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UNIVERSIDAD AUTONOMA JUAN MISAEL SARACHO FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE BIOQUIMICA

HAI CHAGAS

DOCENTE: Dra. Daniela Azurduy UNIV.


:

David Ortega Juan Carlos Velsquez A.

TARIJA - 2010

CHAGAS - HAI HEMAGLUTINACION INDIRECTA FUNDAMENTO DEL METODO HAI chagas consiste en una suspensin estabilizada de hematies de carnero sensibilizados con anticuerpo de T.cruzi, los cuales se aglutinan en presencia de diluciones de sueros humanos o de animales que contengan anticuerpos especficos REACTIVOS PROVISTOS ANTIGENOS: Suspensin estabilisada de hematies de carnero sensibilizados con antigenos de T. cruzi Diluyente de muestras: solucin salina isotnica con adsorbentes y. conservadores. Solucin proteica: So lucin proteica estabilisada con conservadores. Hematies no sensibi1izados: Suspension estabilizada de hematiesde carnero no sensibilizados. Cotrol Positivo Dilucin de suero reactivo para anticuerpos contra T cruzi, titulado inactivado con conservadores. Control Negativo: dilucin de suero no reactivo para anticuerpos contra T cruzi. , inactivado con conservadores. OBTENCION Y PREPARCION DE MUESTRAS Emplear suero fresco y lmpido. La sangre se extraer de un paciente preferentemente en ayunas siguiendo las normas generales, recogiendola en tubos de centrifuga. Para obtener el suero dejar coagular la sangre centrifugar y separar el sobrenadante. Los sueros pueden ser conservados entre 2 y 8grados C hasta 48 Hrs. O ongelados a.-20 gradosC para un almacenamiento prolongado. Debe evtarse los congelamientos y descongelamientos repetidos LECTURA DE RESULTADO: Luego de transcuridas dos horas, proceder a la lectura en espejo para policubetas o sobre un fondo blanco REACCION POSITIVA: Formacin de un manto en el fondo del pocillo por aglutinacin del atigeno, que debe ocupar ms del 50%. del mismo. REACCION NEGATIVA: formacion de un boln nitido con bordes regulares, por sedimentacin del antigeno. CRITERIO DE ACERTABILIDAD DEL ENSAYO La inclusion de un Control Positivo y Negativo permite verificar la reproductibilidad del ensayo, la estabilidad de los reactivos y llamar la atencin sobre posibles errores de tecnica INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS El titulo del suero ser la inversa de la dilucin qu da lugar a un manto que ocupe 5Y. o ms del pocillo. TECNICA Seleccionar una policubeta con pocillos sin usar de fondo en U, pasar un trapo hmedo por la base antes de usar. Con microgotero de 25ul, colocar una gota de Diluyente da Sueros HM en todo

los pocillos a usar d la policubeta Tomar una alcuota de cada suero a ensayar con microdiluidores de.2:ul (uno para cada muestra) y colocar en los pocillos de la columna 1. Realizar diluciones a partir de la 1 (dilucin 1/2) i) pasando ls microdilutores a la columna 2 (dilucin 1/4) y asi sucesivamente hasta la columna 6 (dilucin 1/64). Colocar en las columnas 1 y 2 (diluciones 1/2 y 1/4) una gota (2 ui) de GR no sensibilisados, para control de heterofilia. En el resto de los pocillos, agregar una gota (25 ul) de antigeno., HA. Agitar la policubeta con los dedos en las paredes laterales, durante 30 segundo por lo menos. Dejar en reposo al resguardo de Vibraciones, durante 9 minutos. Leer Se puede aumentar la nitidez de la apreciacin leyendo sobre un espejo.

CONCLUSIONES: se concluyo en la prctica fue satisfactoria para el aprendizaje de la tcnica en el laboratorio y el resultado nos dio positivo en 1/32, en un titulo de 32

LNTERACc1N SECUNDARIA ANTGENO - ANTKUERPO INVES11GACIN DE PROTENA C REACTIVA (PRECIPITACION) E una protena anormal que aparece en la sangre luego de la fae aguda de distintas enfermedades inflamatorias. Es una protena termolbil que no atravieza la barrera placentaria y cuya movilidad elecrofortica se encuentra entre las zonas de las alfa y beta globulinas. Es una de las llamadas protenas de fase aguda y se incrementa en suero, en una gran variedad de enfermedades inflamatorias o como respuesta a necrosis tisular. Su determinacin es importante debido a que aumenta rpidamente al comienzo de la enfermedad, 14 a 26 hrs. luego de la inflamacin o injuria tisuiar y desaparece en la etapa de recuperacin, apareciendo slo durante la fase activa del proceso inflamatorio. Fu aislada y purificada por Mc Leod y Avery. Su nombre proviene de la circunstancia de que forma un precipitado con el polisacrido somtico C no especfico del pneumococo. Al principio se pens que se trataba de un anticuerpo del neumococo, lo que actualmente se desecha, porque aparece con frecuencia en forma independiente a toda infeccin neumoccica No es un anticuerpo genuino porque carce de la cualidad de ste de originarse como consecuencia del contacto de un organismo con un antgeno especifico. Quiz se trate de una alfaglobulina, que contiene por lo menos dos componentes. Tal vez sea una lipoprotena. Las investigaciones realizadas por Gautiery Scheidegger demostraron una identidad absoluta de las protenas C, cualquiera sea la infeccin causal de su aparicin. Actualmente se sabe que la protena C puede aparecer en personas aqarnmagiobulnmicas incapaces de elaborar anticuerpos. Se encuentra presente en el suero de pacientes con distintos grados de actividad reumtica. Debe insistirse, sin embargo, en que su existencia no es especfica, pues puede aparecer como respuesta a otras condiciones inflamatorias. En ics pacientes reumticos tratados con corticoides, la positividad de la protena C reaparece cuando se interrumpe el tratamiento y quiz por un mecanismo de rebote que dura agunos das. Aparoce como consecuencia de destruccin hstica, necrosis masivas de los

