Cultivo celular, siembra de inóculos y visualización de

hongos y bacterias
Matiz Gómez C, Vargas Buenaventura J
Departamento de química, programa de bioingeniería Universidad el bosque, Bogotá Colombia

Un medio de cultivo es un grupo de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que generan
las condiciones necesarias para el desarrollo de diferentes microorganismos. Debido a que la diversidad
metabólica de los microorganismos es muy amplia, existen varios tipos de medios de cultivo. En esta
práctica se utilizan tres en específico: Peptona Dextrosa Agar (para hongos), Agar-harina de avena (para
hongos) y Saburaud Dextrosa Agar (para bacterias), realizando el respectivo cultivo de cada una de ellas,
teniendo en cuenta los diferentes métodos de siembra de inóculos (por dispersión, punto, estrías y puntos);
con el fin de llevarse a cabo la visualización y diferenciación de las estructuras celulares de los hongos
y las bacterias. Al finalizar el tiempo de incubación necesaria de cada uno de los cultivos, y aplicando la
técnica de tinción, se logra observar en el microscopio diferentes estructuras en los hongos como lo son:
micelios, esporas, esporangios y conidióforo, y en las bacterias gram-negativas (muchas de las estructuras
no se lograron identificar debido a que algunos de los objetivos del microscopio se encontraban rayados
o dañados). La identificación de cada una de las estructuras de los hongos permite saber en qué
condiciones se encuentra este y la identificación de las bacterias por medio de la tinción de gram positiva
y negativa permite determinar su clasificación morfológica,

I. INTRODUCCIÓN
En el medio ambiente habitan millones de
microorganismos con distintas necesidades, basadas
en sus mecanismos de desarrollo y reproducción.
La siembra en la microbiología es el proceso en el
cual se lleva una porción de una población de
microorganismos (inóculo) de un cultivo crecido a
un medio nutritivo para su correcto crecimiento; este
proceso se lleva a cabo con instrumentos y medios
previamente esterilizados, es importante siempre
trabajar cerca a la llama del mechero ya que este es
un a ambiente estéril, esto evitará la contaminación
de los medios. [1]
Para el estudio de bacterias y otros
microorganismos que son cultivables, es necesario
conocer y reconocer su morfología tanto
macroscópica como microscópica a partir de su
crecimiento en distintos medios de cultivo.
permitir el crecimiento de microorganismos.
Durante esta práctica veremos cómo crecen bacterias
de un lácteo y hongos de fruta y pan.
Existen técnicas adecuadas para llevar a cabo los
cultivos, la más usada es la transferencia de
microorganismos de un ambiente a otro, con el
propósito de determinar los caracteres de los hongos
o bacterias.
También se observan las técnicas de tinción, que
se pueden definir como: técnicas auxiliares
utilizadas en la microscopia para la mejora del
contraste de la imagen vista en el microscopio, estos
colorantes o tinturas son usadas frecuentemente en
biología y medicina para resaltar estructuras de
tejidos, ayudan a observar a grandes rasgos
diferentes estructuras que a simple vista no se
pueden distinguir. [2]

