UCLA

3 de Febr er o de 1964

UNIVERSIDAD CENTROCCIDENTAL
“LISANDRO ALVARADO”
DECANATO DE CIENCIAS VETERINARIAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS
ÁREA DE BIOQUÍMICA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

ROFESORES DEL ÁREA:

NELITZA LÍNAREZ
(COORDINADORA)
YAJIDY EL ABED
DAVID COLMENÁREZ
JOSÉ NORIEGA
MIRLENY PÉREZ
KARINA RODRIGUEZ
AUXILIAR DOCENTE:
BETTY ORDUZ
ASIST. LABORATORIO:
GELLYS ÁLVAREZ

ABRIL 2011

1
 ÍNDICE

Pág

INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………….... 3

TRABAJO PRÁCTICO Nº 1: Identificación, uso del Material de Laboratorio y preparación 5

de soluciones…….…….......

TRABAJO PRÁCTICO Nº 2: Identificación de Carbohidratos………………….............. 12

TRABAJO PRÁCTICO Nº 3: Determinación del Índice de Acidez d Saponificación de los

Ácidos Grasos………………………………………………….………………………………… 22

TRABAJO PRÁCTICO Nº 4: Fotocolorimetría………………………….………………….... 28

TRABAJO PRÁCTICO Nº 5: Identificación de Proteínas y Aminoácidos…………................ 34

TRABAJO PRACTICO Nº 6 Determinación del Punto Isoeléctrico de una Proteína 43

TRABAJO PRÁCTICO Nº 7: Determinación de la Actividad de la Enzima Deshidrogenasa
Succínica…………………………………………………………………………………………. 47

TRABAJO PRÁCTICO Nº 8: Aislamiento del Glucógeno Hepático…………………………. 53

TRABAJO PRÁCTICO Nº 9: Hidrólisis Ácida del Glucógeno…………................................ 58

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS y ELECTRÓNICAS…………………………. 62

2
 INTRODUCCIÓN

En este manual de prácticas se presentan unas series de actividades estructuradas

siguiendo un esquema que incluye objetivos, pre-laboratorio, laboratorio y pos-laboratorio. A
través de esta guía de prácticas de Bioquímica se da la oportunidad a los estudiantes de
desarrollar habilidades y destrezas en el trabajo de laboratorio que le permitan:

1- Seguir instrucciones en el trabajo práctico.

2- Seleccionar instrumentos y aparatos apropiados.
3- Manipular aparatos y sustancias químicas en forma segura.
4- Realizar mediciones precisas.
5- Registrar con precisión y claridad los resultados de un experimento.
6- Elaborar conclusiones y generalizaciones a partir de los experimentos.
7- Organizar e interpretar la información adquirida.

DESCRIPCIÓN DEL CURSO

Las prácticas de laboratorio constituyen una parte importante de la asignatura de

Bioquímica y durante el curso de su ejecución se pretende familiarizar a los estudiantes con el
conocimiento y manejo tanto técnico como instrumental de las herramientas básicas de esta
disciplina.
Durante el curso correspondiente a la asignatura se desarrollan 09 prácticas de laboratorio
y a cada trabajo práctico corresponderá una guía básica con los detalles fundamentales del
trabajo a realizar; en el desarrollo de cada práctica habrá un tiempo determinado donde se
discutirá el fundamento teórico y detalles del protocolo de la práctica, para lo cual es necesario
que el estudiante haya adquirido con anterioridad el manual de guías prácticas.
El tiempo correspondiente al Laboratorio será utilizado para el desarrollo de la práctica,
durante el mismo, el estudiante aplicará conocimientos y técnicas específicas de cada práctica.
Con respecto al pos-laboratorio, éste se realizará al finalizar la práctica y el estudiante
dispondrá de 10 minutos para desarrollarlo.

Evaluación de la práctica

Evaluación de Laboratorio:
Durante el tiempo correspondiente al trabajo de laboratorio se evaluarán conocimientos y
destrezas en la aplicación de las técnicas correspondientes a la práctica a través de un
interrogatorio oral, así mismo se evaluaran, puntualidad, responsabilidad y actitud
Valor: 6 Ptos.
Informe de práctica: Cada equipo elaborará durante el tiempo del laboratorio un informe que
debe ser entregado al finalizar la práctica. Valor: 8 Ptos.

Post-laboratorio: se realizará una prueba escrita, con la finalidad de evaluar si el estudiante ha

logrado los objetivos propuestos. Valor: 6 Ptos.
3
NORMAS INTERNAS PARA EL USO Y PERMANENCIA EN EL LABORATORIO DE
BIOQUÍMICA.

- La puntual asistencia a práctica es obligatoria. Se permitirá la entrada al laboratorio por

retardo sólo 10 minutos de la hora prevista.
- La inasistencia del 25% del total de las prácticas conlleva a la pérdida de la
asignatura. (Total de prácticas 9, 25% corresponde a 3 inasistencias a prácticas)
- Es requisito indispensable el uso de la bata de laboratorio blanca, limpia y planchada.
- Uso adecuado de ropa para ingreso al laboratorio (zapatos cerrados y uso de pantalón)
- Es obligatorio traer la guía práctica previamente leída. Se evaluará la responsabilidad del
bachiller.
- Durante la realización de los trabajos prácticos sólo se permitirá salir del laboratorio por
motivos especiales, previa autorización del Profesor.
- Al finalizar la práctica el material debe ser lavado cuidadosamente.
- En caso de ruptura del material, deberá ser comunicado al Profesor quien le señalará
cómo y cuándo reponerlo.
- Queda terminantemente prohibido fumar, comer y el uso de celular dentro del laboratorio.
- Muchas sustancias en el laboratorio son corrosivas y venenosas; por lo tanto no trate de
oler ninguna sustancia o reactivo sin previo conocimiento.
- En caso de producirse cualquier accidente durante la realización del trabajo práctico
(quemaduras, ingestión de sustancias tóxicas, etc.) debe notificarse de inmediato al
Profesor.
- Usar cabello recogido al ingresar al laboratorio y evitar posibles accidentes.

4
 TRABAJO PRÁCTICO N0 1:

IDENTIFICACIÒN, USO DEL MATERIAL DE LABORATORIO Y PREPARACIÒN DE

SOLUCIONES

INTRODUCCIÓN
La Bioquímica es una ciencia que se apoya entre otras en la Química. Esta ciencia requiere
para su estudio y comprensión de algunas determinaciones prácticas para lo cual es necesario el
conocimiento y manejo de materiales e instrumentos de uso común en el Laboratorio. Por esta
razón el primer trabajo práctico de esta asignatura presenta el nombre, uso y clasificación de
algunos materiales que se usan con frecuencia en el Laboratorio de Bioquímica.

1. OBJETIVO GENERAL

. Identificar el material de laboratorio usado frecuentemente en el Laboratorio de Bioquímica.

2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

. Manejar el material de laboratorio para su reconocimiento y uso.

. Adquirir destrezas en el manejo del material de laboratorio
Preparar soluciones de diferentes concentraciones.

3 CONTENIDO:
Durante el desarrollo de esta actividad práctica es necesario que el alumno tenga
conocimiento de algunos términos
3.1: Material de Laboratorio.

-Capacidad: Máxima lectura de medida que puede realizarse con un instrumento de laboratorio.

-Apreciación: Mínima lectura que puede medirse con un instrumento de medida volumétrica.

-Exactitud: Un resultado exacto es aquel que concuerda de cerca con el valor real de una
cantidad medida.

-Precisión: Este término se refiere a la concordancia que tienen entre sí, un grupo de resultados
experimentales con respecto al valor real de la cantidad medida.
El material de Laboratorio de uso común para el manejo de reactivos y soluciones en el
Laboratorio de Bioquímica puede clasificarse de la siguiente manera:

Material de alta precisión y exactitud: Este tipo de material nos permite realizar medidas
volumétricas que requieren de precisión y exactitud alta, por ejemplo; tomar un determinado
volumen de un reactivo para preparar una solución, tomar un volumen preciso y exacto para
diluir a un volumen determinado, determinar el punto final en una valoración (titulación).
Ejemplos de este tipo de material son:
Pipetas Graduadas: Pipetas Graduadas de un aforo y de dos aforos.

5
 Buretas.
Pipetas Volumétricas.
Balones Volumétricos.

- Material de baja precisión y exactitud:

Permiten realizar medidas de volúmenes cuando no es necesario una gran exactitud o
precisión por ejemplo: tomar un volumen de una solución para hacer un análisis cualitativo,
tomar volúmenes mínimos para disolver un sólido. Ejemplo de este tipo de material son entre
otros:

Cilindros Graduados.
Vasos de Precipitado (Beakers).
Matraces de Erlenmeyer (Fiolas)
Goteros.

- Material de uso no cuantitativo: En este tipo de material se incluye todo el material

que nos permite almacenar reactivos o muestras, realizar evaporaciones, calentar líquidos,
trasvasar y filtrar líquidos, etc. Ejemplo de este material:

Frascos para contener reactivos.

Pisetas.
Beakers.
Tubos de ensayo.
Embudos.

Existen otros materiales o equipos de laboratorio de uso común que nos permiten realizar
operaciones específicas tales como:

Balanza Analítica: Son equipos de alta sensibilidad que se usan

para realizar pesadas de sustancias químicas necesarias para preparar
reactivos.

6
Plancha Eléctrica: Aparato de laboratorio
que nos permite calentar líquidos y
soluciones.

Fotocolorímetro: Permite determinar la

concentración de una sustancia de acuerdo a una
lectura específica, la cual está dada por la
intensidad de color de la solución química en
estudio.