infartos o de ciertos tumores malignos, en las lesiones serosas del reumatismo articular agudo, en las colagenosis o en las lesiones del sistema reticuloendotelil. As rriismo se encuentra elevada en: artritis reumatoidea activa, nfeccones virales, tuberculosis, fiebre reumtica activa, infarto agudo de miocardio. Quiz tambin se puede encontrar elevada luego de una operacin quirrgica y en grn porcentaje luego de transfusiones sanguneas. La determinacin de PCR no slo indica la intensidad de la enfermedad sino tambin la respuesta del paciente a un tratamiento dado. Mtodos de Investigacin Existen varios mtodos para determinar Protena C Reactiva que se detaPan a continuacin. 1.-MTODO DE LTEX FUNDAMENTO La PCR se detecta en suero por reaccin con un anticuerpo especfico adsorbido sobre un soporte inerte de ltex. La PCR se une a los anticuerpos adsorbidos produciendo la aglutinacin de las parUculas de ltex, visibles macroscpicamente. Reactivos * Reactivo de Ltex: Suspensin de partculas de ltex poliestireno recubiertas con anti-PCR monoespecfico. * Control Netivo * Control Positivo * Buifer Muestra Obtener suero, siguiendo las normas correspondientes. No emplear plasma ya que el ii calcio es fundamental para que se produzca la reaccin. El suero debe ser preferentemente fresco. Pudiendo conservarse hasta 24 horas en refrigerador (2 - 10C) y hasta 4 semanas congelado a -20C. Tcnica Cualitativa Llevar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente antes de usar. Agitar el reactivo Ltex antes de usar. Colocar: Muestra 1 gota Reactivo Ltex 1 gota Mezclar con un paJillo descartable hasta obtener una suspensin uniforme en toda la superficie del crculo. Inmediatamente disparar el cronmetro, balancear suavemente la placa y observar microscpicamente el resultado bajo un haz de luz dentro de los dos minutos. Tcnica Cuantitativa Los suero positivos deben titularse efectuando diluciones seriadas en tubos Khan. Colocar 1.9 ml de Buifer en el primer tubo y 1 ml en cada uno de los restantes. Agregar 0.1 ml de suero al tubo N1 y mezclar. Transferir 1 ml de esta dilucin al tubo N2 y mezclar, continuando as las diluciones hasta el ltimo tubo. Las ciHuciones as obtenidas equivalen a 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, etc. Ensayar posteriormente cada dilucin segn la tcnica cualitativa. Lretacin de Resultados

Negativo : Suspensin homognea Positivo Aglutinacin que aparece dentro de los tres minutos. Se califica de 1 3 4 cruces. Ttul: Es la inversa de fa mxima dilucin a la que se produce agh.itinacin visible macroscpicamente. La concentracin aproximadamente de PCR en la muestra puede ser calculada por la frmula siguiente: PCR (mg/l) = Ttulo x Sensibilidad de la reaccin (6 mg/l) Control de Calidad Se recomienda procesar simultneamente el Control Negativo y Control Positivo provistos, empleando una gota del Control correspondiente sin diluir en lugar de la muestra diluda y una gota del Reactivo Ltex.

Hepatitis crnica.- El FIBsAg se mantiene durante ms de seis meses, y 4dquiere (;OflcefltfflCiofles elevadas. 1 l HBe Ag puede as mismo permanecer detectable ms de tres meses. 1 l DNA siempre es positivo, lo que diferenciar de la hepatitis replicativa de la no replicativa. yASDE TRANSMISIN Son de tres tipos: Parenteral, sexual y vertical materno-fetal. la ms importante es la parenteral a partir del suministro de sangre y hemoderivados, o por inoculacin directa en drogadictos y personal sanitario que se pincha con material c Ofltaminado. La va sexual se ha demostrado de una forma clara tanto en horno corno en beterosexuales, debido a la presencia del virus en semen, saliva y secreciones vaginales. La transmisin madre-hijo se puede producir en el embarazo, en el parto o por el estrecho contacto existente entre ambos en los primeros meses de vida. De todos ellos, el gran intercambio de sangre ocurrido entre la madre y el feto en elo momento del parto. parece ser el principal mecanismo en el caso de la transmisin vertical. PREVENCIN Se basa en medidas que destruyen el virus (recordemos que es muy resistente a la ebullicin, alcohol, detergentes, ter, fenol y componentes dorados a las concentraciones usuales) corno pueden ser la esterilizacin por el calor (autoclave, horno Pasteur), las cmaras de formol y xido de etileno , y las radiaciones ionizantes. Medidas higinico-sanitarias muy importantes son el control de donantes de sangre, el uso de material clnico desechable, y los mtodos de barrera para la va sexual. La utilizacin de imnunoglobulina especfica (con ttulos elevados de HBcAc) est indicada en casos de inoculacin accidental, y en nifios nacidos de madres Hl3sAg positivas inmediatamente despus del parto. La vacuna actual, con antgeno de superficie obtenido mediante tcnicas de ingeuieri.a gentica, ha demostrado un alto poder inmunognico y ua

carencia de efectos dversos importantes. Se adniinistra en tres dosis (0,1 y 6 meses), pudiendo realizarse controles post-vacunacin para comprobar si se ha producido una respuesta adecuada (ttulos superiores a 10 mU/ml de HBsAc) . Se debe vacunar a la poblacin considerada de nesgo, tales como trabajadores sanitarios, personas con minusvalas psquicas , as como sus cuidadores y fmiliares, compafieros sexuales de portadores, pacientes en programas de dilisis, homosexuales, promiscuos, drogadictos, reclusos, vjeros a zonas de alta endemicidad. etc. 1 HEPATITIS B tBBsA) FUNDAMENTOS DEL MTODO muestra e pone en contacto con un anticuelpo monoclonal anti HBs inmovilizado sobre el soporte slido . Si la misma contiene antgeno HBsAg , ste formar un complejo con los anticuerpos y permanecer unido al soporte. La fraccin no unida se elimina por lavado tras lo que se agrega otro anticuerpo monoclonal anti HBs conjugado con peroxidasa. i Si se produjo la reaccin en la primera etapa del proceso, se unir el conjugado. Luego de un nuevo lavado se agrega el sustrato enzimtico. En los casos en que el HBsAg est presente en la muestra , habr desarrollo de color celeste. La reaccin se detiene con el agregado de acido sulfrico, con lo que el color celeste vira a amarillo. Reactivos Provistos * Policubeta sensibilizada : de tiras removibles con pocillos que contienen anticuerpo monoclonal anti-HBs inmovilizado. * Conjugado concentrado: anticueipo monoclonal anti-HBs conjugado con peroxidasa * Diluyente de conjugado: buifer Tris conteniendo aditivos y conservantes. * Revelador A: perxido de hidrgeno en buifer citrato. * Revelador B: Tetrametilbencidina (TMB) en HCI. * Stopper: acido sulfrico 2N. * Buifer de lavado concentrado: CI Na en buifer fosfatos. * Control Positivo: dilucin de suero inactivado, reactivo para HBsAg. * Control Jegativo: dilucin de suero inactivado , no reactivo. TCNICA Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las muestras antes de iniciar la prueba. Procesar simultneamente 2 Controles Positivos (CP) , 3 Controles Negativos (CN) y los Desconocidos. En los pocillos a utilizar de la policubeta colocar: Mezclar aplicando suaves golps. Leer en espectrofotmetro a 450 am