Un medio de cultivo consta de un gel o una II. METODOLOGÍA

solución que contiene los nutrientes necesarios para
 Siembra:
Para la siembra de inóculos primero se lleva
a cabo la respectiva rotulación de las cajas de
Petri en las cuales están conservados los
distintos medios de cultivo, posterior a esto
se inicia con la siembra.
En el medio PDA (Peptona Dextrosa Agar),
se utiliza la técnica de sembrado por punto,
para comenzar se flamea el asa y se toma un
tozo de la fruta donde se pueda observar el
hongo (preferiblemente el micelio) y se
introduce cuidadosamente en el centro del
cultivo; se lleva a la incubadora a 28°C
durante 5 días.
Para el cultivo en AV (Avena) se llevó a cabo
la técnica de siembra por dispersión, se
flamea el asa y dejar enfriar, se toman
fragmentos de los hongos del pan (levaduras)
y se dispersan las esporas del hongo
directamente en la superficie del medio de
cultivo cerrar la caja y llevar a la incubadora
durante 5 días a 28°C.
Finalmente para la siembra en SAB
(Saburaud Dextrosa Agar) se divide la caja
en dos cuadrantes en los cuales se llevará a
cabo la siembra de bacterias del yogurt por
medio de dos técnicas, estrías en el primer
cuadrante, páralo que necesitamos flamear el
asa y tomamos unas gotas de donde se
encuentra el material biológico y trazamos
varias estrías sucesivas. En el segundo
cuadrante se sembrara por la técnica de
puntos, para esto esterilizamos la aguja
microbiológica y tomamos un poco del
material bilógico y colocamos varios puntos
en el medio del cultivo; llevar a la incubadora
a 37°C durante 7 días.
Figura 1. Siembra de inóculos.
 Visualización:
Para observar las estructuras celulares de los
hongos y bacterias obtenidas en los cultivos
anteriores se lleva a cabo la técnica de
tinción para mejorar la imagen vista en el
microscopio.
Para los hongos se toma el porta objetos y se
coloca una gota de azul de lactofenol y con
la técnica de observación de cinta adhesiva
toma cuidadosa mente el hongo del cultivo y
se pega en el porta objetos para ser llevado al
microscopio (cuando se lleva el microscopio
al objetivo 100X colocar una gota de aceite
de inmersión y el cubre objetos)
En las bacterias se flamea el asa y se toma
una gota del cultivo y se coloca en el
portaobjetos, con ayuda del asa extender la
suspensión hasta lograr una capa fina,
colocar el cubre objetos evitando que queden
burbujas. Secar la preparación acercándola
cuidadosamente al mechero (no dejar
calentar tanto la muestra). Cuando la muestra
este seca se pasa tres o cuatro veces por el
mechero para realizar la fijación. Para la
tinción se toma un porta objetos y se realiza
la extensión del cultivo bacteriano y cubrirlo
con violeta de genciana (C24H28N3Cl) y dejar
actuar durante un minuto, enjuagar con agua
destilada y añadir lugol, pasado un minuto
decolorar con alcohol, cubrir con safranina y
 un minuto después lavar con agua corriente y
dejar secar a temperatura ambiente, colocar
una gota de aceite de inmersión en el cubre
objetos y observar en el microscopio.
III. RESULTADOS
 Crecimiento de hongos en la levadura
(pan):
Pasados los 5 días de la incubación, se
obtuvo el crecimiento de hongos en medio
AV (Agar-harina de avena) por el método de
dispersión, este medio de cultivo cuenta con
nutrientes que estimulan el crecimiento de
los hongos puesto que tienen una fuente de
energía como lo son los carbohidratos. El
correcto crecimiento de los hongos se puede
evidenciar en la figura 2, y cuando la muestra
es llevada al microscopio solamente se
logran observar algunas estructuras puesto
que los objetivos se encontraban rayados y
esto dificulto la identificación como se
puede observar en la figura 3.
Figura 2. Cultivo de hongos por el método
de dispersion en medio AV (Agar-Harina de
avena).
Micelio
Esporas
Esporangio
Figura 3. Esporas, micelio y esporangio;
objetivo 40X cultivo de hongos en medio
AV.
 Crecimiento de hongos en la fruta:
Después de haber estado sometido a una
temperatura de 28°C durante 5 días, se
obtuvo el crecimiento de hongos en el medio
de cultivo PDA (Peptona Dextrosa Agar) con
el método de sembrado por punto como se
puede observar en la Figura 4, no se obtuvo
contaminación, esto quiere decir que el
método de siembra fue exitoso, Al llevarlo al
microscopio observar que los objetivos
estaban rayados, sin embargo esta vez sí se
pudo observar al máximo (100X) como
muestra la Figura 5.
Figura 4. Cultivo de hongos por el método
de punto en medio PDA (Peptona Dextrosa
Agar).
 Conidióforo
Gram- Negativas
Micelio
Esporas
Figura 5. Conidióforo, micelio y esporas;
objetivo 100X, cultivo de hongos en medio
IV.
PDA.
 Crecimiento de bacterias en el yogurt:
A 37°C durante siete días estuvo el inóculo
de bacterias en medio de cultivo SAB
(Saburaud Dextrosa Agar) con los métodos
de cultivo de puntos y estrías como se
evidencia en la Figura 6, las bacterias se
encontraban muertas, y algunos factores que
pueden estar implicados es que el tiempo o la
temperatura de incubación no era la indicada.
A pesar de ello la muestra se lleva al
microscopio con el fin de identificar las gram
positivas y negativas como se puede observar
en la figura 7.
Figura 6. Cultivo de bacterias por los
métodos de estrías y puntos en medio SAB.
Figura 7. Gram-Negativas; objetivo 100X,
cultivo de bacterias en medio SAB.
ANÁLISIS DE RESULTADOS