Baño de María: Permite calentar líquidos y

soluciones a temperaturas fijas o determinadas.

-Material volumétrico para contener: Cilindro Graduado, Matraz, Vaso de precipitado.

-Material volumétrico para verter: Pipetas Graduadas, Pipetas Volumétricas, Buretas.

La diferencia que existe entre estos dos tipos de instrumentos consiste en que el material
usado para verter, tiene el cero (0) en la parte superior y requiere dos lecturas: una inicial y otra
final.

Volumen vertido = Lectura final - lectura inicial

Apreciación = Lect. Mayor – lect. Menor / N0 de divisiones

La capacidad del material volumétrico se indica generalmente en mililitros (ml).

Cuando se hace la lectura de un volumen dado de un líquido, hay que evitar el error de
paralaje, y considerar el menisco que se forma en la superficie del líquido. Cuando el líquido
moja el tubo, el menisco es cóncavo; si el líquido no moja el tubo el menisco es convexo
(Mercurio).
El nivel del líquido se lee en la parte inferior de la superficie marcada del mismo con la
ayuda de un trozo de papel blanco colocado detrás de dicho menisco.
Los ojos del observador deben estar situados a la misma altura del menisco para realizar
lecturas más exactas. Si éstos están más arriba o más abajo se comete error de paralaje.

7
 TÉCNICAS DE LABORATORIO.

a.- Lavado: Antes de utilizar el material debe ser lavado con agua y
jabón para asegurar que esté libre de residuos.

b.- Curaje del material volumétrico: Todo material volumétrico que

haya sido lavado contiene una capa fina de agua destilada utilizada en el
enjuague. Esta agua presente diluirá la solución que se añada
inmediatamente, introduciendo un margen de error al experimento, ese
error se evita curando el instrumento tomando una pequeña cantidad de la
solución de trabajo, evitando el error mencionado. Este procedimiento
debe hacerse por lo menos dos veces.

c.- Cebaje del material volumétrico (Bureta): Luego del curaje se procede al
llenado de la Bureta con el reactivo a usar y se abre la llave de la misma para
extraer las burbujas que puedan quedar dentro del instrumento, luego se enrasa la
bureta en cero, y así evitar una medición incorrecta.
5.- Medición de volúmenes: Los instrumentos utilizados para medir volúmenes de
líquidos son de dos tipos:

3.2 Preparación de soluciones

Solución:
Las Soluciones son mezclas homogéneas (una sola fase) de dos o más sustancias puras y
diferentes, cuya unión produce sólo un cambio físico y no una reacción química.

Los componentes de una solución son:

-Soluto: sustancia que se disuelve en otra sustancia y que se encuentra en menor cantidad.

-Solvente: sustancia donde se disuelve el soluto y que se encuentra en mayor cantidad. Estos
componentes pueden separarse utilizando procedimientos físicos.

-Mezcla:
Son sustancias heterogéneas (más de una fase) que resultan de la unión de dos o más
sustancias puras y diferentes, cuya unión no produce reacción química sino solamente cambio
físico.

-Solubilidad:
Es la cantidad máxima de soluto que puede ser disuelta por un determinado solvente.
Varía con la Presión y la Temperatura. Es un dato cuantitativo.

8
-Tipos de Soluciones:
- Solución concentrada: aquellas soluciones que poseen prácticamente la totalidad de soluto que
el solvente puede disolver a una Presión y Temperatura dada.

- Solución diluida: aquellas que poseen menor cantidad de soluto que la que el solvente, puede
disolver a una Temperatura y Presión determinada.

- Solución saturada: solución que contiene la máxima cantidad de soluto que el solvente puede
disolver a una determinada Presión y Temperatura. Si se le agrega más soluto no lo disuelve: si es
un sólido en un solvente líquido, el exceso precipita; si es un líquido en solvente líquido, el
exceso queda separado del solvente por encima o por debajo según su densidad relativa; si es un
gas en un solvente líquido, el exceso de soluto escapa en forma de burbujas.

- Solución sobresaturada: es aquella que posee más soluto del que el solvente puede disolver a
una determinada Presión y Temperatura.

-Concentración de una solución:

Cantidad de soluto disuelto en una determinada cantidad de solvente, o cantidad de soluto

disuelto en una determinada cantidad de solución. Siempre indica una proporción entre soluto y
solvente. Los criterios para expresar cuantitativamente una concentración son, principalmente,
masa, volumen y cantidad de materia (moles).

En el análisis químico son de particular importancia las "unidades" o las expresiones de la

concentración, y en particular dos de ellas: la molaridad y la normalidad.

-Expresiones de concentración.

Unidades Físicas:
Porcentaje (%).
.- Porcentaje en masa (m/m): Es la cantidad de gramos de soluto disueltos en 100 gramos de
solución. Se expresa en g/g.

.-Porcentaje en volumen (v/v): Es el volumen en mililitros de soluto disueltos en 100 mililitros

de solución. Se expresa en ml/ml.

.- Porcentaje en masa-volumen (m/v): Es la cantidad de gramos de soluto disueltos en 100

mililitros de solución. Se expresa en g/ml.

Unidades Químicas:
.-Molaridad (M): Es la cantidad de moles de soluto disueltos en un Litro de solución.

M= moles soluto/Litro de solución

9
Ejemplo: 100 ml de solución de Cloruro de Sodio contienen una concentración: NaCl 0,20 molar

.-Modalidad (m): Es la cantidad de moles de soluto disueltos en un Kilogramo de solvente.

m= moles soluto/Kg de solvente

Ejemplo: 100 ml de Hidróxido de Potasio (KOH) contiene una concentración de 0,2 m.

-Normalidad (N): Es la cantidad de Equivalente-gramo de soluto disuelto en un Litro de

solución.
Ejemplo: La concentración de una solución de Ácido Clorhídrico (HCl) es de 12,3 N

N= Eq soluto/Litro de solución

Densidad: masa contenida en una unidad de volumen

D= m
V

En soluciones las unidades para densidad más utilizadas son: g/cc

-

4- PARTE EXPERIMENTAL.
El trabajo de Laboratorio requiere del uso de soluciones, por lo tanto es necesario que en esta
actividad práctica se ejerciten los métodos de preparación de soluciones por pesada y por dilución

Ejercicio Nº 1:
Identifique el siguiente material de laboratorio:

1. ----------------------------------
2. ------------------------------ ---
3. ---------------------------------
4. -----------------------------------
5. -----------------------------------

Ejercicio Nº 2:

Materiales:
Material de Laboratorio:
Balanza, Beaker, Espátula, Matraz aforado de 50 ml y 100 ml, varilla de vidrio, piseta con
agua destilada, pipetas de 10 ml, embudos de vidrio, goteros.

Preparar 50 ml de solución de Cloruro de Sodio (NaCl), al 10 % p/v.

a.- Calcule el número de gramos (g) necesarios para preparar 50 ml de solución de
Cloruro de Sodio (NaCl) al 10% p/v.
b.- Pese la cantidad determinada, empleando un beaker limpio y tarado.
10
 c.- La muestra pesada arrástrela con agua destilada desde el beaker utilizando un embudo
de vidrio, de tal forma que caiga en el matraz aforado de 50 ml.
d.- Añada más agua destilada (agitando para que se disuelva el sólido) hasta llegar a la
línea de aforo.

Ejercicio Nº 3:

Con la solución preparada en el ejercicio anterior realice el siguiente ejercicio:

1. Lavar la Bureta con agua destilada
2. Lurar y cebar la bureta con la solución preparada y enrazarla, utilizando para ello un
embudo de vidrio, luego deje caer el volumen del líquido contenido entre 3ml y 20 ml,
seguidamente recoga el volumen vertido en un cilindro graduado.
Calcule:
Volumen vertido: __________________

Ejercicio Nº 4
Con la pipeta previamente lavada y curada mida de la solución contenida en el cilindro
graduado del ejercicio anterior los siguientes volúmenes y colóquelos en los tubos de ensayos
respectivos

Tubo N° 1: 0,02 ml ¿Indique cuál pipeta usó? __________________________

Tubo N° 2: 1,5 ml ¿Indique cuál pipeta uso? __________________________
Tubo N° 3: 5 ml ¿Indique cuál pipeta uso? __________________________
Tubo N° 4: 8,3 ml ¿Indique cuál pipeta uso? __________________________

Ejercicio Nº 5

Preparar 100 ml de una solución de Ácido Clorhídrico (HCl) 0,1 N a partir de una solución
concentrada de Ácido Clorhídrico (HCl).
Con los siguientes datos calcule el volumen de ácido que se necesita para preparar 100 ml de HCl
0,1N.
Datos:
Nombre del ácido: Ácido Clorhídrico
Densidad de la solución: 1,19 g solución
Concentración: 37%
Peq: 36,5 g soluto

11
 TRABAJO PRÁCTICO Nº 2

IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS

INTRODUCCIÒN

Los carbohidratos constituyen un importante grupo de compuestos ampliamente

distribuidos en la naturaleza. Se encuentran en todos los seres vivos y son un componente
fundamental del sistema ecológico, debido a que las plantas verdes y otros organismos
fotosintéticos utilizan la energía solar para convertir el bióxido de carbono (CO2), en moléculas
de carbohidratos mediante la fotosíntesis, en los animales estos compuestos representan una
fuente importante para la obtención de energía, también pueden asociarse con otros tipos de
biomoléculas y cumplir una función determinada. Los carbohidratos se les denominan también:
glúcidos azúcares, sacáridos, e hidratos de carbono.
Desde el punto de vista de la química orgánica, un glúcido es una cadena hidrocarbonada
polialcohólica que tiene en uno de sus átomos de carbono un grupo carbonilo (C=O) que puede
situarse en el extremo de la cadena (aldehídos), o dentro de ella (cetonas), aunque existen
glúcidos que se forman por modificaciones químicas de los anteriores.

