Actividad de diferentes formulaciones de Lipasa B de Candida antarctica en disolventes orgánicos

Se determinó la actividad de diferentes formulaciones de Candida antarctica lipasa B (CALB), como

CALB en bruto, CALB purificada, CALB purificada liofilizada con PEG (CALB + PEG) o ácido oleico
(CALB + OA) y la formulación comercial Novozym 435. en tolueno, tetracloruro de carbono y 1,4-
dioxano en diversas actividades acuáticas (aw). La reacción entre acetato de vinilo y 1-octanol se
usó como reacción modelo y se determinaron las actividades de transesterificación (formación de
1-octilacetato) e hidrolítica (formación de ácido acético a partir de acetato de vinilo). Para
cantidades iguales de proteína lipasa, CALB + PEG (y en menor medida CALB + OA) mostraron una
actividad mayor que la de las otras formulaciones; por ejemplo, en tolueno (aw <0.1), fue 260-, 13-
y 1.8 veces más activo que CALB crudo, CALB purificado y Novozym 435, respectivamente.
Además, la actividad de transesterificación de CALB + PEG fue del mismo orden de magnitud (51%)
de la actividad mostrada por la enzima en la hidrólisis de acetato de vinilo en tampón acuoso.
Estos resultados sugieren que el PEG y el ácido oleico podrían actuar como lioprotectores,
evitando la formación de interacciones intermoleculares durante el proceso de liofilización que
podrían ser responsables de la desnaturalización de proteínas. No se observó limitación difusional
para las reacciones catalizadas por CALB + PEG. CALB purificado, en contraste con las otras
formulaciones, mostró un marcado aumento de la actividad (2.1 a 7.8 veces) en función de aw y,
en el 1,4-dioxano, fue 3.5 veces más activo cuando se añadió al solvente después de la disolución
previa del polvo liofilizado en agua.

METODOLOGÍA

Purificación de lipasa

A menos que se indique lo contrario, la purificación se llevó a cabo a temperatura ambiente. Se

disolvió CALB crudo (0,2 g) en 10 ml de tampón de fosfato sódico 0,01 M (pH 8) (tampón A) y se
dializó contra el mismo tampón durante la noche a 4 ° C. La solución enzimática se cargó en una
columna Fractogel EMD DEAE-650 (M) (1,6 x 15 cm) equilibrada con tampón A y la actividad de la
lipasa, espectrofotométricamente determinada usando p-nitrofenil laurato como sustrato, se eluyó
con el mismo tampón (flujo tasa 2 mL / min). No se liberaron otras actividades hidrolíticas después
del lavado con NaCl 0.5 M en tampón A. Las fracciones que contenían lipasa CALB se recogieron y
se dializaron frente a agua durante 24 ha 4 ° C. La solución de proteína se fraccionó en porciones y
finalmente liofilizado La electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE) de
la lipasa purificada se llevó a cabo en un gel de placas de poliacrilamida (12% T y 2,67% reticulado)
usando un aparato Miniprotean Biorad y Coomassie Brilliant Blue R-250 para detectar proteínas. El
gel mostró solo una mancha con una masa molecular de aproximadamente 35 kDa.

Formulaciones enzimáticas

Se emplearon las siguientes formas de lipasa CALB: (a) lipasa purificada CALB. Después de la
purificación, el polvo de lipasa se disolvió en tampón de fosfato de potasio 0,01 M (pH 7), se dividió
en porciones de 0,02 mg (en un volumen de 0,4 ml) y luego se liofilizó. (b) Se preparó lipasa
purificada CALB más PEG (CALB + PEG) como en (a), pero usando 0,4 ml de tampón de fosfato de
potasio 0,01 M (pH 7) que contenía 10 mg de PEG (relación molar PEG / proteína 3500). La muestra
fue luego congelada y liofilizada. (c) Se preparó lipasa CALB purificada más ácido oleico (CALB + OA)
como en (a), excepto que se añadieron 5 ml de ácido oleico antes de añadir el tampón (relación
molar ácido oleico / proteína 27,600). La muestra se agitó y luego se liofilizó. (d) Se suspendieron
lipasa bruta (CALB en bruto) (5 mg) y (e) Novozym 435 (2 mg) en 1 ml de tampón de fosfato de
potasio 0,01 M (pH 7) y luego se liofilizaron. (f) Se preparó lipasa purificada CALB más PEG y ácido
oleico (CALB + PEG + OA) como en (b), excepto que se añadieron 5 ml de ácido oleico antes de añadir
el tampón que contenía PEG.

Ensayo de proteínas

El contenido de proteína de las diferentes formas de CALB se determinó mediante análisis de

aminoácidos después de la hidrólisis clorhídrica. Las muestras se hidrolizaron con HCl 6 M, fenol al
0,1% y b-mercaptoetanol al 0,1% a 110 ° C durante 24 h, y luego se secaron. Los análisis se llevaron
a cabo en una resina de intercambio catiónico CK10 F de 0,46 cm x 15 cm (Mitsubishi Chemical,
Tokio) usando un tampón de citrato convencional para análisis de ácido monocatenario y un aparato
Jasco. La detección del aminoácido se llevó a cabo con o-ftaldialdehído (Roth, 1971). En el caso de
CALB en bruto, el porcentaje de proteína lipasa en la mezcla proteica global se determinó llevando
a cabo un barrido cuantitativo del gel de placa SDS-PAGE de CALB en bruto después de la tinción
con Coomassie Brilliant Blue R-250.