• Hongos: A partir de la técnica de
observación con cinta adhesiva, se
identificaron las siguientes estructuras:
esporas, esporangios, conidióforos y micelio.
Las esporas y esporangios corresponden a las
estructuras más frecuentemente encontradas
en la práctica, tanto en la muestra tomada del
hongo cultivado en medio de avena
(levaduras-pan) como en la muestra obtenida
a partir del hongo cultivado en PDA (fruta).
Los conidióforos escasamente se pudieron
observar durante la práctica, y sólo fue
posible identificarlos en la muestra tomada
del medio cultivado en avena. Así mismo, el
micelio fue prácticamente inadvertido, ya
que se encontró una única estructura
diminuta en la muestra proveniente del
mismo medio (avena). Esto sugiere que, a
pesar de la alta presencia de esporas (lo cual
indica que en su momento el hongo creció, se
desarrolló y proliferó de manera adecuada,
como se pudo observar en las cajas de Petri),
el desarrollo del hongo se vio ciertamente
disminuido, lo cual limitó así mismo su
reproducción. Esto pudo haber sucedido
debido a la ausencia de micelio y la
subsiguiente falta de nutrientes, lo cual
supone condiciones poco favorables para los
mecanismos de desarrollo y reproducción del
hongo.
Sin embargo, hay que tener en cuenta que la
identificación de estas estructuras se vio
limitada debido a que los lentes de los
objetivo del microscopio se encontraban
rayados, con lo cual la calidad de la imagen
obtenida no era 100% óptima. Así mismo, la
presencia de algunas impurezas en los lentes
del objetivo dificultó la determinación del
grado de concordancia de las estructuras
observadas en el microscopio con las
estructuras propias del hongo.
• Bacterias: Una vez realizada la
tinción bacteriana, se determinó que los
microorganismos bacterianos encontrados en
la caja de Petri corresponden a bacterias
Gram negativas, ya que adquirieron la
tonalidad rojiza característica de la safranina.
Esto se debe a que la pared celular de este
tipo de bacteria contiene una capa más fina
de peptidoglucano, por lo cual la célula
tiende a adquirir la coloración del último
reactivo utilizado, que en este caso
corresponde a la tinción rojiza de la
safranina. Así mismo, analizando su
morfología a partir de las imágenes obtenidas
con el microscopio, se clasificó a los
microorganismos encontrados como bacilos,
ya que corresponden con la forma de “barra”
de este tipo de bacterias.
Sin embargo, los microorganismos
encontrados no corresponden con una
colonia de Lactobacillus bulgaricus
(bacterias empleadas en el proceso de
fermentación de la leche para la elaboración
de productos como el yogurt y el queso), ya
que está última es una colonia de bacterias
Gram positivas, mientras que las bacterias
encontradas son de tipo Gram negativas. Una
posibilidad es que las bacterias encontradas
correspondan al género Prevotella, las cuales
son bacterias en forma de bacilos, de tipo
Gram negativas, propias de la flora
bacteriana oral. [1]
V. DISCUSIÓN
 Artículo Científico
 Explique, ¿Cómo funciona la
biorremediación en suelos
contaminados por fertilizantes
nitrogenados?
En este proceso de biorremediación
se utilizan microorganismos
bacterianos con capacidad para
utilizar formas de nitrógeno
inorgánico o amonio provenientes de
fertilizantes nitrogenados (como la
gallinaza y la urea) como fuente de
energía o aceptores/donadores de
electrones dentro de sus dinámicas
metabólicas, transformando así estos
contaminantes en sustancias menos
peligrosas que pueden ser liberadas a
la atmósfera.
 Explique, ¿Qué es un consorcio
bacteriano?
Un consorcio bacteriano es un
conjunto de diversas especies de
bacterias, incluso de distintos
géneros, que interactúan entre sí con
el objetivo de generar un mutuo
beneficio, posibilitando así la
supervivencia de todas las colonias.
 Elabore una tabla donde relacione
todos los microorganismos
identificados en las muestras
analizadas en el artículo y sus
características principales.
Tabla 1. Organismos identificados
y sus principales características.
Microorgani Características a los
smo Principales desinfectantes.
- Bacteria de [2]
suelo
originalmente - Habitantes
nombrada comunes del
Bacillus debido a su suelo y del
megaterium gran tamaño agua, que
con respecto a también se
E. Coli. Pseudomona pueden
- Produce s stutzeri encontrar en
enzimas útiles las superficies
como amilasas de plantas y
y proteasas animales.
que tienen - Son
usos reconocidas
industriales. por su
- Forma: versatilidad
Bacilos. metabólica, ya
- Gram que pueden
positivas. crecer bajo una
- Temperatura variedad de
Óptima: 37 ºC condiciones de
[2] crecimiento y
no necesitan
- Bacterias que ningún factor
habitan en el de crecimiento
suelo y forman orgánico.
fácilmente - Forma:
Bacillus endosporas Bacilos.
licheniformis (células - Gram
especializadas negativas.
). - Temperatura
- Industrialment Óptima: 32 ºC
e son [2]
utilizadas para
producir - Especies
agentes altamente
enzimáticos. distribuidas en
- Gram la naturaleza,
positivas. Acinetobacte aisladas del
- Sus esporas r sp suelo y el
son altamente agua.
resistentes al - Se asocian con
calor, el frío, a infecciones
la desecación, nosocomiales,
a la radiación y que incluyen
 neumonía, 90% de los
meningitis y Staphylococc
sepsis us aislados en
- Forma: la piel.
Cocobacilos. - Gram
- Gram positivas.
negativas. - Forma: cocos.
- Inmóviles. [2] [3]

