Capítulo 3: Análisis de genética bacteriana-

DEFINICIONES:
Mutante: Se refiere a un organismo descendiente de un wild type (WT) pero con alguna diferencia.
Cuando se aíslan bacterias de la naturaleza de una misma especie con alguna diferencia, se habla de
cepas por que no se puede saber cuál era la WT y cuales son las mutantes.
Fenotipo: Se refiere a todas las características observables de un organismo.
Genotipo: El genotipo de un organismo es la secuencia de ADN que este posee.
Mutación: Se refiere a cualquier cambio en la secuencia de ADN heredable.
Alelo: Son las diferentes formas de un mismo gen. Por ejemplo si una forma de un gen tiene una
mutación y la otra es una secuencia WT los dos son alelos de un mismo gen.
NOMBRES EN GENÉTICA:
Mutantes: Iniciales de la persona que las aisló y un N°. Ej: AB 2497
Genes: Tres minúsculas en itálica: ​his
Mutaciones: Si inactivan un gen: his​-​ y his​+​ es el WT
Fenotipo: His​-​, His​+​, Rif​R​, etc.
FENOTIPOS UTILIZADOS EN GENÉTICA BACTERIANA:
➔ Mutantes auxotróficas:
◆ Tipo 1: No puede multiplicarse sin un suplemento adicional que no era requerido por la
WT. Por ejemplo His​-​ auxotróficas no pueden crecer sin histidina mientras que la WT si.
◆ Tipo 2: No pueden usar alguna sustancia en particular para crecer que si puede ser
utilizada por la WT. Por ejemplo la WT puede utilizar maltosa como fuente de carbono y
la Mal​-​ no puede.
En los dos casos una mutación alteró el gen que codifica para una enzima de alguna vía
metabólica. En el caso 1 la enzima pertenece a una vía biosintética y en el caso 2 es parte de una vía
catabólica que degrada la sustancia en cuestión
AISLAMIENTO DE MUTANTES AUXOTRÓFICAS:
La figura 3.1 muestra un método simple para aislar mutantes auxotróficas para histidina y biotina.
En este experimento ocho colonias de la placa 1, que contiene todos los nutrientes que la bacteria
necesita, incluyendo biotina e histidina, fueron repicadas en otras dos placas. La placa 2 carece de
biotina pero tiene histidina, y la placa 3 carece de histidina pero tiene biotina. Las bacterias de la colonia
dos solo crecen en la placa 2, es decir en presencia de histidina, entonces es His​-​. En el caso de la
colonia 6, es Bio​-​. Si existieran mutantes que necesitan nutrientes que no pueden absorber
extracelularmente, sería muy difícil aislarlas.
 MUTANTES LETALES CONDICIONALES:
En el caso anterior al agregarle el producto génico que las bacterias no pueden sintetizar, crecen
normalmente, pero muchos productos génicos son esenciales para crecer, estos genes son llamados
esenciales, algunos ejemplos son la ARN pol, proteínas ribosomales, DNA ligasas y algunas helicasas.
Las células con mutaciones que inactivan estos genes no pueden ser aisladas, a menos que la
mutación solo inactive el gen bajo ciertas condiciones.
● Mutantes termosensibles: Son mutaciones condicionales, suele causar un cambio en un
aminoácido de una proteína causando que no sea estable a altas temperaturas, o temperatura
no permisiva. Para aislar este tipo de bacterias se incuban en una placa a temperatura permisiva
luego se repican las colonias formadas en una nueva placa y se incuban a temperatura no
permisiva.
● Las mutaciones que cambian un codón en el gen por otro sin sentido - UAA, UAG, UGA -
pueden ser mutantes condicionales. Una mutación sin sentido finaliza la traducción de un gen, a
menos que la célula posea un tRNA supresor “nonsense”.
MUTANTES RESISTENTES:
Si una sustancia causa la muerte o inhibe el crecimiento de las células, mutantes resistentes pueden ser
aisladas plaqueando la bacteria en presencia de la sustancia.
HERENCIA EN BACTERIAS:
De acuerdo a la teoría de Charles Darwin, pueden ocurrir mutaciones al azar, y si una de ellas le
confiere un fenotipo deseable a un organismo, esta puede ser seleccionada por el ambiente y se vuelve
un miembro predominante de la población.
EXPERIMENTO DE LURIA Y DELBRÜCK:
Fue diseñado para testear dos hipótesis para entender cómo surgen mutantes en un cultivo
bacteriano: la hipótesis de mutación al azar y la de cambio dirigido. La primera propone que las
mutaciones ocurren azarosamente previo al agregado
de un agente selectivo, y la segunda sugiere que los
mutantes solo aparecen como respuesta al agente
selectivo.
Usaron E. coli y el bacteriofago T1 como
agente selectivo, este fago mata a las E.coli WT, pero
una mutación para el gen de una proteína de
membrana externa llamada TonB puede hacer que
estas células sean resistentes al bacteriofago.
Si la bacteria se esparce en una placa de agar
con el fago, solo aquellas que son resistentes al fago
pueden multiplicarse.
Para determinar si las mutantes aparecen
antes o después de agregar el agente selectivo, se
pueden realizar muchos cultivos en ausencia del
agente selectivo, agregar el agente a todos los cultivos
a la vez, y luego medir la fracción de bacterias
resistentes al agente. Si la primer hipótesis es
correcta, el número de colonias mutantes variará entre
todos los cultivos. A diferencia de esto, si la segunda
hipótesis es correcta, cada bacteria tiene la misma
chance de transformarse en mutante, pero solo
después de que el agente sea agregado. De esta forma el mismo porcentaje de bacterias puede
volverse resistente en los cultivos.