CN

Muestra Control Positivo Control Negativo

100 u! -

100 nl --

100 u!

Para evitar la evaporacin, cubrir la placa con una cinta autoadhesiva e incubar en estiifa 60 mm. a 37 C. Luego aspirar cuidadosamente el liquido de cada pocillo recibindolo en un recipiente para desechos biolgicos que contenga 5% de hipoclorito de sodio. A continuacin, lavar 5 veces con Buifer de lavado empleando aproximadamente300 ullvez/pocillo. Despus de cada lavado, el liquido se descartar tambin en el recipiente con hipoclorito. Al finalizar el ltimo lavado, invertir la policubeta y golpearla varias veces sobre el papel absorbente. Luego agregar en cada pocillo: Conjugado 100 nl 100 ul 100 u! Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta durante 10 segundos. Incubar durante 60 minutos en estufa a 37C. Luego proceder a lavado de la misma manera que indica arriba. Luego agregar: Revelador A 1 gota 1 gota 1 gota ReveladorB 1 gota 1 gota 1 gota

Mezclar con suaves golpes durante 10 segundos. Incubar 30 mm. a temperatura ambiente y luego agregar: Stopper 1 gota 1 gota

Criterios de validacin La corrida se considera vlida si se cumplen simultneamente las siguientes :ondiciones: a) Las lecturas de al menos 2 de los 3 Controles Negativos corregida con el Blanco de Reactivos deben ser menores o iguales a 0.150 D.O. b) La lectura media de los Controles Positivos corregida debe ser mayor o igual a 0600 D.O. i alguna de stas condiciones no se cumple, repetir la corrida. Interpretacin de los Resultados 1 a reactividad de la muestra se determina relacionando la absorbancia de la muestra iespecto al valor de cut-off.: Cut-off = CN +0.060 D.O Donde CN es el promedio de las lecturas del Control Negativo. Muestras Reactivas: Se consideran aquellas con absorbancias mayores o iguales al valor cut-off. Muestras No Reactivas: Se consideran aquellas con absorbancias menores que el valor cut-off. UECNICAMNOCROMATOGRFICA PARA HBsAa Funda xnento El HBsAg es un test de un solo paso para la deteccin cualitativa de antfgeio se superficie de hepatitis B en suero y plasma. El test est basado en un mtodo inmunocromatogrico. El HBsAg presente en suero o plasma reacciona con partculas de oro coloidal recubiertas con anticuerpos monoclonales de ratn contra el HBsAg. la mezcla migra por la membrana por capilaridad . Si el resultado es positivo, se formar una banda coloreada con la partcula compleja en la zona de la banda de prueba. La ausencia de una banda coloreada, en la zona. de prueba indica un resultado negativo. Como un control de procedimiento, siempre aparecer una banda de color en la regin de control, independientemente de la presencia de HBsAg en la muestra. jvopro vistos * Placa de reaccin: placa con anticuerpo anti HbsAg y partculas de oro coloidal recubiertas con anticuerpo monoclonal de ratn anti- HBsAg. TECNICA: 1,- Colocar los reactivos a temperatura ambiente 2.- Anotar en la placa de reaccin los datos del paciente 3.- Depositar en el pocillo marcado A , 2 gotas de suero plasma ayudndose con la pipeia provista.

4.- Agregar 4 gotas de diluente en el pocillo marcado B. 5 - Pasados 15 mm., leer los resultados como sigue. -9NEGATIVO POSITIVO HBsAg ****** c*************************************************************** POSITIVO HCV ************************************************* ******************** 321 c r:i:::::i:::::::::::::::::::]r c:] o AB

3 c [::E::::::: ::

21 :I::::::::::::] T [:J A

c 8

la determinacin y cuantificacin del RNA- VHC es til en las siguientes ocasioiies: deteccin temprana del cuadro clnico cuando los anticuerpos an son negativos estudio de pacientes con alteraciones de la inmunidad , que de alguna manera alteran el normal desarrollo de los anticuerpos. en hernodializados, inmunodeprimidos, trasplantados, etc. estudio de la posibilidad de la transmisin vertical. en la monitorizacin y seguimiento de la terapia antivfrica. VAS DE TRANSMISIN Se puede hacer por dos vas: Parenteral y no parenteral Parenteral: Es la ms frecuente, siendo responsable dei 90% de las heatitis postransfusionales. Tambin puede aparecer entre hemodializados (ya. sea por las dilisis en s o por las mltiples transfusiones) , en drogadictos por va parenteral, hemofihicos y trasplantados. No parenteral: Dentro, se encuentra la transmisin sexual tanto horno corno heterosexual, encontrndose valores de prevalencia muy similares a los de la poblacin general. La posibilidad de exposiciones percutneas ( como en personal sanitario)