- Bacterias - Bacterias
capaces de comensales o
sintetizar ácido habitantes del
Propionibact propiónico suelo / agua
erium sp mediante el Corynebacte dulce
uso de enzimas rium sp - Algunas
poco usuales. especies
- Gram positiva. pertenecientes
- Anaerobias. a este género
- Forma: son patógenos
bacilos. [2] oportunistas,
especialmente
- Bajo inmunocompr
enfermedades ometidos.
inmunosupres - Reciben su
Peptostrepto oras o nombre por
coccus sp traumáticas su forma
estos celular
organismos de "barra
pueden anudada".
convertirse en - Gram
patogénicos. positivas. [2]
- Anaerobias.
- Gram - Bacterias
positivas. cuyo hábitat
- No forman natural es el
esporas. suelo. Sin
- Forma: Clostridium embargo,
Cocos. [2] sp están
ampliamente
- Bacterias distribuidas
residentes de en el
la piel y ambiente,
Staphylococc mucosas sanas habitando en
us del ser el tracto
coagulasa- humano que gastrointestin
negativa constituyen al tanto de
entre el 65 al humanos
 como combinar y complementar las
animales. funciones metabólicas de las
- Anaerobios diferentes especies de
- Forma: microorganismos. Este esfuerzo
Bacilos. colectivo aumenta la efectividad del
- Gram proceso.
positivos.
- Temperatura
Óptima: 37  ¿Cuáles son las ventajas de utilizar
ºC [4] consorcios nativos de bacterias?