TIPOS DE MUTACIONES
Cualquier cambio heredable en la secuencia de nucleótidos es una mutación.
● Algunas mutaciones pueden ser “leaky” o débiles llamadas así por ser menos severas que otra
● Otra propiedad de las mutaciones es que se pueden revertir, se puede producir un cambio por
una mutación que luego se revierte por otra mutación posterior. Un organismo en el que sucede
esto, se conoce como revertante.
Cambio en pares de bases: ​Sucede cuando un par de bases se cambia por otro, por
ejemplo GC por AT, pueden resultar de errores en la replicación, recombinación, o en la
reparación. Estos errores pueden explicarse ya que las bases están en forma enol (tautómero)
apareandose de forma errónea. Normalmente la tautomerización causa mutaciones de transición
y las reacciones químicas como la oxidación pueden causar transición y transversión.
Purinas: A y G Pirimidinas: C, T y U
Transición: Cambio de una pirimidina por otra pirimidina o purina por purina. ​T​=A por ​C​≡G.
Transversión: Cambio de una pirimidina por una purina o viceversa. ​T​=A por ​A​=T.

La frecuencia normal de error para la Dna Pol III es de 10​-10​ y se eleva a 10​-6​ en mutantes ​dnaQ.
 DESAMINACIÓN DE LAS BASES DEL ADN:
La desaminación es la eliminación de un grupo amino que puede causar un cambio de pares de
bases. La citosina es susceptible a este fenómeno y se transforma en uracilo (se elimina el amino del
C6 de la citocina) causando una transición de C≡G a T=A en la próxima ronda de replicación. Sin
​ en ​ung​) que reconoce el uracilo
embargo existe en las células una enzima llamada ​uracil-N-glicosilasa (g
extraño en el ADN y lo elimina.
OXIDACIÓN DE BASES:
Las especies reactivas del oxígeno son producto secundarios del metabolismo oxidativo, estas
pueden reaccionar y alterar las bases en el ADN, un ejemplo común es la base alterada de guanina
8-oxoG, que puede aparearse con adenina en vez de citosina, causando transversiones.
Mutaciones en la región codificante
MUTACIONES MISSENSE​:
Causa que un aminoácido en el polipéptido se cambie por
otro, esto no significa que la proteína quede inactiva; si el
aminoácido original y el nuevo tienen propiedades similares, el
cambio puede tener un mínimo efecto, o ninguno. Ciertos
aminoácidos son más esenciales para la actividad de una
proteína que otros, entonces el cambio por otro puede tener
mayor efecto. Los investigadores usan esto para determinar qué
aminoácidos son esenciales para la actividad en diferentes
proteínas por medio de la mutación sitio específica.