IREVENCIN Se basa en las mismas actuaciones que frente a la hepatitis B , y en el establecimiento de protocolos en el caso de las exposiciones percutaneas. El problema postransfusional no est solucionado de una forma total, ya que en una hipottica infeccin aguda en sus primeros estadios, slo seria demostrable la viremia (no los anticuerpos) , por lo que podra proclucrse la transmisin. La utilizacin de vacunas no es fuctible de momento, debido a la gran variabilidad del virus, an cuando se han hecho ensayos en chimpancs utilizando protenas coificadas por los genes El y E2. FI diagnstico de la infeccin se realiza en base a la determinacin de los anticuerpos anti-HCV. Resulta importante su determinacin no solo para el diagnstiqo de la iifeccin, sino para el control de unidades de donantes en bancos de sangr y para distinguir de otras hepatitis crnicas de etiologa desconocida. IIEPATETIS C Anti-HCV FUNDAMENTOS DEL METODO fa miira se diluye en el soporte en el que se encuentra inmovilizada una nezcla de antgenos sintticos y recombinantes conteniendo secuencias de zonas antignicas de las p:otenas estructurales (core) y no estructurales (NS3, NS4 y NS5). Si las muestras de suero contienen los anticuerpos especficos , stos formarn un compJcjo cori los alitgenos y permanecern unidos al soporte. La fraccin no unida se elimina por lavado tras lo que se agregan anticuerpos antiinmunoglobulina humana conjugados con peroxidsa. Si se produjo la reaccin en la primera etapa del proceso, se unir el conjugado. -3Luego de un nuevo lavado se agrega el sustrato enzmtico y el cromgeno. En los casos en que se haya unido el conjugado habr aparicin de color celeste. La reaccin se detiene con cido sulfiirico, virando el color a amarillo. Reactivos Provistos * Policubeta sensibilizada : de tiras removibles con pocillos que contienen antgeno sinttico y recombinantes de hepatitis C. * Conjugado: anti-inmunoglobulina humana (cabra) conjugadas con peroxidasa. * Revelador A : perxido de hidrgeno en buifer citrato. * Revelador B : tetrametilbencidina (TMB) en HCI. * Sropper: H2S04 2N. Buifer de lavado concentrado: CiNa en buffer fosfatos. * Diluyente de muestras: albmina bovina en solucin fisiolgica. * Control -Positivo: dilucin de suero inactivado conteniendo anticuerpos contra HCV. * Control Negativo: dilucin de suero no reactivo inactivado. Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta durante 10 segundos. Para evitar la evaporacin, cubrir la placa con una cinta autoadhesiva e incubar en estufa 30 mm. a 3 C. Luego aspirar cuidadosamente el liquido de cada pocillo recibindolo en un recipiente para desechos biolgicos que contenga 5% de hipoclorito de sodio. A continuacin,

lavar 5 veces con Buifer de lavado empleando aproxirnadamente300 ulJvez/pocillo. Despus de cada lavado, el liquido se descartar tambin en el recipiente con hipoclorito. Al finalizar el ltimo lavado, invertir la policubta y golpearla varias veces sobre el papel absorbente. Luego agregar en cada pocillo: _______________________ ot Igota igota Mezclar aplicando suaves golpes en los laterales de la policubeta durante 10 segund Incubar durante 30 minutos en estufk a 3 7C. Luego proceder a lavado de la misma manera que indica arriba. -4-

TCN ICA Llevar a temperatura ambiente los reactivos y las muestras antes de iniciar la Procesar ntroles Positivos (CP), 3 Controles Negativos s a simultneamente 2 utilizar de la policubeta colocar: Co los Desconocidos. En los pocillo 1) Diluyente de Muestrs 20 Control Positivo Control Negativo Muestra 1 CP 0 nl 200 nl 10 u.l Oul CN 200 ni 10 nl -

prueb a. (CN y

Revelador A 1 gota 1 gota 1 gota__ Mezclar aplicando suaves golpes. Leer en a 450 nm Criterios de validacin La corrida se considera vlida si se cumplen simultneamente las sigtnentes condiciones: c) Las lecturas de al menos 2 de los 3 Controles Negativos corregidas con el Blanco de Reactivos deben ser menores o iguales a 0.150 D,O. d) Lailectura media de los Controles Positivos corregida debe ser mayor o igual a 0.600 D.O. Si alguna de stas condiciones no se cumple, repetir la corrida.

Interpretacin de los Resultados La presencia o ausencia de ncueipos anti-I-ICV se determina relacionando la absorbanca de la muestra respecto al valor Cut-ofl Cut-off = CN + 0.150 D.O Donde CN = es el promedio de las lecturas del Control Negativo. Zona de iideterzninacin: Cut-off +1-10% Muestras Reactivas: Se consideran aquellas con absorbancias superiores al lmite superior de la zona de indeterminacin. Muestras No Reactivas: Se consideran aquellas con absorbancias inferiores al lmite inferior de la zona de indeterminacin. Muestras Indeterminalas: Se consideran aquellas con absorbancias que caen dentro de la zona de indeterminacin Estas muestras deben ser ensayadas nuevamente. Luego agregar: -5-

RevelaclorB 1 gota Mezclar con suaves golpes ambiente y luego agregar: Stopper 1 gota

1 durante lO segundos.

gota

gota temperatu ra

Incubar 30 mm. a

gota

1 gota

En el cjadro hemtic2 en el perodo de incubacin, slo se observa una ligera neutiofiia que puede pasar inadvertida., En el estado prodrmico generimente se acompana de locitosis moderada, con linfocitosis absoluta y relativa. En e) poodo de estado tiene un cuadro leucocitario en el que se manifiesta a 1eucopen., que es tanto ms intensa cuanto ms lo sea la infeccin. La sedimentacin es normal en sus comienzos y slo se acelera al final de la enfermedad. Los lirnen tos y el agua contaminados son los mecanismos de transmisin. La enfeirnedad puede presentarse en tres formas distintas: gastroenteritis, septicemia cQnJjflendiversosr9nosy fiebre tifoidea. Una irueba aislada es de escaso valor, siendo necesarias 2o ms pruebas, seriadas a fin de poner en evidencia cambios en el ttulos de anticuerpos.