- Bacterias que El uso de consorcios nativos de

pueden ser bacterias permite optimizar el
Actinomyces desde proceso de desnitrificación de los
sp microaerofíli suelos, a través del trabajo conjunto
cas hasta de las distintas especies de bacterias,
anaerobias. mejorando así tanto la calidad de los
- Suelen suelos como las dinámicas
hospedarse metabólicas, de desarrollo y
en humanos, reproducción de los diferentes
caballos y
microorganismos que hacen parte de
ganado.
- Gram dicho consorcio. De esta manera, el
positivas. proceso es útil y beneficioso para
- Forma: ambas partes.
Bacilos. [5]
 ¿Cuál es la recomendación que
sugiere el artículo para futuros
trabajos en este campo?
 ¿Qué significa la unidad UFC/g?
Con respecto a la determinación de
Unidad formadora de colonias sobre una concentración bacteriana óptima
gramo de suelo. La unidad formadora para la desnitrificación, el artículo
de colonias es una unidad de medida recomienda, para futuros ensayos, el
utilizada en la cuantificación de probar diferentes asociaciones
microorganismos. bacterianas y diferentes
concentraciones de las mismas.
 Según el análisis del artículo, ¿Por
qué se considera que el consorcio Por otra parte, para obtener una
bacteriano aislado llevó a cabo el identificación más completa de los
proceso de desnitrificación de una microorganismos involucrados en el
manera efectiva? proceso, el artículo recomienda
utilizar técnicas de biología
La utilización de un consorcio molecular para la identificación de
bacteriano para llevar a cabo el microorganismos difíciles de
proceso de desnitrificación permite recuperar.

