Manual Tecnicas MB

Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL
INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS

ACADEMIA DE MICROBIOLOGÍA
MANUAL DE LABORATORIO DE TÉCNICAS

MICROBIOLÓGICAS
PRIMERA EDICIÓN ELABORADO POR:

REFUGIA PÉREZ SÁNCHEZ
MIRIAM JUÁREZ JÚAREZ
LEONOR PATRICIA RODRÍGUEZ PASCUAL
SEGUNDA EDICIÓN ELABORADA POR:

Refugia Pérez Sánchez
Agosto del 2019
1
NOMBRE DEL ALUMNO: ________________________________________________________
PROFESORES DE LABORATORIO: _______________________________________________
________________________________________________
________________________________________________
GRUPO: _____________________
PERIODO LECTIVO: ____________________________________________________________
CARRERA: ___________________________________________________________________
2
ÍNDICE
Índice __________________________________________________________________________________ 3
Instrucciones generales ____________________________________________________________________ 4
Práctica No. 1 Microscopia _________________________________________________________________ 11
Práctica No. 2 Preparaciones fijas y en fresco__________________________________________________ 19
Práctica No. 3 Esterilización de material para microbiología________________________________________ 32
Práctica No. 4 Nutrición y cultivo de microorganismos aeróbicos____________________________________ 41
Práctica No. 5 Aislamiento y recuento de microorganismos aerobios_________________________________ 58
Práctica No. 6 Conservación de microorganismos________________________________________________ 65
Práctica No. 7 Crecimiento microbiano________________________________________________________ 75
Práctica No. 8 Producción de ácido láctico_____________________________________________________ 83
Práctica No. 9 Cuantificación de microorganismos coliformes por la técnica del número más probable (NMP) 88
Práctica No. 10 Identificación de bacterias aeróbicas_____________________________________________ 95
Práctica No. 11 Identificación de mohos y levaduras _____________________________________________116
Práctica No. 12 Efecto de los factores fisicoquímicos sobre el crecimiento microbiano __________________ 128
Apendice_______________________________________________________________________________135
Bibliografía _____________________________________________________________________________ 152
3
INSTRUCCIONES GENERALES
I.- EVALUACIÓN
1.- El laboratorio representa el 100% del curso total y cada práctica se evalúa de la siguiente
forma:
Trabajo experimental 20%
Actividad previa 10%
Examen escrito de conocimientos 10%
Discusión de la práctica 20%
Examen práctico 20%
1. Objetivos 2.0%
2. Resultados y Análisis de resultados: 3.0%
Reporte de la práctica 20% 3. Discusión: 10%
4. Conclusiones: 3.0%
5. Bibliografía: 2.0 %
2.- Para aprobar el curso de laboratorio se requiere haber asistido al 80% de las sesiones prácticas,
aprobar el 80% de las prácticas efectuadas y obtener un promedio mínimo de seis.
3.- La calificación del trabajo práctico se obtendrá promediando las sesiones de las que conste la
práctica. Si el alumno no cumple en alguna de las tres etapas, se le calificará con cero en la parte
correspondiente.
4.- La calificación de laboratorio se obtendrá por cada departamental
5.- Si un alumno no asiste a una sesión tendrá cero en trabajo práctico, si la justifica se mantiene la
calificación, pero no se cuenta la falta para el cómputo final de asistencias.
6.- Se elige un reporte al azar de cada equipo, revisando que todos los alumnos miembros del equipo
lo hayan elaborado. Si no es así, el alumno que no lo presentó tendrá cero y para acreditar el
laboratorio deberá entregar el 80 % de prácticas
7.- Cuando a un equipo le toque preparar los materiales para utilizarse en la práctica o bien la
esterilización de material limpio y /o sucio y no lo realice, tendrá un punto menos en su evaluación de
trabajo de la práctica correspondiente.
Al final del curso los alumnos limpian y entregan su gaveta, el alumno que no realice esta actividad
tendrá un punto menos en su evaluación del tercer departamental.
8.- Cada sección conformada de cinco equipos, deberá traer un candado para su gaveta y cada
equipo tendrá una llave, en dicha gaveta se podrá guardar solo material de Microbiología.
II.- ORGANIZACIÓN CON LOS ALUMNOS

1. Para asistir al laboratorio el alumno deberá traer:
Una bata limpia y con botones Una fotografía tamaño infantil

Manual de laboratorio Colores
Dos asas bacteriológicas Un marcador indeleble de punto mediano
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2.- El cuaderno de reporte de prácticas debe ser de tamaño profesional forrado de color que se te
indique, en la portada se colocará una etiqueta con el título de la asignatura, el nombre de los tres
alumnos que conforman el equipo, colocando en primer término el del dueño del cuaderno, de manera
remarcada o con letra más grande y en la parte superior derecha se pondrá una etiqueta de 5 cm con
el número de equipo.
Por equipo deberá traer:
Un rollo de Masking tape Una regla graduada

Papel periódico 5 cm de altura Un metro de franela
Una tijera de punta recta Un jabón para las manos
Una pinza de punta roma Dos frascos de boca ancha de vidrio
Tres botes de lámina Dos frascos largos de vidrio
250 g de algodón Una caja de ligas
Una llave del candado Cerillo o encendedor
Una esponja Un rollo de papel sanitario
Una jeringa de 10 ml 250 ml de alcohol
Una caja de portaobjetos Una brocha de cerdas suaves
3.- Por sección
Por sección se deberá traer un candado Una caja de cubreobjetos

Jabón líquido para trastes Un barniz de uñas transparentes
III.- DEL HORARIO Y COMPORTAMIENTO DE LOS ALUMNOS.

1.- Se impartirán dos sesiones por semana de 3.0 horas cada una.
2.- Cada sesión principiará y terminará a la hora indicada.
3.- Se pasará lista cada día al empezar la práctica.
4.- Se anotarán las faltas y asistencias con todo rigor y por ningún motivo se pondrán retardos.
5.- Cuando el alumno abandone el laboratorio antes de terminar la práctica y sin el consentimiento del
profesor, se considerará que no asistió a la práctica.
6.- Las faltas al laboratorio se calificarán con cero.
7.- La asistencia al laboratorio es obligatoria, ya que uno de los objetivos del trabajo práctico es que el
alumno adquiera habilidades y destrezas. La lista de asistencia se efectuará a la hora indicada con
una tolerancia de 10 minutos y con la bata debidamente abrochada. En caso de llegar ya no se le
permitirá la entrada a menos que sea discusión con su correspondiente falta.
8.- El reporte se entregará una semana después de realizada la discusión, excepto la práctica que
este cercana al periodo de evaluación y no se permitirá que el reporte se entregue escrito todo o
alguna fracción con lápiz, se sugiere el uso solo de colores negro, azul, rojo y en caso de esquemas
lápices de colores.
9.- El alumno utilizará el Manual de Prácticas de Laboratorio, obligatoriamente en cada sesión,
apegándose a la metodología a seguir, así como a las instrucciones del profesor y corregirá lo que se
vaya cambiando.
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10.- El material, deteriorado o extraviado, deberá ser repuesto por el equipo responsable, para ello
tiene como mínimos una semana, de lo contrario el vale se irá al expediente del alumno.
11.- El alumno revisará el material que reciba y reportará cualquier anomalía antes de iniciar el trabajo
práctico para evitar que se le responsabilice del material deteriorado que se le entregue.
12.- Después de terminada la práctica, el material debe ser entregado limpio por el equipo
responsable a la persona encargada del almacén.
13.- Evitará su permanencia en el laboratorio después de terminada la práctica.
14.- Se debe guardar el comportamiento adecuado para evitar accidentes, ya que el laboratorio es un
lugar de trabajo donde se manejan cultivos y aparatos delicados.
15.- La entrada de los alumnos al laboratorio en horas que no correspondan a la sesión, estará
condicionada a la autorización del profesor responsable de la práctica, y en caso de retirar su material
de la incubadora deberá traer bata, además traerá su material que va a necesitar.
16.- Una vez esterilizado el material que contenga agar se dejará enfriar y posteriormente se
depositará en una bolsa de plástico para su desecho.
17.- Equipo que no traiga el material biológico solicitado en la práctica no se le permitirá la entrada.
IV BREVES REGLAS DE SEGURIDAD PARA UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

En el laboratorio de Microbiología se manejan agentes que pueden ser infecciosos y pueden presentar
riesgos de enfermedades por lo que sugerimos algunas acciones orientativas para los alumnos, en
principio debemos conocer la normatividad Mexicana para su regulación, por eso es necesario
conocer la NOM 087- ECOL-SSSA1-2002, protección ambiental-Salud ambiental - residuos peligrosos
biológico-infecciosos-clasificación y especificaciones de manejo, para conocer la terminología
microbiológica, el tipo de residuos que se utilizan en prácticas para docencia, los contenedores y la
simbología básica.
Si bien es cierto que el personal de laboratorio tiene mayor riesgo de infectarse con los agentes que
manipula una persona puede ser susceptible a infectarse y presentar una enfermedad.
En principio toda persona que esté en el laboratorio debe cumplir estrictamente con las reglas de
seguridad y conocer los agentes etiológicos que maneja, por lo que deben estar capacitados en los
procedimientos para manipular cepas microbianas de manera segura.
El nivel de bioseguridad que tiene un laboratorio de enseñanza es uno ya que manejamos cepas
definidas y caracterizadas que no se conocen como generadores sistemáticos de enfermedades en
humanos adultos sanos.
Practicas microbiológicas estándar obligatorias.
1. Acceso limitado cuando se están realizando experimentos.
2. Lavado de manos antes y después de trabajar en el laboratorio y si se puede utilizar un gel
desinfectante.
3. No está permitido comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto, maquillarse o masticar.
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4. Está prohibido pipetear con la boca, hay que utilizar pipetas automáticas.
5. La mesa de trabajo se descontamina la inicio y final del trabajo y
después de que accidentalmente ocurra un derrame de material viable y
dejar actuar por lo menos cinco minutos.
6. Las batas protegen de contaminaciones químicas o biológicas, por ello
se recomienda su cambio al salir de laboratorio.
7. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado, cualquier
material que no se utilice en la realización de la práctica debe estar
apartada del área de trabajo.
8. Evitar llevarse las manos a la boca, nariz ojos u oídos.
9. Llevar prácticas correctas para minimizar la creación de aerosoles que contengan
microorganismos, ya que son fácilmente inhalados. Evitar operaciones bruscas como el manejo rápido
de las asas y al esterilizar el asa se debe hacer de manera inclinada procurando empezar el
calentamiento en la base del asa para que el calor se vaya propagando poco a poco hasta llegar al
aro.
10. La manipulación de microorganismos debe manejarse siempre alrededor de la flama del mechero
en un radio de 15 cm o en una campana de seguridad.
11. Evitar desplazarse innecesariamente en el laboratorio.
12. En caso de tener ventilación el laboratorio, las ventanas deben estar cerradas ya que las
corrientes de aire originan contaminaciones en los cultivos.
13. El transporte y almacenamiento de placas y recipientes que contengan cultivos se debe realizar
con una canastilla y si se saca de la incubadora o refrigerador, sacar dicho material se una sola vez,
siempre colocar el material de forma segura para evitar que se caigan.
14. Bajo ningún concepto se debe comer o sacar muestras del laboratorio, estén o no contaminadas.
15. Todos los cultivos deben descontaminarse para ser desechados, por ejemplo, el uso de la
autoclave
16. El material de vidrio roto se debe depositar en los contenedores
específicos y cuando se trate de objetos punzocortantes depositarlo en el
contener.
17. Botiquín de primeros auxilios debe estar disponible a simple vista y
cumplir con la NOM-005-STPS, relativa a las condiciones de seguridad e
higiene en los centros de trabajo para el manejo, transporte y
almacenamiento de sustancias químicas peligrosas, específicamente en la
guía de referencia botiquín de primeros auxilios.
18. En caso de accidente avisar inmediatamente al profesor responsable y registrar en una bitácora el
incidente para prevenir futuros eventos.
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19. Tomar las precauciones necesarias, evitar la presencia de sustancias inflamables, procurar que la
flama del mechero esté en azul, para ello el mechero cuenta con un collarín que regula la cantidad de
aire con el que se obtiene una mezcla de aire- gas que permite una combustión correcta.
20. En el caso de que se produzca un accidente al incendiarse un solvente, nunca soplar, se deberá
emplear una franela mojada para cubrir el recipiente.
21. Aunque los microorganismos con los que se trabaja en docencia no son patógenos, todos los
cultivos de todos los microorganismos deben ser manejados con cuidado
22. Evitar que los microorganismos ambientales presentes en piel, pelo, aire y ropa contaminen el
material biológico.
23. Queda prohibido el uso aparatos que distraigan al alumno, excepto aparatos que tomen fotografías
del microscopio o del pizarrón.
24. La bata protege de contaminaciones químicas o biológicas, por ello se recomienda su cambio al
salir de laboratorio.
25. Lavarse las manos al inicio y al final cada práctica, recordar que se manejan microorganismos.
26. Las ventanas deben estar cerradas, ya que las corrientes de aire originan contaminaciones.
27. Los alumnos con el pelo largo se lo recogerán, no se permite el uso de flecos.
28. Queda prohibido el uso de celulares y aparatos electrónicos durante el desarrollo de la práctica.
29. Al entrar al laboratorio evitar, traer chamarra, bufanda, guantes y la bata deberá estar abrochada.
30. Las tuberías deben ser identificadas con el color de seguridad
Tabla 1 colores de seguridad para tuberías y su significado
Color de seguridad Significado

Rojo Identificación de tuberías contra incendio
Amarillo Identificación de fluidos peligrosos
Verde Identificación de fluidos de bajo riesgo
31. Señales de precaución
Algunas señales para indicar precaución y advertir sobre algún riesgo presente.
Tabla 2 señales de precaución
Indicación Contenido de imagen del símbolo Ejemplo

Precaución Cráneo humano de frente con dos huesos largos
sustancia tóxica cruzados por detrás
Advertencia de Circunferencia y tres medias lunas

riesgo biológico
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32. Señales que indican ubicación de salidas de emergencia y de instalaciones de primeros

auxilios.
Tabla 3 Simbología de emergencia
Indicación Contenido del símbolo Ejemplo

Salida de Silueta humana avanzando hacia una salida
emergencia de emergencia indicando con flecha
direccional el sentido requerido
Ubicación de una Silueta humana bajo una regadera y flecha

regadera de direccional
emergencia
33. Rombo de identificación
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Actividades:
I.- Lectura de Normas Oficiales Mexicanas (NOM)

A. NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental - Salud ambiental - Residuos peligrosos
biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones de manejo.
B. NOM-026-STPS-1998, Colores y señales de seguridad e higiene, e identificación de riesgos por
fluidos conducidos en tuberías
a. Desinfección del área de trabajo
b. Código de colores (instalaciones de gas)
c. Uso del contenedor para punzocortantes
d. Botiquín
e. Extinguidores
II.- Conocimiento del material básico de laboratorio

a. Material de cristalería
b. Uso del mechero
III.- Equipo de laboratorio

a. Cuarto de incubación
b. Cuarto de refrigeración
c. Incubadoras
d. Balanza de dos platillos, granataria, digital y analítica
e. Campana de flujo laminar
f. Campana de extracción
IV.- Material para la gaveta

a. Frasco con benzal, Frasco con alcohol, Frasco con torundas y Frasco con benzal para pipetas
b. Varilla acodada y base de caja de Petri.
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PRÁCTICA No. 1
MICROSCOPÍA
1. OBJETIVOS:
1.1 Objetivo
El alumno utilizará correctamente el microscopio, conocerá sus partes y enfocará una preparación.
2.- INTRODUCCIÓN
El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño. Es el
instrumento que más se usa en los laboratorios que estudian los microorganismos. Mediante un
sistema de lentes y fuentes de iluminación se puede hacer visible un objeto microscópico. Los
microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamaño original. Los diversos
elementos que existen en la naturaleza, presentan tamaños, formas y composiciones distintas, la
mayoría de ellas pueden verse, algunas a simple vista, y otras mediante instrumentos.
Para poder observar a la célula es necesario recurrir a equipos como el microscopio, de este existen
diversas variedades, los cuales están diseñados a lo que pretendemos observar y como ejemplo
tenemos a:
Microscopio óptico
Es un instrumento (de un lente o varios lentes), que amplifica una imagen y permite la observación de
mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio más simple es una lente de aumento o
un par de anteojos. El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos
objetos separados estos deben estar como mínimo a esa distancia. El microscopio aumenta la imagen
hasta el nivel de la retina, para captar la información. La resolución depende de la longitud de onda de
la fuente luminosa, el espesor del espécimen, la calidad de la fijación y la intensidad de la coloración.
Teóricamente la máxima resolución que se puede alcanzar es de 0,2 µm dada por una luz con
longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y con
objetos condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero no
puede aumentar la resolución. Existen distintos microscopios ópticos generales y de investigación que
se diferencian en factores tales como la longitud de onda de la iluminación del espécimen, la
alteración física de la luz que incide en la muestra y procesos analíticos que se aplican a la imagen
final.
El microscopio compuesto está formado por tres sistemas:
1. Sistema de iluminación;
2. Sistema óptico
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3. Sistema mecánico.
El sistema de iluminación corresponde a la fuente de luz y sus aditamentos para iluminar

eficazmente la preparación y está formado principalmente por la lámpara (6V), el diafragma de campo
y el condensador (lente frontal, diafragma de iris y lente auxiliar)
El sistema óptico está formado por una serie de lentes de vidrio en los objetivos y oculares que
permiten agrandar la imagen y está formado por los objetivos, tubo y el ocular.
El sistema mecánico está formado por una serie de engranes y botones que permiten realizar el
movimiento y cambio de las lentes, así como el enfoque de la preparación y está formado por la base,
estativo, tornillos macrométrico y micrométrico, platina, revolver y porta-revolver.
Función básica de cada parte del microscopio:
a.- Sistema mecánico
Base. Pieza metálica que sostiene a todo el aparato
Estativo. Lugar de donde se debe tomar para trasladar al microscopio
Platina. Es una plancha cuadrada y gruesa de metal con un orificio central en donde descansa la
preparación, la cual es fijada por dos pequeñas pinzas, se puede mover hacia arriba y hacia abajo con
los tornillos macrométrico y micrométrico por medio de un sistema de engranes. Posee escalas
numéricas que permiten ubicar fácilmente la posición de lo que se observa y, al mismo tiempo,
deslizar la preparación en forma de cruz (ejes X y Y) para su localización.
Pinzas. Sirve para sujetar al portaobjetos.
Tornillo macrométrico. Permite el enfoque mayor.
Tornillo micrométrico. Permite el enfoque con precisión.
Tubo del ocular. Sostiene el lente del ocular.
Revolver: Es un dispositivo giratorio en donde se atornillan las lentes de los objetivos de distinto
aumento.
Tubo binocular. Cada uno de los tubos contiene en el interior un sistema de prismas y espejos que
dividen el haz de luz en dos haces, cada uno de los cuales se envía por separado a cada tubo, estos
tubos se deslizan hacia los lados para ajustar la distancia interpupilar ya que cada persona posee una
diferente separación entre sus ojos. Los microscopios binoculares tienen entre los tubos una escala
grabada para poder ajustar la distancia y cada persona debe memorizar su valor de apertura
interpupilar; uno de los tubos tiene el ocular fijo y el otro tiene un sistema mecánico que sube o baja.
Para realizar el enfoque de cada ojo primero se enfoca con el tornillo micrométrico el tubo que tiene el
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ocular fijo y después se enfoca el que tiene el ocular móvil, pero en este caso sin mover el tornillo
micrométrico, girando el ocular móvil hasta encontrar el foco.
b.- Sistema de iluminación
Lámpara. Es la encargada de proporcionar los haces de luz y tiene las siguientes características: 6V,
5-15 W ó 12 V, 50-100 W
Diafragma de campo. Está situada en la base del microscopio y su función es la de regular el

diámetro de la emisión de la luz a fin de que se ilumine solo el área de campo visual, es decir controla
la cantidad de luz que atraviesa la preparación.
Condensador. Es un sistema de tres lentes convergentes que concentran los rayos luminosos sobre
el objeto a observar, el condensador utilizado es capaz de agrupar todos los rayos que provienen del
foco y permite aprovechar toda la luz posible que inciden sobre él y los dirige hacia el plano focal del
objeto.
c. Sistema óptico
Oculares
El ocular es la parte óptica final externa, situados en el tubo a través de los cuales se obtiene la
imagen final, el ocular tiene aumento propio (los aumentos son denominados con la letra X), en
nuestro caso es de 10X. El ocular consta de una lente cercana al ojo, collar, tubo del ocular y una
lente cercana al objetivo.
Tubo
El tubo es la parte óptica – mecánica, situada en la parte superior del microscopio, este puede ser
monocular o binocular, además está adaptada para poderle colocar una cámara fotográfica ó una
cámara de televisión. El tubo generalmente está diseñado para trabajar a una distancia mecánica fija
entre ellos y este valor puede ser de 160 mm, el factor del tubo del microscopio a utilizar en el
laboratorio es de 1,25X, dato que nos sirve para calcular el aumento total.
Objetivos. - Son lentes que captan la imagen a observar, están construidos de cristal o fluorita,
poseen aumento propio, apertura numérica y está diseñada para trabajar con diferentes campos.
Todos los objetivos tienen anillos de colores y números grabados sobre el tubo metálico, que nos
permite saber a detalle cuáles son sus ventajas, la disposición de estos caracteres es la siguiente:
1.- El anillo de color superior indica los aumentos (tabla 1)
2.- El lado superior izquierdo indica el número de aumentos
3.- El lado superior derecho la apertura numérica.
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4.- El lado inferior la distancia mecánica
5.- El lado inferior derecho el espesor del cubreobjetos
6.- El anillo de color inferior indica en qué medio se hace la inmersión del objetivo (tabla 2)
En ocasiones el objetivo puede traer en lugar de 0.17, el número 1, el cual indica que:
Acepta cubreobjetos desde 0,17 a 0,22 mm de espesor,
10= No requiere cubreobjetos ó
0,11 – 0,27 = Es ajustable a diferentes espesores de los cubreobjetos, desde 0,11 mm hasta 0,27 mm.
Anillo superior
Los anillos de color cerca del anillo moleteado facilitan el reconocimiento del coeficiente de aumento:
Tabla 1. Correspondencia entre los

aumentos y los anillos de colores
grabados Tabla 2. Colores para el anillo inferior que
Aumentos Color anillo superior indican en qué medio se debe hacer la
inmersión del objetivo
1.0X Negro
Carácte Sustanci Índice de Color del
2.5 X Pardo refracció
r a anillo
4.0 X Rojo n
Oil Aceite 1,515 Negro
6.3 X Anaranjado
W Agua 1,333 Blanco
10 X Amarillo
Glyz Glicerina 1,455 Anaranjad
16 X Verde claro
o
25 X Verde oscuro
Metilen Yoduro 1,740 Amarillo
40 X Azul claro de
o
63 X Azul oscuro metileno
100X Blanco
Aumentos totales:
El número total de aumentos que se puede lograr en un microscopio se obtiene multiplicando el

número de aumentos que tiene el ocular por el número de aumentos que tiene el tubo y por el número
de aumentos que tiene el objetivo con el que se está observando.
Distancia mecánica:
Se llama distancia mecánica a la distancia que recorre a luz por el interior del microscopio desde que
penetra por el objetivo, pasando por los tubos y espejos, hasta llegar al ocular, la distancia mecánica
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se mide desde la superficie de la rosca del objetivo hasta la base del ocular, esta distancia en el caso
de nuestro microscopio es de 160 mm.
Poder de resolución:
El poder de resolución de una lente se define como la capacidad que tiene para discernir entre dos
puntos muy cercanos entre sí y que puedan verse separada.
El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm, el microscopio óptico de 0,2 µ y el microscopio
electrónico de 6 Ángstrom.
Apertura numérica:
Es una medida de la amplitud del cono luminoso que se forma por las lentes del microscopio, ya sea
del condensador o del objetivo.
3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS
3.1 MATERIAL POR EQUIPO
• Microscopio compuesto • Preparaciones fijas de bacterias
• Papel seda • Aceite de inmersión
3.2 REACTIVOS
• Aceite de inmersión • Atomizador con benzal
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
a) Tomar del anaquel un microscopio.
b) Transportar el microscopio de forma vertical tomándolo del brazo con una mano y en la otra la
base.
c) Colocar el microscopio sobre la mesa de trabajo, y observar si presenta alguna irregularidad en

caso de presentarla informar al profesor (cable en mal estado, falta de un objetivo, etc.)
d) Con una perilla retirar el polvo de la parte mecánica y de la parte óptica.
e) Limpiar la parte mecánica del microscopio con una brocha de cerdas suaves.
f) Limpiar la parte óptica del microscopio con papel seda, nunca hacerlo con la bata.
g) Se dará la clasificación del microscopio según el sistema mecánico, óptico y de iluminación.
h) Conectar el microscopio a la toma de corriente
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4.1 Cuidado y limpieza del microscopio
Un proceso de limpieza debe considerar los siguientes aspectos:
a) Limpiar la parte óptica con un bulbo inyector de aire para eliminar las partículas de polvo.
b) Algunos solventes como la acetona disuelven los revestimientos de barniz, la pintura y aún el
cemento de las molduras y los objetivos compuestos, por lo que no se deben usar.
c) Las partes mecánicas se deben lubricar y se limpian por fuera con una brocha de cerdas suaves.
Se enlistan algunos compuestos recomendados sólo para ciertas partes del microscopio.
d) Espuma de jabón suave. - Solo para remover lo sucio de la superficie de instrumentos
e) Agua destilada con algún detergente sin aditivos alcalinos. - para un prelimpiado de la óptica.
f) Solución para limpiar la óptica. - etanol al 40 %, éter al 20 %, para limpiar superficies de la óptica o
remover residuos de aceite de inmersión.
4.3 ENFOQUE DE UNA PREPARACIÓN FIJA CON BASTANTE MUESTRA.
a) Tomar la preparación proporcionada y enfocarla a 10 y 40 X.
b) Adicionarle aceite de inmersión y observarlo a 100 X
c) Observar la preparación que contiene bastante muestra y realizar el esquema biológico
d) Ahora mover la preparación en la periferia donde hay poca cantidad de muestra y realizar un
esquema de lo observado, en donde se anote el aumento real
e) Compara y analiza lo realizado y concluye la conveniencia o no de tener una preparación con

bastante inóculo.
5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO
Esquematiza la preparación observada a 40 y 100X, anota el nombre de la muestra (etiqueta):

_____________________
40x 100x (bastante muestra) 100x (periferia de la muestra)
5.1 Consulta la bibliografía y llena la siguiente tabla
Tipo de microscopio Poder de resolución Aplicaciones

Compuesto
Contraste de fase
Electrónico
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5.2 En la siguiente tabla resume la función de cada una de las siguientes partes:
Parte del microscopio Función Sistema al que pertenece

(mecánico, óptico de iluminación)
Condensador
Diafragma
Objetivo
Filtro azul
Lámpara
Ocular
Platina
Revolver
Tornillo macrométrico
6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Discutir las ventajas y desventajas de un microscopio óptico, así como la cantidad de muestra que
presente una preparación.
7.- CONCLUSIONES
Elabora tus conclusiones tomando en consideración los objetivos de la práctica, los resultados
obtenidos y la bibliografía consultada.
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Esquema de un microscopio
1.- Oculares 11.- Mando para dezplazar la 17.- Objetivo

2.- Unidad binocular del tubo platina dirección X 18.- Platina
3.- Tubo 12.- Tornillo de apriete para 19.- Palanca sujeta objetos
4.- Asa de transporte condensador 20.- Anillo moleteado para revolver
5.- Unidad alimentadora enchufable 13.- Dispositivo de luz 21.- palanca para ajustar el
6.- Indicadores de la intensidad luminosa transmitida , led difragma
7.- Botón giratorio de encendido 14a.- Anillo moleteado para 22.- Botón moleteado para ajustar
8.- Mando de enfoque micrométrico ajustar el diafragma de el condensador (altura)
(lado derecho) campo 23.- Mando de enfoque
9.- Mando de enfoque micrométrico 14b.- Diafragma de campo macrométrico
(lado derecho) luminoso 24.- mando de enfoque
10.- Mando para desplazar la platina 15a y 15b.-Tornillos de micrométrico
dirección X centraje para condensador 25.- Anillo moleteado para ajustar
16a y 16 b.-Condensador de la suavidad del mando
abbe. micrométrico
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PRÀCTICA No. 2
PREPARACIONES FIJAS Y EN FRESCO
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general
1.1.1 El alumno realizará preparaciones en fresco y fijas para ser observadas en el microscopio
óptico
I.2 Objetivo específicos
Al término de la sesión el alumno:
1.2.1 Realizará una preparación en fresco de una muestra líquida de agua estancada.
1.2.2 Realizará una preparación en fresco de mohos con azul de algodón lactofenol.
1.2.3 Realizará frotis para preparaciones fijas.
1.2.4 Realizará tinciones simples y diferenciales.
2. INTRODUCCIÓN
La gran mayoría de los microorganismos no son visibles para el ojo humano, por lo que el uso del
microscopio resulta indispensable para observar a estos seres vivos. Para lograr una buena
observación microscópica es necesario tomar en cuenta la preparación de la muestra, debido a que
los objetos deben tener un cierto grado de contraste con el medio circundante para poder ser
percibidos a través del microscopio, además de que los microorganismos carecen de una coloración
natural, hay que teñirlos previamente para hacerlos resaltar de manera artificial del fondo de la
imagen. Una forma de conseguir este contraste consiste en realizar tinciones simples con un colorante
o tinciones diferenciales.
Las bacterias no teñidas muestran pocos detalles morfológicos; el diagnóstico bacteriológico
generalmente se basa en las diferentes afinidades tintoriales de las bacterias, para poder observar a
los microorganismos es necesario teñir la célula, el cual resulta de un conjunto de reacciones
complejos, algunas pueden ser irreversibles y otras no, por ejemplo, algunos colorantes que han
teñido en exceso pueden eliminarse con disolventes adecuados.
La mayoría de los colorantes utilizados en microbiología son derivados de la anilina, los colorantes
están formados por uno o más anillos bencénicos conectados por uniones químicas bien definidas
(cromóforos) que están bien asociados con la producción de color, teóricamente ciertos radicales
químicos poseen la propiedad de absorber la luz de diferentes longitudes de onda, además poseen un
grupo funcional llamado auxocromo que permite su unión a componentes con carga contraria
presentes en la célula.
19
Cristal violeta Safranina
Estructura química del cristal violeta y safranina
Los colorantes se designan como ácidos o básicos, término que no indican necesariamente sus
reacciones de pH en solución, sino más bien si una parte significativa de la molécula es aniónica o
catiónica.
Un colorante ácido es la eosina y una básico es el azul de metileno, los colorantes básicos se
combinan con los componentes de los ácidos nucleicos y los colorantes ácidos se combinan con los
componentes del citoplasma. Cuando existe poca afinidad del colorante con la estructura celular se
utiliza un mordente el cual favorece la adsorción.
El lugol es el mordente y es una disolución de yodo molecular y yoduro potásico en agua destilada,
recibe su nombre en honor al médico francés J.G.A Lugol.
Cuando hay que determinar la pureza de una muestra pueden existir muy pocas células de la
contaminante, de tal manera que s i la muestra no es muy viscosa se puede colocar una gota, se deja
secar al aire y nuevamente se coloca otra para aumentar la posibilidad de encontrar células diferentes
al de nuestro inóculo.
Paso para teñir a los microorganismos se realiza lo siguiente.
Extensión: Se realiza sobre un portaobjetos que ha de estar totalmente limpio. Si la muestra es

líquida se hace directamente y, si es sólida, hay que resuspenderla previamente en una gota de
solución salina fisiológica, recordar que la extensión se hace suavemente para evitar romper la
agregación de los microorganismos y la preparación debe ser delgada, porque si está muy gruesa no
permitirá el paso de luz a la hora de observar en el microscopio y no se decolorará y si esta es muy
delgada tardaremos un poco en encontrar a los microorganismos.
Fijación: Tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos para que en los lavados no se
desprendan y desnaturalizar las proteínas para inactivar a la célula. Normalmente se realiza con calor,
pasando la muestra por lo menos tres veces por la flama del mechero. Procurar no someterla a un
calor excesivo ya que la célula se deshidratará y perderá su forma, además debe estar delgada
porque si es muy gruesa se corre el riesgo de que no todas se inactiven por el calor.
La fijación puede ser sustancias deshidratantes o precipitantes como el metanol o el cloruro

mercuríco.
Tinción: Se realiza añadiendo el colorante sobre los microorganismos sometidos a los procesos
anteriores, al combinarse lo colorantes le confiere a la célula color, y podemos tener los siguientes:
20
TINCIÓN NEGATIVA:
Se les llama así porque el colorante no se fija a la célula o no penetra es decir el colorante no tiñen el
microorganismo, sino el entorno, aumentando de este modo su contraste. La muestra se extiende
sobre una gota del colorante, y es utilizada para observar la cápsula que está formada de un
exopolimero de naturaleza proteica que la propia bacteria secreta a través de la pared celular. La
cápsula de confiere resistencia al microorganismo, además de tener la capacidad de adhesión y si se
quiere observar no se puede calentar porque se desnaturaliza.
Por su composición química la cápsula no se tiñe con el cristal violeta o la safranina por ser colorantes
básicos, por eso se utiliza la tinción negativa con tinta china, el cual está formado por partículas muy
finas de carbono suspendidas en agua formando un coloide, las partículas son muy grandes que no
pueden penetrar a la célula. Como ejemplos de microorganismo con presencia de cápsula tenemos a
Leuconostoc mesenteroides que produce una capsula que contiene dextranos, el cual es sintetizado a
partir de la sacarosa.
TINCIÓN SIMPLE:
Para la realización de esta tinción, primero se realiza el frotis y la fijación al portaobjetos.
Se añade una gota del colorante que generalmente son básicos como el cristal violeta, el azul de
metileno, el verde de malaquita y la safranina por un minuto, se lava, se deja secar y se observa al
microscopio, por lo que solo nos permite observar la forma, el tamaño y el tipo de agrupación de las
células.
TINCIÓN DIFERENCIAL: Tinción de Gram
Para esta tinción existe una combinación de colorantes y un mordente, la pared celular es
responsable de la tinción de Gram, el procedimiento se inicia con una tinción de las células
bacterianas fijadas mediante el colorante básico cristal violeta, posteriormente se trata con una
disolución de yodo, el yodo forma un complejo con el cristal violeta que es insoluble en agua y sólo
medianamente soluble en alcohol o acetona. Las células se tratan después con alcohol para
diferenciarlas, el alcohol-acetona ocasiona deshidratación en la célula impidiendo la salida del
colorante, además disuelve el exceso de colorante. Las células Gram positivas retienen el complejo
colorante-yodo por lo que las observamos de color morado-azules y las células Gram negativas son
decoloradas por el alcohol por lo que se hacen visibles mediante la coloración de contraste que en
este caso es la fucsina. La diferenciación se basa principalmente en la composición de la pared
celular.
21
La pared celular de una bacteria Gram positiva tiene un contenido más alto de péptidoglicano, el
péptidoglicano está formado de N-acetil murámico y N- acetil glucosamina, las bacterias Gram
negativas tienen poco peptidoglicano y doble membrana celular que está formada por
lipopolisacaridos, el alcohol acetona los disuelve lo que va a permitir la salida del cristal violeta que
penetro, por lo tanto, estas bacterias tomarán el color de la safranina.
Cuando se realiza la tinción de Gram se debe tomar en cuenta la edad del cultivo, ya que una célula
vieja puede haber sufrido daños en su pared celular y no quede el colorante primario, además la
realización de la técnica en función de los tiempos de acción y la perfecta solubilidad del colorante.
TINCIÓN DIFERENCIAL: Tinción de Ziehl – Neelsen
Los microorganismos pertenecientes al género Mycobacterium se caracterizan por tener una pared
celular completamente diferente a las restantes eubacterias. La pared de las Mycobacterias posee un
alto contenido de lípidos que la hace impermeable a los agentes hidrofílicos, por lo tanto, estos
microorganismos no se tiñen adecuadamente con los reactivos utilizados en la coloración de Gram y
no pueden ser clasificados como Gram positivos o negativos. Las Mycobacterias son teñidas
adecuadamente por el método de Ziehl-Neelsen que utiliza como solución decolorante una mezcla de
etanol y ácido clorhídrico. Estos microorganismos una vez coloreados son resistentes a la
decoloración ácido-alcohólica y por eso se denominan Bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR).
Los microorganismos del género Mycobacterium contienen una membrana citoplasmática formada por
una bicapa lipídica similar a las restantes eubacterias. Por encima de esta membrana se encuentra el
rígido peptidoglicano que contiene N-glucolilmurámico en lugar de N-acetilglucosamina. Por medio de
una unión fosfodiéster, el peptidoglicano se halla unido covalentemente al arabinogalactano, un
polímero de arabinosa y galactosa. En la porción más distal y externa de los arabinogalactanos se
hallan fijados los ácidos micólicos que tienen cadenas carbonadas largas (C60 a C90). Los
glucolípidos son un grupo de compuestos (micolatos de trealosa, sulfolípidos, micósidos, etc) que se
encuentran asociados no covalentemente a los ácidos micólicos y se ubican periféricamente en la
pared. Los micolatos de trealosa (llamados factores de cordón porque su presencia produce cultivos
que tienen forma de cordones serpenteantes) y sulfolípidos se encuentran principalmente en las
cepas de Mycobacterias más virulentas. El lipoarabinomanano (LAM) es un compuesto que se halla
22
anclado en la membrana citoplasmática. El LAM es considerado como el equivalente mycobacteriano

del lipopolisacárido de las Gram negativas debido a que provoca una importante respuesta
antimicrobiana en macrófagos. En las cepas de Mycobacterias más virulentas la arabinosa terminal
del LAM está recubierta con residuos de manosa (manLAM) a diferencia de las cepas no virulentas no
están recubiertas (AraLAM). Además, el LAM también podría servir como poro para el paso de los
nutrientes a través de la pared celular. En la pared celular también se encuentran proteínas
inmunoreactivas que son utilizadas con fines diagnósticos.
La Tinción de los microorganismos requiere una pared celular en buen estado, el interior de la célula,
rico en lípidos conserva el colorante, pero la pared no. La función de ésta, y el fenómeno de
resistencia a los ácidos, se debe a la insensibilidad de la pared frente a la acción del aclarador, en
este casi el ácido.
A fin de que el colorante primario, la carbolfucsina, penetre a través de las cápsulas cerosas de los
bacilos acidorresistentes, se requiere de cierto tipo de tratamiento físico como el calor.
El calor favorece la fusión de las ceras por lo que el colorante puede penetrar, luego al dejar enfriar
nuevamente las ceras solidifican, de modo que el colorante ya no puede salir. Como el tratamiento es
muy enérgico cualquier bacteria que no tenga un alto contenido de lípidos como Mycobacterium y
Nocardia perderán el colorante primario durante la decoloración por lo que se teñirá con el colorante
de contraste que es el azul de metileno. Las bacterias que resisten a la decoloración por alcohol ácido
se denominan bacterias ácido alcohol resistente (BAAR positivas) y los vemos al microscopio de color
rojo y las BAAR negativas las vemos de color azul.
Procedimiento en la tinción de Ziehl-Neelsen.
 Colocar el frotis correspondiente en el puente de coloración
 Cubrir el frotis con fucsina-fenicada y calentar con una lámpara de alcohol, hasta que emita
23
vapores, aplicar calor periódicamente durante cinco minutos sin que se seque la preparación y
esperar a que se enfríe.
 Enjuagar con agua de la llave.
 Cubrir el frotis con alcohol ácido por un minuto.
 Enjuagar con agua de la llave.
 Cubrir el frotis con azul de metileno por un minuto
 Enjuagar, dejar secar y observarlos con el microscopio utilizando lente de inmersión
TINCIÓN SELECTIVA DE ESPORAS: Tinción de Shaeffer y Fulton.
Una Tinción selectiva tiene por objetivo poner de manifiesto algunas estructuras de la célula
bacteriana. Las endosporas son resistentes al calor y difíciles de destruir, las bacterias formadoras de
endosporas son del género Bacillus y Clostridium. Las endosporas son impermeables a los
colorantes, por lo que a veces se ven como regiones sin teñir dentro de las células que han sido
teñidas
Diferentes tipos de posición de las esporas
En la realización de las tinciones podemos tener ciertos errores como son:
Edad del cultivo: Un microorganismo Gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo
microorganismo, si sufre daño en la pared por alguna causa, se vuelve Gram negativo. Esto indica la
importancia de la pared para la retención o el escape del colorante.
Tinción de Gram decolorada: Esto nos ocurre cuando dejamos actuar por más de 30 segundos el
alcohol cetona, entonces la preparación nos va a resultar un Gram negativa.
3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO

3.1 EQUIPO
• Microscopio óptico
3.2 MATERIAL
• Portaobjetos • Frasco gotero con solución de cristal violeta
• Cubreobjetos • Frasco gotero con solución de lugol
• Pipeta Pasteur • Frasco gotero con solución de alcohol – acetona
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• Gradilla • Frasco gotero con solución de safranina

• 1 tubo de ensaye de 13 X 100 mm • Frasco gotero con solución de fucsina fenicada
• Asa bacteriológica • Frasco gotero con solución de alcohol ácido
• Mechero • Frasco gotero con solución de azul de metileno
• Asa • Frasco gotero con solución de verde de malaquita
• Puente de coloración • Solución salina
• Gradilla metálica • Lámpara de alcohol
3.3 CEPAS MICROBIANAS
• Staphylococcus aureus • Rhizopus sp
• Saccharomyces cerevisiae • Aspergillus niger
• Escherichia coli
3.3 MUESTRA BIOLÓGICA
• Muestra de agua estancada y de fruta con crecimiento de moho
4.1 Preparación de Frotis:
Método A
4.1.1 Limpiar el portaobjetos con una torunda de algodón impregnada con alcohol.
a.- Etiquetar la preparación, solo sobre la superficie superior del portaobjetos, la etiqueta será
preferentemente pegada a la izquierda de la preparación, si con una etiqueta no basta colocar otra del
lado derecho, la etiqueta llevará el nombre del microorganismo, el nombre de la tinción, el equipo, el
grupo y la fecha.
b) En la gradilla se tiene un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 2 ml de agua, de ahí tomar con el
asa una pequeña gota de agua y colocarla en el centro de la superficie de un portaobjetos.
c) En el mechero, flamear el asa al rojo vivo y en un radio de 20 cm de la flama del mechero, abrir el
tubo de ensaye y flamearlo, tomar la muestra con el asa, volver a flamear la boca del tubo y taparlo.
Dejar el tubo sobre la gradilla y con la mano izquierda tomar el portaobjetos y con la mano derecha en
la que tenemos el asa extender el inoculo aproximadamente un cm2 para obtener una película delgada
de microorganismos. Flamear el asa para esterilizarla.
d) Dejar secar el frotis a temperatura ambiente.
d) Fijar el frotis con calor, es decir pasarlo rápidamente por la flama del mechero, luego colocarlo en el
dorso de la mano, si soportamos el calor pasarlo nuevamente, realizar esta operación una vez más. El
calor deseable es aquel en que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado en
el dorso de la mano. Dejar enfriar el portaobjetos antes de teñir.
Nota: Procurar no tomar una gran cantidad del inóculo de lo contrario quedará un frotis grueso, la luz
25
no pasará y no observaremos; en caso de haber ocurrido esto entonces, observa en la periferia del
frotis
Método B
a) Si se proporciona una suspensión bacteriana o una muestra biológica.
b) Encender el mechero y en un radio de 20 cm abrir el tubo, flamearlo y con el asa tomar un inóculo.
c) Flamear la boca del tubo de ensaye, cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla
d) Colocar el inóculo en el centro de un portaobjetos limpio. Extender el inóculo por lo menos 1 cm2, y
flamear el asa. Dejar secar el frotis y fijarlo al calor.
4.2 Examen en fresco de una muestra de agua estancada
4.2.1 De la muestra de agua estancada que se ha traído al laboratorio, colocar una gota en un
portaobjetos limpio
4.2.2 Con la ayuda de una pipeta Pasteur colocar en el centro una gota de la muestra y cubrirla con
un cubreobjetos.
2.2.3 Al colocarle el cubreobjetos evitar dejarla caer bruscamente, ya que se formarán burbujas.
2.3.4 Observar al microscopio óptico o de contraste de fases con el objetivo de 10 X y 40 X.
4.3 Preparación de una muestra en fresco de mohos con azul de algodón lactofenol
4.4.1 Colocar una gota del colorante azul de algodón lactofenol
4.4.2 Colocar el inoculo y hacer una pequeña extensión
4.4.3 Colocarle el cubreobjetos sin realizar burbujas
4.4.4. Observar la preparación al microscopio con el objetivo 10 X y 40 X. Si se requiere que la

preparación dure un poco más se sellar los bordes del cubreobjetos con barniz de uñas transparentes.
4.4 Tinción simple
a) Tomar la preparación fija de Staphylococcus aureus y colocarla el colorante designado.
b) Tomar el tiempo por un minuto
c) Enjuagar el portaobjetos en el recipiente que contiene el agua
d) Dejar secar la preparación y observarla al microscopio con el objetivo de 40 y 100 X.
4.5 Tinción de Gram:
a) Colocar los frotis correspondientes de cada uno de los microorganismos Bacillus subtilis,
26
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus y Saccharomyces cerevisiae, en el

puente de coloración.
b) Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante un minuto.
c) Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.
d) Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante un minuto.
e) Lavar los frotis con agua de la llave.
f) Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (hasta eliminar el exceso de colorante).
g) Lavar inmediatamente con agua de la llave.
h) Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos
i) Lavar los frotis con agua de la llave.
j) Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio con el
objetivo de 100X. (Previamente realizar la técnica de iluminación de Köhler y enfocar a 10 y 40X)
Para demostrar cómo afecta la decoloración con el alcohol cetona (paso f, se realizará la técnica de
Gram, pero danto un exceso al tiempo de decoloración (90 segundos).
4.6 Tinción de Gram (con exceso de decoloración):
a) Colocar un frotis fijado de Bacillus subtilis y de Escherichia coli en el puente de coloración.
b) Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante un minuto.
c) Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.
d) Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante un minuto.
e) Lavar los frotis con agua de la llave.
f) Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 90 segundos.
h) Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos
i) Lavar los frotis con agua de la llave.
j) Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio.
4.7 Tinción de Gram de una mezcla de microorganismos:
a) Colocar un frotis fijado de una mezcla de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
b) Cubrir el frotis con cristal violeta (colorante primario) durante un minuto.
27
c) Lavar el frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.
d) Cubrir el frotis con lugol (mordente) durante un minuto.
e) Lavar el frotis con agua de la llave.
f) Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (hasta eliminar el exceso de colorante).
h) Cubrir el frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos
i) Lavar el frotis con agua de la llave.
j) Dejar secar el frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio.
4.8 Tinción de Shaeffer–Fulton
a) Cubrir el frotis correspondiente con verde de malaquita y calentar con una lámpara de alcohol,
hasta que emita vapores, aplicar calor periódicamente durante cinco minutos, sin que se seque la
preparación.
b) Dejar que el frotis se enfríe.
c) Lavar con agua de la llave.
d) Cubrir el frotis con safranina por un minuto.
e) Enjuagar, dejar secar y observar con el microscopio utilizando lente de inmersión.
5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO
5.1 Examen en fresco de una muestra de agua estancada
Realiza un esquema de lo observado en el microscopio
5.2 Preparación de una muestra en fresco de mohos con azul de algodón lactofenol
Realiza un esquema de lo observado en el microscopio
5.3 Tinción simple
a) De la muestra que se te ha proporcionado anota el nombre de microorganismo (etiqueta) y realiza
28
un esquema.
Resultados de la sección
Equipo / microorganismo Colorante a utilizar Color
1y6 Azul de metileno
2y7 Safranina
3y8 Cristal violeta
4y9 Verde de malaquita
5 y 10 Lugol
5.4 Tinción de Gram:
a) Realiza un esquema de cada una de las preparaciones de Bacillus subtilis, Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus y Saccharomyces cerevisiae.
Escherichia coli (40X) Escherichia coli (100) Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus (100X)
(40X)
Aumento real: Aumento real: Aumento real: Aumento real:
Forma= Agrupación= Forma= Agrupación=
Micrococcus luteus (40X) Micrococcus luteus (100) Bacillus subtilis (40X) Bacillus subtilis (100X)
Forma= Agrupación= Forma= Agrupación=
Saccharomyces cerevisiae (40X) Saccharomyces cerevisiae (100)

Aumento real: Aumento real:
Forma= Agrupación=
Resumen de la sección
Microorganismos Gram Color Forma Resultado del Gram
1.Bacillus subtilis
2. Escherichia coli
29
3.Staphylococcus aureus
4.Micrococus luteus
5 Saccharomyces cerevisiae
5.5 Tinción de Gram (con exceso de decoloración)

Escherichia coli (40X) Escherichia coli (40X) Bacillus subtilis (100) Bacillus subtilis (100)
Forma= Tipo de Gram Forma= Tipo de Gram:
5.6 Tinción de Gram (mezcla de un Gram + y un Gram -)

Mezcla de: _______________________________________________________________________
(40X) (100)
Tipo de Gram
Formas (s) =
5.8 Tinción de Shaeffer - Fulton
Bacillus sp. (40X) Bacillus sp. (100)
Color de la espora=
Color adquirido de la célula vegetativa
Formas (s) =
5.9 ¿Cuáles son los inconvenientes al realizar un frotis con una gran carga microbiana?
5.10 ¿Cuál es la finalidad de observar una muestra en fresco?
5.11 ¿Por qué se coloca un cubreobjetos sobre la muestra en una preparación en fresco?
5.12 ¿Cuál es el propósito de fijar los frotis con calor?
30
5.13 ¿Cómo afecta la edad del cultivo en la técnica de Gram?
5.14 ¿Por qué la tinción de Gram no se emplea para teñir mohos?
5.15 ¿Cuándo es recomendable utilizar una preparación simple y que colorante utilizarías?
6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
6.1 Discutir los cuidados que se tienen que tener al realizar una preparación en fresco y una fija,
cuales son las ventajas de cada una de ellas, el tiempo que dura dicha preparación para su correcta
observación y los resultados obtenidos en cada tinción realizada.
7. CONCLUSIONES
7.1 Elaborar las conclusiones con base al análisis y discusión de las ventajas y desventajas en la
realización de preparaciones en fresco y fijas, así como a la bibliografía consultada y los objetivos de
la práctica.
31
PRÁCTICA No. 3
MÈTODOS DE ESTERILIZACIÓN Y REDUCCIÒN DE LA CARGA MICROBIANA
1. OBJETIVOS
El alumno preparará material de uso común en un laboratorio de microbiología para su esterilización y
analizará los diferentes métodos para seleccionar el más adecuado acorde a la naturaleza del material
1.2 Objetivo específicos

1.2.1 Preparará el material de vidrio e instrumental para ser esterilizado por calor seco y calor
húmedo.
1.2.2 Esterilizará el material preparado, por calor seco y calor húmedo, haciendo uso de controles.
1.2.3 Realizará el proceso de filtración a través de membrana.
2. INTRODUCCIÓN
La esterilización se conoce como un proceso de destruir a todos los microorganismos de una

superficie, existen varios métodos físicos y químicos de esterilización, para seleccionar el más
adecuado es necesario conocer la naturaleza del material.
1 Métodos físicos
Calor húmedo:
La aplicación de calor húmedo es el método más simple para esterilizar un material, a condición de
que no sufra daño en sí mismo. Una temperatura de 100 °C matará a todas las formas vegetativas,
pero no las esporas, para matar a estas es necesario una temperatura de 121 °C, 15 minutos y 15
libras de presión en una autoclave. La muerte microbiana se produce por la desnaturalización de las
proteínas, generalmente se utiliza vapor, tanto porque las bacterias se mueren más rápidamente
cuando se encuentran húmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor
uniformemente en todas las partes del recipiente.
Calor seco:
Para esterilizar materiales que deben permanecer secos se dispone de hornos eléctricos por los que
circula aire caliente, en vista de que el calor es menos eficaz en materiales secos, se aplica una
temperatura de 170 °C durante dos horas o 180 °C por una hora.
El calor como método de esterilización actúa desnaturalizando las proteínas y los ácidos nucleicos de
la célula y fragmentando las membranas celulares.
Flameo:
32
La llama es un agente esterilizador eficaz, y el más simple de todos. Es frecuentemente utilizado para
esterilizar el asa bacteriológica para sembrar o resembrar un cultivo. Al flamear el asa, debe evitarse
de ser posible, que dicha asa lleve grandes cantidades de material biológico, pues éste podría “saltar”
diseminándose partículas infectantes.
A veces para instrumentos como tijeras, hojas de bisturí o pinzas, se puede esterilizar el material
mojándolo con alcohol y encendiéndolo éste. Se debe repetir varias veces para lograr una
esterilización completa. El método es rápido, pero produce carbonización y pérdida del filo.
Radiaciones ionizante y no ionizante:
La radiación ultravioleta provoca daño en el DNA, la luz ultravioleta induce el entrecruzamiento entre
pirimidinas adyacentes en una u otra de las dos tiras de polinucleótidos, formando dímeros
pirimidínicos, las radiaciones ionizantes producen roturas en las tiras sencillas y en las dobles.
Pueden emplearse también ondas supersónicas o ultrasónicas para romper o desintegrar a la célula.
Filtración a través de Membranas
Algunas sustancias no pueden ser esterilizadas por calor húmedo o seco pues son termolábiles, es
decir que se desnaturalizan o que pierden alguna propiedad deseable, en tal caso se utilizan sistemas
de filtración de membranas para retener a los microorganismos. Aquí debemos de conocer las
dimensiones del microorganismo a eliminar para poder utilizar el filtro adecuado (diámetro).
Los filtros utilizados son fabricados con porcelana, cuarzo, tierra de diatomeas, vidrio pulverizado,
asbesto o esteres de celulosa, para el caso de los filtros de la marca Millipore se utiliza como
bioindicador a Brevundimonas diminuta para filtros con un diámetro de poro de 0,22 µm
2 Métodos químicos Gases (oxido de etileno) y líquidos (formaldehído y β propiolactona)
Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógeno lábiles como los que tiene grupos
carboxilos, amino, sulfhidrilos e hidroxilos. Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en
la industria farmacéutica, sirve para esterilizar material termosensible como el plástico, equipos
electrónicos, bombas cardiorrespiratorias. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo y
además cancerígeno, por lo que se suministra normalmente con una concentración entre el 10 y el 20
% de CO2. La concentración de óxido de etileno, la humedad y la temperatura influyen sobre la
velocidad de esterilización. Un objeto limpio puede esterilizarse si se trata de 5 a 8 h a 38 °C o de 3 a
4 h a 54°C, cuando la humedad relativa se mantiene entre el 40 y el 50 % y la concentración de óxido
de etileno es de 700 mg/L. Una vez esterilizado el material es necesario airear para eliminar el óxido
de etileno residual porque es muy tóxico.
La β-propiolactona se emplea para esterilizar vacunas y suero, se degrada hasta una forma inactiva
después de varias horas y, por ello, no es tan difícil de eliminar. Destruye a los microorganismos más
33
rápidamente que el óxido de etileno, pero no penetra tan bien en los materiales y puede ser
cancerígena.
3 Métodos bacteriológicos para verificar las técnicas de esterilización (Pruebas de esterilidad).
En todo lugar en donde se realice esterilización se debe de contar con indicadores de calidad que
manifiesten que la esterilización se ha llevado correctamente y que dicho material se encuentra estéril,
para ello existen en el mercado varios indicadores que se introducen con el material a esterilizar y
posteriormente se verifica un cambio de color o turbidez de la ampolleta.
Método de la tira de papel
Existen en el mercado tiras impregnadas con esporas de Geobacillus stearothermophilus se

presentan en una envoltura con dos compartimientos. En el primero está la tira testigo, que se ha
esterilizado (testigo negativo) y en el otro compartimiento se encuentran dos tiras, una de las tiras se
saca (problema y testigo positivo) y se coloca en un recipiente que se va a esterilizar en la forma
habitual. Luego las tiras se vuelven a su compartimiento correspondiente y se incuban por 7 días a 55
°C en caldo de soya y tripticaseína. Las esporas sobre las tiras testigos se desarrollan, pero si la
esterilización no fue la correcta habrá desarrollo en la tira testigo.
Método de la ampolleta:
Son ampolletas que contiene una suspensión de Geobacillus stearothermophilus en medio de cultivo.
La temperatura óptima para el desarrollo de este microorganismo se encuentra entre 50 y 65°C;
dentro del medio líquido se encuentra un indicador que es el púrpura de bromocresol. Al utilizarla se
debe colocar la ampolleta en el interior del compartimiento que va a esterilizar el material, después de
terminar la esterilización, las ampolletas (sin abrir) se incuban entre 55 y 65 °C durante 24 h, el
enturbamiento y la aparición de un color amarillo indica una esterilización defectuosa, en cambio si el
color permanece igual durante varios días de incubación el equipo está funcionando bien. Debe
llevarse el control constituido por una ampolleta que no se pone en el equipo, incubada en las mismas
condiciones, debe mostrar desarrollo bacteriano y el medio se vuelve amarillo.
Métodos físicos para esterilizar:
A veces, para instrumentos como hojas de bisturí, tijeras o pinzas, se puede esterilizar el material
mojándolo con alcohol y encendiendo éste. Se debe repetir varias veces para lograr una esterilización
completa. El método tiene la ventaja de ser rápido peor se produce carbonización y perdida de filo.
Pueden emplearse ondas supersónicas o ultrasónicas de 9000 ciclos / s, para romper y desintegrar
las células. Se cree que las bacterias se dañan y destruyen por la formación de pequeñas burbujas de
gas en la suspensión a consecuencia de las ondas sonoras.
3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO

34
3.1 EQUIPO
• Autoclave a 121° C • Incubadora a 35° C
• Autoclave a 110 ° C • Baño María a 55°C
• Horno a 170 ° C • Termómetros de 150 y 200 °C
3.2 MATERIAL (Material para demostración del profesor por sección)
• Dos botes de lámina • Una jeringa de 5 ml

• Un cilindro pipetero • Una pinza de disección
• Un cilindro para cajas de Petri • Una tijera de disección
• Dos filtros estériles swinnex con empaque • Un matraz con 50 ml de suspensión de
• Tres matraces de 125 ml con 50 ml de Escherichia coli (suspensión turbia)
Caldo nutritivo (CN) estéril • Contenedor para punzocortantes
Material por equipo
•Tres cuadros de papel aluminio de 8X8 cm • Una tira de 3 X 0,5 cm impregnada con
para tapón de tubo esporas de Geobacillus stearothermophilus
•Tres cuadros de papel aluminio de 20X20 • Dos tubos de 16 X 150 mm sin tapón.
cm para envolver pinza o tijera • Cuatro cajas de Petri limpias
•Tres cuadros de papel aluminio de 12X12 • Tres pipetas de 10 ml limpias
cm para tapón de matraz • Cuatro matraces de 125 ml
•Tres cuadros de papel Kraf de 18X14 cm • Un matraz de 250 ml.
para gorro de matraz • Algodón suficiente para tapones de matraces
•Tres cuadros de papel Kraf de 15X25 cm • Tres tubos de ensaye de 13 X 100 mm sin
para gorro de matraz tapón
•Tres cuadros de papel Kraft de 20 X 20 cm • Un tubo de ensaye de 13 x 100 sin tapón
para cubrir un bote de lámina. • Dos tubos de ensaye con 3 ml de caldo
•Tres cuadros de papel Kraf de 6 X 60 cm nutritivo sin esterilizar (se preparan el día de la
para envoltura de pipeta de 10 ml. práctica)
•Tres cuadros de papel Kraf de 33 X 40 cm • Tres tubos de ensaye con 3 ml de caldo
para caja de Petri nutritivo estéril
•Tres cuadros de papel Kraf de 22x22 cm • Un frasco con alcohol
para envoltura de pinza o tijera. • Tres matraces con 50 ml de caldo nutritivo
•Tres cuadros de gasa doble de 12X20 cm estéril
para tapón de matraz. • Tres cuadros de gasa doble de 7 X 15 cm para
•Tres cuadros de gasa doble de 15 X 25 cm tapón de tubo
para tapón de matraz.
3.3 MEDIOS DE CULTIVO
• Caldo nutritivo
• Reactivos comerciales (esporas indicadoras de esterilización). Ampolletas con un disco con
esporas.
• Un matraz con 50 ml de una suspensión microbiana de Escherichia coli
35
PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN
.1 Lavado de material de vidrio e instrumental
a) Utilizando escobillones para pipetas, tubos y matraces y una fibra suave para las cajas de Petri,
lavar el material que se va a esterilizar, utilizando de preferencia un detergente neutro.
b) Enjuagar suficientemente con agua de la llave
c) Enjuagar con agua destilada, escurrir y secar en el horno o dejarlos secar a temperatura
ambiente.
4.2 PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO
4.2.1 TUBOS DE ENSAYO
a. Tapar 2 tubos de 16 x 150 mm con tapones de algodón siguiendo las indicaciones del profesor
b. Colocar los tubos en un bote de lámina, taparlos con papel Kraft y asegurarlos con una liga,
anotar fecha, equipo, grupo, medida de los tubos y cantidad preparada.
4.2.2 CAJAS DE PETRI
a) Envolver 8 cajas de Petri con papel Kraft siguiendo las indicaciones del profesor. Anotar en el
papel, la cantidad de cajas envueltas, fecha, equipo, número de equipo de laboratorio y grupo.
4.2.3 PIPETAS
a. Colocar en la boquilla de cada una de las pipetas un tapón de algodón cuidando que no quede
muy compactado, utilizar para ello una aguja de disección o un clip
b. Flamear en la flama del mechero las boquillas de las pipetas a fin de eliminar el exceso de
algodón
c. Envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft, fijar el extremo
con masking-tape y anotar sobre el papel la capacidad de la pipeta, la fecha, el grupo y el número de
equipo de laboratorio. Con una fecha indicar el sentido de la punta de la pipeta.
4.2.4 MATRACES
a. Colocar en la boca de cada matraz un tapón compacto de algodón, envuelto con gasa, siguiendo
las instrucciones del profesor.
b. Con papel Kraft, elaborar un gorro ligeramente más grande que el tapón de algodón.
c. En una tira de Masking-tape anotar la fecha, grupo y equipo, adherir el Masking-tape al matraz.
No anotar los datos sobre el gorro de papel.
4.2.5 PINZAS Y TIJERAS

36
a. Envolver con papel Kraft una pinza o tijera y con lápiz señalar con una flecha la punta.
b. Anotar en el papel la pieza de que se trate, la fecha, grupo y equipo.
4.3 PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO
4.3.1 TUBOS DE ENSAYE
a. Colocar en 2 tubos de ensaye, una cubierta de aluminio y colocarlos en una canastilla metálica.
b. Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, grupo y equipo, sujetar el papel con masking-tape.
c. Los tubos o frascos con tapa de baquelita, nunca deben cerrarse completamente.
4.3.2 CAJAS DE PETRI
a. Colocar en el interior de un cilindro de acero inoxidable para cajas de Petri dos cajas en posición
invertida perfectamente secas. (NUNCA ESTERILIZAR POR ESTE MÉTODO MATERIAL
CONTAMINADO)
b. Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, el número de cajas que contiene el cilindro, el grupo y
la fecha. Colocar la tira de papel entre la tapa del cilindro.
4.3.3 PIPETAS
a. Poner en la boquilla de cada pipeta un tapón de algodón no muy compactado a o floja
b. Flamear las boquillas en la flama a fin de eliminar el exceso de algodón.
c. Colocar en el interior de un cilindro pipetero, las pipetas preparadas.
d. Anotar en una tira de papel Kraft la cantidad de pipetas, su capacidad, fecha, grupo y equipo. Fijar
la tira entre la tapa del cilindro pipetero.
4.3.4 MATRACES
a) Colocar en la boca de un matraz de 125 ml una tapa de papel aluminio.
b) En una tira de papel Kraft anotar fecha, grupo y equipo. Fijar la tira al cuello del matraz sujetándolo
con masking-tape o etiquetar con un marcador indeleble.
4.3.5 PINZAS Y TIJERAS
a) Envolver en papel aluminio una pinza o una tijera.
b) En una tira de masking-tape, anotar fecha, grupo y equipo. Fijar el masking-tape a la envoltura.
4.4. REDUCCIÓN DE LA CARGA MICROBIANA (PROCEDIMIENTO DE ESTERILIZACIÒN POR

CALOR HUMEDO)
37
a. En un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo estéril etiquetarlo. (Etiqueta con
la siguiente información, grupo, equipo, temperatura efectuada y fecha) y colocarle una tira de esporas
de Geobacillus stearothermophilus.
b. Someterlo a una presión de 10 libras por 10 minutos.
c. Sacar el tubo e incubar el tubo a 55 oC ± 2°C durante 5 días en baño maría y observar
diariamente durante el tiempo señalado. Anotar en la bitácora de laboratorio cualquier cambio en
cuanto a la aparición de turbidez.
4.5 ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO
a) Tomar un tubo de de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo estéril y etiquetarlo
b) En un tubo de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo colocar una tira de esporas de Geobacillus
sthearothermophilus, cerrar el tubo y esterilizarlo a 121 °C, 15 min y 15 lb.
c) Sacar el tubo e incubarlo a 55 oC ± 2°C por 5 días en baño maría y observar diariamente. Anotar en
la bitácora cualquier cambio en cuanto a la aparición de turbidez.
Pasos para realizar una buena esterilización:
♦ -Tener cuidado de eliminar todo el aire de la autoclave.

♦ -Colocar agua suficiente hasta el nivel de la rejilla o en la marca de la autoclave vertical
♦ - -Observar que el manómetro registre la presión
♦ -Si se está utilizando la autoclave vertical utilizar agua destilada.
♦ -Al terminar de esterilizar dejar la autoclave limpia
4.6 ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO
a. Encender el horno una hora antes y colocar el material para esterilizar por calor seco, cuando la
temperatura este a 170 oC tomar el tiempo de dos horas o 180 oC por una hora, verificando que la
temperatura sea la indicada.
b. En un tubo de ensaye sin esterilizar y vacío, colocar una tira de papel filtro que contenga esporas
de Bacillus subtilis var. niger, cubrir el tubo con papel aluminio y colocarlo junto con el material a
esterilizar. Esterilizar a 170 oC/2 h, etiqueta el tubo de preferencia con un marcador indeleble.
c. Después de transcurrido el tiempo de esterilización, apagar el horno y esperar a que el

termómetro indique la temperatura ambiente. Abrir, retirar el material y el tubo de ensaye con la tira de
esporas.
d. Con ayuda de la pinza estéril (flamear con alcohol) y bajo condiciones de esterilidad, colocar la
tira de papel filtro conteniendo las esporas de Bacillus subtilis a un tubo de ensaye que contenga 3 ml
38
de caldo nutritivo estéril y etiquetado. Incubar a 55 ± 2oC durante 5 días. Observar diario y anotar
cualquier cambio en cuanto a la aparición de turbidez.
4.7 CONTROL POSITIVO Y CONTROL NEGATIVO
a) Colocar un tubo con 3 ml de caldo nutritivo estéril con una tira de esporas de Geobacillus
stearothermophilus como testigo positivo del procedimiento.
b) Colocar un tubo con 3 ml de caldo nutritivo estéril sin tira de esporas, es el testigo (-).
4.8 PROCESO DE FILTRACIÓN A TRAVÉS DE MEMBRANA
Sistema de filtración Swinnex marca Millipore
a. Colocar 10 ml de la sustancia a filtrar en una jeringa desechable, remover el swinnex estéril del
empaque de papel al que previamente se le ha colocado la membrana y ensamblar la jeringa.
b. Filtrar gota a gota y recibir el filtrado en un matraz con caldo nutritivo estéril, la jeringa y el filtro
colocarlo en un bote de lámina para su esterilización. Incubar el filtrado a 35 ± 2 oC de 48 a 72 h.
c. Observar diariamente y anotar en la bitácora del laboratorio cualquier cambio en cuanto a la

aparición de turbidez durante 3 días.
d. El bioindicador utilizado en la filtración a través de membrana es Brevumdimonas diminuta, para

membranas con un diámetro de poro de 0,22 µm
Esterilización de material de desecho
-El material (pipetas o cajas de Petri) utilizado con suspensiones microbianas o con medio de cultivo,
nunca se esterilizan por calor seco
5. CUESTIONARIO
5.1 ¿Cuál es la finalidad de utilizar agua destilada en el enjuagado del material?
5.2. ¿Por qué utilizamos el papel Kraft para envolver el material?
5.3 Completa el siguiente cuadro, anotando la presencia o ausencia de turbidez en los tubos
5.4 Explicar por qué utilizamos un tapón de algodón en las pipetas, en matraces y tubos de ensaye
5.5 Qué explicación darías si después de la esterilización, el tubo que contiene la tira de esporas hay
crecimiento después de la incubación.
Método Tratamiento Calor húmedo Calor seco Filtración a Control Control

