente
etiquetado, adicionarle un ml de glicerol al 60 % estéril, mezclar y conservarlo en el congelador.
57
Conservación en congelación
5) Con la misma pipeta anterior tomar un ml del cultivo del matraz y colocarlo en el tubo que contiene
arena estéril previamente etiquetado, homogenizarlo y conservarlo a temperatura ambiente
6) Determinación del número de UFC/ ml (No): Con la misma pipeta tomar un ml de la suspensión
microbiana y realizar diluciones, hasta 10-5 y por la técnica de vaciado en placa sembrar las dos últimas
diluciones. Incubar a 35 °C durante 24 h y contar para obtener las UFC/ ml, de esa manera sabemos
cuántos hemos conservado en el glicerol y arena.
En la bitácora llevar el registro de la conservación, con un cuadro como el que se muestra a
continuación.
Nombre Fecha de Fecha de Fecha de Determinación Determinación % de

de la siembra del siembra de conservación de viabilidad de viabilidad Viabilidad
cepa matraz los tubos (1era. vez) (2da.da vez)
Conservar los tubos por dos meses, y una vez transcurrido este tiempo realizar lo siguiente:
Al tubo 1, 2 y 3 Sembrar el cultivo por estría cruzada o simple y verifica si hay crecimiento del
microorganismo, recordar utilizar el medio adecuado según el tipo de microorganismos que se ha
conservado y consulta a los demás equipos para llenar el siguiente cuadro.
Cepa a conservar Medio de Conservación a Conservac Conservación con

cultivo temperatura ión a 4 °C aceite mineral y a 4
ambiente °C
Escherichia coli EMB
Bacillus subtilis AN
Micrococcus luteus AN
S. aureus ASM
S. cerevisiae ACS
P. aeruginosa
Agar
cetrimida
L. delbrueckii Medio MRS
Al tubo (eppendorff)
1.- Etiquetar 5 tubos con 9 ml de solución salina
2.- Tomar un ml del tubo eppendorff y realizar las cinco diluciones
3.- Sembrar la dilución 10 -4 y 10 -5 por duplicado por la técnica de vaciado en placa
4.- Utilizar ACS para la siembra e incubar las placas e incubar las placas
5.- Realizar el recuento (Nf) para calcular el % de viabilidad
58
Al tubo con arena

2.- Tomar un g de arena y realizar las cinco diluciones
-4
3.- Sembrar la dilución 10 y 10 -5 por duplicado por la técnica de vaciado en placa
4.- Utilizar ACS para la siembra e incubar las placas
PARA MOHOS: DÍA 1
1.- Realizar una preparación en fresco del moho (Lo correcto para verificar la pureza es un
microcultivo, pero en este momento aún no conoces la técnica).
2.- Sembrar un tubo de 13 X 100 mm con PDA inclinado con tapan de algodón
3.- Sembrar dos tubos de 13 X 100 mm con PDA y tapón de baquelita
4.- Sembrar un tubo de 16 X 150 mm con PDA y tapón de baquelita
5.- Incubar los tubos por 5 días a 28 °C
DÍA 6 Después de la incubación realizar lo siguiente
Tubo No. 1 que tiene el tapón de Se conservará a temperatura ambiente
algodón
Tubo No. 2 que tiene el tapón de Se conservará a temperatura en refrigeración a 4°C
baquelita
Tubo No. 3 que tiene el tapón de Se le adicionará aceite mineral y se conservará a temperatura de
baquelita refrigeración de 4 °C
Tubo de 16 X 150 mm con tapón Realizar una suspensión, para ello colocarle aproximadamente 3 ml
de baquelita de solución salina y con la ayuda del asa resuspender para tener la
cosecha de esporas y poder obtener el No de células / ml
Del tubo de 16 X 150 mm que tiene la suspensión de esporas realizar lo siguiente:
1.- Depositar la suspensión en un tubo estéril, para facilitar el trabajo
2.- Tomar un ml con pipeta estéril del cultivo del matraz y colocarlo en un tubo eppendorff previamente
etiquetado, adicionarle un ml de glicerol al 60 % estéril, mezclar y conservarlo en el congelador.
3.- Con la misma pipeta anterior tomar un ml del cultivo del matraz y colocarlo en el tubo que contiene
arena estéril previamente etiquetado, homogenizarlo y conservarlo a temperatura ambiente
4.- Determinación del número de UFC/ ml (No): Con la misma pipeta tomar un ml de la suspensión
microbiana y realizar diluciones, hasta 10-5 y por la técnica de vaciado en placa sembrar las dos últimas
diluciones. Incubar a 28 °C durante 5 días y contar para obtener las UFC/ ml, de esa manera sabemos
cuántos hemos conservado en el glicerol y arena.
En la bitácora llevar el registro de la conservación, con un cuadro como el que se muestra a
continuación.
Nombre de Fecha de Fecha de Fecha de Determinación de Determinación de % de
la cepa siembra del siembra de los conservación viabilidad (1era. viabilidad (2da.da Viabilidad
matraz tubos vez) vez)
59
Conservar los tubos por dos meses, y una vez transcurrido este tiempo realizar lo siguiente:
Al tubo 1, 2 y 3 Sembrar el cultivo por punto y verificar si hay crecimiento del microorganismo, utilizar el
agar de papa y dextrosa y consulta a los demás equipos para llenar el siguiente cuadro.
Cepa a conservar Medio de Conservación a Conservació Conservación con aceite
cultivo temperatura ambiente n a 4 °C mineral y a 4 °C
Rhizopus sp
PDA
Aspergillus niger PDA
Penicillium sp PDA
Al tubo (eppendorff)
2.- Tomar un ml del tubo eppendorff y realizar las cinco diluciones
-4
4.- Utilizar PDA acidificado para la siembra e incubar las placas a28 °C
Al tubo con arena
2.- Tomar un gramo de arena y realizar las cinco diluciones
-4
4.- Utilizar PDA acidificado para la siembra e incubar las placas a28 °C
Llenar la siguiente tabla: Antes de la conservación
Método /cepa Temperatura Refrigeración Refrigeración + Aceite Congelación Arena
ambiente Crecimiento + Crecimiento + UFC/ml UFC/g
E. coli
B. subtilis
M. luteus
S. aureus
S. cerevisiae
P. aeruginosa
L. delbrueckii
Rhizopus sp
A. niger
Penicillium sp
+ Solo indicar si hay abundante o no.
60
Después de la conservación
Método /cepa Temperatura Refrigeración Refrigeración + Congelación Arena
ambiente Crecimiento Aceite UFC/ml UFC/g
Crecimiento
Escherichia coli
B. subtilis
M. luteus
S. aureus
S. cerevisiae
P. aeruginosa
L. delbrueckii
Rhizopus sp
Aspergillus niger
Penicillium sp
Determinar el % de reducción bacteriana del microorganismo (RBM)
5.1 Según el microorganismos que conservaste ¿Cuál es el mejor método para consérvalo?
5.1 Investiga otros métodos de conservación como la liofilización.
5.2 ¿Cual el papel del crioprotector?
5.3 Menciona el periodo máximo de conservación de cada uno de los métodos utilizados en la práctica
5.4 investiga la morfología colonial en la bibliografía del microorganismo que conservaste y el medio que
utilizaste
Discutir las ventajas y desventajas de cada uno de los métodos de conservación
7. CONCLUSIONES
Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, a la
bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica.
8.1 Brock, T.D.; Smith y M.T. Madigan. Biología de los Microorganismos. 10ª. Edición. Prentice-Hall.
España.
8.2 Prescott, H, Microbiología, Ed. McGraw-Hill, Interamericana, New York, 2004, 1005 p.
Edición. Interamericana. México. 140 p.
61
8.4 NOM-181-SSA1-1998, salud ambiental. Agua para uso y consumo humano. Requisitos sanitarios
que deben cumplir las sustancias germicidas para tratamiento de agua, de tipo doméstico
62
63
PRÁCTICA No 7
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS (bacterias)
No. DE UNIDAD: V: Metabolismo
UNIDAD IV: Identificación Microbiana
1. OBJETIVOS:
Objetivo general
El alumno identificará bacterias de interés farmacéutico, a través de su metabolismo microbiano.
1.2.1 El alumno realizará pruebas para determinar la actividad enzimática sobre los carbohidratos y
sales orgánicas como principales fuentes de carbono.
1.2.2 El alumno realizará pruebas de hidrólisis para aminoácidos y proteínas para demostrar su
actividad enzimática.
1.2.3 El alumno realizará pruebas para demostrar la actividad enzimática en los procesos de óxido-
reducción.
2. INTRODUCCIÓN
El metabolismo es un proceso químico, mediante el cual los seres vivos transforman una serie de
compuestos químicos con el fin de obtener energía. Los microorganismos son capaces de efectuar
reacciones bioquímicas para degradar nutrientes cuyos productos finales permiten su identificación, a
este grupo de reacciones se les denomina pruebas bioquímicas, las cuales se han clasificado según
su origen:
a) Reacciones de carbohidratos (almidón, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, etcétera).
b) Reacciones para sales orgánicas (citrato, malonato, urea).
c) Reacciones para proteínas y aminoácidos (gelatina, caseína, triptófano, lisina, arginina y ornitina).
d) Por el tipo de respiración que efectúan (aerobios estrictos, microaerofílicos, anaerobios facultativos y
anaerobios estrictos).
La identificación bacteriana preliminar pueden efectuarse observando las características de las colonias
y la morfología microscópica, pero la caracterización final de un aislamiento bacteriano desconocido en
género y especie se logra mediante la detección de ciertos sistemas enzimáticos exclusivos de cada
especie.
En el laboratorio estos sistemas se detectan inoculando una pequeña porción de la colonia aislada a
una serie de medios de cultivo que contienen substratos específicos, e indicadores químicos que
detectan los cambios de pH o la presencia de un subproducto.
Para poder realizar una identificación bacteriana es necesario primero sembrar por estría a los
microorganismos, ya que generalmente se parte de un cultivo mixto, de esta manera se logra aislar y
observar su morfología colonial. Una vez que se tiene el cultivo puro, se transfiere a un medio de cultivo
en la cual se desarrolle, para poder lograr estos pasos es necesario saber la temperatura óptima de
crecimiento. Cuando se tiene el cultivo puro, se procede a realizar la tinción de Gram para clasificarlo y
saber a qué grupo pertenece G+ ó G-. Además en la morfología microscópica permite conocer la forma
y agrupación del microorganismo (bacilo, coco, coma, etc.)
64
Recientes avances biotecnológicos son usados para el análisis microbiológicos. Las pruebas de
identificación bioquímica esta miniaturizada y automatizada haciéndose el análisis más rápido y
económico. Los microorganismos patógenos deben ser aislados e identificados debido a que producen
enfermedades a cientos de personas causando daños económicos. Una vez aislados podemos medir
específicamente los cambios fisicoquímicos resultado del crecimiento o actividad metabólica aunque la
formulación de un producto con proteínas, aceites, ácidos grasos, conservadores hace que en un
momento dado favorezcan o inhiban el crecimiento microbiano.
Algunos métodos utilizados para identificar grupos microbianos o microorgansimos (género y especie)
son:
Placa Petrifilm, Detección de Salmonella por el sistema VIDAS, Sistema API, Coli-complete, Sistema
VITEK, Identificación por PCR, etc
En nuestro caso identificaremos a los microorganismos por medio de pruebas bioquímicas de manera
tradicional, ya que existen métodos “rápidos” que facilitan el trabajo, pero es necesario saber el
fundamento.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
 Fermentación de carbohidratos (glc lac,  Hidrólisis de la gelatina (licuefacción de

sac, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, la gelatina), en el medio gelatina
sorbitol, raf, ram, xilosa) en el medio base
 Crecimiento en caldo nutritivo
CRF.
 Utilización de la esculina, medio de bilis
 Fermentación de la glucosa, producción
y esculina
de ácido sulfhídrico, producción de gas,
en el medio TSI  Utilización del gluconato (oxidación),
medio caldo gluconato peptona
 Descarboxilación de la lisina, en el
medio LIA  Requerimientos de oxígeno, condiciones
aerobias y anaerobias
 Movilidad, descarboxilación de la ornitina
y la producción de indo, en el medio MIO  Producción de Catalasa y oxidasa
 Movilidad, producción H2S, producción de  Reducción de nitratos, en caldo nitrato.
indol, en el medio SIM  Detección del metabolismo oxidativo
 Prueba cuantitativa para la producción /Fermentativo, en el medio OF con
de ácidos. Prueba de Rojo de metilo, sacarosa
medio RM/VP  Utilización del citrato, en citrato de Sodio
 Producción de ureasa, en caldo urea  Utilización de Malonato, en malonato
 Producción de acetil metil carbinol.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM POSITIVAS
 Fermentación de carbohidratos (glc, lac, sac,  Crecimiento en bilis al 40 %

manitol, dulcitol, salicina, adonitol, sorbitol,
 Coagulasa
raf, ram, xilosa, etc.)
 Hidrólisis de gelatina (licuefacción de la
 Fermentación de la glucosa, producción de
gelatina), en el medio gelatina
ácido sulfhídrico, producción de gas, medio
65
de TSI  Hidrólisis de la esculina, en caldo esculina

 Descarboxilación de la lisina, medio de LIA  Producción de acetil metil carbinol, prueba
Voges – Proskauer, medio VP/RM
 Movilidad, descarboxilación de la ornitina y
la producción de indol, medio de MIO  Producción de la fosfatasa, medio PDP
 Movilidad, producción de indol y producción  Prueba de la DNAsa, en el medio agar ADN

de ácido sulfhídrico, medio SIM  Crecimiento a 10 y 45 ª C
 Producción Catalasa y oxidasa  Reducción con azul de metileno en leche
 Reducción de nitratos  Hidrólisis en caldo hipurato de sodio
 Producción de hemólisis, en agar sangre  Formación de cápsula
 Crecimiento en NaCl al 5, 10 y 15 %  Hidrólisis de almidón,
 Sensibilidad a optoquina y bacitracina
Debemos mencionar que para la identificación de un microorganismo es necesario consultar la literatura

para hacer una selección de pruebas recomendable y logras su identificación lo más rápido posible y sin
pérdida de tiempo y de pruebas, las pruebas antes mencionadas son algunas de las cuales podemos
realizar en un momento dado y a continuación se describirán algunas de ellas.
FUNDAMENTO DE ALGUNAS PRUEBAS BIOQUIMICAS
1 PRUEBA DE HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN
Determinar la capacidad de un microorganismo para secretar la enzima amilasa para la degradación de
almidón en moléculas más pequeñas para ser utilizadas en su metabolismo.
2 PRUEBAS DE FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN TUBOS CON CALDO ROJO DE FENOL
Determinar la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato incorporado a un medio,

produciendo ácido y/o gas en una campana de Durham; el medio es líquido y como indicador contiene
rojo de fenol.
3 PRUEBAS EN AGAR TRIPLE AZÚCAR Y HIERRO (MedioTSI)
Detección de fermentadores de glucosa y lactosa en agar de hierro de Kligler (KIA) o agar triple azúcar
hierro (TSI). Este medio sirve para determinar la fermentación de glucosa, sacarosa y lactosa además
de la producción de gas a partir de glucosa y la producción de ácido sulfhídrico que precipita como
sulfuro férrico al reaccionar con el hierro, la liberación del ácido sulfhídrico se libera por acción
enzimática, de los aminoácidos que contienen azufre produciendo una reacción visible de color negro.
La fórmula del TSI y del KIA son idénticas, salvo que el TSI contiene 10 g/l de sacarosa además de
glucosa y lactosa (triple azúcar), el agar está preparado en pico de flauta, de tal manera que se tienen 2
cámaras de reacción dentro del mismo tubo. La porción inclinada, “pico de flauta” expuesta en toda su
superficie al oxígeno, es aeróbica y la parte inferior llamado “fondo” está protegida del aire y es
relativamente anaerobia. Al preparar el medio es importante que el medio solidifique en forma de pico
de flauta y el fondo, además que estos tengan la misma longitud de aproximadamente 3 cm cada uno, a
fin de conservar este efecto de las dos cámaras. La técnica de inoculación es por picadura y por estría
en el pico de flauta, para esto hay que utilizar el asa recta, primero se introduce en la parte profunda y
66
luego se estría el pico de flauta con un movimiento hacia uno y otro lado, el indicador de pH: rojo de
fenol y un pH ácido da una coloración amarilla y en un pH alcalino es rojo.
4. PRUEBA DE ROJO DE METILO
El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6-8 amarillo) y 4,4 (rojo), esta prueba es
cuantitativa para la producción de ácido y requiere de organismos positivos que produzcan ácidos
láctico, acético, o fórmico a partir de la glucosa, por la vía de la fermentación mixta. Dado que existen
muchos microorganismos que producen ácidos, sólo se consideran rojo de metilo positivo aquellos
organismos que puedan mantener este pH bajo un largo tiempo de incubación (48-72 h),
contrarrestando el sistema estabilizador de pH del medio.
Controles
Prueba Control negativo Control positivo

Rojo de metilo Escherichia coli Enterobacter aerogenes
5. PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER
La reacción de Voges – Proskauer se basa en la conversión del acetilmetilcarbinol (acetoína) en
diacetilo por acción del KOH al 40 % y el O 2 atmosférico, la acetoína se convierte en diacetilo el -naftol
actúa como catalizador para revelar un complejo de color rojo, el indicador de pH es el Rojo de metilo.
Controles

Voges - Proskauer Escherichia coli Klebsiella sp
UTILIZACIÓN DE SALES ORGÁNICAS
6. PRUEBA DE CITRATO
Algunos microorganismos pueden suministrar energía en ausencia de la fermentación o producción de
ácido láctico empleando como única fuente de carbono al citrato. El metabolismo del citrato comprende
una condensación de acetilo con la coenzima A y oxaloacetato para entrar en el ciclo de Krebs. Los
productos obtenidos del metabolismo del citrato dependen del pH del medio si es alcalino se produce
más acetato y formato con una disminución del lactato y CO 2. Por encima del pH de 7 no hay
producción de lactato y los productos son CO 2 ácido fórmico y ácido acético.
Con un pH ácido el acetil metilcarbinol y el lactato son los principales productos de la utilización del
citrato. El medio utilizado para la fermentación del citrato contiene también sales de amonio inorgánicas,
un organismo que es capaz de utilizar citrato como su única fuente de carbono utiliza también las sales
de amonio como su única fuente de nitrógeno. Cualquier medio empleado para detectar la utilización de
citrato por parte de las bacterias en estudio debe estar desprovisto de proteínas e hidratos de carbono
como fuente de carbono.
Controles