En la rnayoria de los casos se presenta anorexia, fiebre, decaimiento, y escalofrios, pudiendo aparecer luego compHcaclones importantes como las seas y neuropsquicas. Hwmcultivo En la primera semana tiene una correlacin diagnstica positiva (101 93%, la que desciende a un 75% en la segunday llega a u% en la tercer semana. Coprocultio y urocultivQ Slo Uene inters para identificar los portadores, que eliminan una gran cantidad de bacilos especialmente tiempo en que se hacen ms stios los cultivos. SeroaglutiflaciOfles lo se positiviza partir de la sgunda semana. Ttulopor debajo de 1/loo sepuede obseriar en los vacunados. Se debe buscar siempre con antgeno somtico O y con antQenofi?flIarH. Los ttulos flagelares pueden ser elevados en antiguos tifoideos. En cambio los del antkieno somtico O tienen valor diagnstico a ttulos bajos. Toda aglutinacin del OH con ttulo al 1/100 o ms es diagnstico de fiebre tifoidea. Hay que tener en cuenta que en los nios a veces no se observa respuesta del antgeno O y si del flagelar 11. REACCIN DE WIDAL Esun.ireaCCifl de aglutiifl que se utiliza en el diagnstico de las enfermedades Se puede realizar en pjca o en t La tcnica en pl tiene !a_venjde- ser una microtcni por lo que se de muesra; entre otras ventajas son: un tiempo mnimo, un menor costo, la sencillez del rntoct o. Fu n dimento Se basa en la bsqueda de anticuerpos arrtL.O1. ritW-4 presentes en el suero del los anqflq ico y p?raWcoS empleando una suspensifl de bacilg up, o at?nL , uC atircn observable a simple vista. Reactivos Suspensin de antgeno Paratfico A (antgeno flagelar). Suspensin de antgeno Paratfico B (antigeno flagelar). * Suspensin de antgeno Tfico O (antgeno somtico). Susp,nsin de antgeno Tfico H (antgeno flagelar). * Control Negativo: dilucin de suero negativo. * Control Positivo: dilucin de suero positivo. * Solucin fisiolgica. Material necesario Placa de vidrio Lpiz graso * Micropipetas * Varillas mezcladoras Reloj o tirner * Fuente de luz Muestra Obtener su3ro lmpido en forma estril, libre de hemlisis. No inactivar ni calentr, pues los anticuerpos son termolbiles Tcnica

En una placa de vidrio, se efectan divisiones cuadriculadas con un lpiz graso, colocando en fas filas horizontales los sueros en las cantidades indicadas en l esquema, y en las filas verticales una gota de los antgenos correspondientes Se mezcla con una varilla diferente para cada antgeno partiendo de la dilucin ms alta alancear la placa con movimientos circulares entre 1 - 2 minutos. bservar trente a una tuente de luz, realizan Ta1tur aTifestada por la presencia o ausencia de aglutinacin. Esquema de la tcnica Suero : 80u1 40u1 20u1 lOul 5ul Agregar Antgeno : lgta lgta lgta lgta lqta Mezclar Ttulo : 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 4s -3Interpretacin de los resultados Se considera ositivo, si hay jutinacin. El criterio de positividad se determina por la menor cantidad de suero capaz de producir aglutinacin, siendo sta Ijyorducin. j titulo se considerara positivo a la ltima dilucin ii da aglutinacin. Se considera negativo, cuando Valores referenciales Generalmente ttulos de 1/40 1/80 son sospechosos de enfermedad. Causas de error y reacciones cruzadas * Se debe tomar en cuenta la etapa de la infeccin en la que se solicita el 2fllSiS 3 que en una semana no hay anticuerpos circulantesi sse7, ila irs. de introciucido el grmen pero en un nivel bajo no detectable. * Se debe realizar primeramente un hemocultivo, posteriormente un coprocultivo para finalmente llegar a una reaccin de Widal a los 15 das donde recin son detectables los anticuerpos en el suero del paciente. * Existen zonas endmicas para Salmonelosis, en stas los pacientes padecen de enfermedad suhclinica encontrndose anticuerpos, en este caso se har la determinacin en forma seriada para detectar el incremento de antIcuerpos En zonas endmicas, la positividad se d entre 1/20 y 1/40 siendo un error considerar como positio, por lo que es importante conocer la procedencia del paciente. * La iacuna contra la salmonelosis da inmunidad por 3 - 4 aos aumentando la cantidad de anticuerpos anti H. En casos de pacientes vacunados o que hayan sufrido una infeccin previa dando resultados positivos se debe tomar en cuenta si e tItuio sube al hacer la prueba en forma seriada. * Las aglutininas H pueden encontrarse con ttulos altos durante meses en lOS vacunados o en antiguos tifoideos con enfermedades febriles intercurrentes Las aglutininasO en cambio tienen gran valor a ttulos bajos. Ttulos de 1/40 frente al antgono O y 1/100 frente al antgeno H son tan decisivos como un hernocultvo en os no vacunados. * Pacientes inmunodeprimidos o que presenten agammaglobulinernia, leucemia y carcinomas en fase avanzada los que no presentan respuesta

inmunolgica apraciable, presentan ttulos bajos aunque est presente la infeccin. * La toraputica con antibiticos, particularmente si se administra precozmente puede dismiiuir el ttulo de aglutininas (cloranfenicol, ampicilinas). * Las reacciones cruzadas a ttulos bajos se pueden presentar en casos de infeccin por E coH, Tuberculosis miliar, Klebsiellas, Proteus, etc. * La terapia antimicrobiana no destruye a los anticuerpos sino a los grmenes y los anticuerpos disminuyen. * Pam poder confirmar tina Salmonelosis se debe realizar dos reacciones de Widal distarciadas por 7 das, si un solo examen report ttulos altos podra tratarse de una infecc in reciente.