110°C/10´10 lb través de negativo
121°C/15´/15lb 170°C/2 h membrana positivo
Resultado
39
(turbidez)
6.1 Discutir cuales son los inconvenientes o riesgos de preparar el material con papel aluminio y papel
Kraf para su esterilización por calor seco y húmedo.
7. CONCLUSIONES
7.1 Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de estos, así
como a la bibliografía consultada y los objetivos de la práctica.
40
PRÁCTICA No. 4
NUTRICIÓN Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS AERÓBICOS
1.- OBJETIVOS
1.1 Objetivo General.
El alumno preparará diferentes medios de cultivo en base a sus componentes, uso y consistencia,
utilizando la NOM-065 SSA1-1993 Que establece las especificaciones sanitarias de los medios de
cultivo y los utilizará para cultivar microorganismos.
1.2 Objetivos específicos
2.1 El alumno preparará medios de cultivos complejos, diferenciales, enriquecidos, indicadores y

sintéticos de acuerdo a la NOM–065-SSA-1993, a las necesidades nutricionales de un
microorganismo, los esterilizará y vaciará para su uso.
2.2 Utilizará los medios de cultivo de acuerdo a su presentación final para cultivar microorganismos y
comparará el crecimiento de acuerdo a la clasificación.
2.- INTRODUCCIÓN
Las células están formadas por grandes cantidades de pequeñas moléculas como agua, iones
inorgánicos, carbohidratos y aminoácidos y contienen un número todavía más pequeño de moléculas
grandes, los polímeros de las células, siendo los más importantes las proteínas y los ácidos nucleicos.
La célula puede obtener la mayoría de las moléculas pequeñas de su medio ambiente de manera
preformada, mientras que las grandes moléculas son sintetizadas dentro de ellas. Existen complejas
interrelaciones entre los compuestos incorporados por la célula y los que son sintetizados.
Nutrición.
A las sustancias en el medio ambiente utilizadas por los organismos para el catabolismo y el
anabolismo se les llama nutrientes, y pueden dividirse en dos clases:
a.- Nutrientes necesarios, sin los cuales la célula no podría crecer.
b.- Nutrientes útiles, pero no indispensables, que se emplean si están presentes pero no son
esenciales. Algunos nutrientes son monómeros a partir de los cuales las células forman las
macromoléculas y otras estructuras, mientras que otros nutrientes sirven solo para la obtención de
energía sin ser incorporados directamente en las sustancias celulares, aunque en ocasiones un
nutriente puede desempeñar ambas funciones. Las sustancias pueden dividirse en dos grupos:
macronutrientes y micronutrientes, dependiendo de si son necesarios en cantidades grandes o
pequeñas respectivamente y factores de crecimiento como compuestos orgánicos, vitaminas, ácidos
orgánicos etc. Es fácil detectar cuando se requiere un macronutriente, simplemente porque se
necesita en gran proporción. Frecuentemente los micronutrientes son necesarios en cantidades tan
pequeñas que es imposible determinar cuánto se requiere; muchas veces ni siquiera se sospecha que
un micronutriente esté presente en el medio en que un microorganismo está creciendo, debido a que
41
los componentes del medio pueden contener tales micronutrientes en pequeña cantidad como
contaminantes.
Los microorganismos se desarrollan a partir de sustancias nutritivas que obtienen del medio que las
rodea. Los microorganismos se desarrollan en medios de cultivo que contienen los nutrimentos
adecuados para cada uno y requeridos para la síntesis de sus constituyentes celulares, además estos
medios proporcionan las condiciones de pH, osmolaridad y humedad que le permiten crecer.
Existe una gran diversidad de sustancias que pueden utilizarse en la preparación de medios de
cultivo, formulado con un fin específico, y el cual deberá contener:
a) Fuente de carbono
b) Fuente de nitrógeno
c) Fuente de azufre
d) Factores de crecimiento (que actúan como cofactores, oligoelementos como aminoácidos o
vitaminas que no pueden sintetizar)
e) Fuente de enriquecimiento para microorganismos exigentes (huevo, sangre, suero etc).
f) Inhibidores de crecimiento microbiano como los colorantes, sales biliares, detergentes, antibióticos
o metales pesados.
g) Indicadores de potencial oxido-reducción.
h) Agar como el agente gelificante o soporte.
Medios de cultivo: Según la NOM-065-SSA-1993. Que establece las especificaciones sanitarias
de los medios de cultivo. Generalidades.
Medios selectivos.
Son medios que contienen sustancias que impiden el desarrollo de algunos microorganismos, pero en
una flora mixta permiten el aislamiento y recuperación del germen o grupo de gérmenes de interés.
Medios selectivos de enriquecimiento.
Son medios líquidos que estimulan la multiplicación de algún germen determinado e impiden o inhiben
la reproducción de otros.
Medios diferenciales.
Son aquellos que contienen indicadores de ácido base, redox o sustancias que detectan cambios en
el medio o en las características típicas de las colonias.
Medios para cultivar gérmenes anaeróbicos.
Son medios de cultivo para aquellos gérmenes que requieran condiciones de anaerobiosis o de
microaerofilia.
Medios de transporte.
Sirven para transportar los especímenes que contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del
producto hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio.
42
Estos medios impiden que se altere la proporción original de la flora microbiana en los especímenes.
Medios para filtración a través de membrana.
Pueden ser líquidos o sólidos. En el primer caso, se preparan a la concentración usual y permiten el
crecimiento de microorganismos presentes en la membrana.
Los medios sólidos tienen un contenido mínimo de agar para favorecer la difusión de nutrientes del
medio de la membrana.
Medios especiales para cultivo de hongos y levaduras.
En el caso de los hongos, el medio de cultivo que más se utiliza es el agar de papa y dextrosa, ya que
tiene un pH de 3,5 lo que inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias. Este medio puede ser
más selectivo al adicionarle ciertos antibióticos tales como: cloranfenicol, eritromicina o gentamicina;
para eliminar los hongos filamentosos de rápido crecimiento se adiciona cicloheximida (este medio se
llama mycosel o micobiótico). Se emplea también el medio de agar extracto de malta y el agar rosa de
bengala se emplea para inhibir el crecimiento radial de hongos con micelio cenocítico.
En la formulación de un medio de cultivo deben considerarse, no sólo el tipo de microorganismo, y el

objetivo final que se persiga: aislamiento, recuento, identificación u obtención de masa celular.
Por otro lado, es de suma importancia los cuidados que deben observarse en la preparación de los
medios de cultivo como son:
a. La calidad del agua utilizada (que se prefiere libre de sales)
b. Los materiales que deben encontrarse en condiciones de limpieza
c. Si se debe aplicar calor y cuánto para no incurrir en problemas de homogeneidad,
desnaturalización, caramelización o pérdida de actividad nutricional.
d. pH final del medio que deberá ajustarse según indicaciones del fabricante
e. Esterilidad del medio de cultivo de acuerdo a indicaciones del fabricante si es una formulación
comercial, o en otras condiciones si los componentes lo requieren.
Cultivo microbiano.
Los microorganismos obtenidos a partir de suelo, aire, alimentos se encuentran en consorcio y en

raras ocasiones se encontrará un solo tipo de microorganismo. A partir del cultivo inicial de una
muestra, se encontrará una variedad de tipos de colonias y posteriormente se pretenderá lograr un
cultivo puro. Un cultivo puro es aquel que está constituido por microorganismos de la misma especie.
El cultivo de microorganismos se puede realizar en medio sólido, semisólido o líquido.
Se conoce como cultivo en medio sólido al que se hace en una caja Petri con el medio de cultivo
gelificado (agar). Las variantes del cultivo en caja son diversas, pero todas se centran en la formación
de estrías sobre la superficie del medio de cultivo con el asa en el caso de bacterias y por picadura
(introduciendo el asa en el agar) si se trata de hongos filamentosos.
43
Las siembras en tubos con medio sólido, por lo general se emplean para la conservación de un cultivo
proveniente de una placa.
Existen dos variedades de cultivo en tubo:
a) Por estrías: se utilizan los medios de cultivo inclinados, se toma una muestra de alguna colonia
inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se arrastra el asa en forma zigzagueante en el medio
por la superficie inclinada del agar.
b) Por picadura: se utilizan los medios de cultivo en un tubo solidificado ó semisólido en forma
inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se introduce en el medio picándolo
longitudinalmente.
La siembra en tubos de cultivo en medio líquido se realiza tomado el inóculo con el asa y se introduce
en el medio líquido agitando suavemente el asa.
a) Desarrollo en medio sólido inclinado. Se siembran los microorganismos por estría en tubos
con agar inclinado
b) Desarrollo en medio líquido. Las características que se observan en el cultivo son: turbidez,
un sedimento, una película superficial, o combinados.
c) Desarrollo en medio semisólido por picadura hasta ¾ partes del tubo
Mediante la evaluación de las características de las colonias descritas y la acción en el medio, se
puede hacer una identificación preliminar de los diferentes microorganismos aislados en un cultivo
primario. Estas características son útiles para seleccionar otros medios y pruebas diferenciales
apropiadas para completar la identificación de los microorganismos, aunque cabe señalar que la
identificación de microorganismos por el estudio de sus características de cultivo es solo parcial ya
que se requiere otras pruebas bioquímicas, fisiológicas e inmunológicas.
Agar bacteriológico
El agar utilizado en bacteriología es un medio que está libre de metales, compuestos nitrogenados,
sales insolubles, azúcares libres, microorganismos muertos, bacterias termófilas y pigmentos.
El agar es una sustancia coloidal desecada que se extrae de algunas especies marinas de algas
rojas, particularmente de los géneros Gelidium, Gracilaria, Pteroclaida y Acanthopeltis, químicamente
el agar es una mezcla de dos polisacáridos: agarosa y la agaropectina, cuyas estructuras se revelan
como polímeros de la galactosa en sus distintas formas. La proporción de agarosa y agaropectina es
variable, con valores extremos de 75 % de agarosa y 25 % de agaropectina, según la clase de algas
utilizadas. El agar con agua destilada fría tiene un poder de hinchamiento superior a veces al 3000%,
en agua hirviendo el agar se disuelve totalmente en pocos minutos. La tendencia a la unión de sus
partículas, que en frío se mantienen independientes producen un gel limpio y transparente que, al
44
enfriarse, ya no cede el exceso de agua absorbida. La viscosidad del gel aumenta paulatinamente a
medida que la solución disminuye en su temperatura, gelificando a los 35 – 40 °C.
Los ácidos diluidos en frío, no alteran sensiblemente el agar, desde que se introdujo el agar a los
medios de cultivo como agente gelificante ha resultado muy bueno debido a que:
a) Su estructura le confiere gran estabilidad frente a las enzimas microbianas, muy pocas bacterias
marinas son capaces de hidrolizar como Pseudomonas carragenomora.
b) Su estabilidad química, le permite mantener el medio en estado sólido.
c) Su punto de fusión, superior a 80 °C, permite cultivar en medio sólido bacterias termófilas que se
incuban hasta temperaturas de 65 °C.
d) Su temperatura de gelificación, inferior a los 39 °C, permite mezclarlos en forma líquida.
e) Su elevado poder gelificante permite su utilización a muy bajas concentraciones, generalmente al

1,5 % (m/v) permitiendo obtener geles muy firmes, lo que permite sembrar microorganismos.
f) Su empleo en concentraciones muy bajas permite la obtención de medios semisólidos en los

cuales se pueden realizar pruebas de movilidad.
Clasificación de medios de cultivo
I Los medios de cultivo por su estado de agregación pueden ser: líquidos, semisólidos y
sólidos
a) Medios líquidos. Este medio no contiene agar y se emplea para obtener grandes cantidades de
microorganismos o bien para la producción de algún metabolito.
b) Medios semisólidos. Se utiliza para determinar si un microorganismo tiene movilidad.
c) Medios sólidos. Se utiliza para obtener colonias aisladas de microorganismos.
II.- Por su uso se clasifican en:
a) Medios selectivos. - Son medios que contienen sustancias que inhiben el crecimiento de algunos
microorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperación del microorganismos
o grupo de microorganismos de interés.
b) Medios de enriquecimiento. Son medios que estimulan la multiplicación de algún

microorganismo.
c) Medios selectivos de enriquecimiento. - Son medios que estimulan la multiplicación de algún

germen determinado e impiden la reproducción de otros.
d) Medios diferenciales. - Son aquellos que contienen indicadores ácido base y de redox para
detectar cambios en el medio o en las características típicas de la colonia.
45
e) Medios para cultivar gérmenes anaeróbicos. - Son medios de cultivo para aquellos gérmenes
que requieran condiciones anaeróbicas o de microaerofilia. Incluyendo medios reductores como el
caldo tioglicolato y el uso de jarras de anaerobiosis.
Para los microorganismos anaeróbicos es necesario darles ciertas condiciones reductoras o incubar en
estufa con CO2
III. Por su composición
a) Si a un medio se le conoce completamente su formulación química se denomina medio sintético

como el caldo glucosa sales.
b) Si un medio de cultivo no conocemos su composición química se le denomina un medio complejo

como el agar base sangre.
Acorde a la presentación de un medio, podemos tener cultivos líquidos en matraz, en tubo medios
semisólidos y en placa medios sólidos.
IV.- Medios de cultivo para medir la actividad antimicrobiana (antibiograma).
Los medios para realizar antibiogramas o para medir los halos de inhibición de sustancias
desinfectantes o antisépticas generalmente son medios que no contienen inhibidores como el agar
Mueller Hinton, agar cuenta estándar y agar de soya y tripticaseína.
Para cada medio de cultivo se deben de introducir controles, por ejemplo, para el Agar de papa y
dextrosa se siembran las siguientes cepas de referencia.
Microorganismo Cepa Resultado

Candida albicans ATCC 10231 Bueno
Saccharomyces cerevisiae ATCC9763 Bueno
Trichophyton mentagrophytes ACTT9533 Bueno
Para el agar con eosina y azul de metileno los controles de actividad son:
Microorganismos Cepa Resultado

Escherichia coli ATCC 25922 Colonias moradas con brillo metálico azul verdoso
Enterobacter aerogenes ATCC 13048 Colonias mucoides con centro oscuro por lo general sin brillo
metálico
46
Salmonella typhimurium ATCC 14028 Colonias incoloras y transparentes

Shigella flexneri ATCC 12022 Colonias incoloras y transparentes
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Crecimiento parcialmente inhibido o colonias puntiformes
Candida albicans ATCC 10231 Colonias plumosas de color rosa pálido.
3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS

3.1 MATERIAL POR GRUPO Sesión I
●Balanza granataria ●Potenciómetro
●Autoclave ●Algodón
●Horno 170° C ● Gasa
• Papel Kraf • Refrigerador
♦Incubadora a 28° C ♦ Incubadora a 37° C
3.2 MATERIAL POR EQUIPO (Sesión I)
●Un mechero Fisher ●Una pipeta de 10 ml
●Una espátula ●Cinco tubos de ensaye de 13 x 100 mm
●Seis matraces de 250 ml ● ●Una probeta de 100 ml
●Siete tubos de ensaye de 16 x 150 mm ●Un termómetro
●Dos matraces de 125 ml Seis cajas Petri
Sesión II
♦ Tres tubos con 3 ml de medio SIM ♦ Un matraz con 50 ml de caldo glucosa sales
♦ Tres cajas con agar EMB ♦ Un matraz con 50 ml de caldo nutritivo
♦ Tres tubos con agar PDA ♦ Tres tubos con agar nutritivo
♦ Tres cajas con agar nutritivo ♦ Tres cajas con un medio enriquecido
♦ 3 tubos con 3 ml de caldo glucosa sales ♦ 3 tubos de caldo nutritivo
3.3 REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO
●Agar nutritivo (AN) ●(NH4) 2SO4
●Agar eosina azul de metileno (EMB) ●K2HPO4
●Agar de papa y dextrosa (PDA) ●MgSO4 . 7H2O
●Medio SIM ●MnSO4 . 4H2O
●Glucosa ●Agar bacteriológico
• Agar base sangre • Agar rosa de bengala
• Escherichia coli • Penicillum sp.
• Bacillus sp. • Aspergillus sp.
4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL
Recomendaciones generales para la preparación de los medios de cultivo.
a) Preparar el volumen de medio que se vaya a utilizar en el período recomendado para su empleo.
b) Utilizar agua destilada y material de vidrio libre de detergentes.
c) Pesar la cantidad del medio que marca el fabricante (en la etiqueta)
d) El medio de cultivo en polvo debe de guardarse en su frasco y en un lugar fresco.
47
e) Emplear recipientes con el doble de capacidad al volumen que se va a preparar para evitar la
proyección en el momento de la ebullición.
f) Añadir una pequeña cantidad de agua para permitir la disolución y después completar el volumen.
g) En general los medios se mezclan hasta disolución completa para aclararse, pero debe evitarse
que se derramen. Nunca deben calentarse a la flama directa del mechero para evitar que se
proyecten.
h) El pH de los medios debe ajustarse antes de la esterilización y a una temperatura de 25° C.
i) Es conveniente evitar el sobrecalentamiento durante la esterilización por calor para evitar la
pérdida de materiales nutritivos y agua que puedan cambiar la consistencia del medio.
j) Los medios de cultivo ya preparados y esterilizados deben mantenerse en refrigeración (4° C) y
protegidos de la luz. Antes de emplearlos verificar que no exista contaminación, precipitación, cambio
de color o de consistencia etc.
k) Un medio contenido en un matraz y que ya contenga sustancias de enriquecimiento ó ácido

tartárico no puede ser esterilizado una segunda ocasión.
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
4.2 MEDIO SINTÉTICO (glucosa-sales caldo y agar)
a) Preparar 100 ml de caldo o la cantidad que indique el profesor.
b) Pesar cuidadosamente los componentes del medio de acuerdo a la siguiente formulación:
Reactivos Cantidad
Glucosa 5.0
(NH4) 2SO4 2.0
KH2PO4 0.05
K2HPO4 0.05
MgSO4 . 7H2O 0.25
MnSO4 . 4H2O 0.001
Agua destilada 1000 ml
c) Disolver los componentes por separados y colocarlos en un matraz de 250 ml, adicionar en primer
lugar los metales, luego los fosfatos, el amonio y finalmente la glucosa. Ajustar el pH a 7.0 ± - 0.2 si
fuera necesario, para ello utilizar el potenciómetro.
d) Una vez disueltos los componentes transferir 30 ml a un matraz Erlenmeyer de 125 ml, colocarle el
tapón de algodón su gorro de papel Kraf y colocarlo en la autoclave.
e) Tomar 3 tubos y colocarles 3 ml de caldo glucosa sales, taparlos y colocarlo en un bote.
48
f) Medir el volumen que sobra del caldo y realizar la operación matemática, de tal forma que la
concentración de agar a adicionarle sea 1.5 g de agar bacteriológico/ 100ml de medio.
g) Calentar a ebullición hasta que se haya fundido completamente.
h) Tomar 3 tubos de ensaye y colocarle aproximadamente 3 ml, taparlos y colocarlos en el bote de

lámina para su esterilización.
i) El medio que ha sobrado colocarle el tapón y su gorro e introducirlo a la autoclave.
j) Esterilizar todo el material anterior en autoclave a 110° C durante 15 minutos. Una vez que se ha
llevado a cabo la esterilización, inclinar los tubos que tienen agar.
k) Enfriar el matraz hasta 45° C y en condiciones asépticas transferir del matraz de 15 a 20 ml de

medio en cajas de Petri estériles y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.
l) Etiquetar con los datos correspondientes cada caja (en la base de la caja) colocar el masking tape
o con marcador indeleble Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas en posición invertida.
m) Dejar una muestra para control de esterilidad por 5 días y el resto de material conservarlo en
refrigeración para su uso.
4.3.1 MEDIO COMPLEJO (agar nutritivo para placas de Petri)
a) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad de
medio indicada por el profesor.
b) Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua necesaria.
c) Calentar suavemente hasta disolverlo completamente.
d) Tapar el matraz que contiene el medio con un tapón y gorro de papel Kraft.
e) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase.
f) Enfriar el matraz hasta 45° C y en condiciones estériles transferir del matraz de 15 a 20 ml de

g) Etiquetar con los datos correspondientes cada caja (en la base de la caja) colocar el masking tape
4.3.2 MEDIO COMPLEJO (agar nutritivo para preparar tubos de ensaye)
49
d) En un tubo colocar 3 ml de agua para ser utilizado como tubo de comparación y no usar una
pipeta.
e) Vaciar aproximadamente 3 ml de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm

limpios y etiquetados, taparlos con un tapón de algodón-gasa y colocarlos en un bote
f) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase, al término de
esta y calientes inclinar los tubos con el agar y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.
g) Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas.
4.3.3 MEDIO COMPLEJO (caldo nutritivo en matraz y tubo de ensaye)
a) Pesar la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar 60 ml de medio.
c) Calentar solo si es necesario hasta disolverlo completamente.
d) Medir con una probeta 50 ml y colocarlo en un matraz de 125 ml, colocarle su tapón y gorro
e) Vaciar tres ml de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm limpios y etiquetados,
taparlos con un tapón de algodón-gasa y colocarlos en un bote de lámina.
f) Esterilizar a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase y guardar en refrigeración.
4.4 MEDIO DIFERENCIAL Agar Eosina Azul de Metileno (EMB)
a) Pesar cuidadosamente la cantidad que dice el envase para preparar la cantidad que se indique.
b) Colocar el medio en un matraz con el doble del volumen y adicionarle el agua necesaria.
c) Calentar suavemente hasta disolución completa.
d) Tapar el matraz con un tapón de algodón-gasa y gorro de papel Kraft.
e) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del frasco
f) Enfriar el matraz hasta 45° C y en condiciones asépticas transferir del matraz de 15 a 20 ml de

4.5.1 MEDIO SELECTIVO (Agar Papa y Dextrosa para preparar cajas de Petri)
50
d) Tapar el matraz que contiene el medio con un tapón y gorro de papel Kraft.
e) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase.
f) Enfriar el matraz hasta 45° C y en condiciones estériles transferir del matraz de 15 a 20 ml de

4.5.2 MEDIO COMPLEJO (Agar Papa y Dextrosa para preparar tubos de ensaye)
d) En un tubo colocar 3 ml de agua para ser utilizado como tubo de comparación y no usar una pipeta.
e) Vaciar aproximadamente 3 ml de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm

limpios y etiquetados, taparlos con un tapón de algodón-gasa y colocarlos en un bote
f) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase, al término de
esta y calientes inclinar los tubos con el agar y permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.
g) Finalmente guardar en bolsas de plástico nuevas.
4.5.3 MEDIO SELECTIVO (Agar Papa y Dextrosa para preparar matraces con 80 ml)
h) Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar 80 ml del medio.
i) Colocar el medio en un matraz de 125 ml y adicionar el agua necesaria.
j) Calentar suavemente hasta disolverlo completamente.
k) Tapar el matraz previamente etiquetado que contiene el medio con un tapón y gorro de papel Kraft.
l) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase.
m) Este medio se utilizará para la realización de la técnica de vaciado en placa y para ello será
necesario fundir el medio y cuando este a 45 °C se le adicionará 1.4 ml de ácido tartárico al 10%
estéril por cada 100 ml de medio preparado y homogeneizar.
51
4.6 MEDIO INDICADOR medio SIM (Sulfur Indol Motility).
a) Pesar la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad solicitada.
b) Colocar el medio en un matraz del doble de capacidad y adicionarle agua necesaria.
c) Calentar suavemente hasta disolución completa y colocar 3 ml en tubos de 13 x 100 mm.
d) Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase
e) Dejar los tubos en el bote y dejar que estos solidifiquen en posición vertical.
4.7.-MEDIO ENRIQUECIDO AGAR SANGRE
a) Pesar la cantidad indicada para preparar cuatro placas según la etiqueta del frasco.
b) Fundir el medio con agua destilada, hasta que el medio este claro y sin grumos.
c) Colocar el tapón de algodón y el gorro y esterilizar, según indica el frasco.
d) Una vez esterilizado el medio, enfriarlo hasta que este a 45°C.
e) Cuando este a esa temperatura, adicionar 5 % de sangre estéril desfibrinada.
f) Mezclar bien la sangre y vaciar rápidamente en las placas previamente esterilizadas y etiquetadas.
g) Dejar solidificar el medio y colocarlas en una bolsa de plástico nueva en posición invertida y
guardarlas en el refrigerador.
4.8 AGAR ROSA DE BENGALA
a) Pesar la cantidad indicada para preparar cuatro placas según la etiqueta del frasco.
b) Fundir el medio con agua destilada, hasta que el medio este claro y sin grumos.
c) Colocar el tapón de algodón y el gorro y esterilizar, según indica el frasco.
d) Una vez esterilizado el medio, enfriarlo hasta que este a 45°C y vaciar en placas estériles
e) Dejar solidificar el medio y colocarlas en una bolsa de plástico nueva en posición invertida y
guardarlas en el refrigerador.
4.9 CONTROL DE ESTERILIDAD
a) Tomar una muestra de cada uno de los medios preparados para el control de la esterilización e
incubarlos a 35 °C durante 3 a 5 días.
b) Verificar que no presente crecimiento, cambio de color o precipitación.
Nota: estos medios se utilizarán para la siguiente sesión que es cultivo de microorganismos.
52
SESIÓN II
4.1 Revisar los medios de cultivo que se prepararon
4.2 CULTIVO EN MEDIO SÓLIDO EN PLACA (ESTRÍA CRUZADA, SIMPLE, POR PUNTO Y
MASIVA)
Se utilizarán cajas con agar EMB o Agar sangre para la realización de la estría cruzada.
a) Tomar el asa y esterilizarla al rojo vivo en la flama del mechero.
b) Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la boca del tubo por la flama.
c) Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar con ella el inóculo.
d) Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del mechero y colocarle el tapón.
e) Destapar la caja de EMB y sembrar al microorganismo por estría cruzada como se indica en el
esquema y esterilizar el asa cada vez que se realiza una estría.
f) Una vez sembrado el microorganismo incubar la caja sembrada a 37° C, durante 24 horas.
g) Observar el crecimiento a las 24 h y anotar las características del crecimiento.
Estría cruzada en medio solido e n placa
4.3. CULTIVO DE MICROORGANISMOS POR ESTRÍA SIMPLE EN PLACA
a) Tomar el asa y esterilizarla en la flama.
b) Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar

la boca del tubo por la flama.
c) Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar con ella el

inóculo.
d) Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del mechero y colocarle el tapón.
e) Destapar la caja de Agar nutritivo y sembrar como se indica en el esquema
f) Esterilizar el asa al terminar de efectuar la estría e incubar la caja sembrada a 37° C/ 24 h.
g) Observar el crecimiento a las 24 h y anotar las características del crecimiento.
53
4.4. CULTIVO DE MICROORGANISMOS POR PUNTO (generalmente para mohos)
a) Tomar la placa y dividirla en cuatro fracciones que

corresponden una para cada alumno y testigo
b) Tomar el asa y esterilizarla al rojo vivo en la flama.
c) Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la

boca del tubo por la flama del mechero.
d) Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar el inóculo.
e) Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del mechero y colocarle el tapón.
f) Destapar la caja de agar de papa y dextrosa y sembrar como se indica en el esquema.
g) Esterilizar el asa al terminar de efectuar la estría e incubar la caja sembrada a 28° C/3 - 5 días.
h) Observar el crecimiento a las 24h, 48h, 72h y 5 días, anotar las características del crecimiento.
4.5. CULTIVO DE MICROORGANISMOS POR ESTRÍA MASIVA
a) Tomar un hisopo estéril.
b) Destapar el tubo que contenga la suspensión del microorganismo y

pasar la boca del tubo por la flama del mechero.
c) Tomar un hisopo estéril y humedecerlo en la suspensión.
d) Pasar la boca del tubo por la flama y colocarle el tapón.
e) Destapar la caja de agar de soya y tripticaseína y sembrar como se indica en el esquema
f) Colocar el hisopo en el benzal para su desinfección e incubar la caja sembrada a 37 °C/24 h, y

observar el crecimiento.
4.6 CULTIVO EN TUBO EN MEDIO SÓLIDO INCLINADO
a) Se utilizarán tubos con agar nutritivo y agar papa dextrosa inclinada y AGS
b) Tomar una asada de la bacteria proporcionada y sembrar por estría en “S” la

superficie del medio inclinado de agar nutritivo.
c) Tomar una asada del (micelio y esporas) proporcionada y sembrar por estría en “S” la superficie
del medio inclinado de agar de papa y dextrosa.
d) Esterilizar el asa una vez realizada la siembra e Incubar los tubos sembrados a 37° C para
bacterias y a 28° C para hongos, durante 24 y 48 h respectivamente
e) Observar los cultivos a las 24 y 48 horas y anotar las características del cultivo.
54
4.7 CULTIVO EN MEDIO LÍQUIDO (Se emplearán tubos y matraz con caldo nutritivo y glucosa sales)
a) Tomar el inóculo de bacterias con el asa y disgregar éste

“agitándolo” en las paredes del tubo o matraz, evitar la
formación de grumos.
b) Tomar el inóculo de hongos con el asa en forma de L y

sembrarlo en el matraz o en tubo, procurando tomar esporas
y micelio para disgregarlo en el medio.
c) Esterilizar el asa una vez realizada la siembra.
d) Incubar los tubos y matraz con bacterias a 35° C/24 h, y el matraz con hongos a 28° C/ 5 días en
agitación a 120 rpm
e) Observar los cultivos a las 24 y 48 h y anotar las características observadas.
f) Los equipos designados por el profesor dejarán su matraz con moho o bacterias sin agitación.
4.8 CULTIVO EN MEDIO SEMISÓLIDO (Se emplearán tubos con medio SIM)
a) Tomar un inóculo de bacterias con el asa recta.
b) Sembrar por picadura, sumergiendo el asa hasta ¾ partes del medio SIM sin tocar el
fondo y sacar el asa verticalmente. (El crecimiento debe de darse en la línea de trazo en
el caso de que la bacteria sea no móvil, cuando es móvil el crecimiento se difunde a
través del medio). Esterilizar el asa una vez realizada la siembra.
c) Incubar los tubos a 37° C/ 24 h y observar los cultivos. Anotar las características del cultivo.
4.9 MORFOLOGÍA COLONIAL
Morfología colonial en placa para bacterias y levaduras
Una vez sembrada la placa la descripción de cada una de las colonias SEPARADAS debe incluir:
a. Tamaño: Diámetro en mm, La mayoría de los microorganismos forman colonias de tamaño limitado
al tiempo de incubación.
b. Forma: Es la apreciación general de su figura la cual puede ser:
c.- Elevación: Que puede ser:
55
d. Borde: Se refiere al contorno de las colonias y puede ser: Entero, ondulado, Lobulado, crenado,
filamentoso o rizado.
e. Color: Blanco, amarillo, negro, marrón, anaranjado, etc.
f. Aspecto: Húmedo o seco
g. Consistencia: Suave (butirosa), viscosa, membranosa o dura. Esta prueba se realizar con el asa.
Morfología colonial en placa para mohos:
Tiempo de crecimiento: Los mohos tienen colonias de 2-3 cm de diámetro y va de 3 a 5 días.
Aspecto: puede ser: aterciopelado, pulverulento, velloso y algodonoso.
Pigmentación: Al reverso de la colonia se observa el pigmento del micelio y puede ser de color olivo,
verde claro, grises, blancas, rojas, amarillas.
5.1 En un cuadro anota los medios de cultivo que se prepararon, sus condiciones de esterilización, el
aspecto final del medio y cuál es su clasificación en base a su consistencia y composición.
Medio de cultivo Condiciones de Clasificación por Clasificación por su Presentación del

esterilización su consistencia composición medio
Caldo Glucosa sales 110°C /10 ´ Líquido Simple /sintético Tubo y matraz
Agar Glucosa sales
Agar Nutritivo
EMB
PDA
SIM
Agar sangre
Agar rosa de bengala
5.2 ¿Qué cuidados deben tenerse al preparar un medio de cultivo sólido en caja de Petri?
5.3- ¿De los siguientes medios, mencionar en qué consiste su capacidad diferencial o selectiva y qué
tipos de microorganismos crecen en ellos? Agar Rosa de Bengala y Agar Papa Dextrosa.
5.4 ¿Cuál es la función de los colorantes e indicadores en los medios de cultivo?
5.5 De los medios usados indica cuáles son específicos para mohos y cuáles para bacterias y ¿por
qué?
56
5.6 Cuando se siembran hongos en medio líquido, describe cómo es el crecimiento con y sin
agitación.
5.7 ¿En qué casos se siembra en medio semisólido y cuáles son las precauciones que se deben
tomar?
5.8 Anota la morfología colonial de un moho y de una bacteria, indicando de que medio lo obtuviste.
Discutir con base a la Norma Oficial Mexicana la clasificación de los medios y a las características de
la morfología colonial (macroscópica) para cada especie microbiana.
7.- CONCLUSIONES
Elabora tus conclusiones utilizando los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, la
bibliografía consultada y al objetivo de la práctica.
57
PRACTICA No 5
AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS
1. OBJETIVOS:
El alumno practicará las técnicas de aislamiento y cuantificación de microorganismos de muestras

biológicas siguiendo las recomendaciones de las Normas Oficiales Mexicanas.
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
1.2.1 El alumno practicará las diferentes técnicas de aislamiento y recuento de microorganismos.
1.2.2 Aplicará la técnica de las diluciones para disminuir la carga microbiana de las muestras con base
en las normas oficiales, NOM-109-SSA1-1994 Procedimientos para la Toma, Manejo y Transporte de
Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico y NOM-110-SSA1-1994 Preparación y Dilución
de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico, 092 NOM-092-SSA-1994, Método para la
cuenta de bacterias aerobias en placa y NOM-111-SSA1–1994, Bienes y servicios. Método para la
cuenta de mohos y levaduras en alimentos
2. INTRODUCCIÓN
Se entiende por aislamiento, al proceso que permite separar uno o más microorganismos presentes
en una muestra, forzándolos a crecer en medios de cultivos. No todos los microorganismos pueden
cultivarse en medios de cultivo como el caso de los organismos biotróficos y consorcios microbianos
difíciles de separar (parásitos obligados), los cuales se desarrollan sobre tejido vivo de su hospedante
(virus, rickettsias, hongos).
En el estudio microbiológico, el primer paso es la separación de la población mixta a un cultivo puro y

luego su posterior identificación (familia, género y especie).
-Cultivo puro: es aquel que contiene una sola especie o tipo de microorganismo y que
presumiblemente se ha obtenido a partir de una sola célula. En un cultivo puro, no necesariamente
todas las células que lo componen tienen que ser exactamente iguales, ya que es factible que algunas
de ellas sufran mutaciones y se diferencien de las restantes. Cada uno de los cultivos puros que
componen una especie se denomina cepa.
Las diferentes técnicas de aislamiento son la estría cruzada, el vaciado en placa y la extensión con
varilla, pero en ocasiones la muestra tiene gran cantidad de microorganismos que tenemos que
recurrir a la realización de:
Realización de diluciones (NOM-110-SSA1–1994, Bienes y servicios. Preparación y dilución de

muestras de alimentos para su análisis microbiológico)
La dilución primaria tiene por objeto obtener una distribución lo más uniforme posible de los
microorganismos contenidos en la muestra destinada para el análisis.
58
La preparación de diluciones decimales adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el
número de microorganismos por unidad de volumen, para permitir, después de la incubación, la
observación de la prueba en el caso de tubos o matraces y la cuenta de colonias en el caso de placas.
Dilución primaria, es la suspensión o emulsión obtenida después de pesar o medir una cantidad del
producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporción de diluyente.
Diluciones decimales adicionales, las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un determinado

volumen de la dilución primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que, por repetición de
esta operación con cada dilución así preparada, se obtiene la serie de diluciones decimales
adecuadas para la inoculación de medios de cultivo.
Estría simple
Este método es utilizado cuando se sospecha que la muestra tiene poca cantidad de microrganismos de
acuerdo a la naturaleza de muestra, o bien cuando el medio es diferencial, ya que posee inhibidores que
precisamente inhiben la flora microbiana asociada.
Estría cruzada en placa:
Esta técnica consiste en establecer un gradiente de diluciones por medio de las estrías cruzadas
sobre la superficie de un medio sólido, para separar a los microorganismos, dando origen a colonias
separadas que generalmente corresponden a un cultivo puro, aquí no se puede hacer un recuento.
Técnica de vaciado en placa:
El fundamento de la técnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio de

elección después de un cierto tiempo y temperatura de incubación, presuponiendo que cada colonia
59
proviene de un microorganismo de la muestra bajo estudio. El método admite numerosas fuentes de

variación, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores.
En la lectura seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250 UFC, para disminuir el error
en la cuenta en caso contrario seguir las indicaciones de la NOM 092
Unidades Formadoras de Colonias (UFC), término que debe utilizarse para reportar la cuenta de
colonias en placa, las cuales pueden surgir de una célula o de un cúmulo de células.
Técnica de extensión en placa con varilla acodada
Esta técnica se utiliza para el aislamiento y recuento de microorganismos, donde el inóculo se

distribuye con la varilla, previamente esterilizada. La cantidad de inóculo utilizado puede ser de 0,1 o
0,5 ml.
En algunos casos el aislamiento lo podemos hacer directamente en un medio selectivo, pues lo que
deseamos es ver la producción de un metabolito, por ejemplo, para el aislamiento de microorganismos
productores de amilasas se utiliza el medio denominado agar almidón.
El aislamiento nos sirve para obtener la morfología colonial, microscópica y observar alguna
característica como hidrólisis o hemólisis.
60
3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS

3.1 MATERIAL POR EQUIPO
• Cuatro Cajas de Petri estériles • Cuatro cajas de Petri con Agar Nutritivo
• Cajas de Petri con EMB o medio selectivo • Cilindro con pipetas de un ml estéril
• Matraz con 100 ml de ACS o PDA • Seis frascos de dilución con 90 ml de
• Balanza granataria solución salina al 0.85%
3.2 MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ALUMNO
3.2.1 Muestra de queso, agua de sabor, leche en punto de venta, helado, etc.
4.1 Realizar diluciones de la muestra como lo indique el profesor y según el siguiente esquema.
4.1.1 DILUCIONES
a. Para muestras líquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la distribución de
microorganismos es homogénea o fácilmente homogeneizable por medios mecánicos (agitación, etc.).
b. Para muestras congeladas de un alimento originalmente líquido o licuable, fundir por completo en
baño de agua de 40 a 45°C un tiempo máximo de 15 minutos y homogeneizar agitando
vigorosamente.
c. Para la parte líquida de una muestra heterogénea la cual sea considerada suficientemente
representativa de la muestra total (por ejemplo, la fase acuosa de grasas animales y vegetales).
d. Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm

efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 10 ml de la muestra si es muestra líquida y 10 g si es
muestra sólida y diluir con 90 ml del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a
ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente (todo en condiciones de esterilidad).
e. Utilizar pipetas diferentes para cada dilución, inoculando simultáneamente las cajas. El volumen
que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la pipeta.
61
f) La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular,
dependen del número esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de
análisis previos y de la información que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado.
En ausencia total de información, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.
4.2 AISLAMIENTO Y RECUENTO POR LA TÉCNICA DE VACIADO EN PLACA. Agar cuenta
estándar (ACS) o agar de papa y dextrosa (PDA)
NOM-092-SSA-1994, Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa y NOM-111-SSA1–1994,
Bienes y servicios. Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos
a) Una vez realizadas las diluciones se procede a inocular las placas
b) Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación; la adición de
medio de cultivo y homogenización, se puedan realizar cómoda y libremente. Marcar las cajas en la
base de la misma con los datos pertinentes previamente a su inoculación y correr por duplicado.
c) Se inocula un ml de las dos últimas diluciones según las diluciones que se hayan realizado en las
cajas Petri estériles, agregar de 12 a 15 ml del medio preparado que es agar cuenta estándar,
mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj,
6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una
completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas.
Dejar solidificar.
d) Incluir una caja sin inóculo por cada lote del medio preparado como testigo de esterilidad.
e) El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que
finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.
f) Incubar las cajas en posición invertida por el tiempo y la temperatura que se requieran.
g) Para bacterias y levaduras 37°C 24 a 48 horas.
h) Contar todas las colonias en aquellas cajas que tengan entre 25 y 250 colonias
i) Si se cuenta la última dilución y no tiene entre 25 y 250 sino más, y las colonias están bien
distribuidas, dividir la placa en dos y contar solo una mitad, el resultado se multiplica por dos, si aún
tenemos muchas colonias, dividir la placa en cuatro y solo contar un cuadrante y el resultado se
multiplica por cuatro, y si todavía tenemos muchas contar 5 cm2, sumarlos y sacar un promedio, el
resultado se multiplica por 65, cuando la placa utilizada sea de 100 X 15 mm.
j) Para el aislamiento y recuento de mohos es el mismo procedimiento solo que ahora hay que
acidificar el PDA con 1.4 ml de ácido tartárico al 10 % por cada 100 ml de medio, incubar a 28 °C de
3 a 5 días y contar todas las colonias en aquellas cajas que tengan entre 15 y 150 colonias.
62
4.3 AISLAMIENTO Y RECUENTO POR LA TÉCNICA DE EXTENSIÓN EN PLACA (Agar Nutritivo)
a. Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación; la adición de
medio de cultivo y homogenización, se puedan realizar cómoda y libremente.
b. Etiquetar las cajas en la base previamente a su inoculación y correr por duplicado.
c. Inocular 0.1 ml de las dos últimas diluciones sobre la superficie del medio.
d. Humedecer una varilla de vidrio en forma de L con alcohol y pasarla por la flama del mechero.
e. Enfriar la varilla, una vez fría extender el inoculo por toda la superficie del agar nutritivo.
f. Incluir una caja sin inóculo por cada lote como testigo de esterilidad.
g. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que
finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.
h. Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se
requieran, según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate.
i. Para bacterias 37°C 24 a 48 horas.
j. Se procede a contar el número de bacterias haciendo los cálculos como en la técnica de vaciado
en placa.
4.4 AISLAMIENTO POR ESTRIA CRUZADA (Medio selectivo)
a. Este sistema de siembra en estrías en placas de Petri con medios sólidos y es el procedimiento
habitual para aislar microorganismos.
b. Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se
requieran, según el tipo de producto y/o microorganismo de que se trate.
c. Realizar la morfología colonial de las colonias que estén previamente aisladas.
5 CUESTIONARIO:
5.1 Informe de resultados de la técnica de Vaciado en placa:
Técnica Vaciado en placa ACE/PDA
No. de UFC/ml
5.2 Reportar como: Unidades formadoras de colonias, ___________UFC/g o ml de bacterias aerobias

en placa en agar cuenta estándar, incubadas: ______________horas a _______________°C
63
Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de mohos en agar papa - dextrosa
acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 5 días.
Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o ml) de levaduras en agar papa-
dextrosa acidificado, incubadas a 25 ± 1°C durante 5 días.
Reportar como: Unidades formadoras de colonias, ___________UFC/g o ml de bacterias aerobias en

placa en agar cuenta estándar, incubadas: ______________horas a _______________°C.
5.3 Informe de resultados de la técnica de Extensión en con varilla.
5.4 ¿En qué casos aplicarías la técnica de estría cruzada?
5.5 ¿La técnica de estría cruzada permite contar el número de colonias?
5.6 ¿Cuál es el fundamento de la técnica de vaciado en placa?
5.7 ¿Cuál es el fundamento de la técnica de extensión en placa?
5.8 ¿En qué casos aplicarías utilizar diluciones?
6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS.
Discutir las ventajas y desventajas de cada una de las técnicas de aislamiento y analizar los
resultados obtenidos en cada una de las técnicas.
7. CONCLUSIONES
Elabora tus conclusiones tomando en cuenta los resultados obtenidos.
64
PRÁCTICA No. 6
CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS
UNIDAD III: Identificación bacteriana
TEMA: 3.4 Conservación de microorganismos
1. OBJETIVOS:
El alumno diferenciará cada uno de los métodos de conservación de cepas de acuerdo a sus
características y deducirá el mejor método para conservar al microorganismo de acuerdo al resultado
de viabilidad.
1.2.1 El alumno conocerá métodos de conservación de cepas y conservará algunas cepas para
concluir cual es el más adecuado en función del resultado de viabilidad y tipo de microorganismos.
1.2.2 El alumno realizará pruebas de viabilidad microbiana para elegir el mejor método de acuerdo al
tipo de microorganismos conservado.
2. INTRODUCCIÓN
En un laboratorio de microbiología existen cepas microbianas las cuales hay que preservar,
teniéndose varios métodos para su conservación, aunque necesario tomar en cuenta las
características del microorganismo, los materiales y los recursos con que se cuenta para elegir el
mejor método, pues sucede que nuestra cepa de interés puede en un momento dado sufrir daños
como la deshidratación, cambios genéticos o perdida de la viabilidad.
Las tres condiciones que hay que alcanzar para conservar correctamente las cepas microbianas en un
laboratorio son:
 Que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el
proceso de conservación;
 Que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos del 70-80% de las células, y
 Que estas células permanezcan genéticamente estables.
Las dos primeras condiciones no son muy difíciles de conseguir cuando se conoce bien la técnica
microbiológica, pero el tercero puede presentar dificultades, y este es el motivo por el cual existen
varios métodos de conservación. Los métodos de conservación de cepas se van a agrupar en tres
apartados, que son: Métodos de elección o de conservación a largo plazo, métodos alternativos y
métodos restringidos.
A.- Métodos de elección o de conservación a largo plazo.
Son los mejores porque en ellos se detiene el crecimiento de las células microbianas, pero éstas no
han muerto. Así se garantiza al máximo la estabilidad genética, por evitarse la aparición de
generaciones sucesivas. Aún así no se puede descartar algún cambio originado por el método. Los
métodos de conservación pertenecientes a este grupo son dos: Congelación y liofilización.
Conservación por congelación.
Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y se guardan a
temperaturas inferiores a 0°C, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer las células
de agua en forma líquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las células así
conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor método de conservación desde
todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales. Los cuatro
factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las células conservadas por este método es la
edad de las células, velocidad en la congelación y descongelación, temperatura de almacenamiento: y
empleo de agentes crioprotectores.
65
Conservación por liofilización.

Tampoco se da crecimiento en las células conservadas por este método, puesto que se les ha quitado
el agua mediante la liofilización, que es un proceso suave. Con ello la estabilidad genética es alta,
pero a veces no tanto como en la congelación, porque la liofilización se consigue por sublimación del
hielo de las células. Por lo tanto, primero tenemos que congelar el agua libre de las células y después
eliminarla mediante el vacío, sin que haya necesidad de subir la temperatura, lo que acabaría
afectando a la viabilidad del microorganismo. Para este proceso se emplean los aparatos
denominados liofilizadores. Las células microbianas así conservadas se someten a un tratamiento
más complejo que en el caso de la congelación, pues la liofilización se hace en dos etapas y se añade
la sublimación del agua a la congelación previa. Sin embargo, este es un método muy recomendable
por su comodidad para el almacenamiento y para el envío de las cepas, pues una vez conseguidos
los liófilos pueden almacenarse a temperatura ambiente (18ºC-20ºC), con lo cual su envío es fácil.
Los factores que debemos tener en cuenta para hacer una buena liofilización son los mismos que
influyen en la congelación, a los que hay que añadir otros que surgen como consecuencia de la
deshidratación. La congelación puede hacerse rápida o lentamente, la primera sumergiendo los tubos
en nitrógeno líquido. Respecto a los crioprotectores, se pueden utilizar varios dependiendo del tipo de
microorganismo, pero para liofilizar no se debe utilizar glicerol, debido a su elevado punto de
evaporación y a su higroscopicidad, que provoca que los liófilos queden muy viscosos. Tampoco es
conveniente utilizar el dimetilsulfóxido, porque es algo tóxico, y al concentrarse por la evaporación del
agua puede dañar a las células microbianas. Por lo tanto, para la liofilización se recomiendan como
crioprotectores el inositol para la mayoría de las bacterias y la leche descremada para mohos y
actinomicetos, pero para algunos microorganismos pueden ser más convenientes otros
crioprotectores, como por ejemplo el glutámico-glutamato para las bacterias lácticas y mezclas de
glucosa con caldo hígado (sin carne) para bacterias anaerobias.
Los nuevos factores que influyen específicamente en la eficacia de la liofilización como medio de
conservación son: el tipo de microorganismos, la concentración celular, el grado de deshidratación
alcanzado, la atmósfera de oxígeno en el tubo y las condiciones de almacenamiento.
B.- Métodos alternativos.
Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los métodos de elección, bien por carecer de los
equipos necesarios, o bien porque la cepa microbiana no resiste los tratamientos de la conservación
por estos métodos. Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar un único método alternativo,
sino que se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos métodos.
a).- Conservación por transferencia periódica.
La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que ha crecido.
Sin embargo, estas células no pueden permanecer indefinidamente en el mismo tubo, porque al
seguir activas excretan productos tóxicos del metabolismo que se acumulan, provocando el
envejecimiento y muerte celular, por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo
fresco. Este es el peor método para conseguir la estabilidad genética, puesto que al estar las células
creciendo hay una alternancia de generaciones, y al cabo del tiempo las células que se están
guardando serán descendientes lejanas de las células iniciales y es posible que ya no conserven
algunas de sus características. A veces se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite
mineral estéril. Con esto se consigue también evitar en la medida de lo posible la desecación del
medio de cultivo, que podría ser tóxico para las células al aumentar su concentración. Hay que tener
en cuenta que los microorganismos muy aerobios, como por ejemplo los mohos filamentosos, no se
pueden guardar en tubos completamente cerrados. Por último, otro inconveniente que tiene la
transferencia periódica es que la contaminación de los cultivos resulta más fácil al tener que manejar
los tubos a lo largo del tiempo y también por la posibilidad de entrada de ácaros en los mismos.
b).- Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril.
Es un método alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos de
microorganismos, tanto mohos filamentosos como levaduras y algunas bacterias. Consiste en
66
suspender en agua estéril células del cultivo que se quiere conservar. Se pueden preparar en
criotubos, en este caso la concentración celular no debe ser superior a 104-105 células /ml en el caso
de bacterias y levaduras. Para los mohos filamentosos que no esporulan, se pueden poner en
suspensión trocitos de agar con el crecimiento del hongo. En el caso de microorganismos marinos, la
suspensión se hace en agua de mar diluida.
C.- Métodos restringidos.
En este grupo se engloban métodos no empleados habitualmente, pero a los que es necesario recurrir
a la hora de conservar grupos de microorganismos muy determinados que no resisten bien la
liofilización o la congelación, como por ejemplo los géneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc.
a).- Desecación en papel de filtro.
Se utiliza un papel bastante absorbente que se impregna con una solución muy densa de células y se
deja secar al aire (en condiciones estériles). También es posible desecarlos por el procedimiento que
se llama desecación líquida porque se utiliza para ello el liofilizador, pero sin que haya habido
congelación previa de las células. El vacío producido por el liofilizador deseca las células, pero hay
que evitar que un vacío excesivo provoque evaporación brusca con ebullición o que la temperatura
disminuya demasiado, ocasionando la congelación incontrolada de las células.
b).- Desecación en suelo, arena, silicagel, etc.
Se añaden las células a estos sustratos que las protegerán al desecar. Los microorganismos
productores de esporas se pueden conservar durante bastante tiempo por este método, este método
es barato y de fácil conservación.
c).- Desecación en bolitas de alginato.
Éste es un procedimiento eficaz, las células se encuentran en una matriz de alginato y la eliminación
del agua se hace por tratamiento con soluciones hipertónicas sucesivas y posterior desecación al aire
hasta que se pierde un 70% de su contenido en agua. Estas bolitas de alginato se pueden conservar
en tubos cerrados herméticamente y a temperaturas de entre 4ºC y 18ºC, pudiéndose guardar incluso
a –80ºC debido al bajo contenido en agua de las células y la protección que suministra el soporte de
alginato. Este es un método que se está utilizando para la conservación de algas y células vegetales.
Para demostrar la eficiencia de un método de conservación en cepas se tiene que determinar el
porcentaje de viabilidad en diferentes periodos, determinar la estabilidad morfológica y fisiológica,
bioquímica, la virulencia y la antigenicidad, para garantizar que l cepa es efectiva.
3.1. EQUIPO
• Incubadora a 35 ° C • Autoclave
• Congelador • Horno
• Refrigerador • Balanza digital
3.2. MATERIAL
• Cajas de Petri • Gasa y algodón para un tapón

• Portaobjetos • Un tubo eppendorff de dos ml
• Pipetas de un ml • Una espátula de acero inoxidable
3.3. MEDIOS DE CULTIVO:
• Dos tubos de 13 X 100 con TSA • Un matraz con 30 ml de caldo BHI
67
inclinado con tapón de baquelita • Un tubo de 16X150 mm con PDA inclinado

en tubos con tapón de baquelita (Cosecha
• Un tubo con 4 g de arena estéril
de esporas)
• Un matraz con 80 ml de ACS
• Dos tubos de 13 X 100 con PDA inclinado
• Un tubo de 13 X 100 con TSA o agar base con tapón de baquelita
sangre con tapón de algodón
• Un tubo de 13 X 100 con PDA con tapón de
• Cinco tubos con 9 ml de solución salina algodón.
• Un matraz con 30 ml de BHI • Un matraz con 80 ml de PDA
• Un tubo de 13 X 100 mm estéril con tapón
de baquelita
3.4. REACTIVOS:
• Glicerol al 60 % estéril • Aceite mineral

• Acido tartárico • Colorantes para tinción de Gram
• Colorantes para tinción de esporas • Azul de algodón lactofenol
3.5. CEPAS MICROBIANAS Y MEDIOS SELECTIVOS PARA SU IDENTIFICACIÓN COLONIAL
Escherichia coli Agar eosina azul de metileno Rhizopus sp Agar de papa y dextrosa
Bacillus atrophaeus Agar nutritivo Aspergillus niger Agar de papa y dextrosa
Micrococcus luteus Agar nutritivo Penicillium sp Agar de papa y dextrosa
Pseudomonas. aeruginosa
Staphylococcus aureus Agar de sal y manitol Agar cetrimida
Saccharomyces cerevisiae Agar cuenta estándar Lactobacillus delbrueckii Medio MRS
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL:
Para la conservación de cepas la distribución será la siguiente:
Equipo Cepa a conservar Equipo Cepa a conservar
1,6 Escherichia coli 4,9 Saccharomyces cerevisiae
2,7 Bacillus atrophaeus 5,10 Aspergillus niger
3,8 Micrococcus luteus 11 y 12 Lactobacillus delbrueckii
PARA BACTERIASY LEVADURAS:

DÍA 1
1) Realizar una tinción de Gram para verificar la pureza de la cepa, en caso de ser un microorganismo
esporulado, realizar la tinción de esporas.
2) Sembrar un matraz con 30 ml de caldo infusión cerebro y corazón (BHI) estéril con dos asadas del
microorganismo que te ha tocado según el número del equipo, incubarlo a 35 °C durante toda la
noche en agitación a 150 rpm.
68
DÍA 2
3) A partir del matraz sembrar por estría simple 3 tubos con agar de soya y tripticaseína, e incubarlo a
35 °C y por 24 horas. Recuerda que se te debe proporcionar 2 tubos con tapón de baquelita y uno con
tapón de algodón.
4) Etiquetar cada uno de los tubos, anotando el nombre de la cepa, fecha de siembra, fecha de
conservación y fecha en que se determinará la viabilidad.
DÍA 3 Después de la incubación realizar lo siguiente
Tubo No. 1 que tiene el tapón de algodón Se conservará a temperatura ambiente
Tubo No. 2 que tiene el tapón de baquelita Se conservará a temperatura en refrigeración a 4°C
Tubo No. 3 que tiene el tapón de baquelita Se le adicionará aceite mineral y se conservará a
temperatura de refrigeración de 4 °C
Matraz con 30 ml de BHI y la cepa que te La suspensión es para obtener el número de células /
ha tocado ml
Del matraz realizar lo siguiente:

4) Tomar un ml con pipeta estéril del cultivo del matraz y colocarlo en un tubo eppendorff previamente
etiquetado, adicionarle un ml de glicerol al 60 % estéril, mezclar y conservarlo en el congelador.
Conservación en congelación
5) Con la misma pipeta anterior tomar un ml del cultivo del matraz y colocarlo en el tubo que contiene
arena estéril previamente etiquetado, homogenizarlo y conservarlo a temperatura ambiente
6) Determinación del número de UFC/ ml (No): Con la misma pipeta tomar un ml de la suspensión
microbiana y realizar diluciones, hasta 10-5 y por la técnica de vaciado en placa sembrar las dos
últimas diluciones. Incubar a 35 °C durante 24 h y contar para obtener las UFC/ ml, de esa manera
sabemos cuántos hemos conservado en el glicerol y arena.
En la bitácora llevar el registro de la conservación, con un cuadro como el que se muestra a
continuación.
Nombre de Fecha de siembra Fecha de siembra Fecha de Determinación de Determinación de % de

la cepa del matraz de los tubos conservación viabilidad (1era. vez) viabilidad (2da.da vez) Viabilidad
Conservar los tubos por dos meses, y una vez transcurrido este tiempo realizar lo siguiente:
Al tubo 1, 2 y 3 Sembrar el cultivo por estría cruzada o simple y verifica si hay crecimiento del
microorganismo, recordar utilizar el medio adecuado según el tipo de microorganismos que se ha
conservado y consulta a los demás equipos para llenar el siguiente cuadro.
69
Cepa a conservar Medio de cultivo Conservación a Conservación Conservación con aceite

temperatura ambiente a 4 °C mineral y a 4 °C
Escherichia coli EMB
Bacillus atropheus AN
Micrococcus luteus AN
S. aureus ASM
S. cerevisiae ACS
P. aeruginosa Agar cetrimida
L. delbrueckii Medio MRS
Al tubo (eppendorff)
1.- Etiquetar 5 tubos con 9 ml de solución salina
2.- Tomar un ml del tubo eppendorff y realizar las cinco diluciones
3.- Sembrar la dilución 10 -4 y 10 -5 por duplicado por la técnica de vaciado en placa
4.- Utilizar ACS para la siembra e incubar las placas e incubar las placas
5.- Realizar el recuento (Nf) para calcular el % de viabilidad
Al tubo con arena
2.- Tomar un g de arena y realizar las cinco diluciones
4.- Utilizar ACS para la siembra e incubar las placas
PARA MOHOS: DÍA 1
1.- Realizar una preparación en fresco del moho (Lo correcto para verificar la pureza es un
microcultivo, pero en este momento aún no conoces la técnica).
2.- Sembrar un tubo de 13 X 100 mm con PDA inclinado con tapan de algodón
3.- Sembrar dos tubos de 13 X 100 mm con PDA y tapón de baquelita
4.- Sembrar un tubo de 16 X 150 mm con PDA y tapón de baquelita
5.- Incubar los tubos por 5 días a 28 °C
DÍA 6 Después de la incubación realizar lo siguiente
Tubo No. 1 que tiene el tapón de algodón Se conservará a temperatura ambiente
Tubo No. 2 que tiene el tapón de baquelita Se conservará a temperatura en refrigeración a 4°C
Tubo No. 3 que tiene el tapón de baquelita Se le adicionará aceite mineral y se conservará a temperatura de refrigeración de 4 °C
Tubo de 16 X 150 mm con tapón de baquelita Realizar una suspensión, para ello colocarle aproximadamente 3 ml de solución salina y
con la ayuda del asa resuspender para tener la cosecha de esporas y poder obtener el
No de células / ml
Del tubo de 16 X 150 mm que tiene la suspensión de esporas realizar lo siguiente:

1.- Depositar la suspensión en un tubo estéril, para facilitar el trabajo
70
2.- Tomar un ml con pipeta estéril del cultivo del matraz y colocarlo en un tubo eppendorff
previamente etiquetado, adicionarle un ml de glicerol al 60 % estéril, mezclar y conservarlo en el
congelador.
3.- Con la misma pipeta anterior tomar un ml del cultivo del matraz y colocarlo en el tubo que contiene
arena estéril previamente etiquetado, homogenizarlo y conservarlo a temperatura ambiente
4.- Determinación del número de UFC/ ml (No): Con la misma pipeta tomar un ml de la suspensión
microbiana y realizar diluciones, hasta 10-5 y por la técnica de vaciado en placa sembrar las dos
últimas diluciones. Incubar a 28 °C durante 5 días y contar para obtener las UFC/ ml, de esa manera
sabemos cuántos hemos conservado en el glicerol y arena.
En la bitácora llevar el registro de la conservación, con un cuadro como el que se muestra a
continuación.
Nombre de Fecha de siembra Fecha de siembra Fecha de Determinación de Determinación de % de

la cepa del matraz de los tubos conservación viabilidad (1era. vez) viabilidad (2da.da vez) Viabilidad
Conservar los tubos por dos meses, y una vez transcurrido este tiempo realizar lo siguiente:
Al tubo 1, 2 y 3 Sembrar el cultivo por punto y verificar si hay crecimiento del microorganismo, utilizar
el agar de papa y dextrosa y consulta a los demás equipos para llenar el siguiente cuadro.
Cepa a conservar Medio de Conservación a temperatura Conservación a 4 Conservación con aceite

cultivo ambiente °C mineral y a 4 °C
Rhizopus sp PDA
Aspergillus niger PDA
Penicillium sp PDA
Al tubo (eppendorff)
2.- Tomar un ml del tubo eppendorff y realizar las cinco diluciones
4.- Utilizar PDA acidificado para la siembra e incubar las placas a28 °C
Al tubo con arena

2.- Tomar un gramo de arena y realizar las cinco diluciones
4.- Utilizar PDA acidificado para la siembra e incubar las placas a28 °C
71
Llenar la siguiente tabla: Antes de la conservación
Método /cepa Temperatura Refrigeración Refrigeración + Congelación Arena
ambiente Crecimiento + Aceite UFC/ml UFC/g
Crecimiento +
Escherichia coli
B. subtilis
M. luteus
S. aureus
S. cerevisiae
P. aeruginosa
L. delbrueckii
Rhizopus sp
Aspergillus niger
Penicillium sp
+ Solo indicar si hay abundante o no.

Después de la conservación
Método /cepa Temperatura Refrigeración Refrigeración + Aceite Congelación Arena
ambiente Crecimiento Crecimiento UFC/ml UFC/g
Escherichia coli
B. subtilis
M. luteus
S. aureus
S. cerevisiae
P. aeruginosa
L. delbrueckii
Rhizopus sp
Aspergillus niger
Penicillium sp
Determinar el % de reducción bacteriana del microorganismo (RBM)

% de RBMA= Microorganismos iniciales (No) – Microorganismos finales (Nf) X 100
Microorganismos iniciales
5.1 Según el microorganismo que conservaste ¿Cuál es el mejor método para conservarlo?
5.1 Investiga otros métodos de conservación como la liofilización.
5.2 ¿Cuál el papel del crioprotector?
5.3 Menciona el periodo máximo de conservación de cada uno de los métodos utilizados en la práctica
5.4 investiga la morfología colonial en la bibliografía del microorganismo que conservaste y el medio
que utilizaste
Discutir las ventajas y desventajas de cada uno de los métodos de conservación
72
7. CONCLUSIONES
Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, a la
bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica.
73
74
PRACTICA No.7
CRECIMIENTO MICROBIANO
UNIDAD V: Crecimiento Microbiano
1. OBJETIVOS
El alumno aplicará las técnicas más utilizadas para el recuento de microorganismos y explicará qué
ocurre en cada una de las fases de crecimiento celular.
1.2 Objetivos Específicos
1.2.1 El alumno llevará a cabo una proliferación de crecimiento celular de de Escherichia coli en
cultivo sumergido y agitación (fermentación) a nivel matraz por 24 horas.
1.2.2 El alumno cuantificará el número de microorganismos viables a través del recuento por
diluciones y vaciado en placa como unidades formadoras de colonias (UFC).
1.2.3 El alumno estimará el crecimiento microbiano por la técnica de turbidimetría.
1.2.4 El alumno cuantificará el número de microorganismos por cuenta directa con la técnica de
conteo en cámara de Neubauer.
1.2.5. El alumno comparará los resultados obtenidos con CGS y caldo Luria, para determinar el mejor
medio de cultivo en función de la cantidad de masa celular producida.
2. INTRODUCCIÓN
Al hablar de crecimiento microbiano nos referimos al número de células, las células que crecen, están
aumentando de número y forman cúmulos de cientos de microorganismos, colonias de cientos de
microorganismos o poblaciones de miles de millones.
Al conocer las condiciones para el crecimiento microbiano, podemos predecir la rapidez con que
crecerán estos en distintas situaciones y determinan la forma de controlar su crecimiento, estos
requerimientos pueden ser físicos y químicos. Los aspectos físicos incluyen la temperatura, el pH y la
presión osmótica y entre los requerimientos químicos están el agua, las fuentes de carbono y
nitrógeno, las sustancias minerales, el oxigeno y los factores orgánicos de crecimiento.
Las bacterias se reproducen generalmente por fisión binaria, una división celular da lugar a dos
células, la división de estas células produce cuatro y así sucesivamente.
El tiempo necesario para que una célula se divida y por consiguiente para que su población se
duplique, es lo que se llama tiempo de generación o tiempo de duplicación, puesto que, para los
organismos unicelulares; cada duplicación constituye una nueva generación, varía considerablemente
entre los diferentes microorganismos. La mayoría de las bacterias tienen un tiempo de generación de
una a tres horas.
Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos métodos miden el número de
células, otros la masa total de la población. Las medidas de población se refieren normalmente al
número de células que hay en un mililitro de líquido o en gramo de material sólido.
Los métodos de cuantificación están basados en mediciones directas o indirectas de muestras muy
pequeñas, después se determina mediante cálculos el tamaño de la población total.
Los métodos recomendados para medir la población son:
Recuento en placa Diluciones seriadas.
Siembra por vaciado en placa. Siembra por extensión con varilla
Filtración Método del número más probable
Recuento directo al microscopio (cámara de Neubauer).
75
Hay otros 3 métodos llamados indirectos.

1.- Turbidimetría.
2.- Actividad metabólica.
3.- Peso seco.
Es posible determinar la densidad celular empleando métodos más sencillos. Nos basta con una
cámara de conteo celular, por ejemplo, la cámara de Neubauer, y un microscopio.
Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes métodos. El más común es el de tinción
con azul tripán. El azul tripán es un coloide que se introduce en el interior de las células que presentan
roturas en la membrana.
Es importante diferenciar entre el crecimiento de las células individuales y el crecimiento de
poblaciones de células (proliferación). El crecimiento de una célula es el aumento en su tamaño y
peso y generalmente es la antesala de la división celular. Por otra parte, la proliferación es el aumento
del número de células a consecuencia del crecimiento y la división celulares.
Una vez que se proveen de nutrientes necesarios al microorganismo, la célula empieza a crecer y/o a
producir algunos metabolitos.
Fase del crecimiento
En un cultivo microbiano todas las partes están sujetas a las mismas condiciones de temperatura, pH,
concentración de nutrientes, en la figura siguiente se indican diferentes fases que ocurren en un
cultivo, en donde se refleja los cambios en la biomasa y en el medio ambiente.
Parámetros de la curva de crecimiento
Si se sigue el crecimiento de un cultivo discontinuo a través de la multiplicación de la masa, nos
interesarían tres parámetros que son la producción, la tasa de crecimiento y el periodo de latencia.
La producción es la diferencia entre la masa bacteriana inicial y la máxima: X = Xmax- X0
La tasa de crecimiento exponencial es una medida de la velocidad del crecimiento celular (velocidad
específica de crecimiento celular) se designa con la letra griega μ en la fase exponencial del
crecimiento. Se calcula a partir de las densidades bacterianas X0 y Xt en los tiempos t0 y t, en la fase
de crecimiento exponencial según
Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos métodos miden el número de
células, otros la masa total de la población. Las medidas de población se refieren normalmente al
número de células que hay en un mililitro de líquido o en un gramo de material sólido.
Los métodos que vamos a utilizar en el laboratorio de técnicas microbiológicas es el de cuenta viable
por la técnica de vaciado en placa, cuenta directa al microscopio utilizando una cámara de Neubauer y
por turbidimetría que es un método indirecto que mide la densidad de una suspensión por su
extinción, en algunas ocasiones se utiliza el nefelómetro.
76
3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS

3.1.- MATERIAL
• Un matraz con 100 ml de caldo Luria estéril • Un matraz de 1 L con 600 ml de agar cuenta
(matraz semilla) estándar (para el vaciado en placa)
• Un Matraz de 500 ml con 100 ml de caldo Luria • 120 tubos de 16 x 150 mm con 9 ml de solución
estéril y/o caldo glucosa sales salina (para las diluciones)
• Dos celdas y un portaceldas • 40 Cajas de Petri estériles (para el vaciado en
placa)
• Pipetas de 2,5 y 10 ml estériles
• Una pizeta con benzal
3.2.-REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO
• NaCI ó peptona • Agar cuenta estándar
• Caldo Luria • Caldo glucosa sales al 5 %
3.3.- EQUIPO
• Espectrofotómetro • • Incubadora a 37° C
• • Autoclave • • Contador de colonias
• • Horno • • Cámaras de Neubauer
3.4.- CEPAS:
Suspensión de Escherichia coli Suspensión de Saccharomyces cerevisiae
4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL
ENSAYO DE LOS MÉTODOS (PRIMERA SESIÓN)
4.1 TURBIDIMÉTRIA. Para este primer ensayo no es necesario trabajar en condiciones de esterilidad
De la suspensión de S. cerevisiae, seguir las indicaciones del profesor para leer la absorbencia en el
espectrofotómetro.
a) Colocar en el espectrofotómetro una portacelda y bloquear el paso de luz
b) Encender el espectrofotómetro y dejarlo calentar por 5 minutos, seleccionar la longitud de onda (540 nm) y la
región visible
c) Colocar en una celda espectrofotométrica 3 ml de caldo Luria, este tubo será el blanco
d) En la otra celda colocar aproximadamente 3 ml de la suspensión a leer
e) Limpiar con papel sanitario la celda, tomarlo con los dedos por la boca del tubo y colocar el blanco en el
portacelda. Acomodar la portacelda para dejar pasar la luz y ajustar a cero de absorbencia.
f) Una vez ajustado a cero, bloquear el paso de luz e insertar la celda de la suspensión a leer, previamente
limpiada con papel sanitario.
g) Cuando la lectura se estabilice más o menos 3 segundos, tomar la lectura.
h) Bloquear el paso de luz y retirar la celda, vaciar el contenido en un recipiente con benzal y enjuagar la celda
dos o tres veces con benzal.
i) Una vez leída la muestra, apagar el espectro y retirar la portacelda.
Nota: Las celdas nunca se lavan con escobillón, no se colocan en una gradilla, para ello se entregarán en un
vaso
4.3 CUENTA DIRECTA EN CÁMARA DE NEUBAUER
a) Tomar la cámara y limpiarla con una torunda impregnada con alcohol, con mucho cuidado, ya que el
cuadriculado al frotarlo bruscamente se puede borrar.
77
b) La torunda depositarlo en un recipiente que contenga benzal, de la misma manera limpiar el cubreobjetos
(cubrehematocimetro) y colocarlo sobre la cámara.
c) Con una pipeta coloca la muestra de S. cerevisieae, entre la cámara y el
portaobjetos, para que por cohesión se llene la cámara, La cámara de
Neubauer es una cámara de conteo. Se trata de un portaobjetos con una
depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la
ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen.
Es un cuadrado de 3 x 3 mm., con una separación entre dos líneas
consecutivas de 0.25 mm. Así pues, el área sombreada y marcada le
corresponde a un mm2. La depresión central del cubreobjetos está
hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre
con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 mm, y el
volumen es de 0.1 mm3, es decir 0.1 µl.
d) Colocar la cámara en la platina y enfocar con 10 y 40 X
e) Contar para las levaduras en los cuadrantes denominados en la figura A,B.C y D, sumar los valores
obtenidos, sacar un promedio; multiplicar por 10 000 y las unidades son células/ml.
f) Retira la cámara, límpiala y ahora coloca una muestra de E. coli, pero ahora utiliza el cuadrante de
en medio y contar los cuadros sombreados, de igual forma contar el número de células, sumarlos y
obtener el promedio, después multiplicar por 25 y luego por 10 000, obteniéndose No. de
células/ml.
4.3 DILUCIONES PARA REDUCCIÓN DE CARGA MICROBIANA

a)La muestra se toma en condiciones de esterilidad, tomar 1 ml del matraz cinética y colócalo en un
-1
tubo que contenga 9 ml de solución salina, para realizar la dilución 10 . Mezclar el tubo según las
recomendaciones de la NOM 110 y tomar 1 ml, colocarlo en otro tubo con 9 ml de solución salina
-2
para obtener la dilución 10 y así sucesivamente.
b) El número de diluciones que realices depende del crecimiento que encuentres por turbidimetría o
6 -6
en el conteo directo, si el conteo es del orden de 1x10 , entonces realiza hasta las diluciones 10 y
-7
10 . Conforme aumente el número de microorganismos aumenta el número de diluciones,
recordemos que debemos tener un intervalo de conteo
4.4 CUENTA VIABLE
a.- Recordar la técnica de vaciado en placa, según la NORMA Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994,
Bienes y servicios. Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa.
78
SESIÓN II
Organización de las cinéticas: Se realizarán 4 cinéticas en todo el grupo con las siguientes
consideraciones
Cinética A Cinética B Cinética C Cinética D
Equipos 1,2 y dos alumnos Equipos 3 y 4 y un alumno Equipos 6,7 y dos alumnos Equipos 8 y 9 y un alumno
del equipo 5 del equipo 5 del equipo 10 del equipo 10
150 ml de Caldo Luria 150 ml de CGS al 5% 150 ml de Caldo Luria 150 ml de CGS al 5%
Volumen del inóculo 10 ml 10 ml 10ml
Si la As es de 0.8-0.9
4.5 PREPARACIÓN DE MATRAZ SEMILLA (DIA 1 y generalmente lo hace el profesor)

a) Inocular en condiciones de esterilidad un matraz conteniendo 50 ml de caldo Luria estéril con 2.5 ml
de una suspensión de Escherichia coli de 18 horas de cultivo.
b) Incubar a 35° C por 18 h en agitación aproximadamente a 120 rpm. Éste será el matraz semilla.
4.6 PREPARACIÓN DEL MATRAZ CINETICA (DIA 2)
Trabajo para el profesor

a) El día de la cinética tomar en condiciones de esterilidad 4 ml y medir la turbidez y de acuerdo a este
valor indicará a los alumnos cuanto inocular en su matraz cinética
b) De lo que quede en la pipeta realizar una tinción de Gram para verificar la pureza.
4.7 INOCULACIÓN DE MATRAZ DE CINÉTICA
Trabajo para los alumnos

1.- Enjuagar una celda espectrofotométrica con benzal y luego en condiciones de esterilidad
enjuagarla con alcohol, ahora con una pipeta estéril tomar 4 ml de caldo Luria o CGS del matraz de
cinética y colocarlo en la celda espectrofotomérica y colocarle parafilm (este es el blanco para
ajustar el espectro y poder leer cada lectura).
2.- Homogeneizar la suspensión microbiana del matraz semilla y tomar el volumen indicado por el
profesor que puede ser 5 o 10 ml de esta suspensión en condiciones de esterilidad e inocular el
matraz con caldo Luria o CGS para la cinética y mezclar perfectamente, anotar este tiempo (t0)
3.- Con una pipeta de 5 ml estéril tomar 5 ml inmediatamente y dar el matraz a un compañero para
que lo lleve a incubar y agitar. El alumno que tiene la pipeta con la muestra realizará lo siguiente en
este orden:
a.- Colocar 1 ml en un tubo de dilución y darle el tubo a otro compañero para que realice las
diluciones pertinentes, según el cuadro de diluciones, siguiendo las recomendaciones de la
NOM 110, sembrará las dos últimas diluciones por la técnica de vaciado en placa siguiendo las
recomendaciones de la NOM 092. Dejar solidificar e incubar.
Una vez depositado el ml en el tubo de dilución se puede apagar el mechero
b.- Tomar la otra celda espectrofotométrica y colocar aproximadamente 3.5 ml, colocar la celda
en el vaso de precipitados que contiene la celda (blanco) y se la dará a un compañero para que
realice la lectura en el espectrofotómetro. (Esta segunda celda no es necesario higienizarla)
d.- De lo que queda en la pipeta colocar una gota en la cámara de Neubauer y dársela al
79
compañero que va a realizar el conteo en el microscopio.
e.- Con lo que queda en la pipeta realizar un Gram para corroborar la pureza del matraz semilla
y desechar la pipeta en el benzal.
f.- Este procedimiento se hace según el cuadro de tiempos de toma de muestra
g.- Incubar las placar a 35°/ 24 h y realizar el conteo

5.1 Anota los resultados obtenidos. As del matraz semilla: _________
Tiempo Tiempo real en min Absorbencia 540 nm Cuenta directa UFC / ml
To
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
80
5.2 Cuenta viable por vaciado en placa: Anota el número de UFC/ ml.
Tiempo Conteo Promedio Resultado
To Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
T1 Dilución 10 Placa 1 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
Placa 2 =
81
5.3.3 ¿Es posible diferenciar células muertas de las vivas?