Citrato de sodio Escherichia coli. Enterobacter aerogenes
67
7. PRUEBA DE MALONATO
Determinar la capacidad de un organismo de utilizar malonato de sodio como única fuente de carbono,
con la consiguiente alcalinidad.
El malonato es un inhibidor enzimático ya que interfiere en la oxidación del ácido succínico en ácido
fumárico, inhibiendo la acción catalítica de la enzima succinato deshidrogenasa, mediante un proceso
de inhibición competitiva. El ácido malonico (malonato) se une a la enzima bloqueando los sitios activos
de manera que la enzima no puede combinarse con su sustrato normal, el ácido succínico. Esto
ocasiona un bloqueo en la oxidación del ácido succínico.
Según la concentración del malonato, el inhibidor puede retardar simplemente la velocidad de la
oxidación del ácido succínico o provocar su completa inhibición. En el ciclo de Krebs, cada compuesto
ácido es influido independientemente por enzimas específicas; se consume una molécula y se forma
otra en un proceso por etapas. Si se ha suprimido la formación de un ácido, y no es reemplazado, como
el ácido fumárico, el ciclo se Krebs deja de funcionar, por lo tanto la célula bacteriana, recurre al ciclo
del ácido glioxílico para la producción de intermediarios, para ulterior biosíntesis en el metab olismo.
Indicador de pH: Azul de bromotimol
Controles

Caldo malonato Salmonella Alcaligenes faecalis
8. PRUEBA DE UREASA
La urea es una diamida del ácido carbónico y esta es fácilmente hidrolizada con la liberación de
amoníaco y dióxido de carbono. La enzima ureasa que posee un microorganismo pueden hidrolizar a la
urea que está presente en el medio de cultivo de acuerdo con la siguiente reacción: El amoníaco
reaccionan en solución para formar carbonato de amonio, produciéndose una alcalinización y un
aumento del pH del medio, el indicador de pH es el rojo de fenol.
Controles
Prueba Control positivo débil Control positivo rápido Control negativo

Ureasa Klebsiella sp Proteus sp Escherichia coli
HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS:
9.- PRUEBA DE LICUEFACCIÓN DE LA GELATINA (MÉTODO DEL TUBO)

Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas proteolíticas que, a su vez son
detectadas por la digestión o licuefacción de la gelatina presente. Las proteínas que se producen son
demasiado grandes para entrar en la célula por lo tanto para ser metabolizadas deben ser hidrolizadas
a componentes más pequeños, las enzimas extracelulares de tipo proteolítico son secretadas por
ciertas bacterias para desdoblar a las proteínas y esta capacidad ayuda a la identificación bacteriana. El
68
catabolismo de las proteínas por las proteasas se da en dos etapas la primera origina polipéptido y
posteriormente estos se desdoblan en aminoácidos individuales.
Controles

Gelatina Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus
10. PRUEBAS EN MEDIO SIM. (MOVILIDAD, PRODUCCIÓN DE H 2S E INDOL).
El indol producido por las triptofanasas se combina con el aldehido del reactivo de Kovac´s o de Erlich,
para originar un compuesto de color rojo. Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la
turbidez que producen alrededor de la punción de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de
sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del
tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.
11. MEDIO MIO (MOVILIDAD, INDOL Y ORNITINA).
La prueba de la descarboxilación de la ornitina nos sirve para determinar la capacidad enzimática de un
microorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La
descarboxilación es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas
específicas son capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminoácido dando una amina o una
diamina y anhídrido carbónico, la enzima que efectúa esta reacción se llama ornitina descarboxilasa, la
cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio ácido
en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilación provocan un cambio de pH hacia la
alcalinidad. Además la descomposición del aminoácido se produce anaerobicamente y el proceso es
irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima común, el fosfato de piridoxal.
El aminoácido L-ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina – descarboxilasa para dar la diamina
putrescina y anhídrido carbónico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si
recubrimos la superficie del medio con aceite mineral. La prueba de movilidad nos sirve para determinar
si un microorganismo es móvil por la presencia de flagelos o inmóvil. La prueba de indol nos sirve para
determinar si un organismo es capaz de producir indol a partir de de la oxidación del aminoácido
triptófano. Este aminoácido puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos
indólicos principales: indol, escatol e indolacético. El proceso es efectuado por varias enzimas que en
conjunto se denomina “triptofanasa” y el indicador de pH es el púrpura de bromocresol.
Control
Sustancia Control positivo Control negativo

Indol Escherichia coli Klebsiella pneumoniae
Movilidad Enterobacter sp Klebsiella sp
Descarboxilación de la ornitina Enterobacter cloacae Klebsiella sp
12. DESAMINACIÓN Y DESCARBOXILACIÓN DE AMINOÁCIDOS EN MEDIO LIA. (LYSINE IRON AGAR)
En este medio se determina la descarboxilación de la lisina que se lleva a cabo en anaerobiosis y la

desaminación de la lisina que se lleva a cabo en aerobiosis.
69
La prueba de la descarboxilación de la lisina nos sirve para determinar la capacidad enzimática de un

microorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La
descarboxilación es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas
específicas son capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminoácido dando una amina o una
diamina y anhídrido carbónico, la enzima que efectúa esta reacción se llama lisina descarboxilasa, la
cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio ácido
en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilación provocan un cambio de pH hacia la
alcalinidad. Además la descomposición del aminoácido se produce anaeróbicamente y el proceso es
irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima común, el fosfato de piridoxal.
El aminoácido L-lisina es descarboxilado por la enzima lisina – descarboxilasa para dar la diamina
cadaverina y anhídrido carbónico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si
recubrimos la superficie del medio con parafina o vaselina. Al Preparar el medio es importante que se
deje solidificar en pico de flauta y el fondo, que estos tengan la misma longitud de aproximadamente 3
cm. cada uno, a fin de conservar este efecto de las dos cámaras, el inicador de pH es el púrpura de
bromocresol.
Controles:
Aminoácido Control positivo Control negativo

Descarboxilación de la Lisina Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae
Desaminación de la Lisina Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes
DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO
13. REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOS
La capacidad de un organismo para reducir nitratos a nitritos es una característica importante utilizada
para la identificación y diferenciación de muchas especies, todas las enterobacterias, excepto ciertos
biotipos de Enterobacter agglomerans reducen los nitratos.
Los organismos que reducen nitratos tienen la capacidad de obtener oxígeno de los nitratos para formar
nitritos y otros productos de reducción. La presencia de nitritos en el medio se detecta añadiendo -
naftilamina y ácido sulfanílico, con la formación de un color rojo de diazonio, p – sulfobenceno – azo -
- naftilamina. El color en caso de ser positiva aparecerá a los 30 s de añadir los reactivos y dado que los
reactivos solo detectan nitritos, este último proceso llevaría a una lectura falsa negativa, por lo tanto es
necesario añadir una pequeña cantidad de polvo de Zn a los tubos que sean negativos. Los iones Zn
reducen los nitratos a nitritos, y el desarrollo de un color rojo tras agregar el polvo de Zn indica la
presencia de nitratos residuales y confirma la reacción negativa verdadera.
Controles:
Prueba Control positivo Control negativo

Reducción de nitratos Escherichia coli Acinetobacter calcoaceticus
70
14. DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO DE LA GLUCOSA EN MEDIO

DE HUGH Y LEIFSON
Los microorganismos sacarolíticos degradan glucosa por vía fermentativa u oxidativa, los subproductos
de la fermentación son ácidos mixtos relativamente fuertes, que pueden detectar en un medio de
fermentación convencional. En cambio, los ácidos formados por degradación oxidativa la glucosa son
sumamente débiles y para su detección se requiere de un medio de oxido – fermentación más sensible,
como el medio OF.
Este medio difiere de otros medios de fermentación de carbohidratos en lo siguiente:
a.- La concentración de proteína (peptonas) ha disminuido del 1,5 al 0,2 %.
b.- La concentración de hidratos de carbono está aumentada del 0,5 % al 1 %.
c.- La concentración de agar está disminuida de 1,5 a 0,25, con lo cual su consistencia es semisólida.
La menor relación proteína a carbohidrato reduce la formación de aminas alcalinas que pueden
neutralizar las pequeñas cantidades de ácidos débiles derivados del metabolismo oxidativo. La
concentración relativamente mayor de carbohidratos sirve para aumentar potencialmente la producción
de ácido. La consistencia semisólida del agar permite que los ácidos formados en la superficie se
difundan por todo el medio, facilitando la visualización del viraje del indicador de pH. Este medio es
también apto para determinar la movilidad de un microorganismo.
La prueba OF presenta limitaciones, ya que los bacilos fermentadores de desarrollo más lento pueden
no producir cambios de color durante varios días, y las especies que son esencialmente proteolíticas
pueden con el tiempo producir reversiones de las reacciones débiles, confundiendo así la interpretación
final. Para realizar esta prueba se necesitan dos tubos con 5 ml del medio en posición vertical, se
inocula por picadura con la suspensión microbiana a estudiar, el asa debe ser introducida hasta 0,5 cm
desde el fondo del tubo Cubrir un tubo con 1 ml de aceite mineral estéril o parafina fundida, dejando el
otro tubo “abierto al aire”, es decir sin aceite o parafina. Incubar ambos tubos a 35 ° C durante 48 h o
más, el indicador de pH: Púrpura de bromocresol.
Interpretación.
Tipo de metabolismo Tubo abierto Tubo cubierto
Oxidativo Ácido – amarillo Alcalino – verde
Fermentativo Ácido – amarillo Ácido – amarillo
No sacarolítico Alcalino - verde Alcalino – verde
Controles
Prueba Fermentador de la glucosa Oxidador de la glucosa No sacarolítico

OF Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Moraxella sp
15. PRUEBA DEL CIANURO DE POTASIO
Determinar la capacidad e un organismo de vivir y reproducirse en un medio que contenga KCN.
La respiración es el conjunto de reacciones químicas en las que se libera energía. La transformación de
la energía puede ser aerobia o anaerobia. La respiración aeróbica es un proceso biológico de oxidación
– reducción que produce energía y por medio del cual un sustrato orgánico es oxidado, el mismo
71
trasfiere electrones e iones hidrógeno por medio del sistema de transporte de electrones, al aceptor final
de electrones, el oxígeno molecular. El proceso produce agua o peróxido de hidrógeno, según la
especie bacteriana y su sistema enzimático. El cianuro de potasio es un inhibidor de la citocromo
oxidasa a nivel del complejo IV de la cadena respiratoria, compite con el O 2 y actúa como aceptor final
de electrones, bloqueando la respiración.
Controles

KCN Klebsiella Escherichia coli
16. PRUEBA DEL CITOCROMO OXIDASA
Los citocromos son hemoproteínas que contienen fierro y actúan como el último eslabón de la cadena
respiratoria, transfiriendo electrones (hidrógeno) al oxígeno, con formación de agua. El sistema
citocromo oxidasa se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la
prueba de oxidasa es importante para identificar a aquellos organismos que carecen de la enzima o son
anaerobios obligados. La prueba es muy útil para el conocimiento de las colonias sospechosas de ser
enterobacterias (todas negativas) y para la identificación de colonias que se presume sean especies de
Pseudomonas o Neisseria (positivas).
**Esta prueba utiliza el reactivo diclororhidrato de p-fenilendiamina, que actúa como aceptor final de
electrones, sustituyendo al oxígeno, la p-fenilendiamina es incolora en estado reducido, pero en
presencia de citocromo oxidasa y oxígeno atmosférico se oxida formando azul de indofenol.
La prueba se lleva a cabo por 3 métodos que son:
1.- La técnica directa en placas, en la cual se añaden directamente 2 a 3 gotas de reactivo a las
colonias aisladas que se han desarrollado en la placa.
2.- La técnica indirecta en tiras de papel filtro, en la que se añaden unas gotas del reactivo y,
3.- Tiras comerciales impregnados del reactivo y secos.
En la zona de papel donde se halla el reactivo se extiende un asa de la colonia sospechosa. Se
recomienda no emplear alambres de acero inoxidable, dado que los productos de la oxidación de la
superficie formados al esterilizarse a la llama pueden producir reacciones falsas positivas.
Controles:

Citocromo oxidasa Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli
17.- PRODUCCIÓN DE CATALASA
Determinar la presencia de la enzima catalasa, que se encuentra en la mayoría de las bacterias
aerobias y anaerobias facultativas que contiene citocromo. La catalasa es una enzima que se
descompone en peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua, químicamente la catalasa es una
hemoproteína de estructura similar a la de la hemoglobina. El peróxido de hidrógeno se forma como uno
de los productos finales del metabolismo oxidativo aeróbico de los hidratos de carbono. Si se deja
72
acumular el peróxido de hidrógeno es letal para la célula bacteriana. La catalasa transforma al peróxido
de hidrógeno en agua y oxígeno en agua.
Controles

Catalasa Staphylococcus aureus Streptococcus sp
18 PRUEBA DE LA COAGULASA (SOLO PARA COCOS GRAM POSITIVOS)
Probar la capacidad de un microorganismo de coagular el plasma por la acción de la enzima coagulasa.
Un resultado positivo constituye por lo común el criterio de diagnóstico de para la identificación de S.
aureus y con frecuencia se utiliza para indicar la virulencia de la cepa. La estafilocoagulasa, producida
por S. aureus es relativamente estable al calor y resistente hasta 60 °C / 30 min. Esta enzima es una
proteína que es excretada al medio extracelular y se inactiva fácilmente por las enzimas proteolíticas.
19 HEMÓLISIS EN AGAR SANGRE (SOLO PARA COCOS GRAM POSITIVOS)
La infusión de músculo de corazón y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, pues son la
fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y factores de crecimiento que permite el desarrollo de una gran
variedad de microorganismos exigentes. El agregado de sangre al medio de cultivo, en concentración
final de 5-10 %, aporta nutrientes para el crecimiento bacteriano, y permite detectar hemólisis. El medio
está libre de azucares reductores, ya que estos influirían de forma adversa en reacciones hemolíticas.
El tipo de hemólisis en agar sangre sirve para clasificar al género Streptococcus, la β hemólisis está
asociada con una completa lisis de la célula alrededor de la colonia, la hemólisis se asocia con una
hidrólisis parcial y se manifiesta por una coloración verde.
20.- CRECIMIENTO EN NaCl AL 7.5 %
Existen microorganismos que presentan crecimiento a diferentes concentración de sales y se les
denomina halófilos, aunque existen otros que son denominados extremófilos ya que viven en
condiciones extremas y su hábitat natural son los lugares a salinos. En condiciones normales, la sal
hace que la célula se deshidrate debido a la ósmosis, cosa que no ocurre en los halofilicos debido a
diversas adaptaciones fisiológicas que le permiten retener el agua para su metabolismo.

3.1. EQUIPO
Incubadora a 35 ° C Autoclave
Microscopio Horno
3.2. MATERIAL
Portaobjetos Asas bacteriológicas

Pipetas Pasteur Colorantes para tinción de esporas
Gradilla metálica Colorantes para tinción de Gram