CLASIFICACIÓN DE LOS CARBOHIDRATOS

Los carbohidratos se clasifican de acuerdo a su complejidad molecular en:

1) Monosacáridos: Los monosacáridos son azúcares que contienen 3 a 7 átomos de carbono

y por hidrólisis no dan lugar a azúcares más sencillos. Ej.: Glucosa, Fructosa, Ribosa.

2) Oligosacáridos: Son compuestos formados por la unión de 2 y hasta 10 monosacáridos. Los

más importantes son los formados por 2 monosacáridos y se llaman disacáridos (Lactosa).

12
 Lactosa

3) Polisacáridos: Los polisacáridos están constituidos por más de 10 monosacáridos y pueden

llegar a contener varios miles. Ej.: Almidón, Glucógeno, Celulosa.

Almidón

OBJETIVO GENERAL:

Identificar los carbohidratos presentes en las muestras entregadas por el profesor.

1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

• Ejecutar distintas reacciones químicas que permitan identificar los carbohidratos

presentes en las muestras entregadas.
• Comparar los resultados obtenidos entre las muestras entregadas.
• Identificar las reacciones que permiten diferenciar los distintos grupos carbohidratos.

13
2. REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LOS GLÚCIDOS:

A. Reacción de Molish:

Los glúcidos que contengan 5 o más átomos de carbono, cuando se hacen reaccionar con
ácidos minerales tales como el Ácido Sulfúrico (H2SO4, el Ácido Clorhídrico (HCl) o el Ácido
Nítrico (HNO3) se deshidratan formando furfural o hidroximetilfurfural, los cuales al unirse al α-
Naftol originan compuestos de color violeta.
La reacción de Molish es la prueba más general que se utiliza para el reconocimiento de
los glúcidos libres o asociados a otras moléculas, pero no nos permite identificar a un
carbohidrato determinado. Las pentosas originan furfural y las hexosas hidroximetil-furfural. La
acción del reactivo de Molish sobre los oligo y los polisacáridos produce primero una hidrólisis
de estos compuestos hasta sus monosacáridos correspondientes, que luego originaran los
derivados furfurálicos. La presencia de glúcidos se evidenciará mediante la formación de un
anillo de color violeta en la interfase entre dos líquidos (ácido sulfúrico-solución glucosídica).

B. Reacción de Lugol:

Los polisacáridos tratados con el Lugol originan diferentes compuestos coloreados que
permiten reconocerlos. Al añadir una gota de solución de Lugol al almidón aparecerá un color
azul intenso y con el glucógeno un color rojo caoba. Los mono y disacáridos no reaccionan con el
yodo y el color final corresponde a la coloración propia del reactivo de yodo (Marrón claro ó
amarillo).
La reacción del Lugol nos permite conocer que la solución glucosídica en estudio es un
polisacarido o si se trata de un mono o un disacárido.

C. Reacción de Benedict:

Los glúcidos debido a la presencia en su estructura de grupos aldehídicos y cetónicos

libres o potencialmente libres, en un medio alcalino y en caliente forman un compuesto
intermediario llamado enodioles los cuales son capaces de reducir el Hidróxido de Cobre a Óxido
Cuproso, que es un precipitado que varía de color desde el amarillo hasta el rojo ladrillo, de
acuerdo a la concentración de glúcidos y al tiempo de calentamiento. El reactivo de Benedict se
utiliza para evidenciar la presencia de grupos reductores en los glúcidos (azucares reductores).
Son azúcares reductores todos los monosacáridos y disacáridos (excepto la sacarosa y la trealosa
véase la estructura de la sacarosa en la figura), los polisacáridos son todos azúcares no reductores,
el reactivo de Benedict es particularmente útil en el laboratorio clínico para poner en evidencia la
presencia de glucosa en la orina. El Sulfato de Cobre, Citrato de Sodio, Carbonato Sódico en
solución acuosa, son los componentes del reactivo de Benedict.

14
Estructura de la sacarosa: observe que los carbonos anoméricos están ocupados en el enlace.

El Carbonato de Sodio (NaC03) reacciona con el agua para formar Hidróxido de Sodio, el
Sulfato de Cobre actúa sobre parte del Hidróxido de Sodio originando Hidróxido Cúprico, el
Citrato de Sodio evita que el Hidróxido Cúprico formado precipite y pueda mantenerse en
solución, al calentar, el resto del Hidróxido de Sodio actúa convirtiendo los glúcidos con grupos
aldehidos ó cetónicos libres en enedioles que reducen los iones Cu++ del Hidróxido Cúprico en
iones Cu+ el cual se une al Oxígeno para formar Óxido Cuproso (Cu2O insoluble) el cual
precipita generando una coloración rojo ladrillo.

NaC03 + H2O 2 NaOH + CO2

2 NAOH + CuSO4 Na2SO4

2 Cu(OH)2 + H –C=O COOH + H20 + Cu2O

| | Precipitado
H–C–OH H–C–OH rojo
| |
OH–C–H OH–C–H
| |
H–C–OH H–C–OH
| |
H –C–OH H –C–OH
| |
CH2OH CH2OH

D. Reacción de Barfoed.

Diferenciación de monosacáridos y disacáridos:

Los glúcidos debido a la presencia de grupos aldehídos o cetónicos libres, son capaces en
presencia de ácidos diluidos y en caliente de reducir el Acetato de Cobre a Óxido Cuproso que es
15
un precipitado de color rojo. Mediante esta reacción podemos diferenciar monosacáridos de
disacáridos.
Los monosacáridos reducen rápidamente al reactivo debido a que su grupo reductor se
encuentra libre o potencialmente libre, los disacáridos darán la reacción después que hayan sido
hidrolizados en los monosacáridos respectivos debido al medio ácido débil del reactivo, por lo
tanto el precipitado de color rojo en los disacáridos tarda más tiempo en aparecer.

E. Reacción de Bial:

Reconocimiento de las Pentosas:

Cuando se hacen reaccionar las pentosas con ácidos minerales y en caliente se

deshidratan formando furfural, el cual se condensa con el orcinol, el producto formado en esta
reacción, al agregar sal férrica originará un compuesto químico llamado Di-orcinol-furfural-
metano de color verde botella, poniendo en evidencia la presencia de pentosas.

F. Reacción de Selliwanoff

Reconocimiento de las Cetosas:

Las cetosas que posean más de cinco carbonos en su estructura, al ser tratadas con ácidos
minerales en caliente se deshidratan formando furfurales, los cuales se condensan con la
resorcina (Reactivo de Selliwanoff) originando compuestos de color rosado salmón. Por
calentamiento prolongado, otros azúcares pueden dar una reacción positiva, esta reacción permite
identificar cetosas cuando la reacción es positiva en los primeros 30 segundos de ebullición.

3. MATERIAL REQUERIDO:

• Solución de distintos Carbohidratos

• Reactivo de Molish
• H2SO4 Concentrado
• Lugol
• Reactivo de Benedict
• Reactivo de Barfoed
• Reactivo de Bial
• N-Butanol
• Reactivo de Selliwanoff
• Agua destilada
• Tubos de ensayo
• Gradillas
• Baño de María

16
4. PARTE EXPERIMENTAL:

La actividad práctica consiste en realizar una serie de reacciones químicas que permiten
reconocer los diferentes tipos de carbohidratos. El alumno podrá identificar las muestras
problema que se le asignarán y debe interpretar el fundamento de cada una de las reacciones
utilizadas.

EXPERIMENTO Nº 1: REACCION DE MOLISH

Tome 3 tubos correspondientes a las muestras problemas que tiene en su gradilla, rotúlelos y
proceda:

Tubos
1 2 3
Muestras
Muestra ____
2 ml -- --
Muestra ____
-- 2 ml --
Muestra ____
-- -- 2 ml
REACTIVO DE
3 gotas 3 gotas 3 gotas
MOLISH
H2SO4
2 ml. 2 ml. 2 ml.
CONCENTRADO

Para agregar el “Ácido Sulfúrico concentrado” se debe tomar el tubo por la parte
superior, inclinarlo y añadirlo lentamente por las paredes del tubo.
Nota: CUIDADO, el Ácido Sulfúrico concentrado es “altamente corrosivo y produce
quemaduras”. Observe y anote sus resultados.

RESULTADOS:________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

EXPERIMENTO Nº 2 REACCION DE LUGOL

Tome 3 tubos correspondientes a las muestras problemas que tiene en su gradilla, rotúlelos y
proceda:

17
 Tubos
1 2 3
Muestras
Muestra ____
0,5ml -- --
Muestra ____
-- 0,5 ml --
Muestra ____
-- -- 0,5 ml
H2O
2 ml 2 ml 2 ml
Lugol
3 gotas 3 gotas 3 gotas

RESULTADOS_________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

EXPERIMENTO Nº 3: REACCION DE BENEDITC

Tome tanto tubos de ensayo como muestras desconocidas tenga “sin identificar”,
rotúlelos y proceda:

Tubos
1 2 3
Muestras
Muestra ____
0,5ml -- --
Muestra ____
-- 0,5 ml --
Muestra ____
-- -- 0,5 ml
Reactivo de
2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml
Benedict

Calentar simultáneamente en agua hirviente por 5 minutos. Observar.