MUTACIONES NONSENSE:
En vez de cambiar el codon para un aminoácido diferente,
un cambio de bases a veces produce un codon nonsense, UAA,
UAG, o UGA, estos cambios se llaman mutaciones nonsense.
Estos codones normalmente señalan la finalización de un gen y
son reconocidos por factores de liberación, que liberan el
ribosoma y la cadena polipeptídica. Cuando uno de estos
codones se produce en alguna parte del polipéptido, este queda
trunco.
Si la mutación ocurre en una región no codificante del ADN o en
un gen que codifica para un ARNt, la mutación puede ser
indistinguible. Las mutaciones de cambio de pares de bases
suelen ser leaky y revertir.

Mutaciones de corrimiento del marco de lectura

Un alto porcentaje de mutaciones espontáneas
corresponden a este tipo. Ocurre cuando una o unas pocas bases
son removidas o añadidas en el ADN, causando un
desplazamiento del marco de lectura. Cualquier adición o
eliminación que no sea múltiplo de 3 causa esta mutación.
No son leaky, normalmente inactivan la proteina, porque cada
aminoácido en la proteína pasado el punto de la mutación es
incorrecto. Otra propiedad de estas mutaciones es que pueden
revertir, o ser suprimidas al agregar o quitar aminoácidos que
restauren el marco de lectura.
 Deleciones
Este tipo de mutación puede ser muy larga, removiendo cientos de pares de bases e incluso
genes. La limitación es que no puede eliminar ningún gen esencial, pero si pueden eliminar ciertos
fragmentos de genes no esenciales y aun así no causar una pérdida en la viabilidad celular.
Tienen un alto porcentaje de aparición, pueden ser causadas por recombinación entre diferentes
regiones del ADN.

El ADN bacteriano contiene muchos tipos de repeticiones, incluyendo las secuencias de

inserción (IS) y los genes de rRNA. Los elementos IS son transposones. Este tipo de mutaciones
normalmente no es leaky, y usualmente se inactivan los productos génicos. Las deleciones pueden
fusionar un gen con otro, dejándolo bajo el promotor del primero. ​NO REVIERTEN.
Nomenclatura: Se simbolizan y señalan con la letra griega delta (Δ), este símbolo se coloca delante del
​ en el caso de dos deleciones Δ​(lac-proAB)195​.
nombre del gen por ejemplo Δ​his8, o
Mutaciones de inversión
A veces el ADN se da vuelta causando que quede invertido, luego de dicha inversión, todos los
genes en esa región quedan en la dirección opuesta a la que se hallaban. Al igual que las deleciones
pueden ser causadas por recombinación, pero en este caso entre secuencias invertidas, es decir entre
un fragmento leído de 5’ a 3’ y otro de 3’ a 5’ que tienen homología entre sí.
 Estas mutaciones pueden revertir recombinando nuevamente con la secuencia invertida.
Normalmente no tienen efectos en el fenotipo ya que los genes están invertidos pero siguen intactos. A
veces pueden causar la fusión de dos genes, dejando a uno bajo el promotor del otro. Para nombrarlos
se añaden las iniciales IN seguidas de los genes involucrados.