3.3. MEDIOS DE CULTIVO:
73
Pruebas de cada uno para Gram positivos Pruebas de cada uno para Gram negativos
Tinción de esporas Hidrólisis de almidón.
Hidrólisis de almidón Crecimiento en MacConkey.
Hemólisis en agar sangre Prueba de TSI.
Resistencia a polimixina de 300 Prueba de LIA
Prueba de TSI Prueba de citrato.
Prueba de SIM Prueba de MIO
Prueba de MIO Prueba de SIM.
Licuefacción de la gelatina a 22 °C Licuefacción de la gelatina
Utilización del citrato Prueba de oxidación-
Prueba de oxidación –fermentación fermentación.
Prueba de Voges Proskauer Prueba de ureasa.
Prueba de ureasa Prueba de reducción de nitratos.
Fermentación de glucosa Fermentación de glucosa.
Fermentación de manitol Fermentación de lactosa.
Fermentación de arabinosa Fermentación de sacarosa
Fermentación de Xilosa Fermentación de manitol.
Fermentación de lactosa Fermentación Xilosa.
Crecimiento en NaCl al 6.5 % Rojo de metilo.
Prueba de reducción de nitratos Prueba de Vogues Proakauer
Prueba de catalasa Crecimiento en caldo KCN.
Prueba de oxidasa Prueba de malonato.
Prueba de coagulasa Prueba de catalasa y catalasa
3.4. REACTIVOS:
Solución de rojo de metilo Aceite mineral
Solución de alfa-naftol Solución de peroxido de hidrogeno al 1 %
Solución de KOH N,N,N,N-tetrametil-p-
Reactivo de Kovac o Erlich fenilendiamina
Solución de ácido sulfanílico Reactivos para tinción de Gram
Solución de alfa naftilamina Reactivos para tinción de esporas
Plasma de conejo Oxidasa
Tween 80 estéril Catalasa
Plasma de conejo Jeringas de 10 ml
3.5. BACTERIAS:
Escherichia coli Micrococcus luteus
Salmonella typhi Staphylococcus aureus
Proteus mirabilis Lactobacillus acidophilus
Pseudomonas aeruginosa Bacillus subtilis
Shigella sp Corynebacterium glutamicum
74
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL:
A. Preparación del inoculo
a) Tomar un inoculo del cultivo para realizar una tinción de Gram y esporas si fuera necesario, anotar la
morfología microscópica y determinar si esta puro, si es así continuar con la identificación, si no lo está
es necesario re-aislar.
b) En un tubo de ensaye que contenga 5 ml de solución salina estéril, colocar una asada del cultivo y
homogenizar perfectamente para obtener una suspensión microbiana.
c) Dependiendo el Gram, solicitar las pruebas bioquímicas indicadas para Gram (+) o Gram (-)
d) Ordenar los tubos por la forma de inoculación y sembrar primero aquellos que no tienen inhibidores
Estría simple ( Citrato, placa con agar almidón, agar sangre)
Picadura y estría (TSI, LIA)
Picadura ( SIM, MIO, gelatina, OF )
Caldos (Fermentación de carbohidratos, RM, VP, NaCl, Urea, CM, reducción de NO 3 ,KCN..)
e) De la suspensión microbiana sembrar los tubos y en el caso de los caldos se puede hacer con el asa
o con una pipeta Pasteur colocar 2 gotas de la suspensión para que se estandarice un poco la cantidad
de inoculo.
f) Colocar una batería de bioquímicas como testigo
g) Incubar los tubos 24 horas y leer
h) La placa con agar almidón y agar sangre dividirla en cuatro partes, cada cuadrante corresponde para
un alumno y el cuarto cuadrante queda como testigo.
75
B LECTURA DE PRUEBAS
LECTURA DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS
PRUEBA RESULTADO
FERMENTACIÓN DE AZÚCARES
Agregar lugol sobre la estría
Hidrólisis de + Positiva: Si se forma un halo claro alrededor de la estría.
almidón
- Negativa: No se forma un halo claro alrededor de la estría.
+Positiva: El medio se torna amarillo con la producción de gas, la
Fermentación de campana está llena de gas
manitol - Negativa: El color del medio es rosa-rojizo.
+ Positiva: el medio se torna amarillo con la producción de gas, la
Fermentación de campana está llena de gas
lactosa - Negativa: El color del medio es rosa-rojizo.
Glucosa positiva: Fondo del tubo amarillo.
Fermentación de Sacarosa y lactosa positiva: Superficie amarilla
TSI Fermentación
de glucosa, lactosa Lactosa positiva: Color amarillo en el pico de flauta, Producción
de H2S positivo: Coloración negra en el medio.
y sacarosa con
producción de H2S Producción de CO2 y H2: Burbujas, ligera muesca sobre el costado
del tubo ó desplazamiento del medio.
Glucosa, sacarosa y lactosa ( - ) el medio se torna rojizo.
Producción de H2S ( - ): sin coloración.
Producción de CO2 y H2 ( - ): no hay burbujas.
Prueba de rojo de Agregar 2 gotas de rojo de metilo
metilo + Positiva: Color rojo en la superficie del medio de cultivo
(Producción de acetil-metil-carbinol).
-Negativa: No hay cambio en el color
agregar 6 gotas de naftol y 2 gotas de KOH
Prueba de Voges- +Positiva: El cultivo cambia a color rojo, en todo el tubo.
Proskauer
- Negativa: El cultivo no cambia de color
76

PRUEBA RESULTADO
UTILIZACIÓN DE SALES INORGÁNICAS

Utilización de citrato + Positivo: Desarrollo abundante, cambio de color verde a azul
de sodio
- Negativa: No hay desarrollo ni cambio de color.
Utilización de Positivo: Desarrollo abundante con o sin alcalinización (color azul).
malonato de sodio
Negativa: No hay desarrollo (medio de
Hidrólisis de urea + Positiva: Color rosa fucsia en el medio.
Producción de
- Negativa: Sin cambio de color en el medio
ureasa
HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS
Licuefacción de la Para leer la prueba los tubos se colocan en el cuarto frío durante cinco
gelatina minutos.
+ Positivo: licuefacción de la gelatina.
- Negativo: Si no hay licuefacción de la gelatina volver a incubar,
descartar la prueba negativa hasta los 14 días.
MIO (movilidad, indol Movilidad: Crecimiento alrededor de la picadura.
y ornitina)
Descarboxilación de la ornitina:
+ Positiva: Color púrpura del medio.
- Negativa: Color amarillo del medio.
Después de leer las dos pruebas se agregan 3 gotas de reactivo de
kovacs y se observa:
- Indol + Positivo: Se forma un anillo de color rosa o rojo.
- Negativo: No se forma el anillo.
SIM (producción de Producción de H2S: Presencia de un precipitado color negro
H2S, indol y alrededor de la picadura o en todo el tubo
movilidad)
Producción de Indol: Presencia de un anillo de color rojo en la
superficie al adicionarle el reactivo de Kovac’s.
Movilidad: Turbidez alrededor de la picadura.
Nota: Cuando el microorganismo es móvil y productor de ácido
sulfhídrico el medio se torna completamente negro.
LIA (Desaminación y Desaminación de aminoácidos:
descarboxilación de
+ Positiva: La superficie del tubo es de color rojo vino.
aminoácidos)
- Negativa: La superficie no tiene cambios.
Descarboxilación de aminoácidos
+ Positiva: El fondo del tubo es de color púrpura.
- Negativa: El fondo del tubo es de color amarillo.
77

PRUEBA RESULTADO
METABOLISMO OXIDATIVO – FERMENTATIVO

Reducción de Agregar 3 gotas de naftilamina y 3 gotas de ácido sulfanílico.
nitratos a nitritos
+ Positiva: Aparición de un color rojo en 30 segundos
- Negativa: Sin cambio de color.
Prueba del cianuro + Positivo: Presencia de crecimiento (turbidez)
de potasio
- Negativo: Ausencia de crecimiento (medio claro)
Prueba de citocromo Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un pedazo de papel
oxidasa filtro impregnada con el reactivo (N.N.N.N-tetrametil-p-fenilendiamina).
+ Positiva: aparición de un color azul violeta.
- Negativa: No hay cambio de color.
Determinación de TUBO SIN SELLO DE ACEITE
metabolismo
Oxidativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios
oxidativo y/o
fermentativo de la Fermentativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin
glucosa (OF) cambios
Sacarolitico: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin
cambios.
TUBO CON SELLO DE ACEITE
Oxidativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios
Fermentativo: + positivo acido–amarillo, - negativo verde, sin
cambios
Sacarolitico: + positivo acido–amarillo, - negativo verde, sin
cambios.
Prueba de la Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un portaobjetos que
catalasa contiene 2 gotas de peróxido de hidrogeno y observar.
+ Positiva: Presencia de burbujas de oxígeno.
- Negativa: Ausencia de burbujas de oxígeno.
78

PRUEBA RESULTADO
Prueba de la a) -Sembrar una colonia del Staphylococcus sp en un tubo

coagulasa (Solo con 0.5 ml de caldo infusión cerebro-corazón. Incubar a 35ºC
para cocos Gram durante 24 h.
positivos)
b) Inocular en la misma forma cepas conocidas de S. aureus
y S. epidermidis como testigos positivo y negativo.
c) -En un tubo de ensaye colocar 0,2 ml del cultivo anterior,
0.2 ml de plasma de conejo diluido volumen a volumen con
solución salina estéril.
d) -Incubar en baño de agua de 35 a 37ºC y observar
durante 6 h a intervalos de 1 h; si no hay formación de
coágulo, observar a las 24 h. Considerar positiva la prueba si
hay formación de coágulo.
e) Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo
se añade una gota de cloruro de calcio al 5% a 0,5 ml de
plasma reconstituido empleado, formándose un coágulo en 10-
15 s.
f) En caso de utilizar plasma de humano citratado o
heparina.
Positiva: Coagulación del plasma.
Negativa: El plasma esta líquido.
Hemólisis en a) -En una placa con agar sangre estriar con la cepa
agar sangre (solo presuntiva de Streptococcus sp, al final de la estría enterrar el
para cocos Gram asa en el medio, para crear un ambiente de microaerofilia.
positivos)
b) Incubar durante 24 horas a 35 °C y determinar el tipo de
hemólisis que presenta.
Positiva: Hemólisis β transparente alrededor de la colonia.
Positiva: Hemólisis color verde tenue alrededor de la colonia.
Negativa: Sin cambio de color en el medio.
Crecimiento en Incubar el tubo a 35 °C durante 24 h, después de este tiempo
NaCl AL 7.5 % registrar la turbidez.
Positiva: Turbidez del medio.
Negativa: Sin cambio de color en el medio.
79
Llenar los siguientes cuadros y con la ayuda de la bibliografía y a la información obtenida durante el
desarrollo de la práctica menciona el género y si es posible la especie del microorganismo.
Nombre del microorganismo: ______________________________________________________
5.1. Explicar el significado de la presencia o ausencia de un halo claro, al agregar el lugol, en las
pruebas de hidrólisis del almidón.
5.2. Explicar por qué en las pruebas de fermentación de azúcares en tubos con campana de Durham se
emplea un indicador de pH, cual es el indicador y cuál es su intervalo de sensibilidad.
5.3. ¿Qué otros azúcares se pueden utilizar para la fermentación de azúcares?
5.4. ¿Cuál es el indicador de pH que se emplea en las pruebas de utilización de sales orgánicas y cuál
es su intervalo de sensibilidad?
5.5. Explicar cuál es la utilidad de detectar la capacidad de hidrólisis de proteínas que tienen ciertos
microorganismos. ¿De qué manera se detectan estas enzimas proteolíticas de los microorganismos?
Discutir la importancia de la morfología microscópica y colonial, el aislamiento de los microorganismos,
la adecuada selección de pruebas bioquímicas a realizar y el uso de las claves para la identificación de
los microorganismos.
7. CONCLUSIONES
7.1. Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, a la
7.2. Concluir el género del microorganismo analizado de acuerdo a las pruebas bioquímicas.
8.1 Koneman, E.W. y S.D. Allen, W. R. Bocuell. Diagnóstico Microbiológico. 5ª edición Médica
Panamericana. 2001. México. 1432 p.
8.2 Mac Faddin. Pruebas Bioquímicas, Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. 3ª Edición.
Médica panamericana. Buenos Aires. 850 p.
80
Tablas de Cowan para la identificación de microorganismos
Tabla No. 1 Primera etapa para la identificación de bacterias Gram positivas.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Forma S S S S S S S R R R R R R R R R R R R R R
Acido resistencia - - - - - - - - - - - - - - - - - - - w +
Esporas - - - - - - - - - - - - - - - - + + - - -
Movilidad - - - - + - - + - - + - - - - - D D - - -
Crecimiento aerobio + + + + + + - + + + + + + - - - - + + + +
Crecimiento anaerobio - + w w + + + - + + + + - + + + + D - - x
Catalasa + + w - - - - + + + + - + + - - - + + + +
Oxidasa - - - - - - - - - - - - x x x x x d - - -
Glucosa (prod. acido) D + + + + + +/- - - + + + + + + - D D + + +
O/F O/- F F F F F F/- - - F F F F F F - F/- F/O/- O O O/NT
Micrococcus + · · · · · · · · · · · · · · · · · ·
Staphylococcus + · · · · · · · · · · · · · · · · · ·
Aerococcus + + · · · · · · · · · · · · · · ·
Streptococcus · · · + + · · · · · · · · · · · · · · ·
Pediococcus · · · + · · · · · · · · · · · · · · ·
Gemella · · · + · · · · · · · · · · · · · · ·
Cocos anaeróbicos* · · · · · · + · · · · · · · · · · · · · ·
Kurthia · · · · · · · + · · · · · · · · · ·
Corynebacterium · · · · · · · + + · · · · · · · · · ·
Listeria · · · · · · · + · · · · · · · · ·
Erysipelothrix · · · · · · · · · · + · · · · · · · · ·
Lactobacillus · · · · · · · · · · + · · · · · · · · ·
Arachnia ⁪ · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Rothia · · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Propionibacterium · · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Actinomyces · · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Bifidobacterium · · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Eubacterium · · · · · · · · · · · + + · · · ·
Clostridium · · · · · · · · · · · · · · <> <> + · · · ·
Bacillus · · · · · · · · <> <> <> · <> · · · · + · · ·
Nocardia · · · · · · · · · · · · · · · · · · + +
Mycobacterium · · · · · · · · · · · · · · · · · · +
81
Tabla No. 2 Primera etapa para la identificación de bacterias Gram negativas.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Forma R S S S S/R R R R R R R R R R R R R R
Movilidad - - - - - - + + - + - - + D - - + -
Crecimiento aerobio - - + + + + + + + + + + + + + -* -⁪ +
Crecimiento anaerobio + + - - - - - - - + + + + + + + - +
Catalasa d D + + + + + + + + + - + + D - D -
Oxidasa - x + + - + + + + + + + + - - + + -
Glucosa (prod. acido) D - + - + - + - + + + + + + D - - +
Carbohidratos [f/o/-] F/- - O - O - O - O O F F F F NT - - F
Bacteroides + · · · · · · · · · · · · · · · ·
Veillonella + · · · · · · · · · · · · ·
Neisseria · + · · · · · · · · · · · · ·
Branhamella · + · · · · · · · · · · · · ·
Acinobacter · + · · · · · · · · · · · ·
Moraxella · · · · + · · · · · · · · · · · ·
Brucella · · · · + · · · · · · · · · · · ·
Bortedella · · · · + · · · · · · · · · · · ·
Chromobacterium lividum · · · · · · + · · · · · · · · ·
Alvaligenes · · · · · · + · · · · · · · · ·
Flavobacterium · · · · · · + · · · · · · · · ·
Pseudomona · · · · · · · · · + · · · · · · · ·
Actinibacillus · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Pasteurella · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Necromonas · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Cardiobacterium · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Chromobacterium violaceum · · · · · · · · · · · · + · · · · ·
Benecktea · · · · · · · · · · · · + · · · · ·
Vibrio · · · · · · · · · · · · + · · · · ·
Plesiomonas · · · · · · · · · · · · + · · · · ·
Aeromonas · · · · · · · · · · · · + · · · · ·
Enterobacterias · · · · · · · · · · · · · + · · · ·
Haemophilus · · · · · · · · · · · · · · +
Eikenella · · · · · · · · · · · · · · +
Campylobacter · · · · · · · · · · · · · · +
Streptobacillus‡ · · · · · · · · · · · · · · +
Mycoplasmas · · · · · · · · · · · · · · +
82
Tabla No. 3. Equivalencias de los símbolos utilizados en las Tablas 1 y 2.
Símbolo Significado
Tabla No. 1
* Peptococcus, Peptostreptococcus (también Leuconostoc)
⁪ También Actinomyces odontolyticus
D Reacciones diferentes en distintas especies del género
d Reacciones diferentes en distintas cepas
F Fermentación
O Oxidación
w Reacción débil
x No se conoce
<> Variantes no esporágenas
Formas típicas
Presentan algunas características comunes
S Cocos
R Bacilos
NT No probada
Tabla No. 2
* Crecimiento en aire + CO2
⁪ Crecimiento en oxígeno 5-6%
‡ También Shigela dysenteriae
Forma típica
x No se conoce
Presentan algunas características comunes
NT No probada por métodos comunes
Para ambas tablas
+ Del 85-100% de las cepas son positivas (generalmente todas o la mayor parte)
d Del 16-84% de las cepas son positivas (muchas , algunas)
- Del 0-15% de las cepas son positivas (ninguna, pocas ó algunas)
() Reacción tardía en la prueba o crecimiento tardío
(d) Reacciones positivas tardías en diferentes cepas
(w) Reacción débil y tardía
w/- Reacciones débiles y crecimiento escaso en diferentes cepas
D Reacciones diferentes en distintos grupos (géneros, especies y variedades)
· No se conoce
Tablas tomadas de: Cowan, S. T. Manual for identification of medical bacteria2 nd Cambridge University
1974. pp167.
83
PRÁCTICA No 7 (parte b)
IDENTIFICACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS
1. OBJETIVOS
El alumno identificará mohos filamentosos y levaduras de una muestra.
1.2.1 El alumno identificará un moho por medio de la técnica Ridell (microcultivo).
2.-INTRODUCCIÓN
Existen aproximadamente 100,000 especies de mohos microscópicos, y la mayoría viven en el suelo
como saprofitos sobre materia orgánica en descomposición, manteniendo así la fertilidad de los suelos.
Alrededor de 50 especies producen enfermedades en los animales, y aproximadamente 8,000 especies
causan enfermedades en las plantas, por las que se producen pérdidas económicas en la agricultura.
En la industria farmacéutica algunos mohos son utilizados para obtener antibióticos, como la penicilina a
partir del género Penicillium.
En el campo de la elaboración de alimentos y la biotecnología, los mohos microscópicos se utilizan para
elaboración de cerveza, vino, pan, maduración de quesos, producción de diversos ácidos orgánicos,
etc.
Los mohos también se pueden usar, por ejemplo, en la degradación de hidrocarburos en el caso de
derrames de petróleo en el mar. Los mohos pueden crecer tanto en agua dulce como el agua marina.
También es relevante el hecho de que algunos mohos forman sustancias tóxicas al crecer en alimentos.
MORFOLOGÍA DE LOS MOHOS
Se les llama también Eumicetos, no producen flagelos, es decir, son inmóviles la mayor parte de ellos.
Los mohos mi8croscópicos pueden ser:
1) Mohos Unicelulares: se llaman mohos levaduriformes o levaduras.
2) Mohos filamentosos: se llaman mohos y constan de muchas células.
Tanto las levaduras como los mohos presentan células eucariotes, es decir, con cromosomas múltiples,
membrana nuclear bien definida, mitocondrias, retículo endoplásmico y pared celular.
Son microorganismos que contienen paredes celulares rígidas hechas de glucógeno, de celulosa o de
quitina o mananas. Además la membrana celular fúngica, a diferencia de la bacteriana, presenta
esteroles. Estos microorganismos carecen de clorofila y son heterótrofos.
El conjunto celular de los mohos son llamados micelios. Es decir, a cada filamento individual se le llama
hifa, al conjunto de hifas se le llama micelio, y a la colonia entera del moho se le llama talo. El aspecto
que presentan las colonias de mohos es de tipo aterciopelado, algodonoso o polvoso, con muy diversas
coloraciones que abarcan toda la gama de color. Los mohos poseen hifas multinucleadas y estas
pueden tener septos o carecer de ellos con base en esta característica, se clasifican en:
1) Mohos con micelio cenocítico : son los que carecen de septos o tabicaciones
2) Mohos con micelio septado: son los que presentan septos o tabicaciones entre las células.
84
Cada hifa puede tener un grosor uniforme o puede terminar en porciones más delgadas o anchas. El
diámetro va desde 0.5 hasta 100 micras, y su longitud puede ser desde unas cuantas micras hasta
varios metros. En algunas formas superiores de mohos, las hifas están pegadas juntas para formar
cuerpos fructiferos grandes, de estructura compleja, formado los llamados mohos carnosos o
macroscópicos. Pero aun cuando alcancen tales dimensiones, todos los mohos siguen siendo
microorganismos “primitivos”, debido a su especialización en tejido es reversible.
En cuanto a su función, las hifas y micelios se clasifican en 2 tipos:
1) Hifa o micelio vegetativo: son las que penetran al sustrato para absorber las sustancias nutritivas.
2) Hifa o micelio aéreo o reproductivo: son las que se proyectan sobre el sustrato y producen
estructuras de reproducción.
Muchos mohos patógenos presentan dimorfismo, desarrollándose como formas de aspecto de levadura
o como micelios. Por ejemplo, cuando cierto moho crece a temperatura de 37º C en el cuerpo humano,
se pueden presentar como levaduras, pero cuando crece en un medio de cultivo para mohos a 25º C
presenta forma de moho con micelio y esporas asexuales.
REPRODUCCIÓN
Los mohos se reproducen principalmente por medio de esporas, que son estructuras especializadas
para la propagación del moho y están capacitados para soportar condiciones adversas del medio
ambiente, sin embargo son más sensibles, en general que las endosporas bacterianas. Las esporas
fúngicas pueden formarse asexualmente o pueden ser el resultado de un proceso sexual. A
continuación se muestran la clasificación de estas esporas:
Esporas asexuales:
I.- Talosporas:
a) Artrosporas. Son esporas que se forman por fragmentación de hifas generalmente son rectangulares
con doble pared gruesa.
b) Blastosporas. Se forman en las levaduras por gemación a partir de una célula preexistente; una vez
que la yema ha alcanzado su máximo desarrollo se separa de la célula madre y en este estado o
todavía unida, produce un nuevo brote, pudiéndose formar un pseudomicelio.
c) Clamidosporas. Se forman cuando las condiciones del medio se tornan adversas, las células
aumentan de tamaño y se hinchan. Estas esporas son redondeadas y poseen doble pared gruesa que
les confiere gran resistencia.
II.- Conidiosporas.
Son esporas producidas libremente, por segmentación de las puntas de unas hifas especializadas,
llamadas conidioforos.
85
a) Microconidias. Son esporas unicelulares que se presentan diversidad de tamaños, formas y