RESULTADOS:________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

18
EXPERIMENTO Nº 4 REACCION DE BARFOEED.
Tome tanto tubos de ensayo como muestras desconocidas tenga “sin identificar”,
rotúlelos y proceda:

Tubos
1 2 3
Muestras
Muestra ____
0,5ml -- --
Muestra ____
-- 0,5 ml --
Muestra ____
-- -- 0,5 ml
Reactivo de
4 ml 4 ml 4 ml
Barfoed

Calentar simultáneamente en agua hirviente. Observar.

Anote el tiempo de reacción de cada tubo.

RESULTADOS:________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

EXPERIMENTO Nº 5: REACCIÓN DE BIAL

Tome tanto tubos de ensayo como muestras desconocidas tenga “sin identificar”, rotúlelos y
proceda:

Tubos
1 2 3
Muestras
Muestra ____
0,5ml -- --
Muestra ____
-- 0,5 ml --
Muestra ____
-- -- 0,5 ml
Reactivo de Bial
1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml
Agregar 3 gotas de Cloruro Férrico al 10% a todos
los tubos. Calentar en Baño de María hasta que
aparezcan las primeras burbujas, luego añadir:
Agua destilada
5 ml 5 ml 5 ml
N-Butanol
2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml

19
RESULTADOS:________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

EXPERIMENTO 6: REACCIÓN DE SELLIWANOFF

Tome tanto tubos de ensayo como muestras desconocidas tenga “sin identificar”,
rotúlelos y proceda:

Tubos
1 2
Muestras
Muestra ____
3 gotas --
Muestra ____
-- 3 gotas
Reactivo de
3 ml 3 ml
Selliwanoff
Calentar en agua hirviendo 1 minuto.

RESULTADOS:________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

RESUMA LOS RESULTADOS: Coloque el número de tubo e indique si el ensayo fue positivo
o negativo para cada tubo.

TUBO MOLISH LUGOL BENEDICT BARFOED BIAL SELLIWANOFF

ANOTE SUS CONCLUSIONES:

______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

20
RESPONDA LAS SIGUIENTES PREGUNTAS:

1. ¿Por qué la Sacarosa es un azúcar NO reductor?

2. ¿Cómo se observa el resultado de la prueba de Lugol en el almidón?

3. ¿Por qué la prueba de Molish no se usa para identificar un carbohidrato determinado?

21
 TRABAJO PRÁCTICO Nº 3

DETERMINACIÓN DEL INDICE DE ACIDEZ Y

DE SAPONIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS

Generalidades de los Ácidos Grasos:

Los ácidos grasos son ácidos carboxílicos en su mayoría de cadena larga, suelen tener
número par de carbonos (14 a 22), los más abundantes tienen 16 y 18 carbonos. Se llaman
saturados cuando no poseen enlaces dobles, estos son flexibles y sólidos a temperatura ambiente.
Los Insaturados o poli-insaturados son los que presentan en su cadena hidrocarbonada dobles o
triples enlaces, rígidos a nivel del doble enlace siendo líquidos aceitosos.

Su fórmula general es: R-COOH (R-COO-) para ácidos grasos libres a pH fisiológico),
donde R es usualmente una cadena hidrocarbonada lineal (no ramificada) con un número impar
de átomos de carbono.

Los mamíferos son capaces de sintetizar la mayor parte de los ácidos grasos en sus células
y almacenarlos para sus reservas de energía (tejido adiposo), pero se ha descubierto que los
ácidos linoleico, linolénico y araquidónico no son susceptibles de sintetizarse en las células
animales, por lo que se consideran como "ácidos esenciales", y deben ser suministrados en la
dieta.

1.- INDICE DE ACIDEZ DE LOS ÁCIDOS GRASOS:

El índice de acidez se define como el número de miligramos de Hidróxido de Potasio

(KOH) necesarios para neutralizar los ácidos grasos libres de 1 gramo de sustancia grasa. Su
valor indica la proporción de ácidos grasos libres presentes en un lípido y por lo tanto constituye
una información valiosa para determinar el grado de enranciamiento de las grasas.
Los ácidos grasos son susceptibles a ser atacados por radicales, enzimas bacterianas que
afectan su cadena carbonada, rompiéndola y formando aldehídos, cetonas los cuales le otorgan un
22
carácter ácido a la grasa. Este proceso se conoce como rancidez y altera significativamente la
propiedad nutricional de las grasas.

1.1 OBJETIVO GENERAL:

Determinar el índice de acidez de una muestra de grasa.

1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

1. Titular una muestra de grasas (aceite) desconocida utilizando KOH
2. Determinar el punto de neutralidad de la titulación
3. Utilizando la fórmula de índice de acidez, calcule el índice de acidez de la muestra
desconocida

1.3 Material necesario:

• Fiolas de 250 ml.

• Pipetas de 2 ml.
• Baño de María.
• Bureta.

1.4 Reactivos:

• Hidróxido de Potasio (KOH) 0,1 N.

• Etanol
• Solución indicadora de Fenolftaleína al 1 %.
• Lípido desconocido y aceite neutro.

1.5 PARTE EXPERIMENTAL:

Procedimiento: Tome tres fiolas y márquelas A, B y C. A cada una de las fiolas agregue lo que
se indica en el cuadro:

Fiolas A B (blanco) C
Lípido desconocido 1 gramo (1 ml)
Aceite neutro 1 gramo (1 ml)
H2 O 1 ml
Etanol 12.5 ml 12.5 ml 12.5 ml

Caliente cada fiola durante 7 minutos en baño María a 60 ºC. Agregue 2 gotas de fenolftaleína, a
continuación utilizando la bureta titule en caliente con la solución de KOH 0,1 N.

23
1.6 Cálculos: Calcule el índice de acidez para el lípido de cada fiola, utilizando las siguientes
fórmulas:

Índice de acidez de la fiola A (A-B) x 0.056 x 100

P

Índice de acidez de la fiola C (C-B) x 0.056 x 100

P

En donde:

A = Nº de ml de KOH 0,1N gastados en la fiola A.

B = Nº de ml de KOH 0,1N gastados en la fiola B.
C = Nº de ml de KOH 0,1N gastados en la fiola C.
P = Peso de la muestra.

Explique la diferencia entre el índice de acidez del lípido desconocido y del aceite neutro:

24
2.- ÍNDICE DE SAPONIFICACIÓN DE LOS ÁCIDOS GRASOS

La saponificación es una reacción química entre un ácido graso (o un lípido

saponificable, portador de residuos de ácidos grasos) y una base o álcali, en la que se obtiene la
sal de dicho ácido y la base.
En la saponificación ocurre una hidrólisis alcalina de los esteres glicéricos de los ácidos
grasos presentes en una sustancia grasa con la consecuente formación de jabón (sal). En esta
práctica se cumple, mediante la acción en caliente del KOH o NaOH alcohólico
aproximadamente 0,5 N, en cantidad suficiente como para lograr la saponificación completa. El
exceso de álcali no combinado se determina por acidimetría en presencia de un indicador
adecuado. Simultáneamente se realiza un blanco para los efectos de cálculos.

Se denomina Índice de Saponificación al número de miligramos de Hidróxido de

Potasio (KOH) necesarios para saponificar completamente 1 gramo de grasa.

2.1. OBJETIVO GENERAL:

Determinar el Índice de Saponificación de una grasa (aceite).

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

1. Someter al proceso de saponificación una muestra de grasa.
2. Titular con Ácido Clorhídrico (HCl) 0,5N la cantidad de KOH que quedó libre luego del
proceso de saponificación.
3. Determinar el índice de saponificación de la muestra de grasa utilizando la fórmula.

2.3. Materiales y Reactivos:

• Fiolas de 250 ml.

• Pipetas de 2 ml.
• Baño de María.
• Bureta.
• Tapón de reflujo.
• Solución alcohólica de KOH 0,5 N.

25
 • Solución de HCl 0,5 N.
• Solución indicadora de Fenolftaleína al 1 %.
• Muestra de grasa.

2.4 PARTE EXPERIMENTAL:

Procedimiento: Tome dos fiolas y márquelas A y B. Agrega a cada una lo se indica en el cuadro:

Fiolas A B (blanco)
Muestra de grasa 1 gramo (1 ml)

H2 O
1 gramo (1ml)
Solución alcohólica 10 ml 10 ml
de KOH 0,5 N.

Caliente ambas fiolas durante 15 minutos en baño María a 60 ºC utilizando el tapón de reflujo.
Deje enfriar. Agregue 2 gotas de Fenolftaleína, a continuación utilizando la bureta titule con la
solución de HCl 0,5 N hasta la decoloración.

Cálculos: Calcule el índice de saponificación de la muestra de grasa utilizando la siguiente

fórmula:

Índice de Saponificación (N-N´) x 28

P

En donde:

N = Número de ml de solución de HCl 0,5 N gastados en la titulación del blanco.

N´= Número de ml de solución de HCl 0,5 N gastados en la titulación de la muestra.

P = Peso de la muestra.

ANOTE SUS RESULTADOS:

______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

26
3. RESPONDA LAS SIGUIENTES PREGUNTAS

¿Por qué se enrancian (oxidan) las grasas?

¿Qué utilidad tiene la determinación del índice de acidez de una grasa?

¿A qué nivel del ácido graso ocurre la reacción de saponificación?

¿Qué importancia tiene la reacción de saponificación de los ácidos grasos a nivel biológico y a
nivel industrial?

