Prácticas de Microbiología General FCCBB-UNPRG

PRÁCTICA N° 15

INTRODUCCIÓN A LA INMUNOLOGÍA
PRINCIPIOS DE LA INMUNIDAD CELULAR E INMUNIDAD HUMORAL

INTRODUCCIÓN

Durante los últimos años el desarrollo del campo de la inmunología ha permitido hacer
frente a los problemas de salud pública; así mismo sus aplicaciones diagnósticas y
terapéuticas, han posibilitado un tratamiento eficaz de enfermedades que
anteriormente sólo eran subsidiarias de tratamientos paliativos.

El sistema inmune es capaz de ejercer su acción protectora por medio de diferentes

mecanismos. Éstos incluyen barreras físicas como piel y mucosas, moléculas
circulantes como reactantes de fase aguda y sistema de complemento, células
fagocíticas, células agresoras naturales, natural killer, y citocinas, como interferones y
factor de necrosis tumoral; componentes que forman parte de la inmunidad innata que
al actuar en conjunto con los mecanismos de la inmunidad específica o adquirida,
constituyen una barrera de defensa del organismo.

Teniendo como fundamento las reacciones de antígeno y anticuerpo que se producen

como parte de la respuesta inmunitaria es que se han diseñado una gran variedad de
pruebas inmunológicas para el diagnóstico de diversas enfermedades infecciosas, de
fácil aplicación y de uso contante en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades
emergentes y reemergentes.

COMPETENCIAS

 Demostrará los niveles de respuesta inmunitaria frente a la acción de agentes

patógenos.

 Aprenderá las bases teóricas de la reacción de aglutinación para la

determinación de grupo sanguíneo y conocerá los diferentes factores que
contribuyen a la reacción.

 Aplicará los fundamentos de la reacción antígeno-anticuerpo para el

diagnóstico de enfermedades infecciosas.

PRECAUCIONES

El alumno deberá mantener la cordura y seriedad durante el desarrollo dela

práctica; así mismo aplicará en todo momento las medidas de Bioseguridad según
sea el caso para evitar accidentes biológicos laborales.

MATERIALES:

Material Biológico

 Muestras de sangre humana, obtenidas por venopunción en tubos con

anticoagulante y sin anticoagulante.

Material de Laboratorio

 Contenedor para descarte de punzocortantes.

 Agujas n° 20 o 21.

Dpto. Académico de Microbiología y Parasitología Blgo. Manuel Farcio Villarreal

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 Lancetas
 Tubos de ensayo de 13 x 100 con anticoagulante (EDTA K3)
 Tubos de ensayo de 13 x 100 sin anticoagulante
 Baño María a 37 °C
 Láminas portaobjetos y laminillas
 Placas de vidrio.
 Centrífugas
 Micropipetas y punteras.
 Gradillas
 Pipetas Pasteur o de transporte.
 Palillos monadientes o varillas plásticas.
 Ligaduras, algodón y alcohol.

Reactivos y Soluciones

 Antígenos febriles para Salmonella entérica.

 Antígenos febriles para Brucella abortus.
 Anticuerpos monoclonales para tipificación de grupos sanguíneos (ABO) y
Grupo Rhesus
 Albúmina bobina al 20%.
 Reactivo Coombs.
 Solución salina estéril al 0.9%.

PROCEDIMIENTOS.

A. REACCIONES DE AGLUTINACIÓN (REACCIÓN ANTÍGENO – ANTICUERPO)

1. REACCIÓN DE WIDAL

Método serológico para el diagnóstico de infección por Salmonella entérica.

 Extraer por punción venosa una muestra de sangre del paciente en un tubo
sin anticoagulante.
 Dejar coagular la muestra de sangre (observar la retracción de coágulo).
 Centrifugar el tubo con la muestra de sangre coagulada a 2500 RPM por 5
minutos.
 Una vez terminada la centrifugación, y detenido el movimiento del rotor,
extraer el tubo.
 Con la ayuda de una pipeta de transporte, extraer el suero sanguíneo.
 Sobre una placa de vidrio, colocar una gota de suero (aprox. 50 uL) en
cada uno de los 4 posillos de la placa.
 Agregar a cada uno de ellos 1 gota de los antígenos febriles (Tífico O,
Tífico H, paratífico A y Paratífico B), de Salmonella entérica y
homogenizar usando una varilla distinta para cada una de ellos.
 Agitar manualmente o en rotador serológico por 2 minutos.
 Observar la presencia o ausencia de aglutinación.