Mutaciones de duplicación en tándem

Una secuencia es copiada de una región del ADN
a otra. Lo más común es una secuencia seguida
inmediatamente de su duplicado. Pueden ser resultado de
una recombinación y tienen la misma probabilidad de
darse que las deleciones. Normalmente inactivan el gen y
no son leaky. Si la región duplicada es tan grande como el
gen, entonces no hay inactivación. Incluso si la
recombinación se produce en un gen que queda inactivo,
puede hallarse otra copia en el fragmento que combinó. A
veces pueden causar la fusión de dos genes. La
característica más distinguible es que es una mutación
muy inestable y revierte con alta frecuencia.
Inserciones
Son causadas por la inserción de largos fragmentos de ADN, usualmente dado por transposones
que “saltan” en el ADN. Los transposones son elementos de ADN que pueden promover su propio
movimiento de un lugar del ADN a otro, al hacer esto causan mutaciones de inserción. Transposones
cortos conocidos como elementos de inserción (IS) causan la mayoría de estas mutaciones, tienen
alrededor de 1000 pb y tienen genes que no son fácilmente identificables. Muchas bacterias poseen
estos IS.
Estas mutaciones casi siempre inactivan genes, sin embargo, no son leaky. Los transposones
contienen algunos sitios de terminación de la transcripción, entonces sus inserciones resultan en
polaridad, que previene que se transcriban genes copiados en un mismo mRNA, como el gen con la
inserción. Pueden revertir al remover el ADN insertado.
Los transposones que poseen marcadores como una resistencia a un antibiótico pueden ser
seleccionados generando bacterias mutantes que sean resistentes a ese antibiótico.
Se nombran añadiendo :: entre el nombre del gen y de la inserción, por ejemplo: ​galK::Tn5.​ si
hay más de dos transposones en ese gen: ​galK35::Tn5
Reversion versus Supresión
Una reversión restaura la secuencia original de un gen, en cambio en una supresión, la mutación
es reprimida por otro gen que actúa como represor de esa mutación.
Supresión intragénica
Las mutaciones represoras que se encuentran en el mismo gen que la mutación original se
llaman supresores intragénicos. Por ejemplo la mutación puede ser el cambio de un aminoácido que
causa la pérdida de actividades y la mutación represora es otra mutación en otra parte del polipéptido
que restaura la actividad. Otro ejemplo es la restauración de una mutación que causa un cambio en el
marco de lectura, añadiendo una mutación que corrija dicho marco.
Supresión intragénica
En este caso la represión no ocurre en el mismo gen, el represor de la mutación puede restaurar
la actividad del producto génico con la mutación, o puede generar otro producto que lo reemplace. Un
ejemplo es un gen de una vía metabólica mutado que causa que se acumulen intermediarios tóxicos y la
situación intergénica podría darse en otro gen de la via que evite la acumulacion de este metabolito.
Supresores nonsense
Son otro ejemplo de supresión intragénica, normalmente se trata de una mutación en un gen
para un tRNA que cambia el anticodón del tRNA producido por ese gen. Si sucede que un anticodón
para un aminoácido muta y queda con algún anti codón de STOP, este tRNA se va a unir al codon de
stop y en vez de finalizar la traducción, va a añadir el aminoácido que carga normalmente. Esta
mutación sirve para que cuando se da una mutación nonsense, el polipéptido no quede trunco si no que
simplemente se cambia el aminoácido original por otro. Puede ser que el aminoácido añadido no
restaure la actividad del polipéptido. Además el codon de stop sigue disponible para los factores de
liberación.
ANÁLISIS GENÉTICO EN BACTERIAS
Las ventajas del enfoque genético es que requiere pocos supuestos y puede ser aplicado a
cualquier tipo de organismos, incluso aquellos de los que no conocemos nada. Las bacterias son
ideales para demostrar los principios genéticos básicos, que luego pueden aplicarse a otros organismos.