colores. Son producidas por los conidióforos, mediante el estrangulamiento sucesivo.
b) Macroconidias. Son esporas multicelulares, las hay de diversas formas. Las macroconidias
pueden dividirse en dos o más células por tabiques transversales y pueden adoptar forma de huso o de
clava. La forma de estas estructuras varía, según el género.
III.- Esporangiosporas.
Son esporas producidas en estructuras especializadas llamadas esporangios, que son sacos redondos
unidos al micelio vegetativo por una estructura especial llamada esporangióforo.
Esporas sexuales
I.- Cigosporas o Zigosporas:
Espora que surge cuando dos hifas cercanas se unen y fusionan sus contenidos genéticos,
desarrollándose paredes gruesas. Las dos hifas que se unen pueden ser homotálicas (ambas
provenientes de la misma colonia o talo), o heterotálicas (provenientes de dos talos distintos).
II.- Ascosporas.
De la fusión de los gametos masculino y femenino surge una estructura llamada asco o asca. Las
ascosporas se desarrollan en el interior del asca, que es un saco que contiene generalmente ocho
ascosporas.
III.- Basidiosporas
De la fusión de los gameto masculino y femenino surge una basidia, en cuyo interior están las
basidiosporas; se desarrollan en grupo de cuatro como carácter atípico a partir de los extremos de
estructuras en forma de maza, que debido a su forma reciben el nombre de basidios.
IV.- Oosporas
Esporas que surgen de la unión de dos estructuras llamadas anteridio (gameto masculino) y oogonio
(gameto femenino), y que van a producir una sola oospora.
FISIOLOGÍA DE LOS MOHOS MICROSCÓPICOS.
Respecto a sus requerimientos nutricionales, los mohos son heterótrofos. Al faltarles la clorofila
lógicamente no llevan a cabo fotosíntesis, y comparándolos con las bacterias, los mohos en general
tienen requerimientos nutritivos extraordinariamente simples y sus procesos metabólicos y de
biosíntesis los llevan a cabo por las vías más comunes. Por lo tanto pueden vivir en condiciones más
severas que otros microorganismos, casi en cualquier sustrato. Por ejemplo: cuero, madera, alimentos,
mermelada, frutas, plantas, el cuerpo humano, animales, etc.
El pH óptimo en el cual se desarrollan es de 3 a 5. Pueden crecer en humedad pero también resisten la
falta de agua. Son aerobios estrictos y carecen en un rango de temperatura óptimo de 22 a 30º C.
Algunos mohos son capaces de desarrollarse en condiciones extremas, como deteriorando carne a 0º C
(mohos psicrófilos), o crecimiento a 62 ºC (mohos termófilos).
Las fuentes de carbono que pueden utilizar los mohos son: glucosa, sacarosa, maltosa, almidón o
celulosa. Las fuentes de nitrógeno que pueden utilizar los mohos son: nitrógeno orgánico, nitrógeno
inorgánico y nitratos. Algunos iones que requieren son: Zn, Cu, Mn, Fe y Mo.
De acuerdo al color de las hifas estas pueden ser hialinas cuando no están pigmentadas o dematiáceas
cuando poseen con color café oscuro
86

3.1 MATERIAL
Pipetas de 1 ml Caja de Petri con Varilla en forma de “V” con
porta y cubreobjetos estériles.
Bisturí
Asa micológica
Mechero
3.2 EQUIPO
Autoclave Horno a 170°C
Incubadora a 28°C y 35 °C Microscopio
3.3 MEDIOS DE CULTIVO
Tubos con PDA inclinado Tubos de ensaye de 13 X 100 con campana de
Durham con los azucares siguientes
Caja de Petri con PDA (para microcultivo)
Glucosa 10 %
Matraz con 50 ml de glicerol al 10 % estéril
Lactosa al 10 %
Matraz con 50 ml de formaldehído al 10 %
Maltosa al 10 %
Rafinosa al 10 %
Sacarosa al 10
3.4 CEPAS DE MOHOS Placas con cultivo de:
Penicillium sp Aspergillus niger
Rhizopus sp S. cerevisiae
4.1 MORFOLOGÍA COLONIAL DE MOHOS
Observar la morfología colonial de los mohos que están en la placa y reportar tamaño, forma, aspecto,
además de observar si hay pigmento difusible.
4.2 IDENTIFICACIÓN DE MOHOS POR LA TÉCNICA DE RIDELL (microcultivo)
a) De una caja de Petri con PDA cortar cuadros de 1 cm de lado y 5 mm de espesor con un bisturí
estéril.
b) Colocar el cuadro de PDA en un portaobjetos que esta sobre una varilla de vidrio doblada en forma
de “V” en una caja de Petri (Todo esto previamente esterilizado).
c) Tomar con el asa el inóculo del moho al cual se quiere identificar.
d) Inocular por picadura cada uno de los 4 lados del cuadro de agar.
e) Colocar sobre el cuadro de agar un cubreobjetos y presionar ligeramente para que se adhiera.
f) Adicionar a la caja 10 ml de glicerol al 10 %
g) Cerrar la caja de Petri e incubarla a 28 °C.
h) Realizar observaciones mínimo cada 24 horas para identificar los cuerpos fructíferos.
i) Si se observa que el moho ya se ha desarrollado y se puede identificar las estructuras de
reproducción, quitar el glicerol con una pipeta Pasteur y desecharlo en el benzal.
j) Adicionar 10 ml de formaldehído al 40 % para inactivar el moho por 15 minutos.
87
k) Desprender con cuidado el cubreobjetos que se encuentra sobre el cuadro de agar y colocarlo
sobre un portaobjetos que contenga una gota se azul de algodón lactofenol, sellar la preparación con
barniz de uñas transparente.
l) Desprender con cuidado el cuadro de agar y depositarlo en la caja de Petri, colocar una gota de
azul de algodón lactofenol donde estaba el cuadro de agar y colocar un cubreobjetos
m) Si re requiere la preparación con barniz
n) Realizar las observaciones de las preparaciones en el microscopio con el objetivo de 10 y 40 X.
o) Dibujar las estructuras observadas y con ayuda de la bibliografía comparar las estructuras
reproductivas e identificar el moho.
4.3 OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LEVADURAS

a. De la suspensión proporcionada realizar un frotis, fijarlo con calor y realizar una tinción simple.
b. Observar la preparación al microscopio con el objetivo de 10 y 40 X
c. Dibujar la levadura que se observó.
4.4 IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS POR ASIMILACIÓN O FERMENTACIÓN DE AZUCARES.
Se utiliza para identificar diversos géneros y especies fúngicas, principalmente levaduras y algunas
bacterias pertenecientes a los Actinomycetes, con base en sus capacidad de fermentar azucares.
a. De la suspensión a la que se le hizo la tinción simple y si resulto ser una levadura
b. Inocular una gota a cada tubo que contiene diferentes azucares.
c. Incubar de 24 – 48 h y observar la fermentación o asimilación del carbohidrato y comparar los
resultados que se buscarán en la bibliografía como la siguiente tabla.
d. Identificación de levaduras del género Candida.
88
Dextrosa Maltosa Sacarosa Galactosa Lactosa Trehalosa

C. albicans + + - + - +
C. tropicales + - + + - +
C. glabrata + - - - - +
C. guilliermondi + - + + - +
C. parapsilosis + - - + - +
C. krusei + - - - - -
C. kefyr + - + + + +
C. lipolitica + - - - - -
C. zeylanoides +* - - - - -
4 RESULTADOS Y CUESTIONARIO.
5.1 Dibujar la levadura observada al microscopio
4.2 Dibujar las estructuras de reproducción del moho
5.5 +Anota el nombre del moho identificado ____________________________
5.6 Anotar la composición y utilidad de los medios de cultivo: Saboraud, agar de papa y dextrosa y agar
rosa de bengala
5.7 Porqué es necesario realizar la técnica de microcultivo para identificar mohos?
5.8 Cuál es la función del glicerol y el formaldehído en un microcultivo?
5.9 Cómo identificarías un moho contaminante en un producto biotecnológico?
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
6.1 Discutir las características de cada grupo de mohos, así como su importancia microscópica en la
naturaleza.
7 CONCLUSIONES
7.1 Elabora tus conclusiones tomando en consideración los objetivos de la práctica, los resultados
obtenidos y la bibliografía consultada.
8. BIBLIOGRAFÍA
8.1 Koneman, E:W:& Morrison; Micología, Diagnóstico de Laboratorio, Edito.. Médico Panamericana
1991.
8.2 Tortora, J. Gerard; Introducción a la microbiología, Editorial Acribia, 1993
89
Esquemas de mohos y levaduras
RPS
90
91
92
93
94
95
PRACTICA No. 8
CRECIMIENTO MICROBIANO
UNIDAD V: Crecimiento y cinética microbiana.
I. OBJETIVOS
El alumno aplicará las técnicas más utilizadas para el recuento de microorganismos y explicará qué
ocurre en cada una de las fases de crecimiento celular.
1.2 Objetivos Específicos
1.2.1 El alumno llevará a cabo una proliferación de crecimiento celular de de Escherichia coli en cultivo
sumergido y agitación (fermentación) a nivel matraz por 24 horas.
1.2.2 El alumno cuantificará el número de microorganismos viables a través del recuento por diluciones
y vaciado en placa como unidades formadoras de colonias (UFC).
1.2.3 El alumno estimará el crecimiento microbiano por la técnica de turbidimetría.
1.2.4 El alumno cuantificará el número de microorganismos por cuenta directa con la técnica de conteo
en cámara de Neubauer.
1.2.5. El alumno comparará los resultados obtenidos con CGS y caldo Luria, para determinar el mejor
medio de cultivo en función de la cantidad de masa celular producida.
2. INTRODUCCIÓN
Al hablar de crecimiento microbiano nos referimos al número de células, las células que crecen, están
aumentando de número y forman cúmulos de cientos de microorganismos, colonias de cientos de
microorganismos o poblaciones de miles de millones.
Al conocer las condiciones para el crecimiento microbiano, podemos predecir la rapidez con que
crecerán estos en distintas situaciones y determinan la forma de controlar su crecimiento, estos
requerimientos pueden ser físicos y químicos. Los aspectos físicos incluyen la temperatura, el pH y la
presión osmótica y entre los requerimientos químicos están el agua, las fuentes de carbono y nitrógeno,
las sustancias minerales, el oxigeno y los factores orgánicos de crecimiento.
Las bacterias se reproducen generalmente por fisión binaria, una división celular da lugar a dos células,
la división de estas células produce cuatro y así sucesivamente.
El tiempo necesario para que una célula se divida y por consiguiente para que su población se duplique,
es lo que se llama tiempo de generación o tiempo de duplicación, puesto que, para los organismos
unicelulares; cada duplicación constituye una nueva generación, varía considerablemente entre los
diferentes microorganismos. La mayoría de las bacterias tienen un tiempo de generación de una a tres
horas.
Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos métodos miden el número de
células, otros la masa total de la población. Las medidas de población se refieren normalmente al
número de células que hay en un mililitro de líquido o en gramo de material sólido.
Los métodos de cuantificación están basados en mediciones directas o indirectas de muestras muy
pequeñas, después se determina mediante cálculos el tamaño de la población total.
Los métodos recomendados para medir la población son:
Recuento en placa Diluciones seriadas.
Siembra por vaciado en placa. Siembra por extensión con varilla
Filtración Método del número más probable
96
Recuento directo al microscopio (cámara de Neubauer).
Hay otros 3 métodos llamados indirectos.

1.- Turbidimetría.
2.- Actividad metabólica.
3.- Peso seco.
Es posible determinar la densidad celular empleando métodos más sencillos. Nos basta con una
cámara de conteo celular, por ejemplo la cámara de Neubauer, y un microscopio.
Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes métodos. El más común es el de tinción con
azul tripán. El azul tripán es un coloide que se introduce en el interior de las células que presentan
roturas en la membrana.
Es importante diferenciar entre el crecimiento de las células individuales y el crecimiento de poblaciones
de células (proliferación). El crecimiento de una célula es el aumento en su tamaño y peso y
generalmente es la antesala de la división celular. Por otra parte, la proliferación es el aumento del
número de células a consecuencia del crecimiento y la división celulares.
Una vez que se proveen de nutrientes necesarios al microorganismo, la célula empieza a crecer y/o a
producir algunos metabolitos.
Fase del crecimiento
En un cultivo microbiano todas las partes están sujetas a las mismas condiciones de temperatura, pH,
concentración de nutrientes, en la figura siguiente se indican diferentes fases que ocurren en un cultivo,
en donde se refleja los cambios en la biomasa y en el medio ambiente.
Parámetros de la curva de crecimiento
Si se sigue el crecimiento de un cultivo discontinuo a través de la multiplicación de la masa, nos
interesarían tres parámetros que son la producción, la tasa de crecimiento y el periodo de latencia.
La producción es la diferencia entre la masa bacteriana inicial y la máxima: X = X max- X0
La tasa de crecimiento exponencial es una medida de la velocidad del crecimiento celular (velocidad
específica de crecimiento celular) se designa con la letra griega μ en la fase exponencial del
crecimiento. Se calcula a partir de las densidades bacterianas X 0 y Xt en los tiempos t0 y t, en la fase de
crecimiento exponencial según
Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos métodos miden el número de
células, otros la masa total de la población. Las medidas de población se refieren normalmente al
número de células que hay en un mililitro de líquido o en un gramo de material sólido.
Los métodos que vamos a utilizar en el laboratorio de técnicas microbiológicas es el de cuenta viable
por la técnica de vaciado en placa, cuenta directa al microscopio utilizando una cámara de Neubauer y
por turbidimetría que es un método indirecto que mide la densidad de una suspensión por su extinción,
en algunas ocasiones se utiliza el nefelómetro.
97
3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS

3.1.- MATERIAL
Un matraz con 100 ml de caldo Luria estéril Un matraz de 1 L con 600 ml de agar cuenta
(matraz semilla) estándar (para el vaciado en placa)
Un Matraz de 500 ml con 100 ml de caldo Luria 120 tubos de 16 x 150 mm con 9 ml de solución
estéril y/o caldo glucosa sales salina (para las diluciones)
Dos celdas y un portaceldas 40 Cajas de Petri estériles (para el vaciado en placa)
• Pipetas de 2,5 y 10 ml estériles Una pizeta con benzal
3.2.-REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO
NaCI ó peptona Agar cuenta estándar
Caldo Luria Caldo glucosa sales al 5 %
3.3.- EQUIPO
Espectrofotómetro • Incubadora a 37° C
• Autoclave • Contador de colonias
• Horno • Cámaras de Neubauer
3.4.- CEPAS:
Suspensión de Escherichia coli Suspensión de Saccharomyces cerevisiae
4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL
ENSAYO DE LOS MÉTODOS (PRIMERA SESIÓN)
4.1 TURBIDIMÉTRIA. Para este primer ensayo no es necesario trabajar en condiciones de
esterilidad
De la suspensión de S. cerevisiae, seguir las indicaciones del profesor para leer la absorbencia en el
espectrofotómetro.
a) Colocar en el espectrofotómetro una portacelda y bloquear el paso de luz
b) Encender el espectrofotómetro y dejarlo calentar por 5 minutos, seleccionar la longitud de onda (540
nm) y la región visible
c) Colocar en una celda espectrofotométrica 3 ml de caldo Luria, este tubo será el blanco
d) En la otra celda colocar aproximadamente 3 ml de la suspensión a leer
e) Limpiar con papel sanitario la celda, tomarlo con los dedos por la boca del tubo y colocar el blanco en
el portacelda. Acomodar la portacelda para dejar pasar la luz y ajustar a cero de absorbencia.
98
f) Una vez ajustado a cero, bloquear el paso de luz e insertar la celda de la suspensión a leer,
previamente limpiada con papel sanitario.
g) Cuando la lectura se estabilice más o menos 3 segundos, tomar la lectura.
h) Bloquear el paso de luz y retirar la celda, vaciar el contenido en un recipiente con benzal y enjuagar
la celda dos o tres veces con benzal.
i) Una vez leída la muestra, apagar el espectro y retirar la portacelda.
Nota: Las celdas nunca se lavan con escobillón, no se colocan en una gradilla, para ello se entregaran
en un vaso
4.3 CUENTA DIRECTA EN CÁMARA DE NEUBAUER
a) Tomar la cámara y limpiarla con una torunda impregnada con alcohol, con mucho cuidado, ya que el
cuadriculado al frotarlo bruscamente se puede borrar.
b) La torunda depositarlo en un recipiente que contenga benzal, de la misma manera limpiar el
cubreobjetos (cubrehematocimetro) y colocarlo sobre la cámara.
c) Con una pipeta coloca la muestra de S. cerevisieae, entre la cámara y el
portaobjetos, para que por cohesión se llene la cámara, La cámara de
Neubauer es una cámara de conteo. Se trata de un portaobjetos con una
depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la
ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen.
Es un cuadrado de 3 x 3 mm., con una separación entre dos líneas
consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada le
corresponde a un mm2. La depresión central del cubreobjetos está
hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre
con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 mm, y el
volumen es de 0.1 mm3, es decir 0.1 µl.
d) Colocar la cámara en la platina y enfocar con 10 y 40 X
e) Contar para las levaduras en los cuadrantes denominados en la figura A,B.C y D, sumar los valores
obtenidos, sacar un promedio; multiplicar por 10 000 y las unidades son células/ml.
f) Retira la cámara, límpiala y ahora coloca una muestra de E. coli, pero ahora utiliza el cuadrante de
en medio y contar los cuadros sombreados, de igual forma contar el número de células, sumarlos y
obtener el promedio, después multiplicar por 25 y luego por 10 000, obteniéndose No. de células/ml.
4.3 DILUCIONES PARA REDUCCIÓN DE CARGA MICROBIANA

a) La muestra se toma en condiciones de esterilidad, tomar 1 ml del matraz cinética y colócalo en
-1
un tubo que contenga 9 ml de solución salina, para realizar la dilución 10 . Mezclar el tubo según las
recomendaciones de la NOM 110 y tomar 1 ml, colocarlo en otro tubo con 9 ml de solución salina para
-2
obtener la dilución 10 y así sucesivamente.
b) El número de diluciones que realices depende del crecimiento que encuentres por turbidimetría
6 -6
o en el conteo directo, si el conteo es del orden de 1x10 , entonces realiza hasta las diluciones 10 y
99
-7
10 . Conforme aumente el número de microorganismos aumenta el número de diluciones, recordemos
que debemos tener un intervalo de conteo
4.4 CUENTA VIABLE
a.- Recordar la técnica de vaciado en placa, según la NORMA Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994,
Bienes y servicios. Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa.
100
SESIÓN II
Organización de las cinéticas: Se realizarán 4 cinéticas en todo el grupo con las siguientes
consideraciones
Cinética A Cinética B Cinética C Cinética D
Equipos 1,2 y dos alumnos Equipos 3 y 4 y un alumno Equipos 6,7 y dos alumnos Equipos 8 y 9 y un alumno
del equipo 5 del equipo 5 del equipo 10 del equipo 10
150 ml de Caldo Luria 150 ml de CGS al 5% 150 ml de Caldo Luria 150 ml de CGS al 5%
Volumen del inóculo 10 ml 10 ml 10ml
Si la As es de 0.8-0.9
4.5 PREPARACIÓN DE MATRAZ SEMILLA (DIA 1 y generalmente lo hace el profesor)

a) Inocular en condiciones de esterilidad un matraz conteniendo 50 ml de caldo Luria estéril con 2.5
ml de una suspensión de Escherichia coli de 18 horas de cultivo.
b) Incubar a 35° C por 18 h en agitación aproximadamente a 120 rpm. Éste será el matraz semilla.
4.6 PREPARACIÓN DEL MATRAZ CINETICA (DIA 2)
Trabajo para el profesor

a) El día de la cinética tomar en condiciones de esterilidad 4 ml y medir la turbidez y de acuerdo a este
valor indicará a los alumnos cuanto inocular en su matraz cinética
b) De lo que quede en la pipeta realizar una tinción de Gram para verificar la pureza.
4.7 INOCULACIÓN DE MATRAZ DE CINÉTICA
Trabajo para los alumnos

1.- Enjuagar una celda espectrofotométrica con benzal y luego en condiciones de esterilidad
enjuagarla con alcohol, ahora con una pipeta estéril tomar 4 ml de caldo Luria o CGS del matraz de
cinética y colocarlo en la celda espectrofotomérica y colocarle parafilm (este es el blanco para
ajustar el espectro y poder leer cada lectura).
2.- Homogeneizar la suspensión microbiana del matraz semilla y tomar el volumen indicado por el
profesor que puede ser 5 o 10 ml de esta suspensión en condiciones de esterilidad e inocular el
matraz con caldo Luria o CGS para la cinética y mezclar perfectamente, anotar este tiempo (t 0)
3.- Con una pipeta de 5 ml estéril tomar 5 ml inmediatamente y dar el matraz a un compañero para
que lo lleve a incubar y agitar. El alumno que tiene la pipeta con la muestra realizará lo siguiente en
este orden:
a.- Colocar 1 ml en un tubo de dilución y darle el tubo a otro compañero para que realice las
diluciones pertinentes, según el cuadro de diluciones, siguiendo las recomendaciones de la
NOM 110, sembrará las dos últimas diluciones por la técnica de vaciado en placa siguiendo las
recomendaciones de la NOM 092. Dejar solidificar e incubar.
Una vez depositado el ml en el tubo de dilución se puede apagar el mechero
b.- Tomar la otra celda espectrofotométrica y colocar aproximadamente 3.5 ml, colocar la celda
en el vaso de precipitados que contiene la celda (blanco) y se la dará a un compañero para que
realice la lectura en el espectrofotómetro. (Esta segunda celda no es necesaria sanitizarla)
101
d.- De lo que queda en la pipeta colocar una gota en la cámara de Neubauer y dársela al
compañero que va a realizar el conteo en el microscopio.
e.- Con lo que queda en la pipeta realizar un Gram para corroborar la pureza del matraz semilla y
desechar la pipeta en el benzal.
f.- Este procedimiento se hace según el cuadro de tiempos de toma de muestra
g.- Incubar las placar a 35°/ 24 h y realizar el conteo

5.1 Anota los resultados obtenidos. As del matraz semilla: _________
Tiempo Tiempo real en min Absorbencia 540 nm Cuenta directa UFC / ml
To
T1
T2
T3
T4
T5
T7
102
5.2 Cuenta viable por vaciado en placa: Anota el número de UFC/ ml.
Tiempo Conteo Promedio Resultado
To Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
T1 Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
5.3.3 ¿Es posible diferenciar células muertas de las vivas?
5.3.4 Construye una gráfica del número de UFC/ml vs Tiempo, señalando en la curva las diferentes
zonas de crecimiento.
5.3.5 Construye una gráfica del número de UFC/ml vs Tiempo (horas).
5.3.6. Construye una gráfica del log del número de UFC/ml vs Absorbencia.
5.3.7 Determina la velocidad específica de crecimiento máxima.
5.3.8 Calcula el tiempo de generación de la cepa estudiada.
5.3.9 Define el término velocidad específica de crecimiento
5.3.10 Menciona los factores de que depende la fase de muerte
5.3.11 ¿Por qué es importante la cinética microbiana?
103

6.1 Discute las ventajas y desventajas de los métodos empleados.
6.2 Analiza y discute sobre la base de lo anterior y a la investigación bibliográfica realizada, los
resultados obtenidos en esta práctica.
6.3 Discute la conveniencia o no de construir una curva de calibración con los resultados de
turbidimetría y de cuenta viable para un microorganismo dado, de ser conveniente explica para qué
podrá servir.
7. CONCLUSIONES
Elabora las conclusiones sobre la base de los resultados obtenidos, al análisis y discusión de estos, a la
8. BIBLIOGRÁFIA
8.1.- Atlas, R. W. 1988. Microbiology. Second edition. Mc. Millan Public, U. K. 807 pág.
8.2.- Moat, A. G., J. W. Foster, M. P. Spector. 2002. Microbial Phisiology. Fourth edition. Wiley-Liss,
USA. 715 pág.
8.3.- Brock, T.D.; Smith y M.T. Madigan. 1997. Biología de los Microorganismos. Octava edición.
Prentice Hall, España. 956 pág.
8.4.- Stanbury, F. Peter, A. Whitaker, S. Hall. 1998. Principles of Fermentation Technology. Second
edition. Pergamon Press, Oxford. 376 págs.
8.5.- Reina, Manuel. 2003. Contaje de células: cámara de Neubauer. Departamento de Biología Celular.
Universidad de Barcelona. Última actualización 20 de octubre de 2003.
104
PRACTICA No. 9
EFECTO DE LOS FACTORES FISICOQUÍMICOS SOBRE EL CRECIMEITNO MICROBIANO
1. OBJETIVOS
1.1. Objetivo general
Al término de la práctica el alumno determinará:
1.1.1 La influencia de algunos factores ambientales sobre el crecimiento de algunos microorganismos.
1.2. Objetivos específicos.
1.2.1 Determinar el PTM y TTM) de algunos microorganismos.
1.2.2 Determinar el efecto de la presión osmótica, pH, metales pesados y temperatura sobre el
crecimiento de los microorganismos.
1.2.3 Determinará el efecto de un inhibidor sobre el crecimiento de un microorganismo.
1.2.4 Realizará una pasteurización como una aplicación de un proceso térmico.
2. INTRODUCCIÓN
Cada microorganismo tiene sus propias necesidades, características de su propio crecimiento en un
medio ambiente por lo que determinado factor fisicoquímico lo afectara dentro de límites diferentes.
Dentro de los principales factores fisicoquímicos que afectan el desarrollo microbiano se encuentran:
-Temperatura
-Presión osmótica
-Potencial de hidrógeno
-Potencial de oxido reducción
GRUPO TEMPERATURA OPTIMA DE CRECIMIENTO
Psicrófilas 5°C aproximadamente
Mesófilas de 20 a 45 °C
Termófilas 55°C y mayores
El calor es uno de los factores físicos más utilizados para esterilizar y desinfectar, como el calor es tan
eficaz para destruir a los microorganismos, es esencial disponer de una medida precisa de su eficacia
termodestructiva. Inicialmente, esta eficacia se expresaba con el punto de muerte térmica (PTM), la
temperatura más baja a la que una suspensión microbiana se destruye en 10 minutos. En la actualidad
se emplea más el término de tiempo de muerte térmica (TMT) el cual se define como el tiempo más
corto necesario para destruir todos los organismos de una suspensión microbiana, a una temperatura
especifica y en condiciones definidas. Sin embargo esta destrucción es logarítmica y en teoría no es
posible destruir completamente los microorganismos de una muestra, incluso aumentando el tiempo de
calentamiento, por ello de tiempo de reducción decimal (D) o valor D es más preciso.
Cabe señalar que el crecimiento es el resultado de un conjunto de actividades metabólicas del
microorganismo, así que se puede estudiar el efecto de los factores fisicoquímicas sobre el crecimiento,
o sobre alguna actividad microbiana.
Las bacterias móviles reaccionan frente a estímulos químicos y en algunos casos huyen de estos, a la
respuesta frente a este estímulo se le llama quimiotaxis.
EFECTO DEL pH
105
Los iones H y OH son los iones más móviles, por ello pequeñas modificaciones en su concentración
tiene consecuencias graves, la mayoría de los microorganismos tienen un pH cercano a la neutralidad,
pero existen otros que están en el intervalo alcalino (microorganismos alcalinófilos) y otros en el
intervalo ácido (microorganismos acidófilos)
EFECTO DE LA PRESIÓN OSMÓTICA
Los microorganismos osmófilos y Xerófilos pueden descomponer los alimentos, los microorganismos
osmófilos crecen óptimamente en medios con una elevada concentración osmótica, mientras que los
xerófilos prefieren un medio con baja Aw.
Los microorganismos halófilos se han adaptado bien a crecer a levados niveles de cloruro de sodio
ACTIVIDAD DE AGUA
Los microorganismos se diferencian entre sí por el contenido de agua, para poder comparar las
disoluciones acuosas y las sustancias sólidas desde el punto de vista del agua disponible se recurre a la
actividad acuosa Aw. Este parámetro hace referencia a la fase de vapor de agua que se encuentra en el
equilibrio con un material sólido.
EFECTO DE LOS METALES PESADOS
Los iones metales como el Hg, Ag, Zn, y Cu se han empleado como germicidas, muchos metales
pesados son utilizados como bacteriostáticos que bactericidas.
Los metales pesados se combinan con las proteínas, a menudo con los grupos sulfhidrilos,
inactivándolas, también pueden precipitar las proteínas.
EFECTO DE COMPUESTOS HALOGENADOS.
El yodo y el cloro son los principales agentes antimicrobianos, el yodo se utiliza como antiséptico al
oxidar los constituyentes celulares y formar compuestos de yodo con las proteínas celulares. El cloro es
un desinfectante que se emplea ampliamente, puede aplicarse como gas cloro, hipoclorito sódico, o
hipoclorito cálcico produciendo ácido hipocloroso (HClO) y posteriormente oxígeno.
EFECTO DE LOS ANTIBIÓTICOS.
Los fenómenos de transferencia genética y la aparición de mutantes en las bacterias Gram + y -, han
dado lugar a la aparición de cepas resistentes a uno o varios antimicrobianos, esto lleva a la necesidad
de conocer un patrón de susceptibilidad de las cepas. La prueba se fundamenta en que al colocar un
disco impregnado con determinada cantidad de antimicrobiano sobre un medio sólido inoculado con el
microorganismo de prueba.
RADIACIONES
Las más utilizadas son los rayos UV, X y gamma, la luz Uv (260 nm) es absorbida por los ácidos
nucleicos formando dímeros de timina, las otras dos radiaciones deben su acción a la formación de
radicales OH que disocian a la mayoría de las moléculas, y se utilizan generalmente para esterilizar
alimentos.
DETERGENTES
Son moléculas que actúan como agentes humectantes y emulsionantes porque poseen tanto extremos
hidrófilos polares como hidrófobos no polares, debido a su naturaleza antipática solubilizan residuos
insolubles y son agentes limpiadores muy eficaces.
3. EQUIPO, MATERIAL., MEDIOS DE CULTIVO Y CEPAS MICROBIANAS
3.1. MATERIAL
Pipetas de 1, 2, 5 y 10 ml estériles. Cajas Petri con Agar cuenta estándar

Tubos de 16 x 150 mm con 5 ml de caldo nutritivo Tubos de 16 x 150 mm con 5 ml de caldo
nutritivos pH 3,5
Tubos de 16 x 150 mm con 5 ml de caldo nutritivo
Tubos de 16 x l50 mm con 5 ml de caldo nutritivo
106
Placas con agar nutritivo a pH 7,0

20 ml de leche en punto de venta (establo) Tubos de 16 x 150 mm con 5 ml de caldo nutritivo
a pH 9,0
Tubos con 9 rnl de agua peptonada al 0. 1%
Tubos de 16 x 150 mm con 5 ml de caldo nutritivo
Matraz de 150 ml con Agar bilis rojo violeta con 0,85 % de cloruro de sodio
Tubos de 16 x 150 mm con 5 ml de caldo nutritivo Pinzas de disección
con 1% de cloruro de sodio
Discos de papel filtro impregnados con hipoclorito
Tubos de 16 x 150 mm con 5 ml de caldo nutritivo de sodio
con 5% de cloruro de sodio
Discos de papel filtro impregnados con yodo
Discos de papel filtro de 1 cm de diámetro
Antibiogramas para Gram positivos y Gram
Cajas de Petri estériles negativos
3.2. EQUIPO
Una estufa a 28°C Un baño María a 80°C

Un baño María a 28°C Un baño María a 92°C
Un baño María a 35°C Un baño María a 4°C
Un baño María a 40°C Un termómetro
Un baño María a 50°C Un incubadora a 35°C
Un baño María a 55°C Un incubadora a 28°C
Un baño María a 60°C Una autoclave
Un baño María a 70°C Horno
Sacharomyces cerevisiae Escherichia coli