Transesterificación catalizada por lipasa

La transesterificación entre 1-octanol y acetato de vinilo para dar 1-octilacetato y acetaldehído se

utilizó como reacción modelo. En todos los casos, se añadió una cantidad suficiente de enzima a 1
ml de disolvente orgánico que contenía 0,19 M de 1-octanol y 1,1 M de acetato de vinilo. Todos los
reactivos, la enzima en polvo y los disolventes orgánicos (tetracloruro de carbono o tolueno), antes
utilizados, se llevaron por separado al valor de actividad de agua deseado (aw) en recipientes
sellados durante al menos 48 h, a 25 ° C, con el vapor fase de soluciones saturadas de sal de actividad
acuosa conocida (aw): MgCl2, aw 0,33; y KCl, aw

0,84 (Valivety et al., 1992). Para aw <0,1, las muestras se equilibraron frente a tamices moleculares.
En el caso del 1,4-dioxano anhidro, el contenido de agua fue de 0,028 M, como informa Aldrich,
mientras que la cantidad apropiada de agua se añadió para obtener una concentración de agua de
0,55 o 2,75 M; los valores de aw correspondientes fueron 0.003, 0.06 y 0.25, respectivamente (Bell
et al., 1997). La actividad enzimática de CALB purificada en 1,4-dioxano también se probó después
de la disolución previa de la enzima en agua. En este caso, se añadieron 10 ml de agua a 0,02 mg de
polvo liofilizado de CALB purificado y luego se añadió la solución de proteína resultante a 1 ml de
1,4-dioxano (valor aw final 0,06), que contenía acetato de vinilo 1,1 M y 0,19 M 1-octanol. Las
mezclas de reacción se agitaron a 200 rpm y a 25 ° C en todos los casos. En puntos de tiempo
predeterminados, se extrajeron alícuotas de las mezclas de reacción y la conversión se determinó
mediante GLC (HP-1 Crosslinked Methyl Silicone Gum, 25 m, 0,32 mm id, Hewlett-Packard;
condiciones: temperatura del horno desde 35 ° C [tiempo inicial 10 min ] a 160 ° C con una velocidad
de calentamiento de 15 ° C / min, H2 como gas portador). Los tiempos de retención para acetato de
vinilo, ácido acético, 1-octanol y acetato de 1-octilo fueron 1.8, 2.2, 11.5 y 13.0 min,
respectivamente.
Evaluación de limitaciones difusionales

Los experimentos se llevaron a cabo mediante la adaptación a CALB del procedimiento utilizado
para la subtilisina por Bedell et al. (1998) La CALB purificada se inactivó incubando 1 mg / ml de
enzima en tampón de acetato sódico 0,02 M (pH 6) que contenía 0,002 M de p-nitrofenilfosfato de
dietilo (proporción molar de inhibidor / proteína 70) siguiendo el procedimiento de Moreau et al.
(1991). La enzima se inactivó completamente en 2 h y no se detectó actividad con laurato de p-
nitrofenilo. La enzima inactivada luego se dializó frente a tampón de fosfato de potasio 0,01 M (pH
7) a 4 ° C durante 16 h. Muestras de enzimas

(0,2 mg de proteína de lipasa total) que contiene diferentes porcentajes de lipasa inactivada.
Cuando se probó el efecto de PEG, las muestras de enzima (0,2 mg) se liofilizaron en presencia de
100 mg de PEG (PEG: proporción molar de proteína 3500). Las velocidades de transesterificación
iniciales se midieron en tolueno usando la reacción modelo entre 1-octanol y acetato de vinilo, en
un volumen de reacción de 10 ml. Las preparaciones enzimáticas, el disolvente y los reactivos se
equilibraron frente a tamices moleculares (aw <0,1).

Experimentos de Reciclaje

Una muestra de CALB + PEG (0,02 mg de CALB coliofilizado con 10 mg de PEG), preparada como se
describió previamente, se usó para varios ciclos de reacción de transesterificación usando la
reacción modelo entre 1-octanol y acetato de vinilo para dar 1-octilacetato. Cada ciclo de reacción
se llevó a cabo a aw <0,1 después de equilibrar el disolvente, todos los reactivos y la preparación
enzimática frente a los tamices moleculares durante al menos 48 h. La preparación de CALB + PEG
se recuperó al final de cada ciclo precipitando el complejo enzima / PEG. Para este propósito, se
añadió 1 ml de volumen de reacción a 2 ml de éter de petróleo y luego se centrifugó a 4000 rpm. El
precipitado se recuperó, se lavó con 2 ml de éter de petróleo y se dejó secar en presencia de tamices
moleculares antes de ser reutilizado. El quinto ciclo se llevó a cabo de una manera diferente.
Después de la precipitación, el complejo de enzima / PEG se disolvió en 0,4 ml de tampón de fosfato
de potasio 0,01 M (pH 7), y se liofilizó antes de preequilibrarse frente a tamices moleculares y se
usó.
Lipase Activity in Aqueous Buffer
The hydrolytic activity of purified CALB was determined
using vinylacetate as substrate (100 mL/mL) in 0.05 M potassium
phosphate buffer (pH 7) at 25°C. The acetic acid
produced was titrated with sodium hydroxide using pH-stat
equipment (718 Stat Titrino Metrohm).