5.3.4 Construye una gráfica del número de UFC/ml vs Tiempo, señalando en la curva las diferentes
zonas de crecimiento.
5.3.5 Construye una gráfica del número de UFC/ml vs Tiempo (horas).
5.3.6. Construye una gráfica del log del número de UFC/ml vs Absorbencia.
5.3.7 Determina la velocidad específica de crecimiento
5.3.8 Calcula el tiempo de generación de la cepa estudiada.
5.3.9 Define el término velocidad específica de crecimiento
5.3.10 Menciona los factores de que depende la fase de muerte
5.3.11 ¿Por qué es importante la cinética microbiana?
6.1 Discute las ventajas y desventajas de los métodos empleados.
6.2 Analiza y discute sobre la base de lo anterior y a la investigación bibliográfica realizada, los
resultados obtenidos en esta práctica.
6.3 Discute la conveniencia o no de construir una curva de calibración con los resultados de
turbidimetría y de cuenta viable para un microorganismo dado, de ser conveniente explica para qué
podrá servir.
7. CONCLUSIONES
Elabora las conclusiones sobre la base de los resultados obtenidos, al análisis y discusión de estos, a
la bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica.
82
PRÁCTICA No. 8
PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO
UNIDAD V: Crecimiento microbiano
1. OBJETIVOS
El alumno realizará la producción de un metabolito de importancia industrial de origen microbiano,
medirá algunos parámetros para verificar su producción.
I.2 Objetivos específicos
1.2.1 El alumno determinará cuantitativamente el lactato producido.
1.2.2 El alumno establecerá la correlación entre el crecimiento microbiano y la producción de un del
metabolito primario.
2. INTRODUCCIÓN
Por biotecnología se entiende “Toda aplicación tecnológica que utilice sistemas biológicos y
organismos vivos o sus derivados para la creación o modificación de productos o procesos para usos
específicos”, según la definición de la ONU. Desde los inicios de la civilización, la humanidad ha
hecho uso de los microorganismos para obtener productos específicos como pan, cerveza, vino,
yogurt, etc., en lo que se conoce como biotecnología tradicional o de primera generación. En la
década de los 40´s, se emplearon las herramientas de la bioquímica y la microbiología en el uso y
manipulación de organismos para la obtención de metabolitos (aminoácidos, antibióticos, enzimas),
como biotecnología de segunda generación. Actualmente, la biotecnología de tercera generación hace
uso de las herramientas de la biología molecular y la ingeniería genética para la producción de
compuestos, enzimas, vacunas, anticuerpos, etc.
Uno de estos metabolitos de origen microbiano es el ácido láctico, obtenido generalmente a partir de
bacterias lácticas homofermentativas. Fue el primer ácido orgánico producido mediante fermentación
microbiana industrial en 1880. Se emplea en medicina para estabilización hemodinámica, en
cosmética como queratinolítico, para curtir pieles en peletería, y como acaricida en el ganado. El ácido
láctico tiene múltiples aplicaciones en la industria alimentaria como aditivo y conservante en productos
cárnicos y lácteos, en industria derivada de cereales y en numerosas industrias de bebidas. De hecho
el yogurt se produce por la fermentación de la lactosa de la leche hasta ácido láctico, cuya acidez
genera la precipitación de la caseína, dando el aspecto grumoso del yogurt. Se producen otros
alimentos a partir de fuentes de carbono diversas, en donde se genera acido láctico, tales como la
leche búlgara, el yakult, el jocoque, etc. En la producción de saeukrut (col fermentada), la primera fase
del proceso incluye la fermentación láctica. La producción sólo del ácido es de 20,000 toneladas
anuales.
El ácido láctico se produce a través de la degradación de lactosa ó glucosa por la ruta de Embden –
Meyerhoff –Parnas o glicólisis, hasta producir piruvato, el cuál es reducido por la Lactato
deshidrogenasa (LDH) a L – (+) Lactato. El lactato es un ácido carboxílico, y la acidez que genera, la
cuál llega a ser de pH 4.5, detiene el crecimiento de los microorganismos, lo que da fin al proceso
fermentativo, y permite conservar los productos, pues la acidez evita la contaminación por otros
microorganismos.
Las cepas utilizadas desde hace tiempo en la producción de lactato (sal sódica del ácido láctico, y que
es la forma como se comercializa) son principalmente lactobacilos (homofermentativos), como son
Lactobacillus delbruckii sub. delbrueckii, sub. bulgaricus y sub. lactis, y L. helveticus. Estos
microorganismos son anaerobios aerotolerantes, por lo que la fermentación se puede llevar a cabo en
83
condiciones parcialmente anaerobias, y no es necesaria la anaerobiosis absoluta. Otros lactobacilos

son heterofermentativos (grupo III), y además de producir lactato, producen acético, etanol u otros
productos, por lo que no son útiles para la producción. L. delbruckii sub. delbrueckii fermenta la
glucosa y la fructosa, pero no la lactosa; L. delbruckii sub. bulgaricus y lactis si pueden fermentar la
lactosa. Actualmente la mitad del lactato que se genera se produce por fermentación, y el resto por
síntesis química.
Los fabricantes ponen especial interés en la selección de las condiciones adecuadas de cultivo para
lograr altas tazas de producción del ácido. En la producción se puede emplear glucosa o lactosa como
fuentes de carbono, pero se prefiere la glucosa por el precio. Además de la glucosa y de la fuente de
nitrógeno, generalmente fosfato de amonio, estas bacterias requieren vitaminas del grupo B para su
crecimiento, las cuales se pueden adicionar puras, o adicionar una fuente rica en ellas, como el
extracto de levadura. En los procesos continuos, se adiciona CaCO3 para mantener el pH alto y evitar
que la fermentación se detenga. La fermentación típica dura 72 horas y debe mantenerse una
temperatura entre 30 -35° C. En los últimos tiempos, se han desarrollado procesos para la obtención a
partir del suero lácteo desproteineizado que es un subproducto de queserías, con lo cuál se
disminuyen costos, además de evitar contaminación por su desecho. Este suero contiene un 5%
aprox. de lactosa que funciona como fuente de carbono. También se emplea la melaza del azúcar,
dando un uso alternativo de la caña de azúcar.
Un proceso típico de fermentación “batch”, consiste en la preparación del inóculo, la inoculación del
fermentador semilla, la fermentación en el tanque de producción y la etapa de purificación del
metabolito. El estudio cinético de un proceso fermentativo para la obtención de un metabolito consiste
en la determinación y análisis de los componentes del sistema que nos permitan establecer las
mejores condiciones de producción y tener control sobre ellas, como son: determinación del
crecimiento del microorganismo como biomasa producida (x), el consumo de carbohidratos o de la
fuente de carbono empleada, es decir el sustrato (s) y la cantidad de metabolito producido (P).
La determinación de biomasa microbiana se puede hacer por peso seco o peso húmedo, ó por cuenta
directa. La determinación del consumo de la fuente de carbono o sustrato depende de la naturaleza
de éste, y y existen varias técnicas espectrofotométricas para ello. La técnica elegida para la
determinación del metabolito producido, también depende de la naturaleza de este. Dado que el ácido
es un metabolito asociado al crecimiento, la medición de la biomasa producida, puede ser indicativa
de la producción de láctico en un cultivo “batch”. En este caso la determinación de la acidez del medio
nos permitirá determinar su producción.
3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS
3.1 EQUIPO Y MATERIAL
• Estufa de incubación a 40 ºC • Potenciómetro
• Microscopio • Cámara de Neubauer
• Balanza analítica • Tubos de ensaye de 13 X 100 mm
• Refrigerador • Bureta graduada
• Matraces Erlenmeyer de 125 ml y 250 ml. • Vaso de precipitados de 30 ml
• Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 ml estériles • Centrifuga
3.2 MATERIAL BIOLÓGICO
• Cepa: Lactobacillus delbrueckii sub. lactis en tubos inclinados de medio MRS
84
3.3 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

• Un matraz con 150 ml de Medio MRS • Solución salina isotónica estéril
• NaOH 0.1 N • Colorantes para tinción de Gram
• Regulador de pH 4.0 • Solución de fenolftaleína
• Regulador de pH 7.0
4.1 PREPARACIÓN DEL INÓCULO Y MATRAZ SEMILLA.
a) Tomar un tubo con medio inclinado con un cultivo de Lactobacillus lactis y adicionarle 2 ml de
solución salina isotónica.
b) Homogeneizar perfectamente para tomar suspensión celular.
c) Inocular un matraz conteniendo 150 ml de medio MRS de cultivo con 2.0 ml de la suspensión
celular. A fin de verificar la pureza de éste matraz semilla, se realizará una tinción de Gram y se
revisará en el microscopio.
d) Incubar a 40 oC durante 48 horas sin agitación
PRIMERA SESIÓN
e) . Adicionar del matraz anterior 10 ml de la cepa semilla a un matraz conteniendo 150 ml de medio
MRS y homogenizar.
f) Tomar 10 ml de la muestra del tiempo 0 h y colocarlo en un tubo previamente pesado, etiquetar
perfectamente y guardar en el refrigerador.
g) Tomar 2 ml y colocarlo en un tubo de ensaye, etiquetar y guardarlo en el refrigerador.
SEGUNDA, TERCERA y CUARTA SESIÓN: (algunas de estas sesiones son extra-clase).
1.- Tomar 10 ml de la muestra y colocarlo en un tubo de ensaye previamente pesado, tapar con
parafilm y guardar en el refrigerador.
2.- Colocar los 2 ml en un tubo de ensaye y colocarle parafilm para guardarse en el refrigerador.
3.- Del volumen que quede en la pipeta esparcir un poco para la realización del Gram
4.- Realizar este procedimiento a las 24, 48 y 72 h.
4.2 TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS
a) Centrifugar los cuatro tubos, para ello recuerda que hay que tararlos.
b) Verter el sobrenadante en un vaso de 15 ml para la determinación de pH
c) Posteriormente vaciar el sobrenadante en un matraz y colocarle 3 gotas de fenolftaleína para
realizar el procedimiento de titulación.
d) De los dos ml que tienes en el tubo, agitar perfectamente y proceder a colocar una gota en la
cámara de Neubauer para el recuento de células.
e) Realizar la tinción de Gram y proceder a observar la pureza y morfología microscópica
4.2.1 DETERMINACIÓN DEL PESO HÙMEDO.
a) Pesar cuatro tubos de 0. 24,48 y 72 h previamente etiquetados

b) En estos tubos se pondrá los 10 ml de la muestra de cada tiempo
85
c) El día de la práctica, sacar los tubos del refrigerador y tarar los tubos, centrifugar 5 min a 4000 rpm.
d) Una vez centrifugado decantar el sobrenadante en un vaso de precipitados de 15 ml. Etiquetar el
vaso con el tiempo y pasarlo a la sección de determinación de pH con el potenciómetro.
e) Pesar el tubo que contiene las células y con la diferencia de peso de los tubos vacíos y los
centrifugados sacar el peso en g/ml
f) Realizar lo mismo para las otras muestras.
4.2.2. DETERMINACIÓN DEL ÁCIDO LÁCTICO PRODUCIDO POR DETERMINACIÓN DE pH.
a) Ajustar el potenciómetro según las indicaciones del profesor con un regulador de pH= 4 y otro de
pH= 7 y medir el pH de las muestras. Esto será indicativo de la producción de ácido láctico.
b) Medir el pH de la muestra y pasar el vaso a la sección de titulación
c) Realizar lo mismo para las otras muestras
4.2.3. DETERMINACIÓN DEL ÁCIDO LÁCTICO PRODUCIDO POR DETERMINACIÓN DE ACIDEZ.
d) Vaciar el contenido del vaso a un matraz, colocarle 3 de gotas de fenolftaleína y mezclar bien.
e) Realizar la titulación con NaOH 0.1 N a las cuatro muestras
f) Registrar el volumen de álcali gastado, para calcular los moles de ácido orgánico láctico.
4.2.4. DETERMINACIÓN DE LA PUREZA
a) Para verificar la pureza del cultivo se realizarán las cuatro tinciones de Gram.
4.2.5 CUENTA DIRECTA EN CÀMARA DE NEUBAUER PARA MEDIR EL CRECIMIENTO.
a) Tomar una gota de la alícuota previamente homogenizada del tubo que contiene los 2 ml y colocarla
en la cámara de Neubauer.
b) Colocar la cámara en el microscopio y enfocar a 10X, eligiendo el campo de la cuadricula.
c) Cambiar a 40X y realizar el conteo de bacterias. Registrarlas para el cálculo posterior del número
de células.
5. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS.
5.1 Anotar en la tabla siguiente anotar los resultados obtenidos. Los resultados obtenidos serán
utilizados para elaborar la gráfica de la cinética de producción de lactato
Tiempo Peso húmedo Valor de pH Acidez Pureza No. de Cel / ml
0
24
48
72
5.2 Con los datos del gasto en ml de NaOH de cada una de las muestras y con las formulas calcula
los moles de NaOH.
* La solución de sosa es 0.1N, lo que equivale a 0.1 moles / L

86
Después se calculan los moles de lactatos presentes en la muestra:
5.3 ¿Cuántos moles de lactato se produjo en el matraz que se corrió? Comparar la cantidad de lactato
producido en los matraces con suero de leche y con glucosa, e indicar cuál es más conveniente
para la producción de lactato.
5.4 Con los resultados de pH, y número de células, elaborar una gráfica, de tiempo contra crecimiento
y pH a los diferentes tiempos. Con esto tendremos una gráfica donde se muestre como se
comporta el cultivo con respecto al pH. Recuerda que es una sola gráfica para pH y número de
células.
5.5 Escribir la vía metabólica utilizada en la fermentación para la producción de ácido láctico.
5.6 Explicar porque se eligió esta cepa para la producción de lactato.
5.7 Mencionar dos usos del ácido láctico.
Discutir los resultados obtenidos en función del medio empleado y la cantidad de lactato producido en
cada medio. Explicar las ventajas de producir lactato en cada uno de los medios.
7. CONCLUSIONES
Elabora las conclusiones sobre la base de los resultados obtenidos, al análisis y discusión de estos, a
la bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica.
87
PRÁCTICA No. 9
CUANTIFICACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES POR LA TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS
PROBABLE (NMP)
UNIDAD V: Crecimiento microbiano
1.-OBJETIVOS.
El alumno cuantificará bacterias coliformes por la Técnica de Número Más Probable de una muestra
biológica.
1.1 Objetivos específicos:
1.2.1 El alumno aplicará adecuadamente la Técnica del Número Más Probable para cuantificar a los
microorganismos coliformes totales o fecales presentes en una muestra.
1.2.2 El alumno interpretará la Técnica de Número Más Probable para el conteo de organismos
coliformes totales o fecales en muestras según la NOM-210-SSA1-2014, Productos y servicios. Métodos
de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos patógenos.
2.- INTRODUCCIÓN
Esta técnica está basada en la estadística, matemática inobjetable, para expresar cuantitativamente la
densidad de microorganismos en una muestra. Se basa en la presunción de que las bacterias se hallan
normalmente distribuidas en un medio líquido.
La Norma Oficial Mexicana la NOM-210-SSA1-2014, Productos y servicios. Métodos de prueba
microbiológicos. Determinación de microorganismos patógenos; establece el método microbiológico para
estimar el número de coliformes totales, fecales y E. coli por la técnica del Número Más Probable (NMP)
presentes en productos alimenticios.
Este procedimiento puede aplicarse a agua potable, agua purificada, hielo y alimentos procesados
térmicamente, así como a muestras destinadas a evaluar la eficiencia de prácticas sanitarias en la
industria alimentaria. Este procedimiento debe seleccionarse cuando la densidad esperada es como
mínimo de una bacteria en 10 ml de producto líquido o una bacteria por gramo de alimento sólido.
Cuando la densidad bacteriana sea menor que la aquí citada y si la naturaleza del alimento lo permite,
utilizar el método de filtrado en membrana. Si la densidad microbiana se espera sea mayor a 100 por
mililitro o gramo de muestra, ampliar el intervalo de diluciones o utilizar el método en placa.
El método se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a 35 ± 1°C durante
24 a 48 h, resultando una producción de ácidos y gas el cual se manifiesta en las campanas de
fermentación.
La técnica NMP requiere de mucho más material que la utilizada en los recuentos en placa y se
considera en general, que posee una menor exactitud y precisión; sin embargo, es más sensible ya que
pone de manifiesto unos cuantos microorganismos o uno solo en un gran volumen de muestra
(teóricamente litros). Por esta razón encuentra aplicación en el análisis de agua, por ejemplo, en donde
la presencia de dos organismos coliformes en 100 ml, ya reclama atención especial en un sistema de
abastecimiento.
Con frecuencia en la aplicación de la técnica de NMP de un grupo particular de microorganismos, el
ensayo se extiende a dos o más estadios, en el primero, que constituye la prueba presuntiva, los tubos
positivos pueden ser el resultado de la actividad de los microorganismos en cuestión, o también de otros
con comportamiento similar e incluso, de asociaciones de diferentes microorganismos. La que viene a
ser la prueba presuntiva en la investigación de organismos coliformes, consiste en inocular alícuotas de
la muestra en tubos de fermentación con caldo lactosado. En ellos, estos microorganismos proliferan
fácilmente fermentando la lactosa y liberando gas que se acumula en la campana de Durham. Un efecto
88
semejante puede ocurrir en ausencia de organismos coliformes como resultado de la acción sinérgica de
dos tipos de bacterias; una capaz de fermentar la lactosa hasta ácido láctico y pirúvico; y otra que
metaboliza estos ácidos generando el gas, aldehído y ácidos menores. Algunas bacterias Gram
positivas también pueden, aunque en menor grado producir gas a partir de la lactosa. Se hace por ello
indispensable efectuar un segundo ensayo, llamado prueba confirmatoria en la cual los organismos
coliformes, en caso de existir, proliferan activamente en tanto que los falsos positivos serán inhibidos por
la presencia de sustancias selectivas antibacterianas adicionadas al medio de confirmación.
Otra prueba para determinar la presencia de bacterias coliformes es la cuenta total en placa
El método permite determinar el número de microorganismos coliformes presentes en una muestra,
utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis) en el que se desarrollan bacterias a 35°C en
aproximadamente 24 h, dando como resultado la producción de gas y ácidos orgánicos, los cuales viran
el indicador de pH y precipitan las sales biliares.
El número de organismos se establece mediante la cuenta de unidades formadoras de colonias NOM-
113-SSA1-1994. Método para la Cuenta de Microorganismos Coliformes Totales en Placa.
Las bacterias coliformes son bacilos cortos, Gram negativos, que fermentan la lactosa y producen ácido
y gas, son anaerobios facultativos y se multiplican a mayor rapidez a temperaturas entre 30 y 37 ºC.
Las bacterias coliformes incluyen la E. coli y otras bacterias que se asemejan morfológica y
fisiológicamente.
3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS, MEDIOS DE CULTIVO Y MUESTRAS
• Frascos de dilución con 225 ml de agua • Tubos con 10 ml de caldo EC con campana de
peptonada al 0.1 %. Durham.
• Tubos de dilución con 9mL de agua peptonada al • Placas con Agar Mac Conkey
0.1%
• Placas con Agar EMB
• Tubos con 10 ml de caldo lauril sulfato triptosa
• Tubos con agar nutritivo
triple concentración y campana de Durham
• Tubos con agar cuenta estándar
• Tubos con 20mL de caldo lauril sulfato triptosa
doble concentración con campana Durham • Tubos con medio SIM
• Tubos con 10 mL de caldo lauril sulfato triptosa • Tubos con medio MR-VP
concentración sencilla
• Tubos con agar citrato de Simmons
• Tubos con 10 ml de caldo lactosa bilis verde
brillante con campana de Durham • Frascos estériles con 0.2ml de tiosulfato de sodio
al 10%
Determinación de coliformes totales, fecales y E. coli en muestras de agua o hielo.

• 5 tubos con 10 ml de caldo lauril sulfato triptosa (CLST) de triple concentración con campana Durham
• 10 tubos con 10 ml de caldo EC con campana Durham
• 10 tubos con 10mL de caldo lactosa bilis verde brillante (CBVB) con campana Durham
Determinación de coliformes totales, fecales y E. coli para muestras de agua para uso recreativo.
89
• 5 tubos con 20 ml de caldo lauril sulfato triptosa (CLST) de 1.5 de concentración con campana Durham
o 5 tubos con 10mL de caldo lauril sulfato triptosa (CLST) de doble concentración con campana
Durham.
• 10 tubos con 10 ml de caldo lauril sulfato triptosa de concentración sencilla y campana Durham
• 15 tubos con 10 ml de caldo de bilis verde brillante (CBVB)
Determinación de coliformes totales, fecales y E. coli para muestras de alimento.

• 6 Frascos de dilución con 225 ml de agua peptonada al 0.1 %
• 54 tubos con 10ml de caldo lauril sulfato triptosa concentración sencilla con campana Durham
• 18 tubos con 10 ml de caldo de bilis verde brillante (CBVB)
3.2 MATERIAL
• Un cilindro metálico con pipetas de 1 ml estériles • Tubos de ensayo de 13mmx100mm con tapón de
rosca
• Cuatro pipetas de 10ml
• Frascos de dilución con capacidad de 500ml
• Tubos de ensayo de 18mmx200mm con tapón de
rosca • Cajas Petri de vidrio
• Tubos de ensayo de 16mmx150mm con tapón de • Termómetro
rosca.
3.3 REACTIVOS
• Tiosulfato de sodio • Rojo de metilo
• Colorantes para Gram • KOH al 40%
• Kovac´s • Benzal
• α-naftol
3.4 EQUIPO
• Una autoclave. • Una incubadora a 35° C.
• Una balanza granataria • Un horno a 180° C.
• Un baño María a 44.5 ° C
4.- PROCEDIMIENTO
• Para los equipos que van a traer muestras de agua potable con tratamientos a base de cloro, tendrán
que llevar un frasco que contenga 1 ml de tiosulfato de sodio al 10 % para inactivar el cloro residual,
para los equipos que traigan muestra sin tratamiento con cloro, el frasco solo será estéril, se pueden
utilizar bolsas whirl –pak con o sin una pastilla de tiosulfato.
90
• Para muestras sólidas se tomarán en una bolsa de plástico nueva y tendrán que realizar la dilución
primaria si es que la muestra aparentemente no tiene muncha carga microbiana.
• Las muestras a traer serán las siguientes:
equipo Determinación
1y6 Agua Determinación de Organismos coliformes totales
2y7 Hielo Determinación de Organismos coliformes fecales
3y8 Queso Determinación de Organismos coliformes totales
4y9 Leche Determinación de Organismos coliformes fecales
5 y 10 Fresas Determinación de Organismos coliformes totales
4.1 Procedimiento para agua e hielo de uso y consumo humano

Prueba presuntiva
a. Transferir 5 porciones de 20ml a tubos que contienen 10ml de caldo lauril sulfato triptosa triple
concentración con campana Durham.
b. En el caso del hielo, antes de la inoculación a los tubos con caldo, este se debe fundir por completo a
una temperatura de 45°C.
c. Para agua de uso recreativo, a partir de la muestra transferir 5 porciones de 10ml a tubos que
contienen 10ml de caldo lauril sulfato triptosa doble concentración con campana Durham ó 5 porciones
de 10ml a tubos que contienen 20ml de caldo lauril sulfato triptosa concentración 1.5, con campana
Durham.
d. Transferir otras 5 porciones de 1mL y 0.1mL a tubos que contienen 10ml de caldo lauril sulfato triptosa
concentración sencilla con campana Durham.
e. Incubar los tubos a 35°C±0.5°C por 24-48h.
Prueba confirmativa
a. De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una asada y sembrar un número igual de
tubos de caldo EC (para detección de coliformes fecales) o caldo lactosa bilis verde brillante
(para coliformes totales).
b. Incubar los tubos para prueba de coliformes totales a 35°C±0.5°C por 48h±2h y para la prueba de
coliformes fecales a 44.5°C±0.2°C en baño de agua con recirculación continua por 24h, observar
si hay formación de gas, registrar la lectura, en caso de no haber formación de gas, incubar 24h
más.
c. Utilizar estos resultados para calcular el NMP de coliformes totales o coliformes fecales
respectivamente.
d. Reportar: Para calcular el NMP/100ml multiplicar por 100
4.2 Procedimiento para alimentos

Prueba presuntiva
a. Tomar 25g ó 25ml de muestra y transferir a un frasco que contenga 225mL de agua peptonada al
0.1% estéril, esta será tu dilución primaria. En caso de que la cantidad de muestra sea menor de
91
25g y el análisis necesite ser efectuado, utilizar una cantidad de muestra que represente una
porción 1:10.
b. Realizar diluciones decimales dependiendo de la cantidad de coliformes esperada.
c. Agitar las diluciones 25 veces en un arco de 30cm durante 7 segundos, transferir volúmenes de
1ml a tres tubos con 10ml de caldo lauril sulfato triptosa concentración sencilla, por cada dilución,
por lo menos tres diluciones consecutivas.
d. El tiempo entre la homogenización de la muestra y la inoculación de los tubos no debe exceder de
15 a 20 minutos.
e. Incubar los tubos a 35°C±0.5°C por 24-48h para observar si hay formación de gas.
Prueba confirmativa
e. De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una asada y sembrar un número igual de
tubos de caldo EC (para detección de coliformes fecales) o caldo lactosa bilis verde brillante
(para coliformes totales).
f. Incubar los tubos para prueba de coliformes totales a 35°C±0.5°C por 48h±2h y para la prueba de
coliformes fecales a 45.5°C±0.2°C en baño de agua con recirculación continua por 24h, observar
si hay formación de gas, registrar la lectura, en caso de no haber formación de gas, incubar 24h
más.
g. Utilizar estos resultados para calcular el NMP de coliformes totales o coliformes fecales
respectivamente.
h. Reportar: Número más probable de coliformes por g o ml de muestra NMP/g o NMP/ml.
4.3 Prueba complementaria

Esta prueba es optativa de calidad para todas las muestras de agua, que tiene como finalidad confirmar
el 10% de los tubos positivos de coliformes totales en caldo verde brillante.
a. Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos de caldo verde brillante y sembrar por estría
cruzada en agar Mac Conkey.
b. Incubar a 35°C±0.5°C por 24h±2h. Observar colonias típicas fermentadoras de color rosa intenso
que pueden estar rodeadas de un halo opaco por la precipitación de sales biliares.
c. Seleccionar una o más colonias aisladas con las características anteriores, e inocular en tubos de
fermentación con caldo lauril sulfato triptosa y a tubos con agar nutritivo.
d. Incubar a 35°C±0.5°C por 24h y observar si hay formación de gas, si no se observa gas incubar
por 24h más; anotar los resultados.
e. Realizar tinción de Gram a partir del crecimiento en el agar nutritivo para la observación de la
morfología microscópica.
f. La formación de gas en los tubos y la observación de bacterias Gram negativas, en forma de
bacilos no esporulados constituyen una prueba positiva a la presencia del grupo coliforme.
4.4 Prueba confirmativa para E. coli (por identificación bioquímica)

a. Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos de caldo EC y sembrar por estría cruzada en
agar EMB.
92
b. Incubar a 35°C±1°C por 18-24h. Seleccionar dos colonias de cada placa con la morfología típica;
colonias con centro negro, planas con o sin brillo metálico y sembrarlas en tubos que contengan
agar cuenta estándar, para realizar morfología microscópica y pruebas bioquímicas.
c. Incubar a 35°C±1°C por 18-24h. Realizar un frotis y teñirlo por Gram, observar al microscopio la
presencia de bacilos cortos Gram negativos.
d. Realizar pruebas bioquímicas (IMViC): indol, rojo de metilo, Voges Proskauer y citrato. Incubar a
35°C±1°C por 24-48h.
e. Interpretación: Todos los cultivos que fermenten la lactosa con producción de gas dentro de las
48h a 35°C, sean bacilos cortos Gram negativos no esporulados y se obtengan las siguientes
combinaciones para el IMViC:
Pruebas Biotipo 1 Biotipo 2
Indol + -
RM + +
VP - -
Citrato - -
Anota los resultados de todos los equipos en el siguiente cuadro, para ello consulta la tabla que viene en
la Norma Oficial Mexicana NOM-210-SSA1-2014, Productos y servicios
Equipo Muestra Organismos coliformes por NMP
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
5.1.- ¿Qué son los organismos coliformes?
5.2.-Anota todos los componentes del caldo lauril sulfato triptosa y menciona la función de cada uno de
ellos.
5.3.- ¿Por qué se usa caldo de 1.5, doble o triple concentración para análisis de agua?
5.4.-Anota todos los componentes del caldo EC, menciona la función de cada ingrediente.
5.5.-Anota todos los componentes del caldo de bilis Verde brillante menciona la función de cada uno de
ellos.
5.6.- ¿Por qué se les llama microorganismos indicadores a los coliformes?
5.7.- ¿A qué se debe la presencia de organismos coliformes fecales en muestras de agua y alimentos?
93
Analice la Técnica del Número Más Probable, presencia o ausencia de organismos coliformes totales y
coliformes fecales en muestras de agua, así como el uso de las tablas.
Analiza la presencia o ausencia de organismos coliformes totales y coliformes fecales en agua
7.- CONCLUSIONES
Elabora las conclusiones con base a los resultados obtenidos y a los objetivos de la práctica.
94
PRÁCTICA No 10
IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS
No. DE UNIDAD: IV Metabolismo bacteriano
OBJETIVOS:
El alumno identificará bacterias de interés, a través de su metabolismo microbiano.
1.2.1 El alumno realizará pruebas para determinar la actividad enzimática sobre los carbohidratos y
sales orgánicas como principales fuentes de carbono.
1.2.2 El alumno realizará pruebas de hidrólisis para aminoácidos y proteínas para demostrar su actividad
enzimática.
1.2.3 El alumno realizará pruebas para demostrar la actividad enzimática en los procesos de óxido-
reducción.
2. INTRODUCCIÓN
El metabolismo es un proceso químico, mediante el cual los seres vivos transforman una serie de
compuestos químicos con el fin de obtener energía. Los microorganismos son capaces de efectuar
reacciones bioquímicas para degradar nutrientes cuyos productos finales permiten su identificación, a
este grupo de reacciones se les denomina pruebas bioquímicas, las cuales se han clasificado según su
origen:
a) Reacciones de carbohidratos (almidón, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, etcétera).
b) Reacciones para sales orgánicas (citrato, malonato, urea).
c) Reacciones para proteínas y aminoácidos (gelatina, caseína, triptófano, lisina, arginina y ornitina).
d) Por el tipo de respiración que efectúan (aerobios estrictos, microaerofílicos, anaerobios facultativos y
anaerobios estrictos).
Las identificaciones bacterianas preliminares pueden efectuarse observando las características de las
colonias y la morfología microscópica, pero la caracterización final de un aislamiento bacteriano
desconocido en género y especie se logra mediante la detección de ciertos sistemas enzimáticos
exclusivos de cada especie.
En el laboratorio estos sistemas se detectan inoculando una pequeña porción de la colonia aislada a una
serie de medios de cultivo que contienen substratos específicos, e indicadores químicos que detectan
los cambios de pH o la presencia de un subproducto.
Para poder realizar una identificación bacteriana es necesario primero sembrar por estría a los
microorganismos, ya que generalmente se parte de un cultivo mixto, de esta manera se logra aislar y
observar su morfología colonial. Una vez que se tiene el cultivo puro, se transfiere a un medio de cultivo
en la cual se desarrolle, para poder lograr estos pasos es necesario saber la temperatura óptima de
crecimiento. Cuando se tiene el cultivo puro, se procede a realizar la tinción de Gram para clasificarlo y
saber a qué grupo pertenece G+ ó G-. Además, en la morfología microscópica permite conocer la forma
y agrupación del microorganismo (bacilo, coco, coma, etc.)
Recientes avances biotecnológicos son usados para el análisis microbiológico. Las pruebas de
identificación bioquímica esta miniaturizada y automatizada haciéndose el análisis más rápido y
económico. Los microorganismos patógenos deben ser aislados e identificados debido a que producen
enfermedades a cientos de personas causando daños económicos. Una vez aislados podemos medir
95
específicamente los cambios fisicoquímicos resultado del crecimiento o actividad metabólica, aunque la
formulación de un producto con proteínas, aceites, ácidos grasos, conservadores hace que en un
momento dado favorezcan o inhiban el crecimiento microbiano.
Algunos métodos utilizados para identificar grupos microbianos o microorgansimos (género y especie)
son:
Placa Petrifilm, Detección de Salmonella por el sistema VIDAS, Sistema API, Coli-complete, Sistema
VITEK, Identificación por PCR, etc
En nuestro caso identificaremos a los microorganismos por medio de pruebas bioquímicas de manera
tradicional, ya que existen métodos “rápidos” que facilitan el trabajo, pero es necesario saber el
fundamento.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
 Fermentación de carbohidratos (glc lac,  Hidrólisis de la gelatina (licuefacción de

sac, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, la gelatina), en el medio gelatina
sorbitol, raf, ram, xilosa) en el medio base
 Crecimiento en caldo nutritivo
CRF.
 Utilización de la esculina, medio de bilis
 Fermentación de la glucosa, producción
y esculina
de ácido sulfhídrico, producción de gas,
en el medio TSI  Utilización del gluconato (oxidación),
medio caldo gluconato peptona
 Descarboxilación de la lisina, en el
medio LIA  Requerimientos de oxígeno, condiciones
aerobias y anaerobias
 Movilidad, descarboxilación de la ornitina
y la producción de indo, en el medio MIO  Producción de Catalasa y oxidasa
 Movilidad, producción H2S, producción de  Reducción de nitratos, en caldo nitrato.
indol, en el medio SIM  Detección del metabolismo oxidativo
 Prueba cuantitativa para la producción /Fermentativo, en el medio OF con
de ácidos. Prueba de Rojo de metilo, sacarosa
medio RM/VP  Utilización del citrato, en citrato de Sodio
 Producción de ureasa, en caldo urea  Utilización de Malonato, en malonato
 Producción de acetil metil carbinol.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM POSITIVAS
 Fermentación de carbohidratos (glc, lac, sac,  Crecimiento en bilis al 40 %

manitol, dulcitol, salicina, adonitol, sorbitol,
 Coagulasa
raf, ram, xilosa, etc.)
 Hidrólisis de gelatina (licuefacción de la
 Fermentación de la glucosa, producción de
gelatina), en el medio gelatina
ácido sulfhídrico, producción de gas, medio
de TSI  Hidrólisis de la esculina, en caldo esculina
 Descarboxilación de la lisina, medio de LIA  Producción de acetil metil carbinol, prueba
Voges – Proskauer, medio VP/RM
 Movilidad, descarboxilación de la ornitina y la
producción de indol, medio de MIO  Producción de la fosfatasa, medio PDP
 Prueba de la DNAsa, en el medio agar ADN
 Movilidad, producción de indol y producción
96
de ácido sulfhídrico, medio SIM  Crecimiento a 10 y 45 ª C