Bacillus subtilis Aspergillus. niger
Pseudomonas sp Micrococcus luteus
4. 1. EFECTO DE LA TEMPERATURA DE CULTIVO SOBRE EL CRECIMIENTO
a. Se emplearan los siguiente microorganismos: Pseudomonas sp, Escherichia coli y B. subtilis
b. Hacer una suspensión del microorganismo con el que se va a trabajar
c. Etiquetar una serie de 4 tubos conteniendo cada uno 5 ml de caldo nutritivo con las siguientes
temperaturas. 5, 28, 35 y 55°C. Anotar también el nombre del microorganismo que se inoculará
d. Inocular cada uno de los tubos con 0,1 ml de la suspensión microbiana e incubar los tubos a la
temperatura correspondiente durante 24 h. Dejar un tubo sin inocular que servirá como testigo
negativo del medio.
e. Después de este tiempo observar si hay o no crecimiento haciendo anotaciones con un signo (+)
dependiendo de cuanto crecimiento se observe, si no hay crecimiento con un signo (-).
4.2. DETERMINACIÓN DEL PUNTO TÉRMICO MORTAL (PTM)
a. Etiquetar una serie de 6 de 13 x l00 tubos conteniendo cada uno 5 ml de caldo nutritivo (CN), con las
siguientes temperaturas: 35°C, 50°C, 60°C 70°C, 80°C y 92°C.
107
b. Inocular cada tubo con 0,1 ml de la suspensión microbiana

c. Calentar los tubos a las temperaturas correspondientes durante 10 minutos a baño María y colocar
0,1 ml del primer tubo sobre la superficie de una placa de agar nutritivo y homogeneizar con un a
varilla de vidrio estéril
d. Realizar la misma operación con los otros tubos. Incubar las placas durante 24 h a 25°C para
Pseudomonas sp, a 35°C para E. coli y B. subtilis. Al cabo de las cuales determinar el número de
unidades formadoras de colonias
En caso de no requerir conocer las UFC, observar la turbidez del tubo y con cruces anotar de la menor
turbidez a la mayor, posteriormente dividir una placa en 7 fracciones más o menos equidistantes y en
cada una de las fracciones sembrar por estría simple para observar solo ausencia o presencia de
crecimiento.
4.3. DETERMINACIÓN DEL TIEMPO TÉRMICO MORTAL (TTM)

a. Etiquetar una serie de 7 tubos de 13 x 100 conteniendo cada uno 5 ml de caldo nutritivo con los
siguientes tiempos 5, l0, 20 y 30 min.
b. Inocular cada tubo con 0, 1 ml de la suspensión microbiana
c. Calentar las suspensiones a 70°C en un baño María durante los tiempos indicados
d. Colocar 0,1 ml de cada tubo sobre la superficie de una placa de agar nutritivo y homogeneizar con
una varilla de vidrio estéril
e. Incubar las placas durante 24 h a 25°C para Pseudomonas sp y a 35°C para E. coli y B. subtilis.
f. Una vez pasado este tiempo determinar el número de unidades formadoras de colonias por ml.
En caso de no requerir conocer las UFC, observar la turbidez del tubo y con cruces anotar de la menor
turbidez a la mayor, posteriormente dividir una placa en 7 fracciones más o menos equidistantes y en
cada una de las fracciones sembrar por estría simple para observar solo ausencia o presencia de
crecimiento.
4.4. PASTEURIZACIÓN
a. A) Determinación de organismos conformes y mesofílicos aeróbicos en leche sin pasteurizar De la
leche sin pasteurizar realizar una dilución colocando 10 ml en 90 ml de agua peptonada al 0,1% y
hacer diluciones en tubos con 9 ml con agua peptonada al 0,1% hasta la dilución 10 -2
b. Hacer determinación de Organismos conformes y mesofílicos aerobios como se indica en el
esquema.
c. B) Pasteurizar la leche colocándola a una temperatura de 63°C durante 30 minutos después de este
tiempo enfriar rápidamente en baño de hielo por cinco minutos y realizar determinación de
microorganismos coliformes y mesofílicos aerobios como se indica en la figura
108
d Determina el número de UFC según la NOM para leche en punto de venta y leche pasteurizada.
FACTORES FISICOQUÍMICOS.
4.5. EFECTO DEL pH
a. Se emplearan las cepas de Bacillus subtillis, Sacharomyces cerevisiae, y Escherichia coli
b. Hacer una suspensión del microorganismo que se va a trabajar en un tubo con agua destilada estéril
c. Colocar en una gradilla una serie de 4 tubos de caldo nutritivo con los diferentes pH
d. Marcar los tubos con el nombre de la cepa que se va a estudiar
e. Homogeneizar la suspensión e inocular con 0,1 ml cada uno de los tubos. Incubar los tubos a 35°C
para bacterias y a 28° C para levaduras durante 3 a 5 días.
f. Después de este tiempo observar presencia o ausencia de crecimiento según la turbidez para los
diferentes pH.
4.6. EFECTO DE LA PRESIÓN OSMÓTICA SOBRE EL CRECIMIENTO
a. Se emplearan las cepas de Bacillus subtillis, Sacharomyres cerevisiae, y Escherichia coli
b. Hacer una suspensión del microorganismo con el que se trabajará
c. Colocar en una gradilla una serie de tubos que contienen 5 ml de caldo nutritivo con diferentes
concentraciones de cloruro de sodio (0,85 %, 1, 3 y 5 %)
d. Homogeneizar la suspensión e inocular con 0,1 ml cada uno de los tubos.
e. Incubar las bacterias a 35°C y las levaduras a 28° C durante 24 h
f. Después de transcurrido este tiempo observar turbidez en los tubos problema.
4.7. METALES PESADOS
a. Humedecer los discos de papel filtro con los siguientes compuestos. AgNO3, HgCl2 , CuSO4 y CH 3
COOPb.
b. Sembrar masivamente una caja con agar nutritivo con el microorganismo que se ya a estudiar
109
c. Dividir la placa en 3 y anotar el nombre de la cepa así como con el metal correspondiente.
d. Esterilizar las pinzas de disección y tomar uno de los discos ya impregnado con el metal a estudiar, y
colocarla en el sitio correspondiente en la placa ya inoculada
e. Presionar ligeramente (con las pinzas) el disco de papel filtro e incubar a 35°C durante 24 h.
f. Observar el crecimiento de las cepas y medir el halo de inhibición con una regla graduada de cada
uno.
4.8. COMPUESTOS HALOGENADOS
a. Humedecer los discos de papel filtro con una solución de hipoclorito de sodio y de yodo
respectivamente
b. Sembrar masivamente una caja con agar nutritivo con el microorganismo que se va a estudiar
c. En condiciones de esterilidad colocar los discos en la caja ya inoculada
d. incubar las placas a 35°C durante 24 h.
e. observar el crecimiento y medir los halos de inhibición
4.9. EFECTO DE LA ACTIVIDAD DE ANTIBIÓTICOS SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO
a. Sembrar las placas de agar nutritivo masivamente con un hisopo estéril y con la cepa
correspondiente
b. Colocar un multidisco o discos individuales sobre las placas sembradas con las cepas.
Nota: Determinar el tipo de Gram que es si no se sabe hay que investigarlo para no colocar un
multidisco que no corresponda.
c. Presionar ligeramente cada disco sobre el cultivo con ayuda de pinzas de disección para poner en
contacto el antibiótico con la cepa
d. Incubar las placas a 35°C durante 24 h.
e. Después del tiempo de incubación medir el diámetro del los halos de inhibición del crecimiento
producido por cada antibiótico estudiado y anotar los resultados.
Diferentes formas de observar la sensibilidad a los antimicrobianos.
110
5. RESULTADOS
5. 1. EFECTO DE LA TEMPERATURA DE CULTIVO SOBRE EL CRECIMIENTO
Temperatura 5 °C 28 °C 37 °C 55°C
Turbidez (en cruces)
5.2. DETERMINACIÓN DEL PUNTO TÉRMICO MORTAL (PTM)
Temperatura 37 °C 50 °C 60 °C 70°C 80°C 92°C
Crecimiento en el tubo
(Cruces)
Crecimiento en la placa
111
5.3. DETERMINACIÓN DEL TIEMPO TÉRMICO MORTAL (TTM)
Temperatura 37 °C 50 °C 60 °C 70°C 80°C 92°C
(Cruces)
Crecimiento en la placa
5.4. PASTEURIZACIÓN
Determinación Leche en punto de venta Leche pasteurizada
UFC/mL UFC/mL
Organismos Mesofilicos
aerobios
Organismos coliformes
5.5. EFECTO DEL pH
Efecto del pH 3.5 5.0 7.0 9.0
(Cruces)
5.6. EFECTO DE LA PRESIÓN OSMÓTICA SOBRE EL CRECIMIENTO
Concentración de NaCl 1% 35 5%
(Cruces)
5.7. METALES PESADOS
Efecto del pH AgNO3 CuSO4 HgCl 2 CH 3-COOPb
Diámetro de inhibición
(mm)
5.8. COMPUESTOS HALOGENADOS O DESINFECTANTES
Halógeno o desinfectantes Cloro Yodo Benzal
(Cruces)
112
5.9. EFECTO DE LA ACTIVIDAD DE ANTIBIÓTICOS SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO

ANTIBIÓTICO Gram positivo Gram negativo
Nombre: ______ Nombre: ______
5.10 Cita tres ejemplos de microorganismos psicrofílicos, mesofílicos y termofílicos, indicando su

importancia.
5.11 Define el término termodúrico y menciona un ejemplo.
5.12.-Escribe correctamente el nombre de un microroganismos acidofilo, alcalinofilo y uno neutrofilo.
5.13 Explica brevemente que es el efecto bactericida, bacteriostático, fungicida y fungistático.
5.14 ¿Explica la diferencia como actúan los diferentes metales pesados utilizados en el laboratorio.
5.15 ¿Qué acción tiene los halógenos sobre el crecimiento celular?
5.16 ¿Qué aplicación tienen los factores ambientales en la industria alimentaria?
6.1 Basándose en los resultados anteriores y a la bibliografía consultada, analizar y discutir los
resultados obtenidos en esta práctica, haciendo énfasis en el efecto causado a nivel molecular de los
factores estudiados y la importancia práctica que tiene el conocer el efecto de estos mismos sobre los
microorganismos.
7.-CONCLUSIONES.
7.1 Elabora las conclusiones basándose en los resultados, al análisis y discusión que se hicieron de
estos, a la bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica.
8.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS RECOMENDADAS.
8.1 Brock, T.D, Biología de los microorganismos. 10a Edición, Pearson Prentice Hall. Madrid, España:
2004.
113
PRÁCTICA No. 10
MÉTODOS RÁPIDOS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
UNIDAD VIII: Microorganismos de importancia alimentaria
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general.
1.1.2 El alumno realizará pruebas de identificación rápida de microorganismos y grupos microbianos
de importancia alimentaria.
Al término de la sesión el alumno:
1.2.1 Practicará la identificación de microorganismos utilizando el sistema API
1.2.2 Practicará la identificación de grupos microbianos de importancia alimentaria utilizando las placas
Petrifilm
2. INTRODUCCIÓN
Los métodos tradicionales para la identificación de microorganismos se basan en la observación de los

cambios metabólicos que se producen durante el crecimiento, sin embargo estos métodos son costosos
y llevan mucho tiempo. Surge entonces la necesidad de obtener resultados rápidos y confiables, Los
nuevos avances tecnológicos han llevado a diseñar nuevas técnicas para el análisis microbiológico de
alimentos.
Los métodos rápidos y la automatización en microbiología es un campo de estudio que conjunta la

utilización de métodos microbiológicos, bioquímicos, fisiológicos, inmunológicos y serológicos para el
aislamiento más efectivo, la detección, caracterización y enumeración más rápida de microorganismos y
sus productos en muestras clínicas, ambientales o de alimentos.
Un método rápido es aquel que es más rápido, sencillo o confiable que lo convencional. Sin embargo,
siempre al hablar de metodologías rápidas estamos tratando subjetivamente, porque parten de un
cultivo aislado. Sin embargo, en lo que todos concuerdan es que estos métodos han revolucionado y lo
seguirán haciendo, la forma de realizar los análisis microbiológicos.
Las pruebas rápidas de identificación bioquímica están miniaturizadas y automatizadas, lo que hace al
análisis más rápido y económico. A la fecha muchas compañías comercializan sus propios sistemas
para la identificación rápida, generalmente estos sistemas están diseñados para ser usados en la
identificación de enterobacterias, ya que habitualmente son los agentes etiológicos de las infecciones
gastrointestinales. También están disponibles distintos kits para diversos grupos bacterianos e incluso
para especies únicas, por ejemplo, se han desarrollado kits que contienen una batería de pruebas para
Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Neisseria gonorhoeae, Haemophilus influenzae y
Mycobacterirum tuberculosis.
Los microorganismos patógenos deben ser aislados e identificados debido a que producen
enfermedades a cientos de personas, causando daños económicos a los productores de alimentos. Los
métodos de diagnóstico rápido dependen del crecimiento bacteriano, es decir que tienen que ser
aislados, para poder medir los cambios fisicoquímicos, resultado del crecimiento o actividad metabólica,
el fundamento es entonces el mismo tanto en el método tradicional como en los métodos rápidos.
Algunos ejemplos de bacterias productoras de enfermedad transmitidas por los alimentos son:
Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Escherichia coli (enteroinvasiva y
114
enterotoxigénica), Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Yersinia enterocolítica, Listeria

monocytogenes y Vibrio cholerae,
Algunos métodos rápidos utilizados para identificación de microorganismos son:
Sistemas de Cuantificación Microbiológica.
1.- Placa Petrifilm. Las placas Petrifilm ayudan a maximizar la productividad en el laboratorio. Estas
placas listas para usarse reducen el tiempo y optimizan el espacio.
2.- Sistema Protocol es un sistema modular que abarca desde un sistema para la cuenta de las
colonias, hasta el cálculo de las diluciones, pudiendo leer.
3.- Sistema Simplate. El sistema sirve para realizar recuento de organismos selectos: Cuenta total,
coliformes totales y fecales, Hongos, levaduras y Campylobacter.
Sistemas de Identificación Microbiana
1.- El sistema API. Los sistemas de identificación API comprende celdillas con 20 pruebas bioquímicas
en miniatura. Sistema Mirobac, también consiste de plaquitas con 16 pruebas bioquímicas. Ejemplos:
API 20E, API NFT, API Campy, API Listeria, API Staph, API NH, etc.
2.- El sistema REMEL N/F
3.- El sistema rapid NF PLUS
4.- El sistema Biolog. El sistema es capaz de identificar por encima de 1400 especies de bacterias
aerobias, anaerobias, hongos filamentosos y levaduras.
5.- El sistema VITEK. Sistema automático que identifica en 2 a 24 h y realiza también confirmación de
patógenos. Los equipos son expandibles con 32, 60, 120, 240 ó 480 exámenes y además realiza el
antibiograma y CMI.
6.- Los sistemas Microscan WALKAWAY-96 y 40
7.- El sistema sensititre AP80
8.- Detección de Salmonella por la técnica TECRA UNIQUE
9.- Detección de Vibrio cholerae por el método SMART
Sistemas de Identificación mediante Métodos Moleculares.
1.- Los sistemas BAX® utilizan el poder del PCR para lograr resultados rápidos y confiables. Cada
prueba está diseñada para amplificar un segmento de DNA específico de cada organismo, produciendo
en pocas horas niveles tales para ser detectados. Incluyen todos los primers requeridos, polimerasa y
nucleótidos en una pastilla única, empaquetada dentro del tubo de muestra, evitando errores de
manipulación
3. - The RiboPrinter® Microbial Characterization System. Este sistema detecta múltiples copias del gen
RNAr 16 s logrando la identificación de cualquier bacteria en menos de 8 horas.
Métodos inmunológicos para detección y/o cuantificación de microorganismos.
115
1.- VIDAS® y mini VIDAS. Emplea la tecnología ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) que utiliza el
principio de determinación que asocia el marcaje por una enzima y una medida por fluorescencia.
Ejemplo detección de Salmonella por el sistema VIDAS.
2.- Sistemas VIP. Es un ensayo de inmuno-precipitación, de fácil lectura y de alta reproducibilidad.
Dada la amplia diversidad de métodos, mencionaremos los más utilizados en el área de alimentos.
Placas Petrifilm. Las placas Petrifilm han respondido a las necesidades de la industria de alimentos y
bebidas con soluciones innovadoras para el laboratorio, constituyen un conjunto de placas listas para
usarse que están listas para usarse, y que están diseñadas para ahorrar tiempo, costos, espacio de
trabajo, incrementar la productividad, confiabilidad y eficiencia de las operaciones. Contrariamente a los
métodos tradicionales están listas para usarse y utilizar en forma directa para muestras de tipo
ambiental, son además de fácil uso e interpretación. Se requiere solo de 3 pasos: Inocular, las muestras
se inoculan fácilmente con placas Petrifilm. Incubar, se maximiza el uso de la incubadora con el diseño
de ahorro de espacio. Contar, el diseño de cuadrículas hace el conteo de las colonias rápido y fácil.
Las placas Petrifilm están disponibles para la mayoría de las necesidades de pruebas microbiológicas,
incluyendo:
1.- Cuenta Aerobia.
2.- Cuenta de Coliformes
3.- Cuenta de Escherichia coli /Coliformes
4.- Cuenta de Enterobacterias
5.- Cuenta de Alta Sensibilidad de Coliformes
6.- Cuenta Rápida de Coliformes
7.- Cuenta Rápida de Staphylococcus aureus
8.- Cuenta Express de Staphylococcus aureus
9.- Cuenta de Mohos y Levaduras
10.- Para monitoreo de Listeria en ambientes (incluye Listeria monocytogenes, L. innocua, L. grayi,
L. murrayi y L. welshimeri)
11.- Para muestreo ambiental y muestreo de superficies.
Las placas Petrifilm están recubiertas con nutrientes gelatinosos e indicadores especiales que tiñen a
las colonias, dándoles contraste para su fácil identificación, en general la placa Petrifilm consta de: a)
una base que contiene papel laminado con polietileno impreso con cuadricula, los nutrientes mezclados
con gel soluble en agua fría y adhesivo, b) una película de prolipropileno, un adhesivo con indicador, gel
soluble en agua fría.
Diferentes placas Petrifilm
El sistema API Es un método de identificación que combina una galería de reacciones bioquímicas, una
base de datos y un sistema automatizado de interpretación. El sistema API 20E, diseñado originalmente
para la identificación de la familia Enterobacteriaceae, ha sido ampliado para incluir bacilos no
fermentadores como el género Pseudomonas.
116
El API NFT, es utilizado ampliamente para identificar a los microorganismos no fermentadores. El

sistema API incluye todos los reactivos para la identificación, los cuales se encuentran listos para su uso
y para que podamos identificar a enterobacterias, no enterobacterias, Campylobacter, Staphylococcus,
Streptococcus, Lysteria, Neisseria, Haemophilus, levaduras, bacterias anaerobias estrictas, entre otros.
SISTEMA API 20E. Pruebas bioquímicas que incluye.
Prueba Reacción / Enzimas Negativo Positivo