27
 TRABAJO PRÁCTICO Nº 4
FOTOCOLORIMETRÍA

Introducción
Muchas sustancias al reaccionar con compuestos químicos adecuados originan productos
coloreados, cuya intensidad depende de la concentración de la sustancia. Este hecho nos permite
medir la luz que absorbe una solución coloreada, cuando un haz de luz la atraviesa, lo cual es una
forma indirecta aunque bastante exacta, de obtener la concentración de una sustancia
determinada. Este método se denomina Fotocolorimetría y para ello nos valemos de ciertos
instrumentos como son los fotocolorímetros y los espectrofotómetros, los cuales nos permiten
determinar la concentración de una sustancia en estudio, de acuerdo a una lectura específica. La
diferencia entre ambos instrumentos está principalmente en su sistema óptico.

1. Fundamento teórico

Cuando un haz de luz incide sobre un material este puede ser absorbido total o parcialmente,
también cierta cantidad puede ser reflejado, transmitido o dispersado. Cada uno de estos efectos
es causado por la interacción del haz de luz con los átomos y las moléculas del material; el efecto
óptico que predomina depende de la naturaleza del material y de la longitud de onda de luz
incidente. La energía radiante absorbida se transforma en energía interna dentro del material y
esta propiedad es aprovechada para calcular su concentración.

. El grado de absorbancia de una sustancia depende de la longitud de onda de luz incidente.

Una sustancia incolora, tal como los cristales de cuarzo, absorbe la luz uniformemente a través
del rango de longitudes de onda visibles. Mientras que una sustancia coloreada, absorbe sólo una
parte del rango de longitudes de onda visibles.

La absorción de la luz que pasa a través de una solución varía linealmente con la distancia
recorrida y con la concentración del medio absorbente. Esto se conoce como la ley de Beer o ley
de Lambert -Beer y es utilizado por los químicos y los físicos para determinar la concentración de
un componente de una solución. La ley de Beer establece que la concentración de una
sustancia es directamente proporcional a la cantidad de energía radiante absorbida. A una
longitud de onda determinada la absorción de luz de una solución de concentración desconocida
se compara con la absorción correspondiente de un conjunto de soluciones del mismo
componente pero de concentraciones conocidas llamadas patrones o solución standard.

Usando la ley de Beer, la concentración desconocida puede ser calculada, siempre y

cuando, se cumplan las siguientes condiciones:

La energía radiante debe ser monocromática (es decir, con una sola longitud de onda).

El medio debe ser homogéneo e isótropo (su índice de refracción es idéntico en todas
direcciones).

La absorción del solvente es despreciable.

No debe haber asociación ni disociación de las moléculas absorbentes.

No debe haber reacción entre el absorbente y las moléculas del solvente.

28
 Esta ley es válida solo dentro de unos límites estrechos, sin embargo, existen desviaciones
que se pueden deber a causas instrumentales y químicas, entre las causas químicas tenemos:

Interacción del material absorbente entre si

Interacción del material absorbente con el solvente.

Interacción del material absorbente con cualquier sustancia extraña que pueda haber
en solución.

Cambio del índice de refracción con la concentración.

Desplazamiento de posibles equilibrios que afecte a determinados absorbentes.

Para las determinaciones fotocolorimétricas es necesario la utilización de un colorímetro o

un espectrofotómetro. El colorímetro es un instrumento que compara, define, o mide color y su
intensidad. El colorímetro fotoeléctrico mide la luz convirtiendo su energía en electricidad con el
uso de una célula fotoeléctrica. Los colorímetros también se utilizan en química para medir el
color y la intensidad exacta de una solución química e identificar y cuantificar sus componentes.
El espectrofotómetro es un instrumento que mide intensidad de luz, son ampliamente utilizados
en laboratorios analíticos para identificar y cuantificar sustancias en una solución. La diferencia
entre ambos instrumentos esta en el sistema óptico. Rutinariamente, una sustancia es analizada
dirigiendo un haz de luz monocromática (de una sola longitud de onda) a través de la muestra, la
longitud de onda se selecciona para que un solo soluto la absorba fuertemente pero que no sea
absorbida por los otros componentes de la solución. La concentración del soluto es calculada
comparando la cantidad de luz absorbida por él y la absorbida por una solución estándar.
En fotocolorimetría se utilizan una serie de términos que es necesario conocer:

a) Absorbancia: definida como 2- log%T y es directamente proporcional a la concentración de

las especies absorbentes si se cumple la ley de Beer.
b) Blanco: es una solución que contiene todos los componentes utilizados en la determinación
incluyendo solutos y solventes excepto el compuesto a ser medido.
c) Curva de calibración: es un gráfico de la concentración de los patrones vs. sus
correspondientes absorbancias utilizado para calcular la concentración de una muestra
desconocida.
d) Patrón: también llamado estándar es una solución de concentración conocida.
e) Muestra: es una solución de concentración desconocida.
f) Tramitancia: es la proporción de la luz incidente que es trasmitida y generalmente se expresa
en porcentaje (%T).

29
 COMPONENTES INTERNOS DEL FOTOCOLORÍMETRO

Antes del trabajo práctico se recomienda que el estudiante revise los siguientes conceptos:
- Espectro Electromagnético
- Ondas Electromagnéticas
- Luz visible
- Longitud de Onda
- Monocromador
- Solución Patrón
- Solución Blanco
- Solución Problema

2. OBJETIVO GENERAL DE LA PRÁCTICA:

• Realizar la técnica de Fotocolorimetría para determinación de glucosa en una
muestra sérica.

3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
• Ejecutar la técnica para la determinación enzimática de glucosa sérica usando
patrones de concentración conocida y la muestra problema.
• Realizar la curva de calibración con los patrones correspondientes.
• Calcular la concentración de la muestra desconocida utilizando la curva de
calibración y el método del factor.

4. DETERMINACIÓN DE GLUCOSA EN SANGRE( Método enzimático AA)

Fundamento del método:

30
El esquema de la reacción que permite la determinación de Glucosa en una solución es el
siguiente:

Glucosa + 02 + H20 GOD ácido glucónico + H202

2 H202 + 4-AF + 4-hidroxibenzoato POD quinonimina roja

La Quinonimina roja es la sustancia coloreada que detecta el aparato y nos permite medir
indirectamente la concentración de Glucosa en l solución

5. Materiales:
• Fotocolorímetro
• Reactivo comercial para la determinación de glucosa (Reactivos provistos)
• Agua destilada
• Tubos Klett
• Baño de María

Reactivos provistos:
• Patrones de solución de glucosa de concentración 50, 100 y 150 mg/dl.
• Solución de trabajo: Enzimas glucosa oxidasa (GOD), peroxidasa (POD)
• Sustratos 4-aminofenazona y 4-hidroxibenzoato en buffer fosfato pH 7.0.

Muestra:
• Suero, plasma o líquido cefaloraquídeo.

Material que debe traer el alumno:

• Papel milimetrado
• Regla
• Calculadora

PARTE EXPERIMENTAL
Procedimiento:
Marcar 5 tubos: Blanco, Patrón 1, Patrón 2, Patrón 3 y muestra y agregar las soluciones
como lo indica la tabla.

Nota: Para que la técnica tenga validez y confiabilidad todos los tubos deben ser tratados de
igual manera

Tubo Blanco Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 muestra

H20 0,02 ml
Patrón 50 mg/dl 0,02 ml
Patrón 100 mg/dl 0,02 ml
Patrón 150 mg/dl 0,02 ml
muestra 0,02 ml
Solución de trabajo 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml
31
 Incubar 25 minutos a temperatura ambiente (15-25 °C). Luego leer en fotocolorímetro a 530
nm o filtro verde (490-530 nm) ajustando el aparato a cero con el blanco.

6. Elaboración de la curva de calibración:

Represente gráficamente en papel milimetrado, la función absorbancia/concentración.
Tómese en el eje de las abscisas los valores de 0 a 150 mg/dl de glucosa y en las ordenadas los
valores de absorbancia. Marque los puntos correspondientes a las distintas lecturas de
absorbancias, frente a los correspondientes valores de concentración. Únanse los puntos
marcados y se obtendrá una línea recta que parte de cero.

7. Cálculo de concentración de la muestra:

1.- Método utilizando la curva de calibración:
Ubique en el eje de las ordenadas el valor de la absorbancia obtenido para la muestra,
trace una línea punteada horizontal hasta que toque la línea recta, luego desde ese punto trace una
línea punteada vertical hasta el eje de las abscisas y este punto corresponde a la concentración de
glucosa de la muestra.

2.- Método utilizando factor de calibración:

Para el cálculo del factor de calibración se divide la concentración del patrón entre la
absorbancia correspondiente ejemplo:

Concentración patrón 2
F=
Absorbancia patrón 2

Concentración de glucosa en mg/dl de la muestra = (Absorbancia muestra) x (F).

8. Equipos utilizados:

Fotocolorímetro digital Chemtrix tipo 24.

Este equipo esta provisto de:

Un selector de filtros para 350, 420, 460, 490, 530, 570, 610 y 660 nm.

Botón 1 para ajustar la absorbancia o la tramitancia.

Botón 2 para seleccionar el tipo de lectura, sea absorbancia, tramitancia o concentración.

Botón 3 para ajustar el valor de un patrón cuando se lee en concentración.

Botón de encendido en la parte posterior.

Un orificio donde se coloca la celda.

Pantalla digital.
Procedimiento de lectura de absorbancia en el Chemtrix:
a) Encender el equipo 10 minutos antes de efectuar la lectura.
b) Seleccionar el filtro
c) Seleccionar con el botón 2 la letra A.
d) Introducir la celda con el blanco.
e) Ajustar a cero con el botón 1.
32
f) Leer el resto de los tubos.

9. Elabore la curva de calibración y calcule la concentración de la muestra por el método de la

curva y por el método del factor.