Dpto. Académico de Microbiología y Parasitología Blgo. Manuel Farcio Villarreal

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Lectura

Si se observa aglutinación en alguno de los posillos, deberá aplicarse la

técnica de “Titulación rápida en placa”.

o En una placa de vidrio limpia, agregar con la ayuda de una

micropipeta agregar los siguientes volúmenes de suero:

– 80 uL de suero……….. 1/20
– 40 uL de suero……….. 1/40
– 20 uL de suero……….. 1/80
– 10 uL de suero……….. 1/160
– 5 uL de suero……….. 1/320

o Agregar a cada uno de ellos una gota del antígeno febril.

o Mezclar el suero con el antígeno y agitar durante 2 minutos.
o Observar aglutinación en cada uno de las diluciones.
o Reportar el título correspondiente a la última aglutinación obtenida.

2. PRUEBA DE ROSA DE BENGALA

Método serológico para el diagnóstico de infección por cepas de Brucella

abortus. Llamada también de la tarjeta o Card Test, se basa en la inactivación
de las inmunoglobulinas IgM a un pH bajo. Detecta exclusivamente IgG 1.

 Extraer por punción venosa una muestra de sangre del paciente en un tubo
sin anticoagulante.
 Dejar coagular la muestra de sangre (observar la retracción de coágulo).
 Centrifugar el el tubo con la muestra de sangre coagulada a 2500 RPM por
5 minutos.
 Una vez terminada la centrifugación, y detenido el movimiento del rotor,
extraer el tubo.
 Con la ayuda de una pipeta de transporte, extraer el suero sanguíneo.
 Sobre una placa de vidrio, colocar una gota de suero (aprox. 50 uL) en uno
de los posillos de la placa.
 Agregar 1 gota del reactivo de Rosa de bengala.

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 Agitar manualmente o en rotador serológico por 2 minutos.

 Observar la presencia o ausencia de aglutinación.

Observación. Toda prueba de rosa de bengala positiva debe confirmarse por

la “Prueba en tubo y del 2-Mercaptoetanol”.

B. HEMAGLUTINACIÓN DIRECTA E INDIRECTA (Tipificación de grupos

sanguíneos)

1. Hemoclasificación directa con antisueros

Los grupos sanguíneos se heredan según las leyes genéticas. Son cuatro tipos
y reciben el nombre de sistema de grupos sanguíneos ABO.

 Con una torunda de algodón embebida con alcohol, desinfectar la superficie

del dedo anular.
 Con una lanceta nueva, realizar una punción en la cara lateral del dedo
anular.
 Depositar 3 gotas de sangre por separado sobre la superficie de una placa
de vidrio.
 Agregar una gota de los antisueros a cada una de las gotas de sangre,
evitando contaminar el reactivo.
 Mezclar cada preparación con un palillo de madera.
 Rotar manualmente la placa de vidrio con cuidado de que no se mezclen.
 Observar aglutinación y registrar los resultados:

2. Hemoclasificación Inversa (Prueba sérica inversa)

 Obtener por punción venosa una muestra de sangre en un tubo con

anticoagulante EDTA K3.
 Centrifugar la muestra y separa el plasma sanguíneo en otro tubo limpio.
 Marcar tres tubos como A, B y O.

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 Adicionar dos gotas de suero del paciente a cada tubo.

 Agregar una gota de suspensión de eritrocitos del grupo A al tubo rotulado
como A, una gota de eritrocitos del grupo B al tubo rotulado como B y una
gota de eritrocitos del grupo O al tubo rotulado como O.
 Incubar de 5 – 15 minutos a temperatura ambiente
 Centrifugar por 15 – 30 segundos a 3400 rpm o 1 minuto a 1000 rpm.
 Resuspender los botones celulares y observar aglutinación.
 Observar e interpretar los resultados.

3. Hemoclasificación del grupo Rhesus (factor Rh)

 Depositar 1 gotas de sangre sobre la superficie de una placa de vidrio.

 Agregar una gota del antisuero (anti D) la gota de sangre, evitando
contaminar el reactivo.
 Mezclar la preparación con un palillo de madera.
 Rotar manualmente la placa de vidrio con cuidado.
 Observar si hay aglutinación o no y registrar los resultados.

Interpretación de la Hemaglutinación

4. Pruebas de Compatibilidad Sanguínea

Esta prueba llamada también "Prueba cruzada". Consiste, en determinar si el

suero del paciente contiene anticuerpos que aglutinen los eritrocitos del
donador.