ONPG beta-galactosidasa sin color amarillo
ADH arginina deshidrolasa amarillo rojo o naranja
LDC lisina descarboxilasa amarillo rojo o naranja
ODC ornitina descarboxilasa amarillo rojo o naranja
CIT utilización del citrato verde azul oscuro o turquesa
sin precipitado
H2S producción de H2S precipitado negro
negro
URE ureasa amarillo rojo o naranja
TDA triptófano desaminasa amarillo marrón-rojo
color rosa o anillo rosa-
IND producción de indol amarillo
rojo
producción de acetoína (Voges-
VP sin color rosa-rojo
Proskauer)
GEL gelatinasa sin difusión difusión de pigmento
GLU fermentación/oxidación de glucosa azul o verde amarillo
MAN fermentación/oxidación de manitol azul o verde amarillo
INO fermentación/oxidación de inositol azul o verde amarillo
SOR fermentación/oxidación de sorbitol azul o verde amarillo
RHA fermentación/oxidación de ramnosa azul o verde amarillo
SAC fermentación/oxidación de sacarosa azul o verde amarillo
MEL fermentación/oxidación de melobiosa azul o verde amarillo
AMY fermentación/oxidación de amigdalina azul o verde amarillo
ARA fermentación/oxidación de arabinosa azul o verde amarillo
OX citocromo oxidasa
3.-MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO

3.1. MATERIAL
Contador de colonias Portaobjetos y cubreobjetos
Mechero Gradilla metálica
Asa bacteriológica Tubos de ensaye
Incubadora a 37º C Frascos para dilución
Pipeta automática
3.2 REACTIVOS
Agua peptonada Placas Petrifilm para cuenta de organismos
coniformes
Tiras reactivas API 20E
Placas Petrifilm para cuenta de Escherichia coli
Placas Petrifilm para cuenta de aerobios
117
Solución salina Placas Petrifilm para cuenta de hongos y levaduras

● 3.3 CEPAS
*Escherichia coli Salmonella sp
3.4 MUESTRAS
Jugo de zanahoria, chocolate en polvo, harina, queso, jamón
Placas Petrifilm
INSTRUCCIONES
1.- La preparación de la muestra se realiza tal y como se indica en la técnica y las diluciones son la que
se elija el analista dependiendo del tipo de muestra.
2.- Para la inoculación levantar la superficie superior con cuidado y con la pipeta automática inocular 1
mL en el círculo delimitado.
3.- Con cuidado dejar caer la película superior evitando la formación de burbujas.
4.- Con el difusor, extender la muestra por toda la superficie delimitada presionando con precaución.
Esperar a que la muestra difunda por un minuto.
5.- Incubar a 35 ± 2 °C durante 24 horas
6.- Leer las placas Petrifilm con el contador de colonias o en forma visual.
RESULTADOS. (Interpretación de placas Petrifilm)
Placa de recuento aeróbico. Se presentan colonias rojas en la superficie de la placa, si el número es
mayor a 250 UFC, se procede a contar las colonias en 1 cm2 y multiplicar por 20 para obtener el número
total, esto es porque el área total de una placa es de 20 cm 2.
Placa para recuento de Coliformes. El indicador rojo en la placa colorea las colonias fermentadoras de
lactosa, la película superior atrapa el gas producido por los microorganismos coliformes.
Placa para recuento de Escherichia coli. Tiene el indicador β-glucoronidasa para la detección de
coniformes, en particular Escherichia coli. Las colonias de Escherichia coli producen la enzima
glucoronidasa, reaccionando con el indicador, lo que da como resultado un precipitado azul alrededor
de la colonia, muchas de ellas producen gas, quedando atrapado en la película. Las colonias que no
son de Escherichia coli muestran u color rojo.
Placa para recuento de Hongos y Levaduras. No se requiere de la adición de antibióticos o de ácido
tartárico. Este método requiere de la diferenciación de hongos y levaduras. Hongos: son colonias
filamentosas, difusas, el color es variable por los pigmentos, usualmente un “foco” en el centro de la
colonia. Levaduras: colonias pequeñas, bien definidas y de colores tenues. En el caso de tener cuentas
incontables, contar en 1 cm2 y multiplicar por 30.
Los tiempos de incubación y temperatura son similares a los métodos convencionales.
Sistema API E20
Los microorganismos deben ser aislados y después identificados, una vez aislados podemos medir
específicamente los cambios fisicoquímicos resultado del crecimiento o actividad metabólica, para ello
se han desarrollado diversos métodos debido a la necesidad de detectar a los microorganismos como
el sistema API
El APHI 20 E es un sistema estandarizado que permite la identificación de enterobacterias y otros
bacilos Gram negativos no exigentes, que incluyen 21 pruebas bioquímicas mimiaturizadas.
118
Principio: La galería del sistema APHI 20 E se compone de 20 microtubos que contiene los sustratos
deshidratados. Loa microtubos se inoculan con una suspensión bacteriana
Reactivos complementarios: API OF
Es un método de identificación que emplea reacciones bioquímicas y el que vamos a utilizar es el API
20 E y el API STAPH.
INSTRUCCIONES
1) Primero tenemos que aislar al microorganismo en medios selectivos, posteriormente colocarla en un
caldo nutritivo o en una placa de agar de soya y tripticaseína, de tal forma que el cultivo sea de 18 h.
2) Sacar la tira API (galería) que contiene las siguientes pruebas ONPG, ADH, LDC, ODC, CIT, H2S,
URE, TDA, IND, VP, GEL, GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY y ARA.
3) Preparación de la galería: Reunir fondo y tapa de una cámara de incubación y repartir
aproximadamente 5 ml de agua destilada en los alveolos para crqar una atmosfera humeda. Etiquetar
en la lengüeta lateral.
4) Sacar la galería de su envase y colocarla en la cámara de incubación
5) Preparación del inoculo Preparar la suspensión microbiana en 5 ml de solución salina fisiológica y
a una turbidez del nefelómetro de Mac Farland de 2.
6) Inoculación de la galería. Introducir la suspensión bacteriana en los tubos de la galería con la ayuda
de una pipeta, evitando la formación de burbujas en el fondo de los tubos.
7) Para las pruebas: llenar el tubo y la cúpula

8) Para las pruebas: ADH LCD ODC H2S y URE crear una atmosfera anaerobia llenando la cúpula con
aceite de parafina.
9) Cerrar la cámara de incubación
10) Incubar 36 h ± 2 °C durante 18-24h.+
Lectura de interpretación:
11) Prueba de TDA, agregar una gota de reactivo TDA. Un color marrón rojizo indica una reacción (+)
12) Prueba de IND: agregar una dota del reactivo JAMES. Un color rosado que se disemina en toda la
cúpula indica una reacción (+)
13) Prueba de VP2 esperar un minuto de 10 minutos un color rosa o rojo indica una reacción (+), una
débil coloración rosa que aparece después de 10 minutos en (-).
14) Interpretación: Determinar el perfil numérico, donde las pruebas están separadas en grupos de 3,
como la galería API 20 E se compone de 20 ensayos sumar al interior de cada grupo los valores que
corresponden a las reacciones positivas y se obtiene el bionúmero de 7 cifras.
15) Identificación: se realiza a partir de la base de datos y se obtiene con el software de
identificación.
16) En algunas ocasiones es necesario la realización de pruebas adicionales como la reducción de
Nitratos a nitritos, para ello añadir una gota de los reactivos NIT 1 y Nit 2 en el tubo de GLU, esperar de
2 a 5 minutos y una coloración roja indica una reacción (+)
17) Control de calidad 1 Proteus mirabilis 2.- E. coli
119
ONPG ADH LCD ODC H2s URE TDA IND GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA NO2 N2
- - - + v + + + - - v + - - - - v - - - + -
+ - + + - - - - + - - + + - + + - + - + + -
Tabla de lectura
Prueba Componerntes activos Cantidad Reacciones-enzimas Resultados

Negativo positivo
ONPG 2 nitro fenilβD- 0.223 Β galactyosidasa (Orto Nitrofenil Incoloro Amarillo (1)
galactopiranosido βD galactopiranosido
ADH L-arginina 1.9 Arginina DiHidrolasa Amarillo Anaranjado(2)
LCD L- lisina 1.9 Lisina Descarboxilasa Amarillo Anaranjado
ODC L- ornitina 1.9 Ornitina DesCarboxilasa Amarillo Anaranjado (2)
CIT Citrato de sodio 0.756 Utilización del CITrato Verde palido- amarillo Azul-verde azu (3)l
H2S Tiosulfato de sodio 0.075 Producción de H2S Incoloro grisáceo Depósito negro
URE urea 0.76 UREasa Amarillo Rojo anaranjado(2)
TDA L- triptófano 0.38 Triptofano DesAminasa amarillo Marrón rojizo
IND L-triptófano 0.19 Producción de InDol Verde pálido amarillo rosa
VP Piruvato de sodio 1.9 Producción de acetoina Rosa pálido Rosa –rojo(5)
GEL Gelatina bovina 0.6 GELatinasa No difusión Difusión del pigmento negro
GLU D- glucosa 1,9 GLUcosa Oxidación- Azul-azul verdoso Amarillo/amarillo
fermentación
MAN D-manitol 1.9 MANitol Fermentación- Azul-azul verdoso amarillo
Oxidación
INO Inositol 1.9 Fermentación-Oxidación Azul-azul verdoso amarillo
INOsitol
SOR D-sorbitol 1.9 Fermentación-Oxidación Azul-azul verdoso amarillo
SORbitol
RHA L-rammnosa 1.9 Fermentación Oxidación Azul-azul verdoso amarillo
RHAmnosa
SAC D-sacarosa 1.9 Fermentación-Oxidación Azul-azul verdoso amarillo
SACarosa
MEL D-Melobiosa 1.9 Ferm,entación-oxidación Azul-azul verdoso amarillo
MELobiosa
AMY Amigdalina 0.57 AMYgdalina Fermentación – Azul-azul verdoso amarillo
Oxidación
ARA L-arabinosa 1.9 ARAbinosa Fermentación Azul-azul verdoso amarillo
Oxidación
1.- La aparición de un color amarillo ligero implica un resultado +

2.- La aparición de un color naranja tras 36 h de incubación debe considerarse negativa
3.- Lectura en la cúpula (zona aerobia)
4.- La fermentación comienza en la parte inferior de los tubos, mientras que la oxidación empieza en
la cúpula
5.- Una ligera coloración rosa, que aparece tras 10 minutos debe ser leída como negativa
120
INSTRUCCIONES
1.- De la suspensión bacteriana, inocular las tiras API proporcionadas
3.- Sacar la tira API que contiene las siguientes pruebas ONPG, ADH, LDC, ODC, CIT. H2 S, URE, TDA,
IND, VP, GEL, GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY Y ARA.
4.- Para la inoculación de los pozos se llenan de diferente forma, el CIT, VP Y GEL, se llenan
completamente, lo que están subrayados se llenan solo la base y se le adiciona una gota de aceite
mineral y los que no lo están se llena únicamente la base.
5.- En la base de la tira API se colocan 10 mL de agua destilada para que el sistema este húmedo.
6.- Incubar a 35 ± 2 o C durante 24 horas.
7.- Después de la incubación, leer los resultados adicionando los reactivos correspondientes.
5. RESULTADOS
En base a los resultados obtenidos en las placas Petrifilm, anota el alimento, el grupo bacteriano
encontrado y la cuenta que realizaste.
Alimento Cuenta total aerobia Organismos Escherichia coli Mohos y Levaduras
Coliformes
OMA
Con base a los resultados obtenidos en el sistema API E20, verifica que se trata de la cepa
proporcionada comparando con las tablas de pruebas bioquímicas.
Prueba Resultado Prueba Resultado
ONPG GLU
ADH MAN
LDC INO
ODC SOR
CIT RHA
H2S SAC
URE MEL
TDA AMY
IND ARA
VP OX
GEL
Cepa identificada_____________________________
121
5.1.- Investiga cómo se utilizan las placas Petrifilm para muestreo ambiental y de superficies
5.2.- ¿Qué otros métodos rápidos conoces?
5.3.- ¿Qué muestras se pueden manejar con las placas Petrifilm?
5.4.- ¿Qué método elegirías para trabajar si tuvieras una demanda grande de trabajo, pero también
tienes que cumplir con las normas establecidas?
5.5- ¿Qué enzima se detecta al hacer la cuantificación de Escherichia coli?
6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS.
6.1 Discutir las ventajas y desventajas de cada una de los métodos utilizados, en comparación con los
métodos convencionales.
7. CONCLUSIONES.
7.1 Elabora tus conclusiones tomando en cuenta los objetivos de la práctica, los resultados y la
bibliografía consultada.
http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/LabV/API/api.html
http://cms.3m.com/cms/MX/es/0-253/kReiiFN/view.jhtml
8. BIBLIOGRAFIA.
Brock,T.D.; Smith y M.T. Madigan. Biología de los Microorganismos. 8ª. Edición. Prentice- Hall. España.
956 págs.
Koneman, E.W. y S.D. Allen, W. R. Bocuell. Diagnóstico Microbiológico. 5ª edición Médica
Panamericana. 2001. México. 1432 págs.
122
AGARES
1. AGAR BACTERIOLÓGICO
El agar bacteriológico Bioxon se usa en la preparación de medios de cultivo microbiológicos sólidos y
semisólidos. También puede utilizarse en concentraciones menores como retardante de la
penetración del oxígeno en medios líquidos, la cantidad utilizada es de 15 g/l
2. AGAR NUTRITIVO
Fórmula en g/l de agua destilada:
Peptona de gelatina 5g
Extracto de carne de res 3 g
Agar 15 g
pH final = 6,8 0,2
Método de preparación:
Suspender 23 g de polvo en un litro de agua destilada. Mezclar bien y dejar en reposo por 15
minutos. Calentar a ebullición de 1 a 2 minutos. Distribuir y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos.
Determinar la funcionalidad del medio de cultivo con microorganismos típicos.
3. AGAR PARA MÉTODOS ESTÁNDAR
Peptona de caseína 5g
Extracto de levadura 2.5 g
Glucosa 1g
Agar 15 g
pH final = 7,0 0,1
Suspender 23,5 g de polvo en un litro de agua destilada. Disolver al calor y esterilizar a 121 °C
durante 15 minutos, vaciar en placas estériles
4. AGAR CITRATO DE SIMMONS
Fosfato dehidrogenado de amonio 1,0 g
Fosfato dipotásico 1,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Citrato de sodio 2,0 g
Sulfato de magnesio 0,2 g
Agar 15,0 g
Azul bromotimol 0,06 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 6,9 ± 0,2
Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, dejar remojar durante 5 a 10 minutos. Mezclar
bien y calentar agitando frecuentemente hasta ebullición y completa disolución. Distribuir volúmenes
de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Los tubos se dejan enfriar
en posición inclinada de manera que el medio de cultivo en el fondo del tubo alcance una profundidad
de 1 a 1,5 cm. Se puede emplear también como medio en placas.
5. AGAR DE HIERRO TRIPLE AZÚCAR
123
Mezcla de peptonas 20,0 g