 Producción Catalasa y oxidasa  Reducción con azul de metileno en leche
 Reducción de nitratos  Hidrólisis en caldo hipurato de sodio
 Producción de hemólisis, en agar sangre  Formación de cápsula
 Crecimiento en NaCl al 5, 10 y 15 %  Hidrólisis de almidón,
 Sensibilidad a optoquina y bacitracina
Debemos mencionar que para la identificación de un microorganismo es necesario consultar la literatura

para hacer una selección de pruebas recomendable y logras su identificación lo más rápido posible y sin
pérdida de tiempo y de pruebas, las pruebas antes mencionadas son algunas de las cuales podemos
realizar en un momento dado y a continuación se describirán algunas de ellas.
FUNDAMENTO DE ALGUNAS PRUEBAS BIOQUIMICAS
1 PRUEBA DE HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN
Determinar la capacidad de un microorganismo para secretar la enzima amilasa para la degradación de
almidón en moléculas más pequeñas para ser utilizadas en su metabolismo.
2 PRUEBAS DE FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN TUBOS CON CALDO ROJO DE FENOL
Determinar la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato incorporado a un medio,

produciendo ácido y/o gas en una campana de Durham; el medio es líquido y como indicador contiene
rojo de fenol.
3 PRUEBAS EN AGAR TRIPLE AZÚCAR Y HIERRO (MedioTSI)
Detección de fermentadores de glucosa y lactosa en agar de hierro de Kligler (KIA) o agar triple azúcar
hierro (TSI). Este medio sirve para determinar la fermentación de glucosa, sacarosa y lactosa además de
la producción de gas a partir de glucosa y la producción de ácido sulfhídrico que precipita como sulfuro
férrico al reaccionar con el hierro, la liberación del ácido sulfhídrico se libera por acción enzimática, de
los aminoácidos que contienen azufre produciendo una reacción visible de color negro.
La fórmula del TSI y del KIA son idénticas, salvo que el TSI contiene 10 g/l de sacarosa además de
glucosa y lactosa (triple azúcar), el agar está preparado en pico de flauta, de tal manera que se tienen 2
cámaras de reacción dentro del mismo tubo. La porción inclinada, “pico de flauta” expuesta en toda su
superficie al oxígeno, es aeróbica y la parte inferior llamado “fondo” está protegida del aire y es
relativamente anaerobia. Al preparar el medio es importante que el medio solidifique en forma de pico de
flauta y el fondo, además que estos tengan la misma longitud de aproximadamente 3 cm cada uno, a fin
de conservar este efecto de las dos cámaras. La técnica de inoculación es por picadura y por estría en el
pico de flauta, para esto hay que utilizar el asa recta, primero se introduce en la parte profunda y luego
se estría el pico de flauta con un movimiento hacia uno y otro lado, el indicador de pH: rojo de fenol y un
pH ácido da una coloración amarilla y en un pH alcalino es rojo.
4. PRUEBA DE ROJO DE METILO
El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6-8 amarillo) y 4,4 (rojo), esta prueba es
cuantitativa para la producción de ácido y requiere de organismos positivos que produzcan ácido láctico,
acético, o fórmico a partir de la glucosa, por la vía de la fermentación mixta. Dado que existen muchos
microorganismos que producen ácidos, sólo se consideran rojo de metilo positivo aquellos organismos
97
que puedan mantener este pH bajo un largo tiempo de incubación (48-72 h), contrarrestando el sistema
estabilizador de pH del medio.
Controles
Prueba Control negativo Control positivo

Rojo de metilo Escherichia coli Enterobacter aerogenes
4.5. PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER
La reacción de Voges – Proskauer se basa en la conversión del acetilmetilcarbinol (acetoína) en
diacetilo por acción del KOH al 40 % y el O2 atmosférico, la acetoína se convierte en diacetilo el α-naftol
actúa como catalizador para revelar un complejo de color rojo, el indicador de pH es el Rojo de metilo.
Controles

Voges - Proskauer Escherichia coli Klebsiella sp
UTILIZACIÓN DE SALES ORGÁNICAS
6. PRUEBA DE CITRATO
Algunos microorganismos pueden suministrar energía en ausencia de la fermentación o producción de
ácido láctico empleando como única fuente de carbono al citrato. El metabolismo del citrato comprende
una condensación de acetilo con la coenzima A y oxaloacetato para entrar en el ciclo de Krebs. Los
productos obtenidos del metabolismo del citrato dependen del pH del medio si es alcalino se produce
más acetato y formato con una disminución del lactato y CO2. Por encima del pH de 7 no hay producción
de lactato y los productos son CO2 ácido fórmico y ácido acético.
Con un pH ácido el acetil metilcarbinol y el lactato son los principales productos de la utilización del
citrato. El medio utilizado para la fermentación del citrato contiene también sales de amonio inorgánicas,
un organismo que es capaz de utilizar citrato como su única fuente de carbono utiliza también las sales
de amonio como su única fuente de nitrógeno. Cualquier medio empleado para detectar la utilización de
citrato por parte de las bacterias en estudio debe estar desprovisto de proteínas e hidratos de carbono
como fuente de carbono.
Controles

Citrato de sodio Escherichia coli. Enterobacter aerogenes
7. PRUEBA DE MALONATO
Determinar la capacidad de un organismo de utilizar malonato de sodio como única fuente de carbono,
con la consiguiente alcalinidad.
El malonato es un inhibidor enzimático ya que interfiere en la oxidación del ácido succínico en ácido
fumárico, inhibiendo la acción catalítica de la enzima succinato deshidrogenasa, mediante un proceso de
inhibición competitiva. El ácido malonico (malonato) se une a la enzima bloqueando los sitios activos de
manera que la enzima no puede combinarse con su sustrato normal, el ácido succínico. Esto ocasiona
un bloqueo en la oxidación del ácido succínico.
98
Según la concentración del malonato, el inhibidor puede retardar simplemente la velocidad de la

oxidación del ácido succínico o provocar su completa inhibición. En el ciclo de Krebs, cada compuesto
ácido es influido independientemente por enzimas específicas; se consume una molécula y se forma
otra en un proceso por etapas. Si se ha suprimido la formación de un ácido, y no es reemplazado, como
el ácido fumárico, el ciclo se Krebs deja de funcionar, por lo tanto, la célula bacteriana, recurre al ciclo
del ácido glioxílico para la producción de intermediarios, para ulterior biosíntesis en el metabolismo.
Indicador de pH: Azul de bromotimol
Controles

Caldo malonato Salmonella Alcaligenes faecalis
8. PRUEBA DE UREASA
La urea es una diamida del ácido carbónico y esta es fácilmente hidrolizada con la liberación de
amoníaco y dióxido de carbono. La enzima ureasa que posee un microorganismo pueden hidrolizar a la
urea que está presente en el medio de cultivo de acuerdo con la siguiente reacción: El amoníaco
reaccionan en solución para formar carbonato de amonio, produciéndose una alcalinización y un
aumento del pH del medio, el indicador de pH es el rojo de fenol.
Controles
Prueba Control positivo débil Control positivo rápido Control negativo

Ureasa Klebsiella sp Proteus sp Escherichia coli
HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS:
9.- PRUEBA DE LICUEFACCIÓN DE LA GELATINA (MÉTODO DEL TUBO)

Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas proteolíticas que, a su vez son
detectadas por la digestión o licuefacción de la gelatina presente. Las proteínas que se producen son
demasiado grandes para entrar en la célula por lo tanto para ser metabolizadas deben ser hidrolizadas a
componentes más pequeños, las enzimas extracelulares de tipo proteolítico son secretadas por ciertas
bacterias para desdoblar a las proteínas y esta capacidad ayuda a la identificación bacteriana. El
catabolismo de las proteínas por las proteasas se da en dos etapas la primera origina polipéptido y
posteriormente estos se desdoblan en aminoácidos individuales.
Controles

Gelatina Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus
10. PRUEBAS EN MEDIO SIM. (MOVILIDAD, PRODUCCIÓN DE H2S E INDOL).
El indol producido por las triptofanasas se combina con el aldehido del reactivo de Kovac´s o de Erlich,
para originar un compuesto de color rojo. Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la
turbidez que producen alrededor de la punción de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de
sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del
tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.
99
11. MEDIO MIO (MOVILIDAD, INDOL Y ORNITINA).

La prueba de la descarboxilación de la ornitina nos sirve para determinar la capacidad enzimática de un
microorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La
descarboxilación es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas
específicas son capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminoácido dando una amina o una
diamina y anhídrido carbónico, la enzima que efectúa esta reacción se llama ornitina descarboxilasa, la
cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio ácido
en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilación provocan un cambio de pH hacia la
alcalinidad. Además, la descomposición del aminoácido se produce anaerobicamente y el proceso es
irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima común, el fosfato de piridoxal.
El aminoácido L-ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina – descarboxilasa para dar la diamina
putrescina y anhídrido carbónico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si
recubrimos la superficie del medio con aceite mineral. La prueba de movilidad nos sirve para determinar
si un microorganismo es móvil por la presencia de flagelos o inmóvil. La prueba de indol nos sirve para
determinar si un organismo es capaz de producir indol a partir de de la oxidación del aminoácido
triptófano. Este aminoácido puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos
indólicos principales: indol, escatol e indolacético. El proceso es efectuado por varias enzimas que en
conjunto se denomina “triptofanasa” y el indicador de pH es el púrpura de bromocresol.
Control
Sustancia Control positivo Control negativo

Indol Escherichia coli Klebsiella pneumoniae
Movilidad Enterobacter sp Klebsiella sp
Descarboxilación de la ornitina Enterobacter cloacae Klebsiella sp
12. DESAMINACIÓN Y DESCARBOXILACIÓN DE AMINOÁCIDOS EN MEDIO LIA. (LYSINE IRON AGAR)
En este medio se determina la descarboxilación de la lisina que se lleva a cabo en anaerobiosis y la

desaminación de la lisina que se lleva a cabo en aerobiosis.
La prueba de la descarboxilación de la lisina nos sirve para determinar la capacidad enzimática de un
microorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La
descarboxilación es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas
específicas son capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminoácido dando una amina o una
diamina y anhídrido carbónico, la enzima que efectúa esta reacción se llama lisina descarboxilasa, la
cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio ácido
en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilación provocan un cambio de pH hacia la
alcalinidad. Además, la descomposición del aminoácido se produce anaeróbicamente y el proceso es
irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima común, el fosfato de piridoxal.
El aminoácido L-lisina es descarboxilado por la enzima lisina – descarboxilasa para dar la diamina
cadaverina y anhídrido carbónico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si
recubrimos la superficie del medio con parafina o vaselina. Al Preparar el medio es importante que se
deje solidificar en pico de flauta y el fondo, que estos tengan la misma longitud de aproximadamente 3
cm. cada uno, a fin de conservar este efecto de las dos cámaras, el inicador de pH es el púrpura de
bromocresol.
100
Controles:
Aminoácido Control positivo Control negativo

Descarboxilación de la Lisina Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae
Desaminación de la Lisina Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes
DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO
13. REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOS
La capacidad de un organismo para reducir nitratos a nitritos es una característica importante utilizada
para la identificación y diferenciación de muchas especies, todas las enterobacterias, excepto ciertos
biotipos de Enterobacter agglomerans reducen los nitratos.
Los organismos que reducen nitratos tienen la capacidad de obtener oxígeno de los nitratos para formar
nitritos y otros productos de reducción. La presencia de nitritos en el medio se detecta añadiendo α -
naftilamina y ácido sulfanílico, con la formación de un color rojo de diazonio, p – sulfobenceno – azo - α -
naftilamina. El color en caso de ser positiva aparecerá a los 30 s de añadir los reactivos y dado que los
reactivos solo detectan nitritos, este último proceso llevaría a una lectura falsa negativa, por lo tanto es
necesario añadir una pequeña cantidad de polvo de Zn a los tubos que sean negativos. Los iones Zn
reducen los nitratos a nitritos, y el desarrollo de un color rojo tras agregar el polvo de Zn indica la
presencia de nitratos residuales y confirma la reacción negativa verdadera.
Controles:
Prueba Control positivo Control negativo

Reducción de nitratos Escherichia coli Acinetobacter calcoaceticus
14. DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO DE LA GLUCOSA EN MEDIO
DE HUGH Y LEIFSON
Los microorganismos sacarolíticos degradan glucosa por vía fermentativa u oxidativa, los subproductos
de la fermentación son ácidos mixtos relativamente fuertes, que pueden detectar en un medio de
fermentación convencional. En cambio, los ácidos formados por degradación oxidativa la glucosa son
sumamente débiles y para su detección se requiere de un medio de oxido – fermentación más sensible,
como el medio OF.
Este medio difiere de otros medios de fermentación de carbohidratos en lo siguiente:
a.- La concentración de proteína (peptonas) ha disminuido del 1,5 al 0,2 %.
b.- La concentración de hidratos de carbono está aumentada del 0,5 % al 1 %.
c.- La concentración de agar está disminuida de 1,5 a 0,25, con lo cual su consistencia es semisólida.
La menor relación proteína a carbohidrato reduce la formación de aminas alcalinas que pueden
neutralizar las pequeñas cantidades de ácidos débiles derivados del metabolismo oxidativo. La
concentración relativamente mayor de carbohidratos sirve para aumentar potencialmente la producción
de ácido. La consistencia semisólida del agar permite que los ácidos formados en la superficie se
difundan por todo el medio, facilitando la visualización del viraje del indicador de pH. Este medio es
también apto para determinar la movilidad de un microorganismo.
101
La prueba OF presenta limitaciones, ya que los bacilos fermentadores de desarrollo más lento pueden
no producir cambios de color durante varios días, y las especies que son esencialmente proteolíticas
pueden con el tiempo producir reversiones de las reacciones débiles, confundiendo así la interpretación
final. Para realizar esta prueba se necesitan dos tubos con 5 ml del medio en posición vertical, se
inocula por picadura con la suspensión microbiana a estudiar, el asa debe ser introducida hasta 0,5 cm
desde el fondo del tubo. Cubrir un tubo con 1 ml de aceite mineral estéril o parafina fundida, dejando el
otro tubo “abierto al aire”, es decir sin aceite o parafina. Incubar ambos tubos a 35 ° C durante 48 h o
más, el indicador de pH: Púrpura de bromocresol.
Interpretación.
Tipo de metabolismo Tubo abierto Tubo cubierto

Oxidativo Ácido – amarillo Alcalino – verde
Fermentativo Ácido – amarillo Ácido – amarillo
No sacarolítico Alcalino - verde Alcalino – verde
Controles
Prueba Fermentador de la glucosa Oxidador de la glucosa No sacarolítico

OF Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Moraxella sp
15. PRUEBA DEL CIANURO DE POTASIO
Determinar la capacidad e un organismo de vivir y reproducirse en un medio que contenga cianuro de
potasio.
La respiración es el conjunto de reacciones químicas en las que se libera energía. La transformación de
la energía puede ser aerobia o anaerobia. La respiración aeróbica es un proceso biológico de oxidación
– reducción que produce energía y por medio del cual un sustrato orgánico es oxidado, el mismo
trasfiere electrones e iones hidrógeno por medio del sistema de transporte de electrones, al aceptor final
de electrones, el oxígeno molecular. El proceso produce agua o peróxido de hidrógeno, según la especie
bacteriana y su sistema enzimático. El cianuro de potasio es un inhibidor de la citocromo oxidasa a nivel
del complejo IV de la cadena respiratoria, compite con él O 2 y actúa como aceptor final de electrones,
bloqueando la respiración.
Controles

KCN Klebsiella Escherichia coli
16. PRUEBA DEL CITOCROMO OXIDASA
Los citocromos son hemoproteínas que contienen fierro y actúan como el último eslabón de la cadena
respiratoria, transfiriendo electrones (hidrógeno) al oxígeno, con formación de agua. El sistema
citocromo oxidasa se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la
prueba de oxidasa es importante para identificar a aquellos organismos que carecen de la enzima o son
anaerobios obligados. La prueba es muy útil para el conocimiento de las colonias sospechosas de ser
enterobacterias (todas negativas) y para la identificación de colonias que se presume sean especies de
Pseudomonas o Neisseria (positivas).
102
**Esta prueba utiliza el reactivo diclororhidrato de p-fenilendiamina, que actúa como aceptor final de
electrones, sustituyendo al oxígeno, la p-fenilendiamina es incolora en estado reducido, pero en
presencia de citocromo oxidasa y oxígeno atmosférico se oxida formando azul de indofenol.
La prueba se lleva a cabo por 3 métodos que son:
1.- La técnica directa en placas, en la cual se añaden directamente 2 a 3 gotas de reactivo a las colonias
aisladas que se han desarrollado en la placa.
2.- La técnica indirecta en tiras de papel filtro, en la que se añaden unas gotas del reactivo y,
3.- Tiras comerciales impregnados del reactivo y secos.
En la zona de papel donde se halla el reactivo se extiende un asa de la colonia sospechosa. Se
recomienda no emplear alambres de acero inoxidable, dado que los productos de la oxidación de la
superficie formados al esterilizarse a la llama pueden producir reacciones falsas positivas.
Controles:

Citocromo oxidasa Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli
17.- PRODUCCIÓN DE CATALASA
Determinar la presencia de la enzima catalasa, que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias
y anaerobias facultativas que contiene citocromo. La catalasa es una enzima que se descompone en
peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua, químicamente la catalasa es una hemoproteína de estructura
similar a la de la hemoglobina. El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del
metabolismo oxidativo aeróbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular el peróxido de
hidrógeno es letal para la célula bacteriana. La catalasa transforma al peróxido de hidrógeno en agua y
oxígeno en agua.
Controles

Catalasa Staphylococcus aureus Streptococcus sp
18 PRUEBA DE LA COAGULASA (SOLO PARA COCOS GRAM POSITIVOS)
Probar la capacidad de un microorganismo de coagular el plasma por la acción de la enzima coagulasa.
Un resultado positivo constituye por lo común el criterio de diagnóstico de para la identificación de S.
aureus y con frecuencia se utiliza para indicar la virulencia de la cepa. La estafilocoagulasa, producida
por S. aureus es relativamente estable al calor y resistente hasta 60 °C / 30 min. Esta enzima es una
proteína que es excretada al medio extracelular y se inactiva fácilmente por las enzimas proteolíticas.
19 HEMÓLISIS EN AGAR SANGRE (SOLO PARA COCOS GRAM POSITIVOS)
La infusión de músculo de corazón y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, pues son la
fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y factores de crecimiento que permite el desarrollo de una gran
variedad de microorganismos exigentes. El agregado de sangre al medio de cultivo, en concentración
final de 5-10 %, aporta nutrientes para el crecimiento bacteriano, y permite detectar hemólisis. El medio
está libre de azucares reductores, ya que estos influirían de forma adversa en reacciones hemolíticas. El
tipo de hemólisis en agar sangre sirve para clasificar al género Streptococcus, la β hemólisis está
103
asociada con una completa lisis de la célula alrededor de la colonia, la α hemólisis se asocia con una
hidrólisis parcial y se manifiesta por una coloración verde.
20.- CRECIMIENTO EN NaCl AL 7.5 %
Existen microorganismos que presentan crecimiento a diferentes concentración de sales y se les
denomina halófilos, aunque existen otros que son denominados extremófilos ya que viven en
condiciones extremas y su hábitat natural son los lugares a salinos. En condiciones normales, la sal
hace que la célula se deshidrate debido a la ósmosis, cosa que no ocurre en los halofilicos debido a
diversas adaptaciones fisiológicas que le permiten retener el agua para su metabolismo.
3.1. EQUIPO
• Incubadora a 35 ° C • Autoclave
• Microscopio • Horno
3.2. MATERIAL
• Portaobjetos • Asas bacteriológicas

• Pipetas Pasteur • Colorantes para tinción de
esporas
• Gradilla metálica
• Colorantes para tinción de Gram
3.3. MEDIOS DE CULTIVO:
Pruebas de cada uno para Gram positivos Pruebas de cada uno para Gram negativos
• Tinción de esporas • Hidrólisis de almidón.
• Hidrólisis de almidón • Crecimiento en MacConkey.
• Hemólisis en agar sangre • Prueba de TSI.
• Resistencia a polimixina de 300 • Prueba de LIA
• Prueba de TSI • Prueba de citrato.
• Prueba de SIM • Prueba de MIO
• Prueba de MIO • Prueba de SIM.
• Licuefacción de la gelatina a 22 °C • Licuefacción de la gelatina
• Utilización del citrato • Prueba de oxidación-
• Prueba de oxidación –fermentación fermentación.
• Prueba de Voges Proskauer • Prueba de ureasa.
• Prueba de ureasa • Prueba de reducción de nitratos.
• Fermentación de glucosa • Fermentación de glucosa.
• Fermentación de manitol • Fermentación de lactosa.
• Fermentación de arabinosa • Fermentación de sacarosa
• Fermentación de Xilosa • Fermentación de manitol.
104
• Fermentación de lactosa • Fermentación Xilosa.

• Crecimiento en NaCl al 6.5 % • Rojo de metilo.
• Prueba de reducción de nitratos • Prueba de Vogues Proakauer
• Prueba de catalasa • Crecimiento en caldo KCN.
• Prueba de oxidasa • Prueba de malonato.
• Prueba de coagulasa • Prueba de catalasa y catalasa
3.4. REACTIVOS:
• Solución de rojo de metilo • Aceite mineral
• Solución de alfa-naftol • Solución de peroxido de hidrogeno al 1 %
• Solución de KOH • N,N,N,N-tetrametil-p-
• Reactivo de Kovac o Erlich fenilendiamina
• Solución de ácido sulfanílico • Reactivos para tinción de Gram
• Solución de alfa naftilamina • Reactivos para tinción de esporas
• Plasma de conejo • Oxidasa
• Tween 80 estéril • Catalasa
• Plasma de conejo • Jeringas de 10 ml
3.5. BACTERIAS:
• Escherichia coli • Micrococcus luteus
• Salmonella typhi • Staphylococcus aureus
• Proteus mirabilis • Lactobacillus acidophilus
• Pseudomonas aeruginosa • Bacillus subtilis
• Shigella sp • Corynebacterium glutamicum
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL:
A. Preparación del inoculo
a) Tomar un inoculo del cultivo para realizar una tinción de Gram y esporas si fuera necesario, anotar la
morfología microscópica y determinar si esta puro, si es así continuar con la identificación, si no lo está
es necesario re-aislar.
b) En un tubo de ensaye que contenga 5 ml de solución salina estéril, colocar una asada del cultivo y
homogenizar perfectamente para obtener una suspensión microbiana.
c) Dependiendo el Gram, solicitar las pruebas bioquímicas indicadas para Gram (+) o Gram (-)
d) Ordenar los tubos por la forma de inoculación y sembrar primero aquellos que no tienen inhibidores
• Estría simple (Citrato, placa con agar almidón, agar sangre)
• Picadura y estría (TSI, LIA)
• Picadura (SIM, MIO, gelatina, OF )
105
• Caldos (Fermentación de carbohidratos, RM, VP, NaCl, Urea, CM, reducción de NO3 ,KCN..)
e) De la suspensión microbiana sembrar los tubos y en el caso de los caldos se puede hacer con el asa
o con una pipeta Pasteur colocar 2 gotas de la suspensión para que se estandarice un poco la cantidad
de inoculo.
f) Colocar una batería de bioquímicas como testigo
g) Incubar los tubos 24 horas y leer
h) La placa con agar almidón y agar sangre dividirla en cuatro partes, cada cuadrante corresponde para
un alumno y el cuarto cuadrante queda como testigo.
B LECTURA DE PRUEBAS
PRUEBA LECTURA DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS RESULTADO
FERMENTACIÓN DE AZÚCARES
Hidrólisis de almidón Agregar lugol sobre la estría
+ Positiva: Si se forma un halo claro alrededor de la estría.
- Negativa: No se forma un halo claro alrededor de la estría.
Fermentación de +Positiva: El medio se torna amarillo con la producción de gas, la
manitol campana está llena de gas
- Negativa: El color del medio es rosa-rojizo.
Fermentación de + Positiva: el medio se torna amarillo con la producción de gas, la
lactosa campana está llena de gas
- Negativa: El color del medio es rosa-rojizo.
Fermentación de TSI Glucosa positiva: Fondo del tubo amarillo.
Fermentación de
Sacarosa y lactosa positiva: Superficie amarilla
glucosa, lactosa y
sacarosa con Lactosa positiva: Color amarillo en el pico de flauta, Producción
producción de H2S de H2S positivo: Coloración negra en el medio.
Producción de CO2 y H2: Burbujas, ligera muesca sobre el costado
del tubo ó desplazamiento del medio.
Glucosa, sacarosa y lactosa ( - ) el medio se torna rojizo.
Producción de H2S ( - ): sin coloración.
Producción de CO2 y H2 ( - ): no hay burbujas.
Prueba de rojo de Agregar 2 gotas de rojo de metilo
metilo
+ Positiva: Color rojo en la superficie del medio de cultivo
(Producción de acetil-metil-carbinol).
-Negativa: No hay cambio en el color
Prueba de Voges- agregar 6 gotas de α naftol y 2 gotas de KOH
Proskauer
+Positiva: El cultivo cambia a color rojo, en todo el tubo.
- Negativa: El cultivo no cambia de color
106

UTILIZACIÓN DE SALES INORGÁNICAS
Utilización de citrato + Positivo: Desarrollo abundante, cambio de color verde a azul
de sodio
- Negativa: No hay desarrollo ni cambio de color.
Utilización de Positivo: Desarrollo abundante con o sin alcalinización (color azul).
malonato de sodio
Negativa: No hay desarrollo (medio de
Hidrólisis de urea + Positiva: Color rosa fucsia en el medio.
Producción de
- Negativa: Sin cambio de color en el medio
ureasa
HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS
Licuefacción de la Para leer la prueba los tubos se colocan en el cuarto frío
gelatina durante cinco minutos.
+ Positivo: licuefacción de la gelatina.
- Negativo: Si no hay licuefacción de la gelatina volver a incubar,
descartar la prueba negativa hasta los 14 días.
MIO (movilidad, indol Movilidad: Crecimiento alrededor de la picadura.
y ornitina)
Descarboxilación de la ornitina:
+ Positiva: Color púrpura del medio.
- Negativa: Color amarillo del medio.
Después de leer las dos pruebas se agregan 3 gotas de reactivo de
kovacs (p-dimetilaminobenzaldehído) y se observa:
- Indol + Positivo: Se forma un anillo de color rosa o rojo.
- Negativo: No se forma el anillo.
SIM (producción de Producción de H2S: Presencia de un precipitado color negro
H2S, indol y alrededor de la picadura o en todo el tubo
movilidad)
Producción de Indol: Presencia de un anillo de color rojo en la
superficie al adicionarle el reactivo de Kovac’s. (p-
dimetilaminobenzaldehído)
Movilidad: Turbidez alrededor de la picadura.
Nota: Cuando el microorganismo es móvil y productor de ácido
sulfhídrico el medio se torna completamente negro.
LIA (Desaminación y Desaminación de aminoácidos:
descarboxilación de
+ Positiva: La superficie del tubo es de color rojo vino.
aminoácidos)
- Negativa: La superficie no tiene cambios.
Descarboxilación de aminoácidos
+ Positiva: El fondo del tubo es de color púrpura.
- Negativa: El fondo del tubo es de color amarillo.
107
METABOLISMO OXIDATIVO – FERMENTATIVO

Reducción de Agregar 3 gotas de α naftilamina y 3 gotas de ácido sulfanílico.
nitratos a nitritos
+ Positiva: Aparición de un color rojo en 30 segundos
- Negativa: Sin cambio de color.
Prueba del cianuro + Positivo: Presencia de crecimiento (turbidez)
de potasio
- Negativo: Ausencia de crecimiento (medio claro)
Prueba de citocromo Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un pedazo de papel
oxidasa filtro impregnada con el reactivo (N.N.N.N-tetrametil-p-fenilendiamina).
+ Positiva: aparición de un color azul violeta.
- Negativa: No hay cambio de color.
Determinación de TUBO SIN SELLO DE ACEITE
metabolismo Oxidativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios
oxidativo y/o
fermentativo de la Fermentativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios
glucosa (OF) Sacarolitico: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios.
TUBO CON SELLO DE ACEITE
Oxidativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios
Fermentativo: + positivo acido–amarillo, - negativo verde, sin cambios
Sacarolitico: + positivo acido–amarillo, - negativo verde, sin cambios.
Prueba de la Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un portaobjetos que
catalasa contiene 2 gotas de peróxido de hidrogeno y observar.
+ Positiva: Presencia de burbujas de oxigeno.
- Negativa: Ausencia de burbujas de oxigeno.
Crecimiento en NaCl Incubar el tubo a 35 °C durante 24 h, después de este tiempo registrar
AL 7.5 % la turbidez.
Positiva: Turbidez del medio.
Negativa: Sin cambio de color en el medio.
Hemólisis en agar a) -En una placa con agar sangre estriar con la cepa presuntiva de
sangre (solo para Streptococcus sp, al final de la estría enterrar el asa en el medio,
cocos Gram para crear un ambiente de microaerofilia.
positivos) b) Incubar durante 24 horas a 35 °C y determinar el tipo de hemólisis
que presenta.
Positiva: Hemólisis β transparente alrededor de la colonia.
Positiva: Hemólisis α color verde tenue alrededor de la colonia.
Negativa: Sin cambio de color en el medio.
108
Prueba de a) -Sembrar una colonia del Staphylococcus sp en un tubo con 0.5 ml

la
coagulasa (Solo de caldo infusión cerebro-corazón. Incubar a 35ºC durante 24 h.
b) Inocular en la misma forma cepas conocidas de S. aureus y S.
para cocos Gram
epidermidis como testigos positivo y negativo.
positivos) c) -En un tubo de ensaye colocar 0,2 ml del cultivo anterior, 0.2 ml de
plasma de conejo diluido volumen a volumen con solución salina
estéril.
d) -Incubar en baño de agua de 35 a 37ºC y observar durante 6 h a
intervalos de 1 h; si no hay formación de coágulo, observar a las 24
h. Considerar positiva la prueba si hay formación de coágulo.
e) Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo se añade
una gota de cloruro de calcio al 5% a 0,5 ml de plasma reconstituido
empleado, formándose un coágulo en 10-15 s.
f) En caso de utilizar plasma de humano citratado o heparina.
Positiva: Coagulación del plasma.
Negativa: El plasma esta líquido.
5.1. Explicar el significado de la presencia o ausencia de un halo claro, al agregar el lugol, en las
pruebas de hidrólisis del almidón.
5.2. Explicar porqué en las pruebas de fermentación de azúcares en tubos con campana de Durham se
emplea un indicador de pH, cual es el indicador y cuál es su intervalo de sensibilidad.
5.3. ¿Qué otros azúcares se pueden utilizar para la fermentación de azúcares?
5.4. ¿Cuál es el indicador de pH que se emplea en las pruebas de utilización de sales orgánicas y cuál
es su intervalo de sensibilidad?
5.5. Explicar cuál es la utilidad de detectar la capacidad de hidrólisis de proteínas que tienen ciertos
microorganismos. ¿De qué manera se detectan estas enzimas proteolíticas de los microorganismos?
Discutir la importancia de la morfología microscópica y colonial, el aislamiento de los microorganismos,
la adecuada selección de pruebas bioquímicas a realizar y el uso de las claves para la identificación de
los microorganismos.
7. CONCLUSIONES
7.1. Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, a la
bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica.
7.2. Concluir el género del microorganismo analizado de acuerdo a las pruebas bioquímicas.
Llenar los siguientes cuadros y con la ayuda de la bibliografía y a la información obtenida durante el
desarrollo de la practica menciona el género y si es posible la especie del microorganismo.
Nombre del microorganismo: ______________________________________________________
Resultados obtenidos para bacterias:
109
Gram positivas Resultado Gram negativas Resultado

Tinción de esporas Hidrólisis de almidón.
Hidrólisis de almidón Crecimiento en MacConkey.
Hemólisis en agar sangre Fermentación de glucosa. / gas
Fermentación de glucosa / gas Fermentación de sacarosa / gas
Fermentación de manitol / gas Fermentación de manitol / gas
Fermentación de arabinosa /gas Fermentación Xilosa / gas
Fermentación de Xilosa / gas Prueba de Vogues Proakauer
Fermentación de lactosa / gas Fermentación de lactosa / gas
Rojo de metilo. Rojo de metilo.
Prueba de Voges Proskauer Prueba de Voges Proskauer
Prueba de OF Prueba de OF
Prueba de TSI Prueba de TSI.
Glucosa positiva: Glucosa positiva:
Glucosa negativa: Glucosa negativa:
Sacarosa y lactosa positiva: Sacarosa y lactosa positiva:
Sacarosa y lactosa negativas: Sacarosa y lactosa negativas:
Lactosa positivo: Lactosa positivo:
Lactosa negativo: Lactosa negativo:
Producción de H2S: Producción de H2S:
Prueba de SIM Prueba de SIM
Movilidad Movilidad
Producción de H2S Producción de H2S
Producción de Indol Producción de Indol
Prueba de coagulasa Crecimiento en caldo KCN.
Prueba de MIO Prueba de MIO
Movilidad Movilidad
Descarboxilación Descarboxilación
Producción de Indol Producción de Indol
Licuefacción de la gelatina a 22 °C Prueba de reducción de nitratos.
Utilización del citrato Prueba de citrato
Crecimiento en NaCl al 6.5 % Prueba de ureasa.
Prueba de reducción de nitratos Prueba de malonato.
Prueba de oxidasa Prueba de catalasa
Prueba de ureasa Prueba de oxidasa
Prueba de catalasa Prueba de LIA
Resistencia a polimixina de 300
110
Tablas de Cowan para la identificación de microorganismos
Tabla No. 1 Primera etapa para la identificación de bacterias Gram positivas.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Forma S S S S S S S R R R R R R R R R R R R R R
Acido resistencia - - - - - - - - - - - - - - - - - - - w +
Esporas - - - - - - - - - - - - - - - - + + - - -
Movilidad - - - - + - - + - - + - - - - - D D - - -
Crecimiento aerobio + + + + + + - + + + + + + - - - - + + + +
Crecimiento anaerobio - + w w + + + - + + + + - + + + + D - - x
Catalasa + + w - - - - + + + + - + + - - - + + + +
Oxidasa - - - - - - - - - - - - x x x x x d - - -
Glucosa (prod. acido) D + + + + + +/- - - + + + + + + - D D + + +
O/F O/- F F F F F F/- - - F F F F F F - F/- F/O/- O O O/NT
Micrococcus + · · · · · · · · · · · · · · · · · ·
Staphylococcus + · · · · · · · · · · · · · · · · · ·
Aerococcus + + · · · · · · · · · · · · · · ·
Streptococcus · · · + + · · · · · · · · · · · · · · ·
Pediococcus · · · + · · · · · · · · · · · · · · ·
Gemella · · · + · · · · · · · · · · · · · · ·
Cocos anaeróbicos* · · · · · · + · · · · · · · · · · · · · ·
Kurthia · · · · · · · + · · · · · · · · · ·
Corynebacterium · · · · · · · + + · · · · · · · · · ·
Listeria · · · · · · · + · · · · · · · · ·
Erysipelothrix · · · · · · · · · · + · · · · · · · · ·
Lactobacillus · · · · · · · · · · + · · · · · · · · ·
Arachnia ⁪ · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Rothia · · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Propionibacterium · · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Actinomyces · · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Bifidobacterium · · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Eubacterium · · · · · · · · · · · + + · · · ·
Clostridium · · · · · · · · · · · · · · <> <> + · · · ·
Bacillus · · · · · · · · <> <> <> · <> · · · · + · · ·
Nocardia · · · · · · · · · · · · · · · · · · + +
Mycobacterium · · · · · · · · · · · · · · · · · · +
111
Tabla No. 2 Primera etapa para la identificación de bacterias Gram negativas.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Forma R S S S S/R R R R R R R R R R R R R R
Movilidad - - - - - - + + - + - - + D - - + -
Crecimiento aerobio - - + + + + + + + + + + + + + -* -⁪ +
Crecimiento anaerobio + + - - - - - - - + + + + + + + - +
Catalasa d D + + + + + + + + + - + + D - D -
Oxidasa - x + + - + + + + + + + + - - + + -
Glucosa (prod. acido) D - + - + - + - + + + + + + D - - +
Carbohidratos [f/o/-] F/- - O - O - O - O O F F F F NT - - F
Bacteroides + · · · · · · · · · · · · · · · ·
Veillonella + · · · · · · · · · · · · ·
Neisseria · + · · · · · · · · · · · · ·
Branhamella · + · · · · · · · · · · · · ·
Acinobacter · + · · · · · · · · · · · ·
Moraxella · · · · + · · · · · · · · · · · ·
Brucella · · · · + · · · · · · · · · · · ·
Bortedella · · · · + · · · · · · · · · · · ·
Chromobacterium lividum · · · · · · + · · · · · · · · ·
Alvaligenes · · · · · · + · · · · · · · · ·
Flavobacterium · · · · · · + · · · · · · · · ·
Pseudomona · · · · · · · · · + · · · · · · · ·
Actinibacillus · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Pasteurella · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Necromonas · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Cardiobacterium · · · · · · · · · · + · · · · · ·
Chromobacterium violaceum · · · · · · · · · · · · + · · · · ·
Benecktea · · · · · · · · · · · · + · · · · ·
Vibrio · · · · · · · · · · · · + · · · · ·
Plesiomonas · · · · · · · · · · · · + · · · · ·
Aeromonas · · · · · · · · · · · · + · · · · ·
Enterobacterias · · · · · · · · · · · · · + · · · ·
Haemophilus · · · · · · · · · · · · · · +
Eikenella · · · · · · · · · · · · · · +
Campylobacter · · · · · · · · · · · · · · +
Streptobacillus‡ · · · · · · · · · · · · · · +
Mycoplasmas · · · · · · · · · · · · · · +
112
Tabla No. 3. Equivalencias de los símbolos utilizados en las Tablas 1 y 2.
Símbolo Significado
Tabla No. 1
* Peptococcus, Peptostreptococcus (también Leuconostoc)
⁪ También Actinomyces odontolyticus
D Reacciones diferentes en distintas especies del género
d Reacciones diferentes en distintas cepas
F Fermentación
O Oxidación
w Reacción débil
x No se conoce
<> Variantes no esporágenas
Formas típicas
Presentan algunas características comunes
S Cocos
R Bacilos
NT No probada
Tabla No. 2
* Crecimiento en aire + CO2
⁪ Crecimiento en oxígeno 5-6%
‡ También Shigela dysenteriae
Forma típica
x No se conoce
Presentan algunas características comunes
NT No probada por métodos comunes
Para ambas tablas
+ Del 85-100% de las cepas son positivas (generalmente todas o la mayor parte)
d Del 16-84% de las cepas son positivas (muchas , algunas)
- Del 0-15% de las cepas son positivas (ninguna, pocas ó algunas)
() Reacción tardía en la prueba o crecimiento tardío
(d) Reacciones positivas tardías en diferentes cepas
(w) Reacción débil y tardía
w/- Reacciones débiles y crecimiento escaso en diferentes cepas
D Reacciones diferentes en distintos grupos (géneros, especies y variedades)
· No se conoce
Tablas tomadas de: Cowan, S. T. Manual for identification of medical bacteria2 nd Cambridge University
1974. pp167.
113
MÉTODOS RÁPIDOS UTILIZADOS EN MICROBIOLOGÍA