Fundamento. I:J!etolLsina O fillzada: La estreptolisina O, producida porTestreptococo beta hemoltico del grupo A. Uiii: h propiedad de producir hemlisis cuando se pone en contacto con glbulos rojos. Al colocar distintas diluciones de un suero que contenga antiestrepfcir O(Anticuerpos) en presencia de dosis constantes de estreptolisina O, se produc1 uni reac:in antgeno-anticuerpo que neutraliza la capacidad hemoltica de la misma. Este fenmeno se evidencia por una inhibicin de la hemlisis al agregar s.ispensir1 de glbulos rojos al 5%. El ttulo de antiestreptolisina ser la recproca de la mxima dilucin de! suero de paciente capaz de neutralizar totalmente la estreptolisina. Fundamento 2.-A3T0 LTEX: Los anticuerpos antiestreptolisina O se detectan en suero por su reaccin cori estreotolisina O adsorbida sobre soporte inerte de ltex. Los antici.itrpos antiestreptolisina reaccionan con la estreptolisina produciendo una aglutinacin visible macroscpicamente. Reactivos: Rectivo Ltex: suspensin de partculas de ltex poliestireno recubiertas con estrel)tolisina O. * Contra. Positivo: suero humano conteniendo antiestreptolisina O en concertiraciri. * Control Negativo: Suero humano no reactivo con el reactivo de ltex. * Solucin fisiolgica. Material requerido: Placa ce vidrio * Gotero Pdlilos mezcladores * Cronmetro * Lrr para de luz * Tubos Kahn (semicuantitativa) Tcnica: Llevar los reactivos y la muestra a temperatura ambiente. Agitar el Reactivo de Ltex antes de usar. L-YCNICA CUALITATIVA En uno de los crculos delimitados de la placa de vidrio adjunta al equipo colocar:

Reacilvo de Ltex 1 gota (50 UI) Muesra 1 gota (50 UI) Mezclar con palillo descartable (uno para cada muestra) hasta obtener una suspersin uniforme en la superficie delimitada de la placa. Inmediatamente disparar un cronmetro, balancear suavemente la placa y observar microscpicamente el resultado dentro de los 2 minutos. -2-

2...TCNICA CUANTITATIVA Los sueros positivos deben titularse efectuando diluciones seriadas en tubos de .ahn. y ) Colocar 0.5 ml de solucin fisiolgica en cada uno de los tubos. b) Agregar 0.5 ml de suero al tubo N1 y mezclar. c) Transferir 0.5 ml de esta dilucin I tubo N2 y mezclar, continuando as las diluciones hasta el ltimotubo. d) Las diluciones as obtenidas equivalen a 1:2, 1:4, 1:8, 1:16,1:32 e) Ensayar cada dilucin segn la tcnica cualitativa. Interpretacin de resultados: Positi,o : Aglutinacin que aparece dentro de los dos minutos. Se califica de 1 a 4 cruces. Negativo : Suspensin homognea. Valor Referencial: Hasta 200 UI/ml Ttulo: Inversa de la mxima dilucin a a que se produce aglutinacin visible macroscpicamente. El nivel aproximado de antiestreptolisina O en la muestra, puede ser caIcuada por la frmla siguiente; ASO (Ui/mi) =Ttulo x Sensibilidad d la reaccin Control de calidad: Es coneniente procesar simultneamente el control Positivo y control Negativo provistos, empleando una gota del control correspondiente en !ugar de la muestra y una gota del reactivo Ltex. Limitaciones del Procedimiento: 1 . Tiempos de reaccin mayores de 2 minutos pueden producir reacciones falsamente positivas por efecto del secado de los reactivos. 2.. Se pueden producir falsos negativos en nios mayores de 6 meses y menores de 6 aos o en iflfeccin reciente. Por lo que debe tenerse en cuenta que en este tipa de infecciones, un resultado aislado slo constituye n dato auxiliar, por lo quo se recomienda efectuar determinaciones seriadas cada 15 20 das durante 4 o 6n semanas. Lo genes responsables de la especificidad del grupo ABO tienen como locus (sitio especfico de un gen sobre un cromosoma) el brazo largo del cromosoma # 9. CARACTERSTICAS DE LOS ANTGENOS Los antgenos del sistema ABO estn compuestos por

rnucopolisacridos(Hidratos de carbono y aminocidos). CARACTERSTiCAS DE LOS ANTICUERPOS Los anticuerpos del sistema ABO son: * lg de tipo lgM * Dar, aglutinacin de 3 cruces Son anticuerpos fros, reaccin a T ambiente (4 - 200) * Son anticuerpos salinos, naturales, porque estn presentes en el organismo sin que esten presentes los antgenos correspondientes. MTODO EN LMINA FUNDAMENTO Los gbulos rcjos del paciente se ponen en contacto con Reactivo Anti-A, AntiB, o Anti-AE monoclonal, Si existen en la superficie 6 membrana de los eritocrtos los antgenos correspondientes, se producir una aglutinacin visible macroscpicamente. La ausencia de aglutinacin en todos los casos, irnplca gupo O. Reactivos * Suero Anti A, Anti B, o Anti A, B monoclonal. Reactivos preparados a pirtir de ancuerpos monclonales secretados por lneas celulares de hibridomas de ritn. U) (U,cr) t O Muestra Obtener sangre entera aspticamente, con o sin anticoagulante. leiiacin 1.Tcnca en placa: En una paca limpia y desengrasada, colocar una gota del Reactivo Anti-A, AntiE3, o Anti A, B monoclonal, agregar 1 gota de sangre, Mezclar el reactivo y los glbuks con un paHilo rJescartabje y cubriendo un rea circular de 2cm. de dimetro y balancear la placa contInuamente, Observar aglutinacin visible macroscpicamente hasta los 2 minutos. No debe emplarse microscopio. U fl(.-- , 2.- Tcnita en tubo (Celular o antignica- por centrifugacin) Preparar previamente una suspensin de glbulos rojos al 3 - 5%. En un tubo de hemlisis, colocar una gota del Reactivo Anti-A, Anti-B o Ant A, B monoclonal, agregar 1 gota de suspensin de glbulos rojos al 3 - 5%. Mezclar y centrifugar durante 20 segundos a 3500 rpm. Agitar el tubo para despegar las clulas y examinar macroscpicamente la preseca o ausencia de aglutinacin. 3 cnica en tubo ( por sedimentacin) Preparar previamente una suspensin de glbulos rojos al 3 - 5 %. Colocar en un tubo de hemlisis una gota de Reactivo Anti-A, AntiB, Anti-A, 8 monoclonal, agregar una gota de suspensin de glbulos roios a35% Mezrar e incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente. Agitar el tubo para despegar las clulas y examinar macroscpicamente la