AISLAMIENTO DE MUTANTES:
Un análisis genético clásico comienza buscando mutantes en la cual alguna función se ve
alterada. La principal razón por la cual las bacterias son excelente modelo genético es por la relativa
facilidad con la que se pueden aislar dichas mutantes. Las bacterias generalmente son haploides, es
decir que solo tienen un alelo de cada gen. Esto causa que el efecto de cada mutación recesiva sea
aparente. Las bacterias se multiplican asexualmente, su progenie es idéntica a la mutante original, son
pequeñas, y se pueden obtener números equivalentes a la población humana en una sola placa,
facilitando el aislamiento de cada mutante rara.
MUTAGENIZAR O NO MUTAGENIZAR:
Las mutaciones ocurren normalmente como errores durante la replicación del ADN, se puede
aumentar la frecuencia de estos errores tratando las células con químicos o radiación, conocidos por ser
mutagénicos. Estos agentes son mutágenos. Es importante aclarar que daño en el ADN no es sinónimo
de mutación.
Las mutaciones son cambios heredables en la secuencia de los desoxinucleótidos del ADN. Las
mutaciones espontáneas son más raras que las inducidas y por eso son más difíciles de aislar, por otro
lado, las inducidas suelen tener más de un tipo de mutación y son más difíciles de analizar.
SELECCIÓN DE MUTANTES:
El proceso de encontrar mutante se llama screening. El screening para encontrar mutantes
requiere condiciones selectivas para distinguir las mutantes de la WT. Se utilizan placas con medio
selectivo. La selección puede ser positiva o negativa, en la selección positiva, las condiciones se eligen
para que pueda crecer la mutante pero no la WT. En la selección negativa puede crecer la WT pero no
la mutante, esta no es una selección si no un screen, por que las condiciones negativas se usan para
hacer un screen de mutantes en vez de eliminar el resto de tipos celulares.

AISLANDO MUTANTES POR SELECCIÓN NEGATIVA:

Muchas mutantes como las autotróficas o termosensibles,
pueden ser aisladas solo por selección negativa. La bacteria
es plaqueada en una placa no selectiva en la cual pueden
crecer la mutante y la WT. Una vez que las colonias
crecieron, algunas se transfieren a una placa selectiva para
determinar cuales son mutantes ya que no pueden
multiplicarse bajo esas condiciones, la mutante puede ser
identificada en la placa no selectiva. (ver figura 3.21)