RESPONDA:

1. ¿Por qué podemos calcular la concentración de una sustancia utilizando energía radiante
(Luz)?

2. ¿Cuál es la utilidad de la solución Patrón?

3. ¿Por qué debemos usar una solución Blanco?

33
 TRABAJO PRÁCTICO Nº 5

IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS

Las proteínas son biomoléculas formadas por la unión de aminoácidos a través de un enlace
peptídico. Debido a esta estructura peptídica y la presencia de determinados grupos, las proteínas
pueden reaccionar con una gran variedad de agentes originándose productos coloreados. Muchas
de estas reacciones de coloración son de gran importancia para la determinación cualitativa y
cuantitativa de las proteínas. No obstante, por presentarse variaciones, en cuanto a la
composición de los aminoácidos de las distintas proteínas, es lógico esperar diferentes
coloraciones y grados de intensidad para una misma reacción, lo cual va a estar íntimamente
relacionado a la naturaleza de la proteína analizada.

Los grupos R de los aminoácidos son diversos, por lo que pueden reaccionar de varias
maneras. Así, aminoácidos como al ácido aspártico y el ácido glutámico poseen un segundo ácido
carboxílico, la lisina, posee un segundo grupo amino. Además, otros aminoácidos con grupos
laterales reactivos son: la cisteína (-SH), la arginina (guanidio), la histidina (imidazol), la serina,
la treonina y la tirosina (alcoholes), la asparagina y la glutamina (amidas), la metionina (un
tioéter) y el triptófano (indol).

Las proteínas son las biomoléculas más abundantes de la materia viva. Sus propiedades
físico-químicas pueden diferir drásticamente, y así la queratina del pelo se parece poco a una
proteína plasmática o a la insulina. Sin embargo, todas tienen en común su composición, basada
en α-aminoácidos unidos por enlaces peptídicos dando lugar a cadenas lineales.

Para que las proteínas cumplan su función biológica tiene que adoptar una estructura espacial
determinada, denominada configuración nativa. La pérdida de esta estructura tridimensional
conlleva la perdida de su actividad biológica, y el proceso se denomina desnaturalización. Las
propiedades físico-químicas cambian drásticamente, y en el caso de las proteínas globulares
solubles, generalmente se produce una insolubilización. Agentes desnaturalizantes típicos son el
calor, valores extremos de pH, disolventes orgánicos.

34
Niveles estructurales de las proteínas:

35
Nivel de organización Enlaces que lo mantienen
Primario Enlace peptídico.
Secundario Puentes de hidrógeno entre los elementos del enlace peptídico.
Terciario Puentes de hidrógeno entre las cadenas laterales de los aminoácidos, interacción
hidrofóbica, interacción electrostática, puentes disulfuro, enlace éster.
Cuaternario Los mismos que para el nivel terciario más las fuerzas de Van der Walls

1. OBJETIVO GENERAL:
Identificar los aminoácidos y las proteínas presentes en las muestras desconocidas.

2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

• Ejecutar distintas reacciones químicas que permitan identificar los aminoácidos o las

proteínas presentes en las muestras entregadas.

• Identificar al aminoácido y a la proteína presente en la muestra desconocida.

• Realizar un cuadro resumen en donde identifique las muestras según reacciones

ejecutadas.

1. REACCIÓN DE NINHIDRINA

Tiene como objetivo detectar y cuantificar cantidades de aminoácidos libres. Los

aminoácidos, en general reaccionan con la ninhidrina (hidrato de hicelohidrandeno) cuando son
calentados con un exceso de la misma. Todos los aminoácidos que poseen un grupo amino libre
reaccionan y forman Dióxido de Carbono, Amoníaco y un Aldehído que contiene un átomo de
carbono menos que el compuesto original. Esta reacción da lugar a la formación de un producto
color azul o púrpura (que posteriormente puede ser utilizado para cuantificar el aminoácido). En
el caso de la prolina, que estructuralmente no posee el grupo amino libre, sino un grupo imino, la
coloración final es amarilla.

Producto Coloreado:

36
2. REACCIÓN DE BIURET

La producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos, ya que se debe a la
presencia del enlace peptídico (-CO-NH-) que se destruye al liberarse los aminoácidos.
Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali concentrado, se forma una sustancia
compleja denominada Biuret, de fórmula:

El resultado positivo para proteínas es una coloración violeta producto de la formación de

dicha sustancia.

3. REACCIÓN XANTOPROTEICA

Es debida a la formación de un compuesto aromático nitrado de color amarillo, cuando las

proteínas son tratadas con Ácido Nítrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas
proteínas con aminoácidos portadores de grupos bencénicos, especialmente en presencia de
tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali vira a un color anaranjado
oscuro.

4. PRUEBA DE COAGULACIÓN: Positiva para Albúmina, globulinas, glutulinas y

prolaminas.

5. PRUEBA DEL SULFATO DE AMONIO: Las proteínas, como otros coloides emulsoides
son precipitadas por soluciones concentradas de sales (NaCl, (NH4)2SO4 y NaSO4) en estos casos
la precipitación se debe a deshidratación y neutralización de la moléculas, lo cuál trae como
consecuencia la agregación de las moléculas y su precipitación.

6. REACCIÓN DE MILLON

Los compuestos mercúricos en medio fuertemente nítrico (reactivo de Millón) se

condensan con el grupo fenólico del aminoácido tirosina, formando complejos de color rojizo.

7. REACCIÓN DE ARGININA (SAKAGUCHI)

El grupo guanidino del aminoácido Arginina se condensa con el alfa-naftol del reactivo,
y luego forma un complejo coloreado con el hipoclorito de sodio. La reacción da un precipitado
rojo ladrillo.

8. REACCIÓN DE LA CISTEINA (GRUPOS SH)

Esta reacción dará positiva con aquellos aminoácidos que presenten azufre en su
estructura, como son la Cisteina y la metionina. La reacción consiste en someter la muestra a una
hidrólisis alcalina con Hidróxido de Sodio.

37
 R-SH + 2 NaOH - R-OH + SNa2 + H2O

De esta manera el sulfuro de sodio se encuentra libre para reaccionar con el acetato de plomo

SNa2 + (CH3-COO)2 Pb - 2 CH3-COONa + SPb (precipitado)

Al contacto con el acetato de plomo se forma una precipitación lechosa al agregar hidróxido de
sodio la precipitación formada desaparece. Al contacto del baño Maria la coloración cambia a
pardo.

3. PRUEBAS CUALITATIVAS PARA IDENTIFICAR PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS

PARTE EXPERIMENTAL:

1.- PRUEBA DE LA NINHIDRINA:

Tome 3 tubos de ensayo, identifíquelos y coloque en cada uno de ellos:

a) Sustancia problema............................................ 0,5 ml

b) Reactivo de Ninhidrina...................................... 0,5 ml
c) Calentar hasta ebullición 1 o 2 minutos
d) Dejar enfriar y observar.
e) Anote los resultados:

Tubo ____: ______________________________________________________

Tubo ____: ______________________________________________________

Tubo ____: ______________________________________________________

2.- PRUEBA DE BIURET:

Tome tantos tubos de ensayos como muestras problemas tenga “sin identificar” y coloque:

a) Sustancia problema............................................ 0,5 ml

b) NaOH al 10%.................................................... 0,5 ml
c) Mezclar e ir añadiendo gota a gota CuSO4 al 0.5% agitando después de cada adición,
hasta la aparición del color violeta, azul o amarillo; siendo el color violeta el que
indica la reacción positiva.

38
 Tubo ____: ______________________________________________________

Tubo ____: ______________________________________________________

Tubo ____: ______________________________________________________

3.- PRUEBA DE COAGULACIÓN:

Tome tantos tubos de ensayos como muestras problemas tenga “sin identificar” y coloque:

a) Sustancia problema............................................ 1,0 ml

b) Ácido Acético al 30%........................................ 2 gotas
c) Solución saturada de NaCl................................. 0,5 ml
d) Mezclar bien y calentar en Baño de María durante 1 minuto. En caso de Albúmina o
globulina se presenta un enturbiamiento más o menos intenso que persiste al
enfriamiento, o pequeños coágulos por las paredes del tubo. Se recomienda observar
el tubo sobre un fondo oscuro.
e) Anote los resultados:

Tubo ____: ______________________________________________________

Tubo ____: ______________________________________________________

4.- PRUEBA DE SULFATO DE AMONIO:

Tome tantos tubos de ensayos como muestras problemas tenga “sin identificar” y coloque:

a) Sustancia problema.......................................... 0,5 ml

b) Sulfato de Amonio al 50%...............................0,5 ml
c) Mezclar bien
d) Dejar en reposo durante 10 minutos, ver si se forma precipitado en alguno de los tubos,
indicando la positividad de la reacción que depende directamente de la concentración de
globulina presente en la muestra.
e) Anote los resultados:

Tubo ____: ______________________________________________________

Tubo ____: ______________________________________________________

39
5.- PRUEBA XANTOPROTEICA:
Tome tantos tubos de ensayos como muestras problemas tenga “sin identificar” y coloque:

a) Sustancia problema.......................................... 1,0 ml

b) Ácido Nítrico Concentrado............................. 0,5 ml
c) Mezclar bien
b) Calentar suavemente y observar.
c) Anote los resultados:

Tubo ____: ______________________________________________________

Tubo ____: ______________________________________________________

Tubo ____: ______________________________________________________

6.- PRUEBA DE LOS GRUPOS SH:

Tome tantos tubos de ensayos como muestras problemas tenga “sin identificar” y coloque:

a) Sustancia problema........................................... 0,5 ml

b) Hidróxido de Sodio al 40%.............................. 0,5 ml
c) Acetato de Plomo al 2% .................................. 0,5 ml
d) Mezclar bien
e) Calentar durante 4 minutos, mezclar continuamente
f) Observar
g) Anote los resultados:

Tubo ____: ______________________________________________________

Tubo ____: ______________________________________________________

Tubo ____: ______________________________________________________

7.- PRUEBA DE SAKAGUCHI:

Tome tantos tubos de ensayos como muestras problemas tenga “sin identificar” y coloque:

a) Sustancia problema........................................... 1 ml
b) NaOH al 40%................................................... 3 gotas

40
 c) Naftol (Solución alcohólica al 1%).................. 4 gotas
d) Hipoclorito de Sodio al 2%.............................. 5 gotas
e) Observar
f) Anote los resultados:

Tubo ____: ______________________________________________________

Tubo ____: ______________________________________________________

8.- PRUEBA DE MILLON:

Tome tantos tubos de ensayos como muestras problemas tenga “sin identificar” y coloque:

a) Sustancia problema............................................................. 1 ml
b) Reactivo de Millón............................................................. 3 gotas
c) Mezclar bien
g) Calentar suavemente
h) Observar
i) Anote los resultados:

Tubo ____: ______________________________________________________

Tubo ____: ______________________________________________________

RESUMA SUS RESULTADOS: llene el cuadro con los resultados obtenidos en cada reacción,
colocando positivo o negativo

TUBO Ninhid. Biuret Coag. Na2SO4 Xantop. Grupos Sakag. Millón

SH

Anote sus conclusiones:

______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

41
Responda:
1.- Si los aminoácidos poseen todos un grupo amino y un grupo carboxilo ¿Cómo se pueden
diferenciar en el Laboratorio?
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

42
 TRABAJO PRÁCTICO Nº 6

DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE UNA PROTEÍNA

1.- INTRODUCCIÓN

El elevado momento dipolar del agua y su facilidad para formar puentes de hidrógeno
hacen que el agua sea un excelente disolvente. Una molécula ó un ión, son solubles en agua si
pueden, interaccionar con las moléculas de la misma mediante puentes de hidrógeno o por
interacciones del tipo dipolo-dipolo. Se produce un enlace de hidrógeno o puente de hidrógeno
(correctamente llamado enlace por puente de hidrógeno) cuando un átomo de hidrógeno se
encuentra entre dos átomos máselectronegativos, estableciendo un vínculo entre ellos. El átomo
de hidrógeno tiene una carga parcial positiva, por lo que atrae a la densidad electrónica de un
átomo cercano en el espacio. Existen diferentes dadores de hidrógeno para formar enlaces de
hidrógeno. Los dadores clásicos son:

• El grupo hidróxilo (OH)

• El grupo amino (NH)
• El fluoruro de hidrógeno (HF)

Los diferentes dadores de electrones para formar enlaces por puente de hidrógeno son:
Pares electrónicos solitarios deoxígeno, azufre, nitrógeno, y halógenos, entre otros.

Así mismo, los aniones que tengan átomos de oxígeno (CO3-2, SO4-2, NO-) pueden formar
puentes de hidrógeno con el agua, dado que el oxígeno actúa como aceptor de los mismos. Por su
parte, los cationes como el Na+, K+, Ca++ o Mg++ se rodean de moléculas de agua a las que unen
formando interacciones del tipo dipolo-dipolo; en este tipo de interacción los átomos de oxígeno
se orientan hacia el catión.

Las moléculas neutras son solubles en agua si pueden formar puentes de hidrógeno. La
solubilidad de moléculas más grandes y complejas depende del número de grupos químicos
polares que tenga y de la geometría de la molécula.

Entre las propiedades de las proteínas tenemos:

Solubilidad:
La solubilidad de las proteínas depende de la proporción de animoácidos polares que
contenga, y es debida a los radicales (-R) libres de los aminoácidos que, al ionizarse, establecen
enlaces débiles (puentes de hidrógeno) con las moléculas de agua. Esta propiedad es la que hace
posible la hidratación de los tejidos de los seres vivos. Las proteínas que son solubles en agua son
aquellas que adoptan una conformación globular.

Desnaturalización:
La desnaturalización de una proteína se refiere a la ruptura de los enlaces que mantenían
sus estructuras cuaternaria, terciaria y secundaria, conservándose solamente la primaria. En estos

43
casos las proteínas se transforman en filamentos lineales y delgados que se entrelazan hasta
formar compuestos fibrosos e insolubles en agua.

Los agentes que pueden desnaturalizar a una proteína pueden ser: el calor excesivo, las
sustancias que modifican el pH, alteraciones en la concentración, alta salinidad, agitación
molecular, etc. El efecto más visible de este fenómeno es que las proteínas se hacen menos
solubles o insolubles (pueden llegar a precipitar en el medio acuoso que las contiene y además
pierden su actividad biológica).

La mayor parte de las proteínas experimentan desnaturalizaciones cuando se calientan

entre 50 y 60 °C, otras se desnaturalizan también cuando se enfrían por debajo de los 10 a 15 °C.
La desnaturalización puede ser reversible (renaturalización) cuando el agente
desnaturalizante afecta la estructura cuaternaria, terciaria y secundaria, pero en muchos casos es
irreversible, cuando además de afectar las estructuras antes mencionadas, se afecta la estructura
primaria, es decir, se rompen los enlaces peptídicos.

El punto Isoeléctrico es el valor de pH en el cual una molécula no posee carga eléctrica y

es incapaz de desplazarse en un campo eléctrico. En el caso de las proteínas esta condición va a
depender de la carga eléctrica de los aminoácidos que la componen, es por ello que en el curso
de una titulación de una proteína a partir de un pH extremo existirá un valor de pH en el cual la
carga eléctrica de los aminoácidos que la componen se iguala y por lo tanto la proteína va a tener
una carga neta igual a cero (Electro neutralidad). En estas condiciones no va a existir repulsión
electrostática de las moléculas de proteínas y ésta precipita.

Debido a que la condición de electro neutralidad de las proteínas es afectada por la

presencia de sales (como resultado de la capacidad de las proteínas para captar iones y la
alteración del pKa debido a los efectos de la fuerza iónica), el punto Isoeléctrico es una función
de la naturaleza y concentración de la solución reguladora, y en general de cualquier otro soluto
presente. Los puntos isoeléctricos no son una función de la concentración de la proteína.

Los puntos isoeléctricos de la mayor parte de las proteínas son cercanos a pH neutro, lo
cual nos indica de manera aproximada que en las proteínas existen números aproximadamente
44
iguales de residuos ácidos y básicos, sin embargo, en algunos casos existen comportamientos
diferentes como el caso de la pepsina, enzima del jugo gástrico donde las condiciones son
normalmente ácidas y posee un punto Isoeléctrico cercano a pH 1, en contraparte de las proteínas
básicas cuyo punto isoleléctrico es cercano a pH 12. El punto isoeléctrico de una proteína permite
a técnicas como la electroforesis la separación de las mismas de muestras biológicas, ya que se
utiliza un determinado buffer y se aplica un campo eléctrico que permita migrar a las proteínas
según la carga eléctrica que adquieren gracias al buffer (Ej.: Perfil lipídico, determinación de
proteínas séricas).

En el siguiente trabajo práctico los estudiantes determinaran el punto Isoeléctrico a la

proteína CASEÍNA (proteína presente en la leche de los mamíferos). Para ello se utilizará la
ecuación de HENDERSON HASSELBALCH:

pH (PI) = Pka + Log. [Sal]

[Acido]

2. OBJETIVO GENERAL
• Determinar el punto Isoeléctrico de una proteína, la caseína de la leche.

3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
.
• Identificar el tubo donde precipita la mayor cantidad de proteína (Punto Isoeléctrico).
• Calcular el pH final (Aplicando la ecuación de Henderson-Hasselbalch) a cada tubo de
Caseína en Acetato de Sodio titulado con Äcido Acético.
• Reportar el pH del tubo correspondiente al punto Isoeléctrico.

4.-PARTE EXPERIMENTAL:

Materiales y reactivos
Tubos de ensayo
Balones aforados de 50 ml de capacidad
Medidas cilíndricas de 50 ml y de 10 ml
Pipetas de 1ml, 2ml, 5ml y 10ml.
Gradillas
Solución de Caseína en Acetato de Sodio 0,1N
Solución 1N de NaOH (Valorada)
Solución 1N de Ácido Acético (Valorada)
Solución 0,1N de Ácido Acético (Valorada)
Solución 0,01N de Ácido Acético (Valorada)

45
5.- PROCEDIMIENTO

Coloque en cada tubo previamente rotulado los reactivos como se indica en el cuadro:

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Reactivos
ml de agua destilada 8,40 7,75 8,75 8,50 8,0 7,0 5,0 1,0 7,4
ml de Ácido Acético 0,01N 0,60 1,25
ml de Ácido Acético 0,1N 0,25 0,50 1,0 2,0 4,0 8,0
ml de Ácido Acético 1N 1,6

Añada a cada tubo 1ml de solución de Caseína en Acetato de Sodio 0,1N, mezcle bien.
Examine los tubos a lo 0 min, 10 min, 20 min, y 30 min. Anotando sus observaciones de
acuerdo a la siguiente escala:
Sin cambios: 0
Opalescencia: 
Precipitado: +

Resuma sus observaciones en la siguiente tabla:

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0 min.
10 min.
20 min.
30 min.

Calcule el Punto Isoeléctrico de la proteína y anote sus Resultados:

______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

RESPONDA LAS SIGUIENTES PREGUNTAS:

1. Explique: ¿Por qué a un determinado pH una proteína tiene carga eléctrica neta igual a
cero?

2. ¿Todas las proteínas tienen el mismo Punto Isoeléctrico? ¿Por qué?