agk.:tinan 4.- Prueba srica o inversa Marcar en tres tubos de ensayo: A, B, O Coloar en cada tubo 2 gotas del suero problema (sin antisueros). Agregar a cada tubo la Suspensin de Glbulos rojos al 5%. Centrifugar todos los tubos 15 segundos a 3400 rpm o 1 minuto a 1000 rpm. Leer hemlisis o aglutinacinen los tubos respectivos y anotar resultados. !ntecin de los resultados La observacin de aglutinacin (con cualquiera de las tcnicas utilizadas) indica una reacin positiva. Con! Antisueros Anti./k Anti-B Grupo sanguneo (+) (-) A (+) 8 () (-) O (+) (+) AB (ii-) (-) variantes dbles del grupo A como Ax Control_de calidad ntrol d alidad puede efectuarse ensayando glbulos rojos tipificao3. Causas de error * Baji reactividad del antisuero * Contaminacin bacteriana * Aamiento de los eritrocitos (Roleaux) esto se comprueba por el agregado do 2 gotas de solucin fisiolgica, si el grumo no se deshace, es una agutinacin verdadera, caso contrario es una seudoaglutinacin Tiempo de lectura inadecuado * Temperatura inadecuada para el desarrollo de la prueba. * Material viejo, sucio o rayado. La regulacin de la persistencia de clulas B infectadas se realizara en el ganglio linftico mediante seales que provienen del virus o del ambiente. Para mentener la per&stenia de la infeccin latente los linfocitos B infectados por e! VEB de la sangre perifrica podran recibir seales en el ganglio linfatico que le cambien al programa de EBNA-1. En este programa se expresara slo esta protena, que es necsari para replicar el episoma y, por lo tanto, para la proliferacin. La ventaja de este programa es que EBNA- 1 es la nica protena codificada por el virus que contiene una secuencia peptdica no reconocible por los CTLs. Este programa es un mecanismo que mantiene el nivel de clulas infectadas de forma latente favoreciendo que stas no sean detectadas por el sistema inmune. Es el eciuivaleme al tipo de latencia 1 del otro modelo. Durante [i infeccin aguda y probablemente en las reactivaciones es necesani la expansin y diseminacin de la infeccin, para eNo se inducira en tos linfocios B el programa de crecimiento, que es anlogo al tipo de latencia III del rnodlo anterior, que permitira la expansin del virus, pero que, a su vez, al generar cluas inmortales podria constituir una amenaza para el husped. Sin embargo, cuando a clula B entra en este programa expresa diferentes protenas inmurgenas (EBNAs y LMPs) que inducen una respuesta. El papel de los CTLs seria mpedir la supervivencia de los linfocitos B infectados por el VEB que expresen un programa de crecimiento y as minimizar el riesgo de acontecimientos secundanos que favorezcan el desarrollo de linfomas.

ANTICUERPOS HETERFILOS stos son muy manifiestos, con afinidad para los antgenos relacionados con los glbulos rojos de carnero o bovino. Son anticuerpos de tipo lg M y se conocen con el nombre de reaccin de Paul Bjnnell los que se dtectan con glbulos rojos de carnero. Aparecen en las dos primeras semanas y persisten entre 2 y 3 meses. El rin de cobayo contiene el antgeno de Forssman pero no el de la mononucleosis y los eritocitos de bovino contienen el antgeno heterfilo de la mononucleosis, pero n el de Forssman. Los eritrocitos de caballo son los indicadores,en vez de los de cordero. Se coflsicera esta reaccin ms espocfica y segura para los anticuerpos heterfitos de a mononupleosis que la que emplea eritrocitos de cordero. Tiene una seguridad diagnstica del 96%, contra un 81% de la de Paul Bunneli. PRUEEADE AGLUTINACIN EN PLACA FUNDAMENTO Los anticuerpos heterfilos asociados a la mononucleosis infecciosa se detectan por su capacidad de aglutinar los eritrocitos de caballo, previa neutralizacin de los anticuerpos heterfilos no asociados a la Mononucleosis infecciosa (anticuerpos Fors3man) con extracto de rin de cobayo. De esta manera, los anticuerpos heterTlos asociados a la mononucleosis infecciosa se unen especficamente a los eritrocitos, producindose una aglutinacin visible rnacroscpicarnente.

Rea ctiv os * Eritrocitos : suspensin de eritrocitos de caballo estabilizados. * Reactivo GPK: extracto de rin de cobayo en Solucin (para la neutralizaDin de los antinuerpos Forssman). * Control Positivo: dilucin de suero positivo equivalente a 2 3 cruces. * Control Negativo: dilucin de suero negativo. * Solucin fisiolgica. Tcnica: PrUE ba de s&eccin / Colocar una gota (50 UI) de Muestra nactivada en uno de los crculos de la pca provista. Colocar en los otros crulos una gota (50 UI) de Control Positivo y una qota (50 uf) de Control Negativo respectivamente. Adicionar a acada uno de los crculos una gota (50 UI) de eritrocitos perfectamente hom.geneizados. Mezclar hasta obtener una suspensin uniforme en toda la superficie del crcuo, empleando un palillo o varilla de vidrio. Inmediatamente disparar un cronmetro, balancear suavemente fa placa y observar macroscpicarnente el resuIado dentro de los dos minutos. Para una correcta visualizacin de los resultados, debe mantenerse la placa sobre un fondc negro y ligeramente por encima de una fuente luminosa. A los resutados positk,os debe realizarse la prueba conffrmatoria. Prueba_Confirmatoria Colocar una nueva gota de muestra inactivada en uno de los crculos de la