REPLICA PLATING:
Puede usarse para encontrar mutantes cuando se utiliza
la selección negativa. Se propagan bacterias en una
placa no selectiva y se incuba para que las colonias
puedan crecer. Luego se realiza una réplica de la pĺaca,
invirtiendo y presionando sobre un material adecuado
que sirve para transferir las colonias a otra placa que es
selectiva. Se comparan ambas placas para detectar
colonias que no crecen en condiciones selectivas.
(figura 3.22)
 ENRIQUECIMIENTO:
Este método utiliza antibióticos como la penicilina que solo mata a las células en crecimiento,
entonces si yo estoy buscando una mutante que crece rara vez y la mayoría son WT que no me
interesan, aplicó el AB, centrifugo y rescato la alicuotas de células que no podían dividirse por la presión
de las WT, así hay mayor probabilidad de encontrar un mutante que necesito y que es muy raro.
Mapeo genético por recombinación:
TEST DE RECOMBINACIÓN:
Una vez que tenemos una colección de mutantes, se busca caracterizar las mutaciones, y algo
que se puede realizar es localizarlas en el ADN de la bacteria. Si disponemos de un mapa genético de
la bacteria podemos localizar las mutaciones por medio de la recombinación genética, esto se conoce
como mapeo genético.
La recombinación se define como una ruptura y unión de dos moléculas de ADN formando una
nueva combinación. El sitio de ruptura se llama crossover. La recombinación puede ser sitio específica o
generalizada. La primera utiliza enzimas que cortan el ADN y lo vuelven a ligar, pero solo sucede en
secuencias específicas. El segundo caso se utiliza en el mapeo genético y también es llamada
recombinación homóloga por que ocurre solo entre dos regiones homólogas de hebras de ADN.
MARCADORES GENÉTICOS:
Si dos hebras de ADN se recombinan y tienen diferencias es sus secuencias a cada lado de la
región de homología, vamos a tener como resultado dos ADN diferentes al original. Si esas secuencias
fueran mutaciones que causan fenotipos observables podríamos saber cuando se produce la
recombinación, estas secuencias diferentes se utilizan como marcadores genéticos.
La progenie que es genéticamente diferente a sus parentales como resultado de una
recombinación se llaman especies recombinantes.
Tests de complementación:
Es otro método utilizado en el análisis genético, depende de la interacción funcional de
productos génicos de distintos ADNs. El test de complementación nos permite obtener información
preliminar sobre las funciones afectadas por una mutación.
Se colocan dos copias de una región de ADN de diferentes cepas conteniendo dos mutaciones
diferentes en una misma célula y se ven los efectos de estas en el fenotipo.
Las bacterias pueden ser parcialmente diploides introduciendo una pequeña región del
cromosoma de una cepa a otra, usando plásmidos o profagos que pueden coexistir con el cromosoma.
TEST ALÉLICO:
Se utiliza para saber cuántos genes deben mutar
para obtener un fenotipo particular. Por ejemplo si
tenemos una colección de mutantes His​- y queremos saber
por cuantos genes está representada esa mutación (esto
sirve para saber cuantas enzimas se requieren para
sintetizar el aminoácido histidina). Cada uno de los
polipéptidos requeridos está codificado por un gen que
puede ser inactivado por una mutación. El test alélico se
realiza con dos mutaciones a la vez (una mutación en
cada hebra de ADN), si las dos mutaciones se encuentran
en genes diferentes, la bacteria aún exhibe fenotipo His​+​,
pero si las mutaciones son alélicas (las dos copias de un
mismo gen están mutadas) no hay productos de ese gen y
la bacteria tiene fenotipo His​-​.
 A veces la complementación no ocurre entre dos mutaciones por mas que esten en genes
diferentes por que uno de los dos genes puede ser polar o porque están acoplados traslacionalmente.
TEST CIS-TRANS​:
Otro uso de la complementación es determinar cuando una mutación afecta a una región en
trans o en cis. Una mutación en trans usualmente afecta un producto génico difusible como una proteína
o un ARN que por medio de una complementación pueden ser sustituidos. Una mutación que actúa en
cis usualmente tiene un cambio en el ADN, que puede ser en una región promotora o en un origen de
replicación, y este tipo de mutaciones no puede ser complementada por que afecta directo al ADN.
CLONADO POR COMPLEMENTACIÓN:
La complementación puede usarse para identificar clones que contienen un gen en particular,
por su habilidad de complementar una mutación en el cromosoma y restaurar el fenotipo WT.
Cruzamiento genético en bacterias
MARCADORES SELECTIVOS Y NO SELECTIVOS:
Necesitamos una forma de seleccionar bacterias que hayan participado de una unión con otra
bacteria (mating). Los marcadores selectivos sirven para obtener bacterias aceptoras en las que haya
ocurrido un crossover ya que convierte a la cepa en recombinante con un nuevo marcador selectivo, por
selección positiva.
 Mapeo genético con cruzas Hfr
Si un plásmido auto transmisible se integra al cromosoma de una bacteria que lo porta, el
cromosoma puede ser transportado cuando el plásmido se transfiere. Una cepa bacteriana con un
plásmido auto transmisible integrado en su cromosoma es llamada Hfr. La transferencia de ADN
cromosómico por medio de un plásmido F de una cepa a otra, permite la recombinación. En contacto
con la célula aceptora el ADN en la célula dadora es nickeado en el sitio donde se integró el cromosoma
y una hebra es transferida a la aceptora. La transferencia del cromosoma completo es poco frecuente
por que el mating o el ADN pueden romperse antes que la transferencia se complete. Transferir todo el
cromosoma en ​E.coli ​a 37°C lleva 100 min.