Lactosa 10,0 g
Sacarosa 10,0 g
Dextrosa 1,0 g
Sulfato de amonio férrico 0,2 g
Rojo fenol 0,025 g
Agar 13,0 g
Tiosulfato de sodio 0,2 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 7,3 ± 0,2
Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando
frecuentemente hasta ebullición y completa disolución. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar
a 118ºC durante 15 minutos. Los tubos se deben enfriar en posición inclinada de manera que el
medio de cultivo en el fondo del tubo alcance una profundidad de 1,5 a 2,0 cm.
6. AGAR HIERRO Y LISINA (LIA)
Extracto de levadura 3g
Glucosa 1g
L-lisina 10 g
Citrato férrico de amonio 0,5 g
Púrpura de bromocresol 0,02 g
Agar 13,5 g
pH final = 6,7 0,2
Suspender 33 g de polvo en un litro de agua destilada. Calentar agitando con frecuencia hasta el
punto de ebullición para disolver el medio por completo. Distribuir 5 ml en tubos de 13 X 1000 mm y
esterilizar a 121 °C durante 15 minutos. Dejar enfriar en posición inclinada.
7. AGAR EMB (AGAR EOSINA AZUL DE METILENO)
Digerido pancreático de gelatina 10,0 g
Fosfato dibásico de potasio 2,0 g
Agar 15,0 g
Lactosa 10,0 g
Eosina "Y" 0,4 g
Azul de metileno (Metiltionina) 0,065 g
Agua 1 000,0 ml
pH después de esterilizar 7,1 ± 0,2
Disolver el digerido pancreático de gelatina, el fosfato dibásico de potasio y el agar en el agua.
Esterilizar, dejar enfriar y antes de utilizar, agregar las siguientes soluciones a cada 100 ml de agar
líquido: 5 ml de solución 1:5 de lactosa, 2 ml de solución 1:50 de eosina "Y" y 2 m l de solución 1:300
de azul de metileno. Mezclar.
8. AGAR PDA (AGAR DE PAPA Y DEXTROSA)
Infusión de papa (sólidos) 4 g
124
Dextrosa 20 g
Agar 15 g
pH final = 5,6 0,1
Suspender 39 g del polvo en un litro de agua destilada. Mezclar perfectamente, calentar con agitación
frecuente y hervir durante un minuto hasta disolución completa, distribuir y esterilizar a 121 °C
durante 15 minutos.
9. AGAR LISINA HIERRO
Peptona de gelatina 5,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Dextrosa 1,0 g
L-lisina 10,0 g
Citrato férrico-amónico 0,5 g
Trisulfato de sodio (anhidro) 0,04 g
Púrpura de bromocresol 0,02 g
Agar 15,0 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 6,7 ± 0,2
Suspender el medio deshidratado, remojar unos 15 minutos, calentar para disolver los ingredientes
agitando con frecuencia y hervir durante un minuto o hasta disolución completa. Distribuir en
porciones de 4 ml en tubos con tapón de rosca de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave 12 minutos a
121ºC. Dejar solidificar en posición inclinada a tener 4 cm de un extremo y 2,5 cm sesgado. Cerrar
con cuidado las tapas a fin de evitar pérdidas de agua por evaporación.
125
CALDOS
1. CALDO ROJO DE METILO Y VOGUES PROSKAUER (RM-VP)
Peptona especial No. 1 7,0 g
Dextrosa 5,0 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 6,9 ± 0,2
Disolver el medio deshidratado en un litro de agua, mezclar bien, si es necesario calentar un poco
hasta disolución total. Distribuir y esterilizar a 121ºC durante 15 minutos.
2. CALDO NUTRITIVO
Extracto de carne de res 3g
pH final = 6,9 0,2
Suspender el almidón en 100 ml de agua destilada. Disolver los demás ingredientes en 900 ml de
agua destilada con calentamiento y agitación continua, mezclar ambas suspensiones y esterilizar a
115 °C por 15 minutos en autoclave.
3. CALDO DE MALONATO DE EWING MODIFICADO
Formula en g/l de agua destilada:
Extracto de levadura 1g
Sulfato de amonio 2g
Fosfato monopotásico 0,4 g
Cloruro de sodio 2g
Malonato de sodio 3g
Dextrosa 0,25 g
Azul de bromotimol 0,025 g
pH final = 6,7 0,2
Disolver 9,3 g de polvo en un litro de agua destilada. Distribuir en tubos de ensaye adecuado y
esterilizar en autoclave a 121° C durante 15 minutos.
4. CALDO DE INFUSIÓN DE CEREBRO Y CORAZÓN
Infusión de cerebro de ternera200 g
Infusión de corazón de res 250 g
Peptona de gelatina 10 g
Cloruro de sodio 5g
Fosfato disódico 2,5 g
Dextrosa 2g
pH final = 7,4 0,2
Disolver 37 g de polvo en un litro de agua destilada. Si es necesario calentar suavemente para
disolverlo.
126
Distribuir y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos, para obtener buenos resultados el medio debe
utilizarse el mismo día de su preparación.
5. CALDO ROJO DE FENOL CON LACTOSA
Peptona de caseína 10 g
Cloruro de sodio 5g
Rojo de fenol 0,018 g
Lactosa 5g
pH final = 7,4 0,2
Disolver 20 g de polvo en un litro de agua destilada. Mezclar y calentar frecuentemente hasta su
ebullición y completa disolución. Distribuir y esterilizar en autoclave de 116 a 118 °C durante 15
minutos.
6. CALDO UREA
Urea 20 g
pH final = 6,8 0,2
Disolver 3,87 g en 100 ml de agua destilada. Esterilizar por filtración. Distribuir en cantidades de 0,1 a
1 ml en tubo estériles. En lugar de esterilizarse por filtración puede esterilizarse en autoclave a 108 °C
de 7 a 10 minutos.
7. CALDO NITRATO
Nitrato de potasio 1g
pH final = 7,0 0,2
Pesar exactamente las cantidades, rehidratar con agua destilada y calentar suavemente hasta
disolución total. Distribuir 5 ml en tubos de 13 X 100.y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos.
8. CALDO KCN
MEDIO BÁSICO
Peptona 3g
Cloruro de sodio 5g
Fosfato de potasio monobásico (KH2 PO4) 0,225 g
Fosfato dibásico de sodio (Na2 HPO4.2H2O) 5,64 g
pH final = 7,6 0,2
Pesar exactamente las cantidades y rehidratar con agua destilada, calentar suavemente si es
necesario hasta su disolución. Distribuir 5 ml en tubos de 13 X 100 mm con tapón de rosca y
127
esterilizar a 121 °C durante 15 minutos.

CIANURO DE POTASIO
Preparar un tubo con tapón de rosca, estéril
KCN 0.5 g
No absorber la solución de KCN con la pipeta por la boca, usar una pipeta de jeringa o bulbo. El
cianuro es sumamente venenoso y puede causar la muerte.
A los 5 ml del medio básico frió agregar 1 ml de KCN al 0,5 % utilizando una pipeta de bulbo y
mezclar bien.
9. MEDIO ROJO DE METILO VOGES PROSKAUER
Peptona especial No. 1 7,0 g
Dextrosa 5,0 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 6,9 ± 0,2
Disolver el medio deshidratado en un litro de agua, mezclar bien, si es necesario calentar un poco
hasta disolución total. Distribuir y esterilizar a 121ºC durante 15 minutos
10. CALDO UREA
Urea 20,0 g
Fosfato de sodio 9,5 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 6,8 ± 0,2
Disolver 38,61 g en 1 000 ml de agua, calentando en caso necesario a 60ºC como máximo. Esterilizar
por filtración o tras distribución a razón de 3 ml por tubo; o bien esterilizar con cuidado en marmita de
vapor durante 5 minutos. No esterilizar en autoclave.
128
MEDIOS SEMISÓLIDOS
1. MEDIO PARA PRUEBA DE MOVILIDAD (SIM)
Medio SIM
Peptona de caseína 20,0 g
Peptona de carne 6,1 g
Sulfato de hierro y amonio 0,2 g
Agar 3,5 g
Agua 1000,0 ml
pH final 7,3 ± 0,2
Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, agitando frecuentemente. Remojar durante 10
minutos y hervir a ebullición durante un minuto. Distribuir en tubos de ensayo a una altura de unos 4
cm y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
2. MEDIO BASAL OF o MEDIO DE HUGH Y LEIFSON
Peptona Caseína 2,0 g
Azul bromotimol 0,03 g
Agar 2,5 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 7,1 ± 0,2
Suspender el medio deshidratado en un litro de agua, remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando
con frecuencia, hasta disolver el agar. Agregar 10 ml de solución de glucosa al 10% esterilizada por
filtración (o del azúcar apropiado) por cada 100 ml del medio fluido, mezclar y distribuir asépticamente
5 ml en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave a 118°C durante 10 minutos a fin de evitar la
degradación del azúcar. El medio tiene un color verde.
3. MEDIO INDOL ORNITINA (MIO)
Peptona 10,0 g
Triptona 10,0 g
L-ornitina 5,0 g
Dextrosa 1,0 g
Agar 2,0 g
Bromocresol púrpura 0,02 g
Agua 1 000,0 ml
pH final 6,5 ± 0,2
Disolver el medio deshidratado en un litro de agua, remojar unos 5 minutos, calentar a ebullición.
Distribuir porciones de 4 ml en tubos de 10 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15
minutos.
4. GELATINA NUTRITIVA
Gelatina 120 g
129
pH final = 6,8 0,2

Suspender 128 g de polvo en un litro de agua destilada. Calentar ligeramente para disolver y distribuir
en tubos. Esterilizar a 121 °C durante 15 minutos.
130
SOLUCIONES Y REACTIVOS
1. Aceite mineral
Envasar y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
2. Solución de rojo de metilo
Formula:
Rojo de metilo 0.1 g
Alcohol etílico 300 ml
Disolver el rojo de metilo en el alcohol y diluir con el agua destilada, para llevar a cabo la prueba,
añadir 5 gotas de la solución a 5 ml del cultivo problema.
Resultados: Un color rojo demuestra un pH menor a 4,5 y la prueba es Positiva. Un color amarillo se
reporta como prueba Negativa.
3. Solución de ácido tartárico al 10% p/v
Formula:
Acido tartárico 10,0 g
Agua c.b.p. 100,0 ml
Disolver el ácido tartárico en 50 ml de agua, aforar a 100 ml, envasar y esterilizar por filtración por
membrana
4. Solución de -Naftil amina
Fórmula:
Dimetil alfa naftil amina 5,0 g
Ácido acético 5 N 1,0
5. SOLUCIÓN DE HIDRÓXIDO DE POTASIO AL 40 %
Fórmula:
Hidróxido de potasio 40 g
6. SOLUCIÓN DE ALFA NAFTOL
Fórmula:
Alfa naftol 5g
Etanol 100 ml
8) Reactivo de Kovacs y Ehrlich
Para-dimetil-amino-benzaldehído 5,0 g
Alcohol amílico o butílico 75,0 ml
Acido clorhídrico (37%) QP 25,0 ml
Disuelva el para-dimetil-amino-benzaldehído en el alcohol. Caliente suavemente la solución en un
baño de agua tibia. Una vez disueltos los ingredientes, agregue el ácido clorhídrico con cuidado.
9) Prueba de Vogues Proskauer
Esta prueba es para comprobar la presencia del diacetilo.
Formula:
Alfa naftol 5g
Alcohol etílico absoluto 100 ml
131
Añadir 0,6 ml de la solución de alfa naftol y 0,2 ml de una solución acuosa al 40% de KOH a 1 ml de
cultivo.
Resultados: El desarrollo de una coloración roja en 15 minutos constituye una reacción Positiva.
10) Reacción de Indol (reactivo de Kovac)
Formula:
P-dimetilaminobenzaldehído 5,0 g
Alcohol amílico.o alcohol isoamílico750 ml
Acido clorhídrico concentrado 25 ml
Disolver el p-dimetilaminobenzaldehído en el alcohol amílico y agregar el ácido clorhídrico
lentamente, gota a gota y agitando. Debe conservarse en frasco ámbar con tapón esmerilado; el
color del reactivo va del amarillo al café claro. Se debe conservar a 4 ºC.
Disolver los ingredientes en agua destilada. Mezclar bien y calentar a ebullición, agitando
ocasionalmente hasta completa disolución. Enfriar a 60 ºC y ajuste el pH de 7,3 ± 0,1.
11) Solución de ácido sulfanilico
Formula:
Ácido sulfanílico 8,0 g
Ácido acético 5N
(Una parte de ácido acético glacial a 2.5 partes de agua) 1,0 L
12) Solución de agua oxigenada 1:10
Preparación:
Preparar momentos antes de usarla. Colocar 1 ml en 9 ml de agua destilada.
13) Solución de telurito de potasio al 1% p/v
Telurito de potasio 1,0 g
Disolver el telurito en 50 ml de agua, aforar a 100 ml, envasar y esterilizar por filtración por
membrana.
14) Solución salina al 0,85%
Agua c.b.p. 1 000,0 ml
Disolver el cloruro de sodio en 500 ml de agua, aforar a 1 000 ml, ajustar el pH a 7,2 ± 0,1 filtrar,
envasar y esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
15) Solución de agua oxigenada al 3% v/v
Peróxido de Hidrógeno 3,0 ml
Mezclar el peróxido en agua, aforar a 100 ml y envasar.
16) Solución indicadora rojo de metilo
Rojo de metilo 0,1 g
Alcohol al 95% 300,0 ml
Mezclar el rojo de metilo en el alcohol y diluir con agua a 500 ml.
132
17) Solución yodo-yodurada

Yoduro de potasio 2,0 g
Yodo 1,0 g
Agua 100,0 ml
Triturar en un mortero el yodo y el yoduro de potasio, adicionar el agua necesaria para que se
disuelva el yodo, agregar agua hasta un volumen de 100 ml. Conservar protegido de la luz.
18) Solución safranina
Safranina "O" 2,5 g
Alcohol etílico al 95% 100,0 ml
Disolver la safranina "O" en el alcohol etílico.Tomar 10 ml de esta solución y llevar a 100 ml con
agua. Agitar.
19) Solución alcohol-acetona
Partes iguales de acetona y alcohol etílico al 95%.
20) Reactivo de Ehrlich
Fórmula:
Para-dimetil amino benzaldehído 2g
Alcohol etílico absoluto 190 ml
Ácido clorhídrico concentrado40 ml
133
COLORANTES, DECOLORANTES Y MORDENTE

1) Cristal violeta
Formulación en g/100 ml:
Cristal violeta 2
Agua destilada 80
Etanol al 95% 20
Oxalato de amonio 0,8
Preparación:
Disolver el cristal violeta en 20 ml de etanol al 95%. Posteriormente disolver 0,8 g de oxalato de
amonio en 80 ml de agua. Una vez terminadas las soluciones mezclarlas.
2) Yodo (lugol-Mordente)
Yoduro de potasio 2
Yodo 1
Agua destilada 100
Preparación:
Disolver 2 gramos de yoduro de potasio en agua destilada. Agregar el gramo de yodo metálico y
disolver. Aforar a 100 ml con agua destilada y colocarlo en un frasco ámbar.
3) Alcohol cetona
Acetona 50
Alcohol etílico 100
Preparación:
Adicionar lentamente el alcohol etílico a la acetona y mezclar con cuidado. Guardar en frasco
herméticamente cerrado, hasta su uso.
4) Safranina
Agua destilada 100
Safranina 0,5
Preparación:
Disolver los 0,5 g de safranina en 20 ml de agua destilada. Después aforar a 100 ml con agua
destilada.
5) Fucsina fenicada
Formulación:
Solución A
Fucsina básica 0,3
Alcohol etílico al 95% 10
Mezclar hasta disolución completa
Solución B
Cristales de fenol 5
Agua destilada 95
Preparación:
Combinar las dos soluciones A y B. Filtrar a través de un papel filtro Whatman No 2. Mantener la
solución en un frasco ámbar, protegida de la luz y filtrar nuevamente si es necesario.
6) Azul de metileno
Formulación:
Azul de Metileno 1g
134

Preparación:
Disolver el gramo de azul de metileno en los 100 ml. de agua destilada.
7) Verde de malaquita
Formulación:
Verde de malaquita 10 g
Preparación:
Disolver el colorante en el agua. Filtrar a través de papel filtro Whatman No. 2. Guardar el colorante
en frasco ámbar.
135
ESTÁNDARES NEFELOMÉTRICOS DE McFARLAND
1.- Preparación de estándares: Sulfato de bario

Reactivos:
BaCl2, solución acuosa al 1 %
H2SO4 QP al 1 %
BaCl2, + H2SO4 BaSO4 + 2 HCl
2.- Preparar 10 tubos nuevos con tapa de rosca de igual tamaño, mismos diámetro, limpios y
enjuagados con agua destilada.
3.- Agregar los reactivos a los tubos rotulados de la siguiente manera en las cantidades que se indican a
continuación:
Estándares de sulfato de bario
Tubo número 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
BaCl2, al 1 % (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
H2SO4 al 1% (ml) 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9,0
Densidad aprox. De 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
células (X 108/ml)
Densidad aprox. de 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000
células en millones /ml
4.- Tapar los tubos y rotulas

5.- El precipitado de BaSO4 suspendido corresponde aproximadamente a la densidad de células
homogéneas de E. coli por ml.
Precauciones:
Si el caldo de cultivo es claro, o si es coloreado.
136

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Manual de microbiología UPIBI_IPN

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS

Refugia Pérez Sánchez

NOMBRE DEL ALUMNO: ________________________________________________________

PROFESOR DE TEORÍA: ________________________________________________________

PROFESORES DE LABORATORIO: _______________________________________________

PERIODO LECTIVO: ____________________________________________________________

Instrucciones generales _____________________________________________________________ 4

Practica No. 1 Microscopia __________________________________________________________ 9

Practica No. 2 Preparaciones fijas y en fresco ____________________________________________ 16

Practica No. 3 Métodos de esterilización y reducción de la carga microbiana ___________________ 23

Practica No. 4 Nutrición y cultivo de microorganismos aeróbicos ____________________________ 31

Practica No. 5 Aislamiento y recuento de microorganismos aeróbicos________________________ 46

Practica No. 6 Conservación de microorganismos_________________________________________ 52

Practica No. 7 Identificación de microorganismos (bacterias)________________________________ 63

Practica No. 7 Identificación de microorganismos (mohos y levaduras)________________________ 83

Practica No. 8 Crecimiento microbiano _________________________________________________ 95

Practica No. 10 Métodos rápidos para la identificación de microorganismos____________________113

Medios semisólidos________________________________________________________________ 128

Soluciones y reactivos _____________________________________________________________ 130

Colorantes, decolorantes y mordente_________________________________________________ 133

Nefelómetro de McFarland________________________________________________________ 135

Una bata limpia y con botones Una fotografía tamaño infantil

Un rollo de Masking tape Una regla graduada

Por sección se deberá traer un candado Una caja de cubreobjetos

III.- DEL HORARIO Y COMPORTAMIENTO DE LOS ALUMNOS.

8.- Evitar desplazarse en el laboratorio.

El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño. Es el

Función básica de cada parte del microscopio:

a.- Sistema mecánico

b.- Sistema de iluminación

Tabla 1. Correspondencia entre los

aumentos que tiene el objetivo con el que se está observando.

Microscopio de contraste de fase

Microscopio compuesto Preparaciones fijas de bacterias

4.1 Cuidado y limpieza del microscopio

Pasos a seguir para la iluminación de Köhler en un microscopio

5- Subir completamente el condensador con la 6.- Enfocar la preparación con el objetivo 4X

4.3 OBSERVACIONES DE UNA PREPARACIÓN FIJA.

a) Tomar una preparación y enfocarla a 10 y 40 X.

5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO

Esquematiza la preparación observada a 40 y 100X, anota el nombre de la muestra (etiqueta):

5.1 Consulta la bibliografía y llena la siguiente tabla

Parte del microscopio Función Sistema al que pertenece

Portaobjetos Frasco gotero con solución de cristal violeta

Staphylococcus aureus Rhizopus sp

3.3 MUESTRA BIOLÓGICA

a. Si se proporciona un tubo con una suspensión bacteriana, entonces encender el mechero.

4.2 Examen en fresco de una muestra de agua estancada

a. Colocar una gota del colorante azul de algodón lactofenol

e. Lavar los frotis con agua de la llave.

5.3 Tinción simple

5.4 Tinción de Gram:

Escherichia coli Escherichia coli Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus

Micrococcus luteus Micrococcus luteus Bacillus subtilis Bacillus subtilis

5.5 Tinción de Gram (con exceso de decoloración)

5.6 Tinción de Gram (mezcla de un Gram + y un Gram -)

Aumento real (40X) _______ (100X) _______

5.8 Tinción de Shaeffer - Fulton

(problema y testigo positivo) y se coloca en un recipiente que se va a esterilizar en la forma habitual.

Autoclave a 121° C Incubadora a 35° C

cm para envolver pinza o tijera Cuatro cajas de Petri limpias

Aumento real (40X) _ (100X) _