46
 TRABAJO PRÁCTICO Nº 7

INHIBICIÓN DE LA ENZIMA DESHIDROGENASA SUCCÍNICA.

1. OBJETIVO GENERAL:
Determinar el tipo de Inhibición que experimenta la Enzima Deshidrogenasa Succínica en
presencia de Malonato.

2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
1. Determinar el porcentaje de inhibición de la enzima Deshidrogenada Succínica a
diferentes concentraciones de sustrato y en presencia del inhibidor.
2. Comparar los resultados obtenidos en ambas determinaciones.
3. Indicar el tipo y característica de la inhibición, según los resultados obtenidos ambos
casos.

3. FUNDAMENTO TEORICO:
La enzima deshidrogenasa succínica (o succinato deshidrogenasa) cataliza la oxidación
del succinato a fumarato, reacción que ocurre en el ciclo de Krebs dentro de la mitocondria, de la
siguiente manera:

Deshidrogenasa Succínica
Succinato Fumarato

FAD FADH2

En la célula, dentro de la mitocondria, el FADH2 es reoxidado al ceder los electrones a la

cadena transportadora de electrones o cadena respiratoria.
En la práctica utilizamos un colorante: el 2,6-diclorofenol-indofenol, que recoge los
electrones del FADH2 de manera que se pone en evidencia la reacción ya que este colorante es
de color azul intenso cuando está en forma oxidada y al tomar los electrones provenientes del
FADH2 se reduce volviéndose incoloro.

47
 La deshidrogenasa succínica es muy abundante en el homogenizado de hígado de ratón,
en este tejido se encuentran una gran variedad de enzima, incluyendo las de la cadena
transportadora de electrones, por lo que al utilizarlo hay que añadir cianuro de potasio, un tóxico
muy potente que bloquea el paso de electrones por la cadena respiratoria permitiendo que sea el
colorante el que tome los electrones y se reduzca y no las enzimas de la cadena respiratoria del
tejido hepático.
Según al modo de unión con la enzima, los inhibidores se pueden clasificar en dos grupos:
los irreversibles, que se unen a la enzima por enlaces covalentes y la inactivan permanentemente;
y los reversibles, que lo hacen mediante enlaces no covalentes y en condiciones adecuadas
pueden ser desplazados de la enzima que recupera sus características cinéticas nativas.

Inhibidores reversibles.
Existen varios tipos de inhibidores reversibles distinguibles mediante criterios cinéticos.
Los inhibidores competitivos poseen una estructura semejante al sustrato y son reconocidos por
el centro activo de la enzima impidiendo la unión del sustrato, por lo que pueden formar un
complejo ES y EI.
La velocidad de reacción para una concentración determinada de sustrato y enzima es
menor cuanto mayor es la concentración de inhibidor. Sin embargo, a concentración de inhibidor
fija, el grado de inhibición disminuye a medida que aumenta la concentración de sustrato. Los
inhibidores competitivos aumentan la KM de la enzima por su sustrato, sin modificar la VMAX de
la reacción. La representación gráfica de Lineweaver-Burk sería la siguiente:

1/v Inhibidor

Control

1/[S]

48
 Los inhibidores no competitivos se unen a sitios específicos en la molécula de enzima,
distintos del centro activo; por lo que su efecto no puede revertirse aumentando la concentración
de sustrato. Además, el inhibidor presenta afinidad tanto por la enzima libre como por la enzima
sola, formando los complejos ES, EI y ESI. Tras la unión del inhibidor, la actividad catalítica de
la enzima se anula, sin que varíe la capacidad de la enzima de unir el sustrato; por tanto, la
presencia de un inhibidor no competitivo provoca una disminución de la velocidad máxima sin
alteración de la KM. La representación gráfica de Lineweaver-Burk sería la siguiente:

1/v Inhibidor

Control

1/[S]
Los inhibidores acompetitivos se unen al complejo enzima-sustrato formando un
complejo ESI catalíticamente inactivo y sin afinidad por la enzima libre. Este tipo de inhibidor
reduce la velocidad máxima y desplaza el equilibrio hacia la asociación de la enzima y sustrato
por lo que hay un aparente aumento de la afinidad de la enzima por su sustrato y el KM
disminuye. La representación gráfica de Lineweaver-Burk sería la siguiente:
1/v
Inhibidor
Control

1/[S]

49
 La deshidrogenasa succínica puede ser inhibida por compuestos, como el Malonato, ya
que al parecerse estructuralmente al succinato puede unirse a la enzima e impedir que oxide al
succinato.
El objetivo de este trabajo es determinar el tipo de inhibición del Malonato sobre la
deshidrogenasa succínica de acuerdo a los resultados obtenidos.

4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
Materiales:
• Homogenizador
• Centrífuga
• Tubos de ensayo
• Tapones de caucho
• Fotocolorímetro
Reactivos:
• Hígado de ratón
• Solución reguladora de fosfatos 0,02M y pH entre 7,2 – 7,5
• Solución 1N de ácido acético
• Solución 0,25 M de Sacarosa 0,02 en bicarbonato de Sodio
• Solución reguladora de fosfatos 0,1M de pH 7,2
• Solución 0,01M de Cianuro de Potasio ajustada a pH con HCL
• Solución 0,01% de 2,6-Dicloroindofenol-indofenol
• Solución 0,01M de Malonato de Sodio
• Solución 0,01M de Succinato de Sodio
• Enzima Deshidrogenada Succínica.

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 Agregue los reactivos de acuerdo a las cantidades en ml. y orden establecidas en el
siguiente cuadro:
Tubos 1 2 3 4
Reactivos
Fosfato 0,1 M 1,0 1,0 1,0 1,0
KCN 0,01 M 1,0 1,0 1,0 1,0
Agua destilada 3,5 2,5 1,0 0,0
Indofenol 0,01% 1,0 1,0 1,0 1,0
Malonato 0,01 M 0,0 0,0 1,5 1,5
Enzima 0,2 0,2 0,2 0,2
Succinato 0,01 M 0,0 1,0 1,0 2,0
Mezcle los tubos por inversión utilizando tapones de caucho. El KCN es muy tóxico.
Lea en el fotocolorímetro a 535 nm de longitud de onda inmediatamente, a los 15 y 30
minutos, tomando la última lectura para determinar el % de oxidación e inhibición.

TUBO LECTURA LECTURA % DE OXIDACIÓN % DE

CORR. INHIBICIÓN
1
2
3
4

Indique las características observadas y señale qué sucede con el % de inhibición cuando se
añade más sustrato indicando con qué tipo de inhibición se corresponde.
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________

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RESPONDA:

1. ¿Qué es un inhibidor?

2. Cómo podemos determinar el tipo de inhibición de una reacción enzimática?

3. ¿Cuál es la importancia de la inhibición enzimática?

52
 TRABAJO PRÁCTICO N° 8

EXTRACCIÓN Y AISLAMIENTO DE GLUCÓGENO HEPÁTICO

FUNDAMENTO TEÓRICO

Los polisacáridos son carbohidratos formados por unión de muchas moléculas de

monosacáridos con dos funciones básicas en los seres vivos: los que cumplen funciones de
almacenamiento, cuyos monosacárido serán utilizados como fuente de energía y siempre están
unidos por enlaces glucosídicos tipo α, y los polisacáridos con función estructural donde los
enlaces glucosídicos que los mantienen unidos son de tipo β. Los polisacáridos se clasifican
además como homopolisacáridos aquellos que están formados por un solo tipo de monosacáridos
y heteropolisacáridos formados al menos por dos tipos diferentes de monosacáridos.

Los principales polisacáridos de almacenamiento son el almidón en las plantas y el

glucógeno en los animales, los cuales se deposita en forma de gránulos dentro de las células. En
los animales el glucógeno se almacena principalmente en las células hepáticas y musculares.

Químicamente, el glucógeno es un homopolisacárido formado exclusivamente por

moléculas de α-D glucopiranosa que forman cadenas lineales unidas por enlaces α (1→ 4) y
presentan cada 8 a 10 residuos de glucosa uniones α (1→6),l así forman abundantes
ramificaciones (FIG 1), esta estrategia de almacenamiento facilita la movilización de la glucosa
cuando las condiciones fisiológicas indiquen que la misma debe ser liberada al torrente
sanguíneo. El glucógeno ayuda a equilibrar los niveles de glucosa sanguínea, la glucosa se
almacena como glucógeno durante una buena alimentación (glucogenogénesis) y libera
(glucogenólisis) durante el ayuno, ya que en esta situación no hay ingesta de alimentos. La
duración del glucógeno hepático en ayunas es de aproximadamente 24 h. A partir de este
momento, la concentración en sangre se mantiene por síntesis de glucosa a partir de sustancias
distintas a los carbohidratos (gluconeogénesis).

Por efecto de insulina que se libera al torrente sanguíneo luego de la ingesta de glucosa, el
glucógeno queda almacenado en la célula especialmente en las hepáticas. Estas moléculas podrán
ser empleadas como fuente de glucosa bajo condiciones de ayuno, por el efecto esta vez del
glucagón hormona que induce a la degradación de glucógeno hepático en moléculas de glucosa, y
así mantener los niveles séricos de la glucosa al menos durante dos horas. La función del
glucógeno muscular es actuar como una fuente de fácil disponibilidad de unidades de glucosa
para la glucólisis dentro del propio músculo. El glucógeno muscular disminuye de manera
significativa después de ejercicio vigoroso prolongado.

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