FORMACIÓN DE RECOMBINANTES:
El ADN transferido por conjugación
puede perderse, esto no ocurre solo si se
recombina con el cromosoma de la célula
aceptora, si la célula dadora y aceptora difieren
en sus marcadores genéticos, la nueva cepa
recombinante puede identificarse por que sera
diferente a las líneas parentales.
Por ejemplo si la dadora Hfr tiene una
mutación en arg (no puede formar colonias en
ausencia de arginina) y la aceptora tiene una
mutación en trp (no puede formar colonias en
ausencia de triptófano), al juntarlas la dadora
Hfr puede transferir y recombinar un fragmento
que contenga el alelo trp+ WT, entonces la
nueva cepa transconjugante no necesitará
arginina ni triptófano para crecer,
distinguiendola de sus parentales.
MAPEO POR GRADIENTE DE
TRANSFERENCIA:
Muchos métodos de mapeo por cruzas
de Hfr se basan en el hecho de que el ADN
cromosomal es transferido en orden,
comenzando desde donde se integró el
plásmido y finalizando en el otro extremo del
sitio de integración.
El mapeo puede hacerse interrumpiendo el mating y viendo que marcadores entraron a la célula
aceptora en distintos tiempos. La frecuencia en la que se transfiere un marcador disminuye a medida
que nos alejamos del origen de transferencia del plásmido auto transmisible integrado al cromosoma.
 ● Seleccionando recombinantes para un solo marcador:
Se realiza una mezcla de la dadora y la aceptora, se
incuba y se plaquea en condiciones en las que estas
no puedan crecer pero si las recombinantes. Para
plaquear bajo condiciones en las que recombinantes
para un marcador particular puedan crecer, es decir
que sean selectivas para ese marcador, deben tener
(en el ejemplo) dos aminoácidos y el del marcador bajo
estudio no debe suplementarse, podría ser por ejemplo
la histidina. Asi solo las células recombinantes serán
capaces de multiplicarse y formar una colonia. (Fig.
3.29)
● Test para marcadores que no pueden seleccionarse en
recombinantes:
Las transconjugantes recombinantes se testean
nuevamente para ver si hay más marcadores. Esto se
realiza nuevamente eliminando uno de los suplementos
de la placa selectiva, podría ser por ejemplo arginina, si
son capaces de crecer en esa placa, entonces también son recombinantes para arginina.
este método es útil solo si disponemos un mapa genético con información de algunos
marcadores, y está siendo reemplazado por la secuenciación genómica.
Mapeo de marcadores por transducción y transformación
En la transformación el ADN de una bacteria ingresa al de otra bacteria como una hebra simple,
en la transducción el ADN de una bacteria es transferido a otra por medio de un bacteriofago. Si las dos
cepas tienen distintos marcadores genéticos puede realizarse el mapeo que se basa en la cercanía de
los marcadores. Como solo pequeños fragmentos de ADN son transferidos, si dos marcadores
aparecen juntos, quiere decir que se encuentran cerca en el cromosoma, es decir son cotransformables
o cotransducibles. Se puede determinar de este modo la frecuencia de cotransformacion o
cotransduccion.
MAPEO POR FRECUENCIA DE COTRANSDUCCION:
La transducción o transformación pueden usarse para para definir mejor la posición de
marcadores genéticos. El primer paso es determinar si dos marcadores bajo estudio están tan cerca
como para ser cotransducidos, si lo son, las bacterias transductantes serán seleccionables por los dos
marcadores. La bacteria dadora se incuba con el fago que puede tomar ADN cromosómico por error y
se usar esta mezcla para infectar a la aceptora. Si los dos marcadores están en una región cercana,
mayor probabilidad de ser costransducidos.
Las frecuencias de cotransduccion pueden utilizarse para determinar qué marcadores se hallan
cercanos y el orden en que se encuentran.
ORDENANDO MUTACIONES POR CRUZAS DE 3 FACTORES
Este análisis se basa en cuantos crossovers se requieren para obtener cierto tipo de
recombinante. Considerando que un solo crossover del cromosoma con un fragmento lineal de ADN
causa una ruptura del mismo y es letal, la cantidad de crossovers siempre deberá ser un número par
para que una secuencia de ADN recombine en el cromosoma.
La cantidad de crossovers requeridos y la cantidad de colonias obtenidas para los distintos marcadores,
nos darán el orden de ellos.