Recientes avances biotecnológicos son usados para la identificación de microorganismos por medio de pruebas de
identificación bioquímica de manera miniaturizada y automatizada haciéndose la identificación más rápida y
económica.
Los microorganismos deben ser aislados y después identificados, una vez aislados podemos medir
específicamente los cambios fisicoquímicos resultado del crecimiento o actividad metabólica, para ello se han
desarrollado diversos métodos debido a la necesidad de detectar a los microorganismos como el sistema API
El APHI 20 E es un sistema estandarizado que permite la identificación de enterobacterias y otros bacilos Gram
negativos no exigentes, que incluyen 21 pruebas bioquímicas mimiaturizadas.
Principio: La galería del sistema APHI 20 E se compone de 20 microtubos que contiene los sustratos
deshidratados. Loa microtubos se inoculan con una suspensión bacteriana
Reactivos complementarios: API OF
Es un método de identificación que emplea reacciones bioquímicas y el que vamos a utilizar es el API 20 E y el API
STAPH.
INSTRUCCIONES
1) Primero tenemos que aislar al microorganismo en medios selectivos, posteriormente colocarla en un caldo
nutritivo o en una placa de agar de soya y tripticaseína, de tal forma que el cultivo sea de 18 h.
2) Sacar la tira API (galería) que contiene las siguientes pruebas ONPG, ADH, LDC, ODC, CIT, H2S, URE, TDA,
IND, VP, GEL, GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY y ARA.
3) Preparación de la galería: Reunir fondo y tapa de una cámara de incubación y repartir aproximadamente 5 ml
de agua destilada en los alveolos para crqar una atmosfera humeda. Etiquetar en la lengüeta lateral.
4) Sacar la galería de su envase y colocarla en la cámara de incubación
5) Preparación del inoculo Preparar la suspensión microbiana en 5 ml de solución salina fisiológica y a una
turbidez del nefelómetro de Mac Farland de 2.
6) Inoculación de la galería. Introducir la suspensión bacteriana en los tubos de la galería con la ayuda de una
pipeta, evitando la formación de burbujas en el fondo de los tubos.
7) Para las pruebas: llenar el tubo y la cúpula

8) Para las pruebas: ADH LCD ODC H2S y URE crear una atmosfera anaerobia llenando la cúpula con aceite de
parafina.
9) Cerrar la cámara de incubación
10) Incubar 36 h ± 2 °C durante 18-24h.+
Lectura de interpretación:
11) Prueba de TDA, agregar una gota de reactivo TDA. Un color marrón rojizo indica una reacción (+)
12) Prueba de IND: agregar una dota del reactivo JAMES. Un color rosado que se disemina en toda la cúpula
indica una reacción (+)
13) Prueba de VP2 esperar un minuto de 10 minutos un color rosa o rojo indica una reacción (+), una débil
coloración rosa que aparece después de 10 minutos en (-).
14) Interpretación: Determinar el perfil numérico, donde las pruebas están separadas en grupos de 3, como la
galería API 20 E se compone de 20 ensayos sumar al interior de cada grupo los valores que corresponden a las
reacciones positivas y se obtiene el bionúmero de 7 cifras.
15) Identificación: se realiza a partir de la base de datos y se obtiene con el software de identificación.
114
16) En algunas ocasiones es necesario la realización de pruebas adicionales como la reducción de Nitratos a
nitritos, para ello añadir una gota de los reactivos NIT 1 y Nit 2 en el tubo de GLU, esperar de 2 a 5 minutos y una
coloración roja indica una reacción (+)
17) Control de calidad 1 Proteus mirabilis 2.- E. coli
ONPG ADH LCD ODC H2s URE TDA IND GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA NO2 N2
- - - + v + + + - - v + - - - - v - - - + -
+ - + + - - - - + - - + + - + + - + - + + -
Tabla de lectura
Prueba Componerntes activos Cantidad Reacciones-enzimas Resultados
Negativo positivo
ONPG 2 nitro fenilβD- 0.223 Β galactyosidasa (Orto Nitrofenil Incoloro Amarillo (1)
galactopiranosido βD galactopiranosido
ADH L-arginina 1.9 Arginina DiHidrolasa Amarillo Anaranjado(2)
LCD L- lisina 1.9 Lisina Descarboxilasa Amarillo Anaranjado
ODC L- ornitina 1.9 Ornitina DesCarboxilasa Amarillo Anaranjado (2)
CIT Citrato de sodio 0.756 Utilización del CITrato Verde palido- amarillo Azul-verde azu (3)l
H2S Tiosulfato de sodio 0.075 Producción de H2S Incoloro grisáceo Depósito negro
URE urea 0.76 UREasa Amarillo Rojo anaranjado(2)
TDA L- triptófano 0.38 Triptofano DesAminasa amarillo Marrón rojizo
IND L-triptófano 0.19 Producción de InDol Verde pálido amarillo rosa
VP Piruvato de sodio 1.9 Producción de acetoina Rosa pálido Rosa –rojo(5)
GEL Gelatina bovina 0.6 GELatinasa No difusión Difusión del pigmento negro
GLU D- glucosa 1,9 GLUcosa Oxidación- Azul-azul verdoso Amarillo/amarillo
fermentación
MAN D-manitol 1.9 MANitol Fermentación- Azul-azul verdoso amarillo
Oxidación
INO Inositol 1.9 Fermentación-Oxidación Azul-azul verdoso amarillo
INOsitol
SOR D-sorbitol 1.9 Fermentación-Oxidación Azul-azul verdoso amarillo
SORbitol
RHA L-rammnosa 1.9 Fermentación Oxidación Azul-azul verdoso amarillo
RHAmnosa
SAC D-sacarosa 1.9 Fermentación-Oxidación Azul-azul verdoso amarillo
SACarosa
MEL D-Melobiosa 1.9 Ferm,entación-oxidación Azul-azul verdoso amarillo
MELobiosa
AMY Amigdalina 0.57 AMYgdalina Fermentación – Azul-azul verdoso amarillo
Oxidación
ARA L-arabinosa 1.9 ARAbinosa Fermentación Azul-azul verdoso amarillo
Oxidación
1.- La aparición de un color amarillo ligero implica un resultado +

2.- La aparición de un color naranja tras 36 h de incubación debe considerarse negativa
3.- Lectura en la cúpula (zona aerobia)
4.- La fermentación comienza en la parte inferior de los tubos, mientras que la oxidación empieza en la cúpula
5.- Una ligera coloración rosa, que aparece tras 10 minutos debe ser leída como negativa
115
PRÁCTICA No. 11
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS
UNIDAD: VII
Nombre: Mohos y levaduras
1. OBJETIVOS
El alumno identificará y cuantificará mohos filamentosos y levaduras en productos de interés
biotecnológicos.
1.2 Objetivo específicos
1.2.1 El alumno aislará y determinará el número de UFC de mohos y levaduras a partir de una muestra
por la técnica de vaciado en placa.
1.2.2 El alumno describirá la morfología colonial y microscópica de los mohos y levaduras aislados.
1.2.3 El alumno identificará un moho por medio de la técnica Ridell (microcultivo).
2.-INTRODUCCIÓN
Existen aproximadamente 100,000 especies de mohos microscópicos, y la mayoría viven en el suelo
como saprofitos sobre materia orgánica en descomposición, manteniendo así la fertilidad de los suelos.
Alrededor de 50 especies producen enfermedades en los animales, y aproximadamente 8,000 especies
causan enfermedades en las plantas, por las que se producen pérdidas económicas en la agricultura. En
la industria farmacéutica algunos mohos son utilizados para obtener antibióticos, como la penicilina a
partir del género Penicillium.
En el campo de la elaboración de alimentos y la biotecnología, los mohos microscópicos se utilizan para
elaboración de cerveza, vino, pan, maduración de quesos, producción de diversos ácidos orgánicos, etc.
Los mohos también se pueden usar, por ejemplo, en la degradación de hidrocarburos en el caso de
derrames de petróleo en el mar. Los mohos pueden crecer tanto en agua dulce como el agua marina.
También es relevante el hecho de que algunos mohos forman sustancias tóxicas al crecer en alimentos.
MORFOLOGÍA DE LOS MOHOS
Se les llama también Eumicetos, no producen flagelos, es decir, son inmóviles la mayor parte de ellos.
Los mohos mi8croscópicos pueden ser:
1) Mohos Unicelulares: se llaman mohos levaduriformes o levaduras.
2) Mohos filamentosos: se llaman mohos y constan de muchas células.
Tanto las levaduras como los mohos presentan células eucariotes, es decir, con cromosomas múltiples,
membrana nuclear bien definida, mitocondrias, retículo endoplásmico y pared celular.
Son microorganismos que contienen paredes celulares rígidas hechas de glucógeno, de celulosa o de
quitina o mananas. Además, la membrana celular fúngica, a diferencia de la bacteriana, presenta
esteroles. Estos microorganismos carecen de clorofila y son heterótrofos.
El conjunto celular de los mohos son llamados micelios. Es decir, a cada filamento individual se le llama
hifa, al conjunto de hifas se le llama micelio, y a la colonia entera del moho se le llama talo. El aspecto
que presentan las colonias de mohos es de tipo aterciopelado, algodonoso o polvoso, con muy diversas
coloraciones que abarcan toda la gama de color. Los mohos poseen hifas multinucleadas y estas
pueden tener septos o carecer de ellos con base en esta característica, se clasifican en:
116
1) Mohos con micelio cenocítico: son los que carecen de septos o tabicaciones
2) Mohos con micelio septado: son los que presentan septos o tabicaciones entre las células.
Cada hifa puede tener un grosor uniforme o puede terminar en porciones más delgadas o anchas. El
diámetro va desde 0.5 hasta 100 micras, y su longitud puede ser desde unas cuantas micras hasta
varios metros. En algunas formas superiores de mohos, las hifas están pegadas juntas para formar
cuerpos fructiferos grandes, de estructura compleja, formado los llamados mohos carnosos o
macroscópicos. Pero aun cuando alcancen tales dimensiones, todos los mohos siguen siendo
microorganismos “primitivos”, debido a su especialización en tejido es reversible.
En cuanto a su función, las hifas y micelios se clasifican en 2 tipos:
1) Hifa o micelio vegetativo: son las que penetran al sustrato para absorber las sustancias nutritivas.
2) Hifa o micelio aéreo o reproductivo: son las que se proyectan sobre el sustrato y producen
estructuras de reproducción.
Muchos mohos patógenos presentan dimorfismo, desarrollándose como formas de aspecto de levadura
o como micelios. Por ejemplo, cuando cierto moho crece a temperatura de 37º C en el cuerpo humano,
se pueden presentar como levaduras, pero cuando crece en un medio de cultivo para mohos a 25º C
presenta forma de moho con micelio y esporas asexuales.
REPRODUCCIÓN
Los mohos se reproducen principalmente por medio de esporas, que son estructuras especializadas
para la propagación del moho y están capacitados para soportar condiciones adversas del medio
ambiente, sin embargo, son más sensibles, en general que las endosporas bacterianas. Las esporas
fúngicas pueden formarse asexualmente o pueden ser el resultado de un proceso sexual. A
continuación, se muestran la clasificación de estas esporas:
Esporas asexuales:
I.- Talosporas:
a) Artrosporas. Son esporas que se forman por fragmentación de hifas generalmente son rectangulares
con doble pared gruesa.
b) Blastosporas. Se forman en las levaduras por gemación a partir de una célula preexistente; una vez
que la yema ha alcanzado su máximo desarrollo se separa de la célula madre y en este estado o todavía
unida, produce un nuevo brote, pudiéndose formar un pseudomicelio.
c) Clamidosporas. Se forman cuando las condiciones del medio se tornan adversas, las células
aumentan de tamaño y se hinchan. Estas esporas son redondeadas y poseen doble pared gruesa que
les confiere gran resistencia.
II.- Conidiosporas.
Son esporas producidas libremente, por segmentación de las puntas de unas hifas especializadas,
llamadas conidioforos.
117
a) Microconidias. Son esporas unicelulares que se presentan diversidad de tamaños, formas y colores.
Son producidas por los conidióforos, mediante el estrangulamiento sucesivo.
b) Macroconidias. Son esporas multicelulares, las hay de diversas formas. Las macroconidias pueden
dividirse en dos o más células por tabiques transversales y pueden adoptar forma de huso o de clava. La
forma de estas estructuras varía, según el género.
III.- Esporangiosporas.
Son esporas producidas en estructuras especializadas llamadas esporangios, que son sacos redondos
unidos al micelio vegetativo por una estructura especial llamada esporangióforo.
Esporas sexuales
I.- Cigosporas o Zigosporas:
Espora que surge cuando dos hifas cercanas se unen y fusionan sus contenidos genéticos,
desarrollándose paredes gruesas. Las dos hifas que se unen pueden ser homotálicas (ambas
provenientes de la misma colonia o talo), o heterotálicas (provenientes de dos talos distintos).
II.- Ascosporas.
De la fusión de los gametos masculino y femenino surge una estructura llamada asco o asca. Las
ascosporas se desarrollan en el interior del asca, que es un saco que contiene generalmente ocho
ascosporas.
III.- Basidiosporas
De la fusión de los gameto masculino y femenino surge una basidia, en cuyo interior están las
basidiosporas; se desarrollan en grupo de cuatro como carácter atípico a partir de los extremos de
estructuras en forma de maza, que debido a su forma reciben el nombre de basidios.
IV.- Oosporas
Esporas que surgen de la unión de dos estructuras llamadas anteridio (gameto masculino) y oogonio
(gameto femenino), y que van a producir una sola oospora.
FISIOLOGÍA DE LOS MOHOS MICROSCÓPICOS.
Respecto a sus requerimientos nutricionales, los mohos son heterótrofos. Al faltarles la clorofila
lógicamente no llevan a cabo fotosíntesis, y comparándolos con las bacterias, los mohos en general
tienen requerimientos nutritivos extraordinariamente simples y sus procesos metabólicos y de biosíntesis
los llevan a cabo por las vías más comunes. Por lo tanto, pueden vivir en condiciones más severas que
otros microorganismos, casi en cualquier sustrato. Por ejemplo: cuero, madera, alimentos, mermelada,
frutas, plantas, el cuerpo humano, animales, etc.
El pH óptimo en el cual se desarrollan es de 3 a 5. Pueden crecer en humedad, pero también resisten la
falta de agua. Son aerobios estrictos y carecen en un rango de temperatura óptimo de 22 a 30º C.
Algunos mohos son capaces de desarrollarse en condiciones extremas, como deteriorando carne a 0º C
(mohos psicrófilos), o crecimiento a 62 ºC (mohos termófilos).
Las fuentes de carbono que pueden utilizar los mohos son: glucosa, sacarosa, maltosa, almidón o
celulosa. Las fuentes de nitrógeno que pueden utilizar los mohos son: nitrógeno orgánico, nitrógeno
inorgánico y nitratos. Algunos iones que requieren son: Zn, Cu, Mn, Fe y Mo.
De acuerdo al color de las hifas estas pueden ser hialinas cuando no están pigmentadas o dematiáceas
cuando poseen con color café oscuro
3.1 MATERIAL
118
• Pipetas de 1 ml • Caja de Petri con Varilla en forma de “V” con porta y

cubreobjetos estériles.
• Bisturí
• Asa micológica
• Mechero
3.2 EQUIPO
• Autoclave • Horno a 170°C
• Incubadora a 28°C y 35 °C • Microscopio
• 5 tubos con 9 ml de agua peptonada al 0.1% l • Tubos de ensaye de 13 X 100 con campana de
Durham con los azucares siguientes
• Matraz con 200 ml de Agar Papa Dextrosa
• Glucosa 10 %
• Tubos con PDA inclinado
• Lactosa al 10 %
• Tubos con agar dextrosa saboraud inclinado
• Maltosa al 10 %
• Cajas de Petri con agar Rosa de Bengala
• Sacarosa al 10 %
• Caja de Petri con PDA (para microcultivo)
• Rafinosa al 10 %
• Matraz con 50 ml de glicerol al 10 % estéril
• 80 ml de de PDA
• Matraz con 50 ml de formaldehído al 10 %
• Ácido tartárico al 10 %
• Matraz con 50 ml de ácido tartárico al 10%
3.4 CEPAS DE MOHOS
• Penicillium sp • Aspergillus níger
3.4 MUESTRA BIOLÓGICA
Equipo 1 Y 6 Muestra de suelo
Equipo 2 y 7 Tortillas o harina de maíz
Equipo 3 y 8 Bagazo de alguna fruta
Equipo 4 y 9 Pan o harina de trigo integrales
Equipo 5 y 10 Queso fresco
4.1 CUANTIFICACIÓN DE MOHOS FILAMENTOSOS Y LEVADURAS
a) Colocar 10 gramos de la muestra en un frasco que contiene 90 ml de agua peptonada al 0.1% con
una pinza estéril y en condiciones de esterilidad.
b) Homogenizar según recomendaciones de la NOM 110 y esperar a que se sedimente.
c) Realizar diluciones de 10-1 hasta 10-4 en tubos que contienen 9 ml de agua peptonada al 1%.
d) Realizar la técnica de vaciado en placa, colocando 1 ml de la dilución 10-3 y la dilución 104 a una caja
de Petri estéril.
e) Vaciar en la caja aproximadamente 20 ml de agar papa dextrosa previamente acidificado y a una
temperatura de 45ºC.
f) Homogenizar según las recomendaciones de la NOM 092 y dejar solidificar.
g) Sembrar por duplicada cada dilución.
h) Incubar una serie de placas a 25°C/ 5 días para mohos y otra serie a 35°C/ 48 h para levaduras.
119
i) Revisar las placas y hacer los recuentos según las recomendaciones de la NOM 092.
j) Realizar los cálculos y reportar el número de UFC/ml o g
4.2. MORFOLOGÍA COLONIAL DE MOHOS
Observar la morfología colonial de los mohos aislados y reportar tamaño, forma, aspecto, además de
observar si hay pigmento difusible.
4.3 RESIEMBRA DEL MOHO AISLADO
a) Elegir una colonia de moho bien aislada y sembrarlo por punto en tubos con PDA o ADS y en una caja
con agar Rosa de bengala.
b) Incubar los tubos y las cajas a 28°C de 3 a 5 días.
c) Una vez terminado el tiempo de incubación observar la morfología colonial en el agar rosa de
bengala.
4.4 IDENTIFICACIÓN DE MOHOS POR LA TÉCNICA DE RIDELL (microcultivo)
a) De una caja de Petri con PDA cortar cuadros de 1 cm3 con un bisturí estéril.
b) Colocar el cuadro de PDA en un portaobjetos que esta sobre una varilla de vidrio doblada en forma de
“V” en una caja de Petri (Todo esto previamente esterilizado).
c) Tomar con el asa el inóculo del moho al cual se quiere identificar.
d) Inocular por picadura cada uno de los 4 lados del cuadro de agar.
e) Colocar sobre el cuadro de agar un cubreobjetos y presionar ligeramente para que se adhiera.
f) Adicionar a la caja 10 ml de glicerol al 10 %
g) Cerrar la caja de Petri e incubarla a 28 °C.
h) Realizar observaciones mínimo cada 24 horas para identificar los cuerpos fructíferos.
i) Si se observa que el moho ya se ha desarrollado y se puede identificar las estructuras de
reproducción, quitar el glicerol con una pipeta Pasteur y desecharlo en el benzal.
j) Adicionar 10 ml de formaldehído al 40 % para inactivar el moho por 15 minutos.
k) Desprender con cuidado el cubreobjetos que se encuentra sobre el cuadro de agar y colocarlo sobre
un portaobjetos que contenga una gota se azul de algodón lactofenol, sellar la preparación con barniz de
uñas transparente.
l) Desprender con cuidado el cuadro de agar y depositarlo en la caja de Petri, colocar una gota de azul
de algodón lactofenol donde estaba el cuadro de agar y colocar un cubreobjetos
m) Si re requiere la preparación con barniz
n) Realizar las observaciones de las preparaciones en el microscopio con el objetivo de 10 y 40 X.
o) Dibujar las estructuras observadas y con ayuda de la bibliografía comparar las estructuras
reproductivas e identificar el moho.
4.5 OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE LEVADURAS
a. De la placa de PDA que se incubo a 28 °C seleccionar una colonia sospechosa de levadura

b. Realizar un frotis, fijarlo col calor y realizar una tinción simple.
c. Observar la preparación al microscopio con el objetivo de 10 y 40 X
120
d. Dibujar la levadura que se observo.
4.6 IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS
Se utiliza para identificar diversos géneros y especies fúngicas, principalmente levaduras y algunas
bacterias pertenecientes a los Actinomycetes, con base en su capacidad de fermentar azucares.
a. De la colonia a la que se le hizo la tinción simple y si resulto ser una levadura, colocarla en un tubo
con 3 ml de solución salina
b. inocular una gota a cada tubo que contiene diferentes azucares
c. Incubar de 24 – 48 h y observar la fermentación o asimilación del carbohidrato y comparar los
resultados que se buscarán en la bibliografía como la siguiente tabla.
d. Identificación de levaduras del género Candida.
Dextrosa Maltosa Sacarosa Galactosa Lactosa Trehalosa
C. albicans + + - + - +
C. tropicales + - + + - +
C. glabrata + - - - - +
C. guilliermondi + - + + - +
C. parapsilosis + - - + - +
C. krusei + - - - - -
C. kefyr + - + + + +
C. lipolitica + - - - - -
C. zeylanoides +* - - - - -
5 RESULTADOS Y CUESTIONARIO.
5.1 Anotar el número de UFC/ml o g de mohos y levaduras de las diluciones correspondientes en la

siguiente tabla.
Muestra MOHOS UFC/ml LEVADURAS UFC/ml
5.2 Dibujar la levadura observada al microscopio

5.3 Dibujar las estructuras de reproducción del moho
5.4 Anotar en la siguiente tabla las características de la morfología colonial del moho.
Características PDA ADS ARB

Tamaño
Forma
Aspecto
Color
Pigmento difusible
121
5.5 Anotar en la siguiente tabla las características de la morfología colonial de la levadura en el medio
PDA.
Tamaño
Aspecto
Color
Consistencia
5.6 +Anota el nombre del moho identificado ____________________________
5.7 Anotar la composición y utilidad de los medios de cultivo: Saboraud, agar de papa y dextrosa y agar
rosa de bengala
5.8 ¿Por qué es necesario realizar la técnica de microcultivo para identificar mohos?
5.9 ¿Cuál es la función del glicerol y el formaldehído en un microcultivo?
5.10 ¿Cómo identificarías un moho contaminante en un producto biotecnológico?
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
6.1 Discutir las características de cada grupo de mohos, así como su importancia microscópica en la
naturaleza.
6.2 Discutir la relación que guarda el crecimiento de los mohos en los diferentes medios de cultivo.
7 CONCLUSIONES
7.1 Elabora tus conclusiones tomando en consideración los objetivos de la práctica, los resultados
obtenidos y la bibliografía consultada.
122
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124
125
126
127
PRÁCTICA No. 12
FACTORES AMBIENTALES
UNIDAD VIII: Factores ambientales
1. OBJETIVOS
El alumno determinará la influencia de algunos factores ambientales que modifican el crecimiento de los
microorganismos que identificó en prácticas anteriores.
4.2.1 El alumno determinará la temperatura óptima, el punto térmico mortal (PTM) y el tiempo térmico
mortal (TTM) de algunos microorganismos.
4.2.2 El alumno determinará el efecto de la presión osmótica, pH, metales pesados, desinfectantes y
halógenos sobre el crecimiento de los microorganismos.
4.2.3 El alumno realizará una pasteurización como una aplicación de un proceso térmico.
4.2.4 El alumno evaluará la resistencia bacteriana ante un antibiótico.
2.-INTRODUCCIÓN
La temperatura es el factor ambiental que ejerce una variada influencia sobre el crecimiento microbiano,
el crecimiento microbiano se ve afectado de manera importante por la temperatura por lo que se
clasifican en psicrofílicos: (0°C a 20ºC), los mesofílicos crecen entre 20 y 40ºC y los termofílicos: crecen
entre 40 y 80ºC.
La forma más común de determinar la sensibilidad a calor de un organismo es por medio de su Punto
Térmico Mortal (PTM), que es la temperatura mínima necesaria para que todos los organismos de una
población mueran en 10 minutos y el Tiempo Térmico Mortal (TTM), es el tiempo mínimo en el cual
muere una población a una temperatura dada.
La elevada concentración de solutos en la célula genera una presión interna que recibe el nombre de
presión osmótica; las bacterias poseen paredes celulares rígidas y por lo general no presentan cambios
muy pronunciados de forma y tamaño cuando experimentan plasmólisis o plasmoptisis.
Existen microorganismos que crecen en medios con alta concentración de solutos y reciben el nombre
de osmofilicos, como son los halofílicos, que crecen en altas concentraciones de sal y los sacarofílicos,
que crecen en altas concentraciones de azúcar.
El pH optimo de crecimiento de los microorganismos pueden afectar el crecimiento y se clasifican en
acidófilos, neutrófilos, basófilos, la degradación de las proteínas y otras substancias nitrogenadas, la
fermentación de azucares produce ácidos, por lo tanto, la naturaleza del microorganismo y el sustrato
determinara si el medio se alcaliniza o acidifica.
Los metales pesados presentan actividad antimicrobiana, actúan generalmente por medio de la
precipitación de enzimas o de otras proteínas esenciales para la célula o interfieren con algunas
funciones celulares, el mercurio, la plata, el arsénico, el zinc y el cobre son los más utilizados, se utilizan
en bajas concentraciones ya que tienen buena actividad antimicrobiana.
Compuestos halogenados como el yodo, cloro, el hipoclorito, actúan como oxidantes de los
constituyentes celulares, como las proteínas.
128
Los antibióticos se definen como substancias producidas por un microorganismo, la cual a bajas
concentraciones inhibe el crecimiento de los microorganismos, por su modo de acción, los antibióticos se
pueden clasificar como bactericidas, bacteriostáticos, macrólidos, polipéptidos y grupo misceláneo.
La pasteurización es un proceso térmico en el que se aplica un calentamiento moderado seguido de
un enfriamiento brusco, con la finalidad de reducir la carga microbiana presente en productos que son
termo sensibles, este proceso no es un método de esterilización, puesto que existen microorganismos
que resisten la pasteurización, a los cuales se le conoce con el nombre de termodúricos; ejemplo de
ellos son algunas especies de los géneros: Streptococcus, Micrococcus, Corynebacterium,
Lactobacillus, Arthrocabter, Bacillus y Clostridium.
3. EQUIPO, MATERIAL, MEDIOS DE CULTIVO Y CEPAS MICROBIANAS
3.1.- MATERIAL
• Pipetas de 1,2,5 y 10ml estériles. • Tubos de 13x 100 mm con 3 ml de caldo
nutritivo a pH 9.0
• Tubos de 13x 100mm con 5 ml de caldo nutritivo
• Tubos de 13x 100 mm con 3 ml de caldo
• Placas con agar nutritivo nutritivo con 1% de cloruro de sodio
• 100 ml de leche en punto de venta • Tubos de 13x100 mm con 3 ml de caldo
• Tubos con 9 ml de agua peptonada al 0. 1% nutritivo con 3% de cloruro de sodio
• Matraz de 100 ml con Agar bilis rojo violeta • Tubos de 13x 100 mm con 3 ml de caldo
nutritivo con 5% de cloruro de sodio
• Cajas Petri con Agar cuenta estándar
• Discos de papel filtro de 1 cm de diámetro
• Caja con agar Luria
• Cajas de Petri estériles
• Caja con agar Luria + ampicilina (50µg/ml)
• Pinzas de disección
• Tubo con 5 ml de caldo Luria inoculado con
Escherichia coli, con crecimiento • Discos de papel filtro impregnados con
hipoclorito de sodio
• Tubos de 13x 100 mm con 3 ml de caldo
nutritivos pH 3. 5 • Discos de papel filtro impregnados con yodo
• Tubos de 13x l00 mm con 3 ml de caldo nutritivo • Sensidiscos con diferentes antibióticos
a pH 7.0
3.1 EQUIP0
• Un termómetro • Un baño María a 70°C
• Un refrigerador a 4°C • Un baño María a 80°C
• Una incubadora a 25°C • Un baño María a 92°C
• Una incubadora a 35°C • Una autoclave
• Un baño María a 50°C • Probetas
• Un baño María a 60°C • Horno
• Bacillus sp. • Escherichia coli
• Saccharomyces cerevisiae • Aspergillus niger
• Pseudomonas sp. • Micrococcus luteus
4.1 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO
a. Hacer una suspensión del microorganismo, cada equipo utilizará el mismo microorganismo en todos
sus experimentos.
129
b. Etiquetar 4 tubos con 3 ml de caldo nutritivo con: nombre del microorganismo, fecha, equipo, grupo y
con las siguientes temperaturas, 5°C, 28°C, 35°C y 55°C.
c. Inocular cada uno de los tubos con 0.1 ml de la suspensión microbiana e incubar los tubos a la
temperatura correspondiente por 24 h.
d. Después de este tiempo observar si hay crecimiento haciendo anotaciones con un signo (+)
dependiendo de cuanta turbidez se observe y si no hay crecimiento con un signo (-).
4.2 DETERMINACIÓN DEL PUNTO TÉRMICO MORTAL (PTM)
a. Etiquetar una serie de 7 tubos conteniendo cada uno 3 ml de caldo nutritivo, con las siguientes
temperaturas: 28°, 35°, 50°, 60°, 70°, 80° y 92° C.
b. Inocular cada tubo con 0. 1 ml de la suspensión microbiana.
c. Calentar los tubos a las temperaturas correspondientes durante 10 minutos a baño María.
d. Dividir una caja con agar nutritivo en 7 partes y marcar con 28°, 35°, 50°, 60°, 70°, 80°, 92°C.
e. Sembrar por estría simple con el asa recta sobre el agar en su correspondiente temperatura.
f. Incubar la placa por 48 h a 25°C si se sembró a mohos y a 35°C, 24 h si se trata de bacterias y
levaduras.
g. Incubar los tubos que llevaron a cabo el proceso para ver la presencia o ausencia de turbidez
h. Observar si hay crecimiento en cada una de las temperaturas.
i. Si utilizaste moho tu testigo de crecimiento es el tubo de 28°C y si utilizaste una bacteria es el de 35°C.
4.3 DETERMINACION DEL TIEMPO TERMICO MORTAL (TTM)
a. Etiquetar una serie de 7 tubos conteniendo cada uno 3 ml de caldo nutritivo, con los siguientes
tiempos 0, 5, l0, 15, 20, 25 y 30 minutos.
b. Inocular cada tubo con 0.1 ml de la suspensión microbiana
c. Colocar los 6 tubos en una gradilla e introducirlo en el baño a 70°C y poner un cronometro y cuando
pase los 5 minutos retirar un tubo, cuando pase los 10 minutos retirar el tubo y así sucesivamente hasta
completar los 30 minutos. Recuerda el del tiempo 0 es el testigo, no sufre calentamiento.
d. Dividir una caja Petri con agar nutritivo en 7 partes y marcar con 0, 5, l0, 15, 20, 25 y 30 minutos.
e. Sembrar por estría simple con el asa recta sobre el agar en su correspondiente tiempo.
f. Incubar la placa por 3 días/a 25°C y si se sembró una bacteria 35°C/24 h.
g. Los tubos que recibieron el tratamiento incubarlos para observar la presencia o ausencia de turbidez
h. Observar si hay crecimiento en la placa para cada una de los tiempos.
130
4.4.-PASTEURIZACIÓN
4.4.1 Leche sin pasteurizar: determinar organismos mesofílicos aerobios (OMA) y organismos
coliformes (OC).
Para organismos coliformes.
a. Realizar diluciones siguiendo las recomendaciones de la NOM 110 hasta la dilución 10-2 .
b. Sembrar por la técnica de vaciado en placa y por duplicado la dilución 10-1 para organismos
coliformes. (NOM 113- SSA1 – 1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de microorganismos
coliformes totales en placa)
c. Sembrar por duplicado utilizando agar bilis rojo violeta, homogenizar, dejar solidificar y agregar una
capa de agar, solidificar e incubar a 35°C durante 24 horas.
d. Contar las colonias típicas de coliformes que son de color rosa o roja con un halo de precipitación y
reportar el Número de UFC/ ml de leche.
Para organismos mesofílicos aerobios.
e. Sembrar por duplicado la dilución 10-2 utilizando agar cuenta estándar, siguiendo las
recomendaciones de la NOM 092
f. Dejar solidificar e incubar a 35°C 24 horas.
g. Contar y reportar el número de colonias como unidades formadoras de colonias.
Pasteurización de la leche
a. Colocar 10 ml de leche de punto de venta en un tubo estéril.

b. Colocar el tubo baño María a 70° C durante 30 minutos.
c. Enfriar rápidamente en baño de hielo y determinar organismos mesofílicos y organismos coliformes.
4.4.2 Leche pasteurizada: determinar organismos mesofílicos aerobios (OMA) y organismos

coliformes (OC).
Para organismos coliformes.