placa Hmpia y sec. Agregar una gota de Reactivo GPK y mezclar con palillo. Adicionar una gota de Eritrocitos homogeneizados. Mezclar hasta obtener una suspensin uniforme, disparar el cronmetro y observar macroscpicamente el resultado dentro de los dos mh,utos. Titula cin Los sieros positivos y confirmados, deben titularse efectuando diluciones seriadas: a) Coocar en unos tubos 0.5 ml de Solucin fisiolgica. b) Agregar al primer tubo 0.5 ml de la muestra inactivada en cuestin y mezc! ar Transferir 0.5 ml de esta dilucin al segundo tubo y mezclar continuando de esta forma las diluciones hasta el ltimo tubo. Las dIuciones as obtenidas equivalen a 1/2; 1/4; 1/8; 1/16. Tomar una gota de cada dilucin y ensayar segn la prueba confirmatoria. r)jcin_d_eJos resultados Positvo : Aglutinacin que aparece dentro de los dos minutos Se califica de 1 a 4 cruces. Negaivo : Suspensin homognea. En la Prueba de seleccin, un resuJtado positivo indica la presencia de anticuerpos heterfilos que pueden o no estar asociados a la Mononucleosis infecciosa Por fo tanto la reaccin no debe darse como positiva para Mononucleosis sin antes confirmar el resultado (efectuando la neutralizacin de los anticuerpos Forssrnan). En la Prjeba confirmatoria, con reactivo GPK, que neutraliza los anticuerpos de Forssrnan, un resultado positivo indica la presencia de anticuerpos heterifios asociados a la Mononucleosis infecciosa. En la Fitulacion el titulo se expresa como la inversa de la maxima dIur ron a la qe se produce aglutinacin visible macroscpicarnente. 3.- Inmunoprecipitacin Consiste en la demostracin de anticuerpos anti-VIH en el suero, que en presencia de protenas vricas marcadas radiactivarnente conduce a la formacin de inmunocomplejos. Los complejos protena viral-anticuerpo especfico son separados por tcnicas electroforticas segn su peso molecular y se ponen en evidencia mediante la impresin del marcaje radiactivo en placa fotogrfica, obteniendo un patrn de bandas similar al de WB. 4.- Reaccin de amplificacin genrnica por reaccin en cadena de la polimerasa (POR) La base de este diagnstico reside en la demostracin de parte del genoma vrico a partir de muestras de sangre perifrica. Estas tcnicas logran un diagnstico ms rpido y precoz de la infeccin VIH en situaciones en las que el diagnstico clsico serolgico puede tardar en confirmarse: a) Recin nacidos de madres infectadas por VIH o con antecedentes de riesgo de infeccin VIH durante el embarazo, y en sujetos con perodos ventana ms largos del habitual. b) Demostracin de infecciones por VIH-2 con serologla no concluyente, infecciones dobles por VIH-1 y VIH-2. c) Deteccin de mutaciones especficas asociadas a la resistenci a los antivricos empleados en la traputica antiVll-I.

Fundamento Especficamente, los pocillos microelisa se hallan recubiertos con una mezcla de antgenos 111V: HIV-1 p24 recombinante, HIV-1 gplGO viral y pptido sinttico HIV-2 env (aminocidos 592 - 603). Cada pocillo microelisa contiene una esfera de conjugado marcada con HRP de la misma mezcla de antgenos 111V. El diluyente de muestras, que se adicionan en primer lugar a los pocillos, disolver la esfera de conjugado. A continuacin, se incuba la muestra problema o control apropiado conteniendo anti-HIV1 o anti-HIV-2 en los pocillos microelisa. Si los anticuerpos frente a HIV-1 y/o HIV-2 estn presentes, se formar un complejo de antgeno en fase slida/ariti-HIV/ antgeno marcado con enzima. Despus de lavar e incubar con sustrato TMB, se produce un color que se vuelve amarillo cuando la reaccin se para con cido sulfrico. Si antiHIV1 y/o anti-HIV-2 estn presentes en la muestra, se desarrolla un color intenso. Si la muestra est libre de anti-HIV, al aadir el sustrato no se forma color o es dbil. Reactivos * Placas de tiras microelisa: Pocillos ,ecubiertos con una mezcla de HIV-1 p24, 1 llV-1 gp 160 e 111V env (aa592 - 603). marcado con HPR. * Control negativo: Suro humano rio reactivo a anti-HIV. Conservantes. * Control anti-HIV-1 positivo: Suero humano conteniendo anti-HIV-1 monoclonal humano. Conservantes. * Control anti-HIV-2 positivo: Sueio humano conteniendo anti-1-IIV-2 monoclonal de ratn. Conservantes. * Diluyente de muestras: Contiene protena estabilizadora y detergente. Conseivantes. * Tampn fosfato concentrado * Solucin TMB: Tetrametilbencidina en cido ctrico. * Solucin de perxido de rea. * Pinza y varilla. * Precintos para las placas. Precaucin Manipular con cuidado; material potencialmente infeccioso. Los sueros controles han sido examinados para el antgeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y anticuerpos frente al virus de la hepatitis C (HCV) encontrndose no reactivos. Todos los materiales empleados en el ensayo deben ser destruIdos a fin de asegurar la inactivacin de agentes patgenos. Los lquidos de desecho pueden ser desinfectados con hipoclorito de sodio (concentracin final 5%) durante por lo menos 60 minutos. Muestra La sangre debe recogerse mediante venipuncin normal y manejarse con precaucin segn los procedimientos normales de laboratorio. Obtener suero o plasma para el que no se observaron efectos adversos utilizndo citrato, heparina o EDTA como anticoagulantes. Tcnica

Preparar el soporte con la cantidad necesaria de las tiras microelisa.Quitar los precintos. Pipetear 100 ul de diluyente de muestras en todos los pocillos, incluyendo los pocillos de control. Pipetear 50 ul de muestra o control en los pocillos. Incluir tres controles negativos y un control anti-HIV-1 positivo en cada sporte. Si se desea, puede incluirse un control anhiHIV-2 positivo (5Oul) en cada soporte Incubar las tiras a 37+- 2ac durante 60+-5 minutos. Lavar e inundar cada pocillo seis vecos con tampn fosfato, preparado previamente. Pipetear 100 ul de susirato TMB en cada pccillo. No mezciar ni agitar. Desechar el sustrato TMB no utilizado. Incubar las tiras a 18 25C durante 30+-2 minutos. Pararla reaccin por adicin de 100 ul de cido sulfrico lmol/l a cadd pocillo. Las placas deben leerse antes de !as 2 horas. Hacer el blanco al aire (sin el soporte y tiras adentro) y leer la absorbancia de la solucin de cada pocillo a 450 -nm (longitud de onda nica).