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a. Obtención de muestra

o Se obtiene una muestra de sangre por punción venosa del donante

y del receptor, en tubos con anticoagulante EDTA K3. Rotular cada
tubo.
o Centrifugar ambas muestras a 150 rpm por 5 min.

b. Lavado de glóbulos rojos del donante y suspensión al 5%

o Rotular 3 tubos de ensayo de 13 x 100 del 1 al 3.

o En el tubo 1: Mezclar 0.5 ml del sedimento de eritrocitos más 8 mL
de la solución salina al 0.9%
o Homogenizar y centrifugar a 1500 rpm por 2 min.
o Aspirar y eliminar el líquido sobrenadante.
o Agregar al sedimento nuevamente 8 ml de solución salina y repetir
el proceso de 3 – 5 veces (3 a 5 lavados).
o Resuspender el último sedimento de glóbulos rojos obtenido
agitando el tubo suavemente.
o En el tubo 2: Preparar una suspensión de glóbulos rojos al 5%
depositando en un tubo de ensayo limpio 50 uL de glóbulos rojos
lavados con 950 uL de solución salina (1 gota de GR lavados con 19
gotas de solución salina).

c. Fase Térmica

o En el tubo 3: depositar 2 gotas de hematíes lavados y agregar 2

gotas de albúmina bobina al 20% con 2 gotas del plasma del
receptor.
o Llevar a incubación en baño maría a 37°C por 15 min.
o Posteriormente centrifugar el tubo a 1500 rpm por 2 minutos.
o Agitar fuerte el tubo para desprender el sedimento.
o Observar la presencia o ausencia de aglutinación.
o Si se observa aglutinación. Entonces se da por finalizada la prueba
y se realiza la interpretación. Si no hay aglutinación se continúa con
la siguiente fase.

d. Fase Coombs

o Para esta fase al tubo n° 3 se agrega 5 ml de solución salina y se

homogeniza.

Dpto. Académico de Microbiología y Parasitología Blgo. Manuel Farcio Villarreal

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o Se lleva el tubo a centrifugación y luego se elimina el sobrenadante.

o Se resuspende el sedimento y se le agrega 2 gotas de suero
Coombs.
o Posteriormente se lleva a centrifugación.
o Observar la presencia o ausencia de aglutinación.

Si no hay aglutinación: La sangre es compatible y se puede

administrar sin riesgos al paciente.

Si hay aglutinación: La sangre es incompatible y no debe ser

transfundida ya que representa un riesgo
potencial para el receptor.

C. INMUNOCROMATOGRAFÍA

La inmunocromatografía se basa en la migración de una muestra a través

de una membrana de nitrocelulosa. La muestra es añadida en la zona del
conjugado, el cual está formado por un anticuerpo específico contra uno de
los epítopos del antígeno a detectar y un reactivo de detección. Si la
muestra contiene el antígeno problema, éste se unirá al conjugado
formando un complejo inmune y migrará a través de la membrana de
nitrocelulosa. De lo contrario, migrarán el conjugado y la muestra sin unirse.

1. Prueba rápida para Hepatitis B

Para cada caso se sigue las especificaciones técnicas establecidas por el

laboratorio que fabricó la prueba, incluido en el inserto de la prueba.

 Llevar los cassetes y diluyente del HBsAg a temperatura ambiente.

Dpto. Académico de Microbiología y Parasitología Blgo. Manuel Farcio Villarreal

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 Obtener por punción venosa una muestra de sangre en un tubo con o sin
anticoagulante, esto debido a que la prueba puede realizarse con suero o
sangre total.
 Con una pipeta agregar 1 a 2 gotas de suero o sangre total al posillo para
de muestra.
 Agregar 1 a 2 gotas de diluyente.
 Dejar en reposo y realizar la lectura.
 Realizar la lectura dentro de los primeros 15 minutos.
 Interpretar los resultados obtenidos.
 En el caso de ser positiva la prueba debe ser confirmada por métodos de
mayor especificidad.

CUSETIONARIO

1. Esquematice lo realizado en práctica e interprete los resultados obtenidos.

2. Defina que es conjugado.
3. ¿Cuáles son las zonas de una prueba inmunocromatográficas y de que están
compuestas?
4. Defina sensibilidad y especificidad.
5. Cuáles son las ventajas y desventajas de las pruebas inmunocromatográficas?.

Dpto. Académico de Microbiología y Parasitología Blgo. Manuel Farcio Villarreal