a. Etiquetar 2 cajas vacías y estériles con los siguientes datos: leche pasteurizada, equipo, grupo, seguir
las recomendaciones de la NOM 113 …
b. Sembrar por duplicado la leche, adicionar agar bilis rojo violeta, homogenizar, dejar solidificar, agregar
una capa de agar, dejar solidificar e incubar a 35°C durante 24 horas.
c. Contar las colonias típicas de coliformes que son de color rosa o roja con un halo de precipitación.
Para organismos mesofílicos aerobios.
d. Etiquetar 2 cajas vacías y estériles con los siguientes datos: leche pasteurizada, equipo, grupo y OMA.
e. Realizar la técnica de vaciado en placa y seguir las recomendaciones de la NOM 092.
f. Adicionar 1 ml de leche a cada caja, adicionar agar cuenta estándar, homogenizar, dejar solidificar e
incubar a 35°C durante 24 horas.
g. Contar y reportar el número de UFC/ ml de leche.
131
EFECTO DE LOS FACTORES FISICOQUIMICOS EN EL CRECIMIENTO CELULAR
4.5- EFECTO DEL pH
a. Etiquetar 4 tubos de caldo nutritivo con los diferentes pH (3.5, 5.0, 7.0 y 9.0)
b. Inocular con 0.1 ml de la suspensión cada uno de los tubos.
c. Incubar los tubos a 35°C para bacterias y levaduras durante 24 h y a 25°C durante 72 h para mohos.
d. Después de este tiempo observar presencia o ausencia de crecimiento observando la turbidez.
4.6-EFECTO DE LA PRESION OSMOTICA SOBRE EL CRECIMIENTO

a. Etiquetar los tubos que contienen 3 ml de caldo nutritivo con diferentes concentraciones de cloruro de
sodio (1%, 3% y 5%.) con nombre de la cepa, grupo y equipo.
b. Inocular con 0.1 ml de la suspensión cada uno de los tubos.
c. Incubar los tubos a 35°C para bacterias y levaduras durante 24 h y a 25°C durante 48 h para mohos.
d. Después de este tiempo observar presencia o ausencia de crecimiento observando la turbidez.
4.7- METALES PESADOS

a. Impregnar discos de papel filtro con los siguientes compuestos. AgNO3, CuSO4 y HgCl2 al 1 %
b. Marcar una caja Petri con agar nutritivo con: nombre de la cepa, grupo, equipo, nombre del metal.
c. Sembrar por estría masiva la caja y colocar los discos sobre la placa.
d. Incubar la placa a 35 ° C para bacterias y levaduras por 24 h y a 25°C durante 48 h para mohos.
e. Observar el crecimiento del microorganismo y medir el halo de inhibición de c/u de los agentes
utilizados.
132
4.8 COMPUESTOS HALOGENADOS

a. Impregnar discos de papel filtro con los siguientes compuestos: hipoclorito de sodio y de yodo.
b. Etiquetar una caja Petri con agar nutritivo con: nombre de la cepa, grupo, equipo y desinfectantes.
c. Sembrar por estría masiva la caja y colocar los discos sobre la placa.
d. Incubar la placa a 35°C para bacterias y levaduras durante 24 horas y a 25°C durante 48 horas para
mohos.
e. Observar el crecimiento del microorganismo y medir el halo de inhibición de c/u de los agentes
utilizados.
4.9 EFECTO DE LA ACTIVIDAD DE ANTIBIÓTICOS SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO
a. Marcar una placa con agar nutritivo con el nombre de la cepa, grupo y equipo.
b. Sembrar el microorganismo en la placa por estría masiva con un hisopo o con asa.
c. Colocar un multidisco o discos individuales sobre la placa sembrada con la cepa.
d. Presionar ligeramente cada disco sobre el cultivo con ayuda de pinzas de disección para poner en
contacto el antibiótico con la cepa
e. Incubar las placas a 35°C durante 24 horas.
f. Después del tiempo de incubación medir el diámetro de los halos de inhibición.
NOTA: De acuerdo a la tinción de Gram obtenida se utilizarán los sensidiscos para Gram positivos
(morados) y para Gram negativos (rosas).
133
4.9.1 RESISTENCIA BACTERIANA A UN ANTIBIÓTICO
a. Tomar 1 ml del cultivo de Escherichia coli e inocularlo en cada una de las cajas con agar Luria y agar
luria + ampicilina (50µg/ml). Incubar a 35°C durante 24 horas, marcar correctamente las cajas.
b. Contar el número de colonias desarrolladas en cada caja.
c. Guardar la placa con colonias desarrolladas en presencia del antibiótico en el refrigerador para la
práctica siguiente.
d. Calcular la frecuencia de bacterias resistentes al antibiótico, como UFC en presencia de
antibiótico/UFC sin antibiótico (número de bacterias resistentes / cuenta total).
5. RESULTADOS
5.1 EFECTO DE LA TEMPERATURA
Temperatura 5°C 28°C 37°C 55°C

Crecimiento UFC/ml
5.2 PUNTO TÉRMICO MORTAL

Temperatura 28°C 37°C 50°C 60°C 70°C 80°C 92°C
Crecimiento UFC/ml
5.3 TIEMPO TÉRMICO MORTAL
Tiempo 0’ 5´ 10´ 15´ 20´ 25´ 30´

Crecimiento UFC/ml
5.4 PASTEURIZACIÓN
Leche sin pasteurizada UFC/ml Leche pasteurizada UFC/ml
Organismos mesofilos aerobios
Organismos coliformes
5.5 EFECTOS DEL pH
Efecto del pH 3.5 5.0 7.0 9.0
Crecimiento
5.6 EFECTO DE LA PRESIÓN OSMÓTICA
Concentración de NaCl 1% 3% 5%
Crecimiento
5.7 EFECTO DE METALES PESADOS
Metal AgNO3 CuSO4 HgCl2 Lugol
Diámetro del halo de inhibición (mm)

134
5.8 EFECTO DE COMPUESTOS HALOGENADOS
Halógeno Cloro Isodine H2O2 Gel
Diámetro halo de inhibición (mm)
5.9 EFECTO DE LOS ANTIBIÓTICOS

Antibiótico Halo de Antibiótico Halo de
Gram(+) inhibición Gram (-) inhibición
Pefloxacina PEF Cefalotina CF
Dicloxacilina DC Cloranfenicol CL
Penicilina PE Ceftriaxona CRO
Cefalotina CF Ampicilina AM
Ceftazidima CAZ Amikacina AK
Eritromicina E netilmicina NET
Ampicilina AM Cefotaxima CTX
Tetraciclina TE Gentamicina GE
Trimetroprim- SXT Trimetroprim- SXT
sulfametoxazol sulfametoxazol
Cefotaxima CTX pefloxacina PEF
Gentamicina GE carbenicilina CB
Cefuroxima CXM Nitrofurantoina NF
5.9 RESISTENCIA A UN ANTIBIÓTICO
UFC en presencia de antibiótico
UFC sin antibiótico
Número de bacterias resistentes / cuenta total = ___________________

CUESTIONARIO
5.1 Menciona tres ejemplos de microorganismos psicrofílicos, 3 de mesofílicos y 3 de termofílicos
5.2 Define el término termodúrico
5.3 ¿Qué significa actividad de un antibiótico?
5.4. ¿Cómo actúan los antibióticos utilizados sobre el microorganismo con el que trabajaste?
5.5 ¿A qué se debe la resistencia a un antibiótico?
5.6 Explica brevemente que es el efecto bactericida, bacteriostático, fungicida y fungistático.
5.7 ¿Explica la diferencia de como actúan los diferentes metales pesados utilizados en el laboratorio?
5.8 Explica la relación que existe entre la concentración del agente químico y el tiempo de exposición
6.1 Basándose en los resultados anteriores y a la bibliografía consultada, analizar y discutir los
resultados obtenidos en esta práctica, haciendo énfasis en el efecto causado a nivel molecular de los
factores estudiados y la importancia práctica que tiene el conocer el efecto de estos mismos sobre los
microorganismos.
7.-CONCLUSIONES.
7.1 Elaborar las conclusiones basándose en los resultados, al análisis y discusión que se hicieron de
estos, a la bibliografía consultada y a los objetivos de la practica.
135
APÉNDICE
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
VOCABULARIO
Medio de cultivo.-es el material nutritivo en el que se pueden recuperar, multiplicar y aislar los
microorganismos, así como efectuar pruebas de susceptibilidad, generalmente se presenta desecado en
forma de polvo fino o granular y en ocasiones puede presentarse también hidratado y preparado.
Medio líquido.- Cuando no tiene agar en su formulación
Medio sólido.- Cuando la concentración de agar es de aproximadamente de 15 g/L
Medio selectivo.- Son aquellos que contienen sustancias que impiden el desarrollo de algunos
microorganismos pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperación del microorganismo de
interés.
Medio diferencial.- Es aquel que contienen indicadores de ácido base, redox o sustancias que
detectan cambios en el medio o en las características típicas de las colonias.
Medio de enriquecimiento.- Son medios líquidos que estimulan la multiplicación de algún
microorganismo determinado e impiden o inhiben la reproducción de otros.
Medio de transporte.- son medios que nos permiten transportar únicamente al microorganismo
INTRODUCCIÓN
La identificación adecuada de los microorganismos depende de varios factores como proporcionarles los
nutrimentos necesarios, los cuales varían ampliamente, estos medios proporcionan una fuente de
carbono, fósforo, azufre, vitaminas y otras sustancias promotoras del crecimiento.
Utilizando la clasificación de medios según la norma oficial mexicana NOM-065-SSA1-1993, tenemos
que los medios que estamos utilizando en nuestro laboratorio son:
Medios líquidos.
Se emplean fundamentalmente para:
- Cultivar los microorganismos y obtener grandes cantidades de los mismos o bien la producción de
metabolitos específicos.
- Estimular y promover la selección de algún o algunos microorganismos e impedir que otros se
multipliquen.
- Identificar al microorganismo estudiado mediante pruebas bioquímicas.
Medios de transporte.
Sirven para transportar los especímenes que contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del
producto hasta el laboratorio donde vamos a efectuar el estudio. Este medio impide que se altere la
proporción original de la flora microbiana en la muestra.
La calidad del trabajo microbiológico en el análisis de los alimentos y del agua se encuentra vinculada
tanto con la idoneidad de los medios de cultivo y reactivos, como de la limpieza del material de vidrio y/o
plástico que se utilizan durante su preparación y/o envase.
Las mejores instalaciones y equipo disponible y la habilidad del analista pierden todo su valor si la
composición de los medios de cultivos no corresponde a la requerida y si durante la preparación de
éstos no se respetan las indicaciones del fabricante.
MÉTODO DE PRUEBA
La viabilidad de los medios se debe probarse con cultivos tipo de microorganismos de la ATCC
(Colección Americana de Cultivos Tipo) u otras cepas certificadas en centros de referencia de cultivos
tipo de la SS, ENCB o IMSS.
136
ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS

Los medios de cultivo deberán almacenarse en un lugar fresco y seco o en el refrigerador dentro
de una bolsa de plástico.
AGARES
1.- AGAR BACTERIOLÓGICO
El agar bacteriológico Bioxon se usa en la preparación de medios de cultivo microbiológicos sólidos y
semisólidos. También puede utilizarse en concentraciones menores como retardante de la penetración
del oxígeno en medios líquidos, la cantidad utilizada es de 15 g/l
2.- AGAR NUTRITIVO
Fórmula en g/L de agua destilada:
Peptona de gelatina 5g
Extracto de carne de res 3 g
Agar 15 g
pH final = 6,8 ± 0,2
Método de preparación:
Suspender 23 g de polvo en un litro de agua destilada. Mezclar bien y dejar en reposo por 15 minutos.
Calentar a ebullición de 1 a 2 minutos. Distribuir y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos. Determinar la
funcionalidad del medio de cultivo con microorganismos típicos.
3.- AGAR PARA MÉTODOS ESTÁNDAR
Peptona de caseína 5g
Extracto de levadura 2.5 g
Glucosa 1g
Agar 15 g
pH final = 7,0 ± 0,1
Suspender 23,5 g de polvo en un litro de agua destilada. Disolver al calor y esterilizar a 121 °C durante
15 minutos, vaciar en placas estériles
4.- AGAR CITRATO DE SIMMONS
Fosfato dihidrogenado de amonio 1 g
Fosfato dipotásico 1g
Cloruro de sodio 5g
Citrato de sodio 2g
Sulfato de magnesio 0.20 g
Agar 15 g
Azul de bromotimol 0,8 g
pH final = 6,9 ± 0,1
Suspender 24,2 g de polvo en un litro de agua destilada y dejar remojar durante 5 a 10 minutos. Mezclar
bien y calentar suavemente agitando frecuentemente hasta que el medio hierva un minuto. Distribuir 5
ml en tubos de 13 X 100 mm y esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Se deja enfriar en
posición inclinada.
5.- AGAR HIERRO DE KLIGER
137
Peptona de caseína 5g
Glucosa 1g
Agar 15 g
Rojo de fenol 0,025 g
pH final = 7,4 ± 0,2
Suspender 52 g de polvo en un litro de agua destilada. Mezclar perfectamente y calentar con agitación
frecuente, hervir durante un minuto. Distribuir 5 ml en tubos de 13 X 100 y esterilizar a 121 °C durante 15
minutos. Dejar enfriar en posición inclinada.
6.- AGAR DE HIERRO TRIPLE AZÚCAR
Peptona de caseína 10 g
Peptona de carne 10 g
Cloruro de sodio 5g
Lactosa 10 g
Sacarosa 10 g
Glucosa 1g
Sulfato de hierro y amonio 0,2 g
Tiosulfato de sodio 0,2 g
Agar 13 g
pH final = 7,3 ± 0,2
Suspender 59,4 g de polvo en un litro de agua destilada. Mezclar perfectamente y calentar con agitación
frecuente, hervir durante un minuto: Distribuir 5 ml en tubos de 13 X 100 y esterilizar a no más de 118 °C
durante 15 minutos. Dejar enfriar en posición inclinada.
7.- AGAR MIO
Peptona de gelatina 10 g
Extracto de levadura 3g
L-ornitina 5g
Glucosa 1g
Agar 2g
Púrpura de bromocresol 0,02 g
pH final = 6,5 ± 0,2
Suspender 31 g de polvo en un litro de agua destilada. Calentar hasta ebullición durante un minuto hasta
disolver completamente y distribuir 5 ml en tubos de 13 X 100 mm. Esterilizar en autoclave a 121 °C
durante 15 minutos.
8.- AGAR HIERRO Y LISINA (LIA)
Glucosa 1g
L-lisina 10 g
Citrato férrico de amonio 0,5 g
138

Púrpura de bromocresol 0,02 g
Agar 13,5 g
pH final = 6,7 ± 0,2
Suspender 33 g de polvo en un litro de agua destilada. Calentar agitando con frecuencia hasta el punto
de ebullición para disolver el medio por completo. Distribuir 5 ml en tubos de 13 X 1000 mm y esterilizar
a 121 °C durante 15 minutos. Dejar enfriar en posición inclinada.
9.- AGAR EMB (AGAR EOSINA AZUL DE METILENO)
Lactosa 5g
Sacarosa 5g
Agar 13,5 g
Eosina 0,4 g
Azul de metileno 0,065 g
pH final = 7,2 ± 0,2
Suspender 36 g de polvo en un litro de agua destilada. Calentar agitando frecuentemente y hervir
durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
10.- AGAR PDA (AGAR DE PAPA Y DEXTROSA)
Infusión de papa (sólidos) 4g
Dextrosa 20 g
Agar 15 g
pH final = 5,6 ± 0,1
Suspender 39 g del polvo en un litro de agua destilada. Mezclar perfectamente, calentar con agitación
frecuente y hervir durante un minuto hasta disolución completa, distribuir y esterilizar a 121 °C durante
15 minutos.
11.- AGAR-ROJO- VIOLETA-BILIS-LACTOSA (RVBA)
Formula
Cloruro de sodio 5.0
Peptona 7.0 g
Lactosa 10g
Sales biliares
Rojo neutro 0.03
Cristal violeta 0.002
Agua 1L
Preparación:
Mezclar los componentes en el agua y dejar reposar durante algunos minutos.
Mezclar perfectamente y ajustar el pH a 7,4 con ácido clorhídrico 0,1N o con hidróxido de sodio 0,1N a
25°C, de forma que después del calentamiento se mantenga en este valor.
139
Calentar con agitación constante y hervir durante 2 minutos.

Enfriar inmediatamente el medio en un baño de agua hasta que llegue a 45°C.
Evitar el sobrecalentamiento del medio.
No debe esterilizarse en autoclave.
Usar el medio dentro de las tres primeras horas después de su preparación.
En el caso de utilizar medio de cultivo deshidratado, seguir las instrucciones del fabricante.
11.- AGAR DEXTROSA SABOURAUD
Formula
Polpetona o neopeptona 10.0
Dextrosa 40 .0 g
Agar 15.0 g
Agua destilada 1L
pH final = 5,6 ± 0,2

Calentar hasta disolución completa. Esterilizar en autoclave a 118 - 121°C por 15 min, no exceder de
121 ± 1°C.
140
CALDOS
1.- CALDO ROJO DE METILO Y VOGUES PROSKAUER (RM-VP)
Peptona especial No.1 7g
Glucosa 5g
Agua destilada 1,000 ml
pH final = 6,9 ± 0,2
Suspender 17 g del polvo en un litro de agua destilada. Disolver calentando y hervir aproximadamente
un minuto si es necesario .Distribuir 6 ml en tubos de 13 X 100 mm y esterilizar en autoclave durante 12
- 15 minutos a 121 ºC. Al término de la incubación el volumen de este tubo se dividirá en dos uno para la
prueba del Rojo de metilo y la otra mitad para la prueba de VP.
2.- CALDO NUTRITIVO
Extracto de carne de res 3g
pH final = 6,9 ± 0,2
Suspender el almidón en 100 ml de agua destilada. Disolver los demás ingredientes en 900 ml de agua
destilada con calentamiento y agitación continua, mezclar ambas suspensiones y esterilizar a 115 °C por
15 minutos en autoclave.
3.- CALDO DE MALONATO DE EWING MODIFICADO
Formula en g/L de agua destilada:
Sulfato de amonio 2g
Fosfato dipotásico 0,6 g
Fosfato monopotásico 0,4 g
Cloruro de sodio 2g
Malonato de sodio 3g
Dextrosa 0,25 g
pH final = 6,7 ± 0,2
Disolver 9,3 g de polvo en un litro de agua destilada. Distribuir en tubos de ensaye adecuado y esterilizar
en autoclave a 121° C durante 15 minutos.
4.- CALDO DE INFUSIÓN DE CEREBRO Y CORAZÓN
Infusión de cerebro de ternera 200 g
Infusión de corazón de res 250 g
Cloruro de sodio 5g
Fosfato disódico 2,5 g
Dextrosa 2g
pH final = 7,4 ± 0,2
141
Disolver 37 g de polvo en un litro de agua destilada. Si es necesario calentar suavemente para

disolverlo.
Distribuir y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos, para obtener buenos resultados el medio debe
utilizarse el mismo día de su preparación.
5.- CALDO ROJO DE FENOL CON LACTOSA
Cloruro de sodio 5g
Lactosa 5g
pH final = 7,4 ± 0,2
Disolver 20 g de polvo en un litro de agua destilada. Mezclar y calentar frecuentemente hasta su
ebullición y completa disolución. Distribuir y esterilizar en autoclave de 116 a 118 °C durante 15 minutos.
6.- CALDO UREA
Urea 20 g
Fosfato monopotásico 9,1 g
Extracto de levadura 0,1 g
pH final = 6,8 ± 0,2
Disolver 3,87 g en 100 ml de agua destilada. Esterilizar por filtración. Distribuir en cantidades de 0,1 a 1
ml en tubo estériles. En lugar de esterilizarse por filtración puede esterilizarse en autoclave a 108 °C de
7 a 10 minutos.
7.- CALDO NITRATO
Nitrato de potasio 1g
pH final = 7,0 ± 0,2
Pesar exactamente las cantidades, rehidratar con agua destilada y calentar suavemente hasta disolución
total. Distribuir 5 ml en tubos de 13 X 100.y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos.
8.- CALDO KCN
MEDIO BÁSICO
Peptona 3g
Cloruro de sodio 5g
Fosfato de potasio monobásico (KH2 PO4) 0,225 g
Fosfato dibásico de sodio (Na2 HPO4.2H2O) 5,64 g
pH final = 7,6 ± 0,2
Pesar exactamente las cantidades y rehidratar con agua destilada, calentar suavemente si es necesario
142
hasta su disolución. Distribuir 5 ml en tubos de 13 X 100 mm con tapón de rosca y esterilizar a 121 °C
durante 15 minutos.
CIANURO DE POTASIO
Preparar un tubo con tapón de rosca, estéril
KCN 0.5 g
No absorber la solución de KCN con la pipeta por la boca, usar una pipeta de jeringa o bulbo. El
cianuro es sumamente venenoso y puede causar la muerte.
A los 5 ml del medio básico frió agregar 1 ml de KCN al 0,5 % utilizando una pipeta de bulbo y mezclar
bien.
9.- CALDO LACTOSADO
Ingrediente Medio de 1.5 de Concentración Medio de concentración sencilla
Extracto de carne 4,5 g 3,0 g
Peptona de gelatina 7,5 g 5,0 g
Lactosa 7,5 g 5,0 g
Agua destilada 1000,0 ml 1000,0 ml
Disolver los ingredientes en 1 l de agua, calentando si es necesario o el medio completo deshidratado,
siguiendo las instrucciones del fabricante.
Ajustar el pH final de tal manera que después de la esterilización éste sea de 6,9 ± 0,2 a 25 °C.
Distribuir en volúmenes de 10 ml en tubos con dimensiones de 16 x 160 mm el medio de concentración
sencilla y de 20 ml en tubos de 20 x 200 mm el medio de concentración 1,5, cada tubo debe tener
campana de fermentación.
Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ± 1,0 °C.
Enfriar rápidamente para evitar una exposición excesiva al calor. El aspecto del caldo es claro y de color
beige.
Se puede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 ml del
caldo preparado, cuando se agreguen 10 ml de la muestra.
10.- CALDO LAURIL SULFATO TRIPTOSA.
Ingredientes Medio de 1,5 concentración Medio de concentración sencilla

Triptosa 30,0g 20,0 g
Lactosa 7,5g 5,0 g
Fosfato dipotásico 4,125g 2,75 g
Fosfato monopotásico 4,125 g 2,75 g
Cloruro de sodio 7,50 g 5,0 g
Lauril sulfato de sodio 0,15 g 0,1 g
Agua destilada 1000,0 ml 1000,0 ml
Disolver los componentes en 1 L de agua, calentando si es necesario o el medio de cultivo completo

deshidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Ajustar el pH de tal manera que después de la esterilización éste sea de 6,8 ± 0,2 a 25 °C.
143
Distribuir en volúmenes de 10 ml en tubos con dimensiones de 16 x 160 mm el medio de concentración

sencilla y de 20 ml en tubos de 20 x 200 mm el medio de concentración 1,5, cada tubo debe tener
campana de fermentación.
Se recomienda almacenar el medio una vez preparado.
Las campanas de fermentación no deben de contener burbujas de aire después de la esterilización.
Se puede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 ml de
caldo preparado, cuando se agreguen 10 ml de muestra.
11.- CALDO LACTOSA BILIS VERDE BRILLANTE
Formula
Cloruro de sodio 5.0
Peptona 7.0 g
Lactosa 10g
Sales biliares
Verde brillante 0.002
Agua 1L
Formula
Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en agua, calentar si es necesario.
Ajustar el pH, de tal manera que después de la esterilización éste sea de 7,2 a 25 °C.
Distribuir el medio en cantidades de 10 ml en tubos de 16 X 160 mm conteniendo campana de
fermentación.
Las campanas de fermentación no deben contener burbujas de aire después de la esterilización.
12.- CALDO EC
Base para la detección de organismos coliformes en agua, aguas de desecho, mariscos y alimentos.
Preparación
Suspenda 37 g del polvo en un litro de agua purificada y caliente ligeramente para disolver
completamente. Dispénselo en tubos que contienen viales de fermentación invertidos. Autoclave a 121
°C durante 15 minutos. Analice muestras del producto final para verificar su rendimiento usando
controles
Fórmula aproximada en g/l
Digerido pancreático de caseína 12,0
Pepetona de proteosa No. 3 8,0
Lactosa 5,0
Sales biliares No. 3 1,5
Fosfato di potásico 4,0
Fosfato monopotásico 1,5
NaCl 5,0
Ajustar y /o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento
pH final 6,9 0,2
13.- MEDIO MRS

Peptona 10 g
144
Extracto de res 10
Extracto de levadura 5
Dextrosa 20
Polisorbato 80 1.0
Citrato de amonio 2.0
Acetato de sodio 5.0
Sulfato de magnesio 0.1
Sulfato de manganeso 0.05
Fosfato di potásico 2.0
pH final 6.5 ± 0.2
Suspender 55 g en un litro de agua destilada y esterilizar a 121°C durante 15 minutos .
145
MEDIOS SEMISÓLIDOS
1.- MEDIO PARA PRUEBA DE MOVILIDAD (SIM)
Formula en g/L:
Extracto de carne 6,1 g
Sulfato de hierro y amonio 0,2 g
Agar 3,5 g
pH final = 7,3 ± 0,2
Suspender 30 g del material seco en un litro de agua destilada. Mezclar bien y cuando se tenga la
suspensión uniforme, calentar agitando frecuentemente y hervir durante un minuto. Distribuir y esterilizar
en autoclave a 121 °C por 15 minutos.
2.- MEDIO BASAL OF o MEDIO DE HUGH Y LEIFSON
Caseína digerida por enzimas pancreáticas2 g
Cloruro de sodio 5g
Agar 2,5 g
pH final = 6,8 ± 0,1
Suspender 9,8 g de polvo en un litro de agua destilada. Mezclar bien, calentar agitando frecuentemente
y hervir durante un minuto. Distribuir y esterilizar a 121 °C durante 15 minutos. Agregar 10 ml de
solución de dextrosa estéril por filtración a través de membrana al 10 % a 100 ml de base estéril.
(Agregar 10 ml de solución de lactosa estéril al 10 % a 100 ml de base estéril y agregar 10 ml de
sacarosa estéril al 10 % a una tercera porción de 100 ml.
Otra forma de preparar el medio es agregar los carbohidratos antes de la esterilización en autoclave y
esterilizar a 118 °C durante 10 minutos.
3.- GELATINA NUTRITIVA
Gelatina 120 g
pH final = 6,8 ± 0,2
Suspender 128 g de polvo en un litro de agua destilada. Calentar ligeramente para disolver y distribuir en
tubos. Esterilizar a 121 °C durante 15 minutos.
146
SOLUCIONES Y REACTIVOS
1.- PRUEBA DE ROJO DE METILO
FORMULA:
Rojo de metilo 0.1 g
Alcohol etílico 300 ml
Disolver el rojo de metilo en el alcohol y diluir con el agua destilada, para llevar a cabo la prueba, añadir
5 gotas de la solución a 5 ml del cultivo problema.
Resultados: Un color rojo demuestra un pH menor a 4,5 y la prueba es Positiva. Un color amarillo se
reporta como prueba Negativa.
2.- PRUEBA DE VOGUES-PROSKAUER
Esta prueba es para comprobar la presencia del diacetilo.

FORMULA:
Alfa naftol 5g
Alcohol etílico absoluto 100 ml
Añadir 0,6 ml de la solución de alfa naftol y 0,2 ml de una solución acuosa al 40% de KOH a 1 ml de
cultivo.
Resultados: El desarrollo de una coloración roja en 15 minutos constituye una reacción Positiva.
3.- PRUEBA DE OXIDASA
FORMULA:
N,N,N,N-Tetrametil-p-Fenilendiamino 0,5 g
Conservar en frasco oscuro a 5 – 10 °C. El reactivo se conserva durante 14 días.
Sembrar en un tubo de base de gelosa para sangre. Incubar 18 h a 35 ºC. Agregar 0,3 ml de reactivo.
Resultado: La reacción positiva se observa por la producción de un color azul en un minuto.
4.- REACCIÓN DE INDOL (REACTIVO DE KOVAC)
FORMULA:
P-dimetilaminobenzaldehído 5,0 g
Alcohol amílico.o alcohol isoamílico 750 ml
Ácido clorhídrico concentrado 25 ml
Disolver el p-dimetilaminobenzaldehído en el alcohol amílico y agregar el ácido clorhídrico lentamente,
gota a gota y agitando. Debe conservarse en frasco ámbar con tapón esmerilado; el color del reactivo va
del amarillo al café claro. Se debe conservar a 4 ºC.
Disolver los ingredientes en agua destilada. Mezclar bien y calentar a ebullición, agitando
ocasionalmente hasta completa disolución. Enfriar a 60 ºC y ajuste el pH de 7,3 ± 0,1.
5.-SOLUCIÓN DE ÁCIDO SULFANÍLICO
FÓRMULA:
Ácido sulfanílico 8,0 g
Ácido acético 5N
(Una parte de ácido acético glacial a 2.5 partes de agua)1,0 L
6.- SOLUCIÓN DE AGUA OXIGENADA 1:10
Preparación:
Preparar momentos antes de usarla. Colocar 1 ml en 9 ml de agua destilada.
147
7.-SOLUCIÓN DE α-NAFTIL AMINA

Fórmula:
Dimetil alfa naftil amina 5,0 g
Ácido acético 5 N 1,0 L
8.- SOLUCIÓN DE ALFA NAFTOL
Fórmula:
Alfa naftol 5g
Etanol 100 ml
9.- REACTIVO DE EHRLICH
Fórmula:
Para-dimetil amino benzaldehído 2 g
Alcohol etílico absoluto 190 ml
Ácido clorhídrico concentrado 40 ml
10.- SOLUCIÓN DE HIDRÓXIDO DE POTASIO AL 40 %
Fórmula:
Hidróxido de potasio 40 g
148
COLORANTES
1.- AZUL DE ALGODÓN LACTOFENOL
Formulación en g/100 ml:
Fenol 20
Ácido láctico 20
Glicerina 40
Agua destilada 20
Azul algodón 0,05
Preparación:
Disolver el fenol en el agua calentando en baño maría. Agregar el ácido láctico, la glicerina y el
colorante. Mezclar perfectamente
2.- CRISTAL VIOLETA
Cristal violeta 2
Agua destilada 80
Etanol al 95% 20
Oxalato de amonio 0,8
Preparación:
Disolver el cristal violeta en 20 ml de etanol al 95%. Posteriormente disolver 0,8 g de oxalato de amonio
en 80 ml de agua. Una vez terminadas las soluciones mezclarlas.
3.- YODO (LUGOL)
Yoduro de potasio 2
Yodo 1
Agua destilada 100
Preparación:
Disolver 2 gramos de yoduro de potasio en agua destilada. Agregar el gramo de yodo metálico y
disolver. Aforar a 100 ml con agua destilada y colocarlo en un frasco ámbar.
4.- ALCOHOL ACETONA
Acetona 50
Alcohol etílico 100
Preparación:
Adicionar lentamente el alcohol etílico a la acetona y mezclar con cuidado. Guardar en frasco
herméticamente cerrado, hasta su uso.
5.-SAFRANINA
Agua destilada 100
Safranina 0,5
Preparación:
Disolver los 0,5 g de safranina en 20 ml de agua destilada. Después aforar a 100 ml con agua destilada.
6.- FUCSINA FENICADA
Formulación:
SOLUCIÓN A
149
Fucsina básica 0,3

Alcohol etílico al 95% 10
Mezclar hasta disolución completa
SOLUCIÓN B
Cristales de fenol 5
Agua destilada 95
Preparación:
Combinar las dos soluciones A y B. Filtrar a través de un papel filtro Whatman No 2. Mantener la
solución en un frasco ámbar, protegida de la luz y filtrar nuevamente si es necesario.
7.- AZUL DE METILENO
Formulación:
Azul de Metileno 1g
Preparación:
Disolver el gramo de azul de metileno en los 100 ml. de agua destilada.
8.-VERDE DE MALAQUITA
Formulación:
Verde de malaquita 10 g
Preparación:
Disolver el colorante en el agua. Filtrar a través de papel filtro Whatman No. 2. Guardar el colorante en
frasco ámbar.
150
ESTÁNDARES NEFELOMÉTRICOS DE McFARLAND
1.- Preparación de estándares: Sulfato de bario

Reactivos:
BaCl2, solución acuosa al 1 %
H2SO4 QP al 1 %
BaCl2, + H2SO4 BaSO4 + 2 HCl
2.- Preparar 10 tubos nuevos con tapa de rosca de igual tamaño, mismos diámetro, limpios y
enjuagados con agua destilada.
3.- Agregar los reactivos a los tubos rotulados de la siguiente manera en las cantidades que se indican a
continuación:
Estándares de sulfato de bario

Tubo número 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
BaCl2, al 1 % (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
H2SO4 al 1% (ml) 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9,0
Densidad aprox. De 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
células (X 108/ml)
Densidad aprox. de 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000
células en millones /ml
4.- Tapar los tubos y rotulas

5.- El precipitado de BaSO4 suspendido corresponde aproximadamente a la densidad de células
homogéneas de E. coli por ml.
Precauciones:
Si el caldo de cultivo es claro, o si presenta coloración.
151
No
BIBLIOGRAFÍA
.
1 Alexopoules, C. J. Introducción a la Micología. Universitaria de Buenos Aires, Argentina. 1966. 480 p.
2 Brock, T.D.; Smith y M.T. Madigan. Biología de los Microorganismos. 8ª. Edición. Prentice- Hall. España. 956 p.
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12 NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental - Salud ambiental - Residuos peligrosos biológico-infecciosos -
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13 NOM-065-SSA1-1993, Bienes y servicios. Que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo.
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oficial de la federación el día 12 de diciembre de 1995.
15 NOM-110-SSA1–1994, Bienes y servicios. Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.
16 NOM-111-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos. Publicada en el diario
oficial de la federación el día 13 de septiembre de 1995.
17 NOM-113-SSA1–1994, Bienes y servicios. Método para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa.
18 NOM-181-SSA1-1998, salud ambiental. Agua para uso y consumo humano. Requisitos sanitarios que deben cumplir las
sustancias germicidas para tratamiento de agua, de tipo doméstico.
19 Prescot, H. K. Microbiología. 4ª. Edición. Mc Graw Hill. 1999.
20 Reglamento de la Ley General de Salud en materia de control sanitario de actividades, establecimientos, ptos y servicios.
21 Schiegel, G. Microbiología General. Edición. Omega. 1997. España. 654 p
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23 Tortora, G. Introducción a la Microbiología. Acribia. 1993. España. 792 p.
24 NOM-210-SSA1-2002. Productos y Servicios. Método de prueba Microbiológicos. Determinación de microorganismos
indicadores. Determinación de microorganismos patógenos y sus toxinas
Recursos digitales
Normas Oficiales Mexicanas.- Secretaria de salud www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nomssa.html
https://www.cmic.org.mx/comisiones/Sectoriales/.../Leyes...Normas.../NOM/nom.htm
Kenyon College, Microbe Wiki
152

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Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS

MANUAL DE LABORATORIO DE TÉCNICAS

PRIMERA EDICIÓN ELABORADO POR:

SEGUNDA EDICIÓN ELABORADA POR:

Agosto del 2019

NOMBRE DEL ALUMNO: ________________________________________________________

PROFESORES DE LABORATORIO: _______________________________________________

PERIODO LECTIVO: ____________________________________________________________

Instrucciones generales ____________________________________________________________________ 4

Práctica No. 1 Microscopia _________________________________________________________________ 11

Práctica No. 2 Preparaciones fijas y en fresco__________________________________________________ 19

Práctica No. 3 Esterilización de material para microbiología________________________________________ 32

Práctica No. 4 Nutrición y cultivo de microorganismos aeróbicos____________________________________ 41

Práctica No. 5 Aislamiento y recuento de microorganismos aerobios_________________________________ 58

Práctica No. 6 Conservación de microorganismos________________________________________________ 65

Práctica No. 7 Crecimiento microbiano________________________________________________________ 75

Práctica No. 8 Producción de ácido láctico_____________________________________________________ 83

Práctica No. 10 Identificación de bacterias aeróbicas_____________________________________________ 95

Práctica No. 11 Identificación de mohos y levaduras _____________________________________________116

Bibliografía _____________________________________________________________________________ 152

II.- ORGANIZACIÓN CON LOS ALUMNOS

Una bata limpia y con botones Una fotografía tamaño infantil

Un rollo de Masking tape Una regla graduada

3.- Por sección

Por sección se deberá traer un candado Una caja de cubreobjetos

III.- DEL HORARIO Y COMPORTAMIENTO DE LOS ALUMNOS.

IV BREVES REGLAS DE SEGURIDAD PARA UN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Color de seguridad Significado

Indicación Contenido de imagen del símbolo Ejemplo

Advertencia de Circunferencia y tres medias lunas

32. Señales que indican ubicación de salidas de emergencia y de instalaciones de primeros

Indicación Contenido del símbolo Ejemplo

Ubicación de una Silueta humana bajo una regadera y flecha

33. Rombo de identificación

I.- Lectura de Normas Oficiales Mexicanas (NOM)

II.- Conocimiento del material básico de laboratorio

III.- Equipo de laboratorio

IV.- Material para la gaveta

El microscopio compuesto está formado por tres sistemas:

El sistema de iluminación corresponde a la fuente de luz y sus aditamentos para iluminar

Función básica de cada parte del microscopio:

a.- Sistema mecánico

Base. Pieza metálica que sostiene a todo el aparato

Estativo. Lugar de donde se debe tomar para trasladar al microscopio

Pinzas. Sirve para sujetar al portaobjetos.

Tornillo macrométrico. Permite el enfoque mayor.

Tornillo micrométrico. Permite el enfoque con precisión.

Tubo del ocular. Sostiene el lente del ocular.

b.- Sistema de iluminación

Diafragma de campo. Está situada en la base del microscopio y su función es la de regular el

1.- El anillo de color superior indica los aumentos (tabla 1)

2.- El lado superior izquierdo indica el número de aumentos

3.- El lado superior derecho la apertura numérica.

4.- El lado inferior la distancia mecánica

5.- El lado inferior derecho el espesor del cubreobjetos

Acepta cubreobjetos desde 0,17 a 0,22 mm de espesor,

10= No requiere cubreobjetos ó

Tabla 1. Correspondencia entre los

El número total de aumentos que se puede lograr en un microscopio se obtiene multiplicando el

3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS

3.1 MATERIAL POR EQUIPO

• Microscopio compuesto • Preparaciones fijas de bacterias