 HONGOS
 Explique, ¿Cuál de todos los medios
de cultivo fue el mejor para el
crecimiento de hongos?
Según los resultados presentados
anteriormente, el medio de cultivo en
el que se evidenció un mayor
crecimiento de hongo fue en el medio
de agarosa-harina de avena. Sin
embargo, también se observó un
crecimiento favorable del hongo en el
medio de cultivo de PDA (Potato
Dextrose Agar). El principal factor
que marcó una diferencia
significativa en la dispersión y
crecimiento del hongo fue el método
de sembrado. En el medio con PDA
se utilizó un método de sembrado por
punto, con lo cual el hongo creció en
una zona localizada, en vez de
dispersarse a lo largo del medio. Por
su parte, en el medio con avena se
utilizó el método de sembrado por
dispersión, de manera que el hongo
pudo crecer y extenderse, cubriendo
casi por completo la superficie del
medio.
 Por la morfología macroscópica y
microscópica, ¿Cómo puede ser un
hongo? Explique su respuesta.
Según su morfología, los hongos
pueden ser unicelulares (levaduras) o
multicelulares (filamentosos). Los
hongos unicelulares, como se puede
esperar, son muy sencillos, mientras
que los hongos pluricelulares están
formados por estructuras en forma de
red muy complejas llamadas
micelios. El tamaño del hongo
(macroscópico o microscópico)
puede ser un factor determinante en
cuanto a la cantidad de estructuras
diversas que lo componen.
 ¿Qué parámetros se deben
considerar para hacer una
identificación microscópica de los
hongos?
Para hacer una identificación
microscópica de hongos se deben
tener en cuenta principalmente el
parámetro morfológico. En este
aspecto es importante definir la forma
celular, así como identificar
estructuras como hifas,
blastoconidias, clamidosporas,
artrosporas y ascosporas, micelio,
conidióforos, entre otras estructuras
propias de los hongos filamentosos.
También se puede tener en cuenta el
parámetro bioquímico, realizando
diversas pruebas que permiten
identificar las diferencias en las
dinámicas metabólicas de las
levaduras y los hongos filamentosos.
[6]
 Mencione los grupos de esporas por
las cuales se reproducen los hongos.
o Esporangiosporas: Son las
esporas producidas dentro del
esporangio. Se liberan al
medio cuando el esporangio
se rompe.
o Conidiosporas: Se denomina
conidias a las esporas que se
forman libres en la punta de
las hifas. En este caso, la
 estructura especializada
donde se forman se denomina
conidióforo.
o Artrosporas: Se forman por
segmentación y posterior
desarticulación de la hifa.
Cuando los segmentos se
separan, cada uno constituye
una artrospora.
o Clamidosporas: La
formación de estas esporas se
da por engrosamiento de un
segmento de la hifa, el cual se
arredonda y produce la pared
gruesa que las caracteriza,
para luego desprenderse al
medio.
o Oosporas: Esporas sexuales
que son el resultado de la
fusión de un anteridio
pequeño y de un oogonio
mucho más grande. [7]
 Un hongo filamentoso, ¿Por qué
tipo de esporas se reproduce?
Los hongos se reproducen de manera
sexual y asexual (según sea el caso)
por medio de las esporas
mencionadas anteriormente.
 Una levadura, ¿Por qué tipo de
esporas se reproduce?
Las levaduras se reproducen
sexualmente mediante ascosporas o
basiodiosporas. [8]
 BACTERIAS
 ¿Cuál es la función que desempeña
el violeta de genciana en esta
coloración?
El violeta de genciana (colorante
catiónico) penetra en todas las
células bacterianas, a través de la
pared bacteriana.
 ¿Cuál es la función que desempeña
el lugol en esta coloración?
El lugol permite solubilizar el yodo y
actuar como mordiente, haciendo
que el cristal violeta (violeta de
genciana) se fije con mayor
intensidad a la pared de la célula.
 Escribir el nombre científico de 5
bacterias Gram positivas y 5
bacterias Gram negativas.
o Gram positivas
 Staphylococcus
aureus.
 Streptococcus
pneumoniae.
 Clostridium tetani.
 Clostridium
botullinum.
 Clostridium
perfringes.
o Gram negativas
 Neisseria
gonorrhoeae.
 Escherichia coli.
 Salmonella typhi.
 Haemophilus
influenzae.
 Francisella tularensis.
[9]
 ¿Cuál es la función que desempeña
el violeta de genciana en esta
coloración?
El violeta de genciana (colorante
catiónico) penetra en todas las
 células bacterianas, a través de la optimización del proceso de
pared bacteriana. [10] biorremediación de suelos
contaminados con fertilizantes
 ¿Cuál es la función que desempeña nitrogenados.
el lugol en esta coloración?  La identificación y caracterización de
los microorganismos es clave para
El lugol permite solubilizar el yodo y entender las distintas dinámicas que
actuar como mordiente, haciendo se llevan a cabo entre diferentes
que el cristal violeta (violeta de especies, así como los aportes
genciana) se fije con mayor individuales de cada uno de los
intensidad a la pared de la célula. microorganismos al proceso de
[10] biorremediación.

 ¿Cuál es la función que desempeña

la safranina en esta coloración?

Sirve para hacer una tinción de

contraste que pone de manifiesto las  LABORATORIO
bacterias Gram negativas, de manera
que al final las Gram positivas se  La identificación de las diversas
verán azul-violáceas y las Gram estructuras del hongo no solo permite
negativas, se verán rosas (si no se su caracterización, también permite
hizo la tinción de contraste) o rojas entender las condiciones en las que se
si se usó la safranina. [10] encuentra, tomando en cuenta qué tan
bien se puede estar desarrollando o si
se está o no reproduciendo.
VI. CONCLUSIONES  La identificación de tipos de bacterias
mediante la tinción de Gram y la
 ARTICULO CIENTÍFICO clasificación morfológica a partir del
análisis de las imágenes obtenidas en
 El uso de microorganismos el microscopio, permite determinar
bacterianos que tengan la capacidad diferencias que pueden tener una
de aprovechar los contaminantes influencia significativa en sus
provenientes de fertilizantes propiedades y comportamiento (por
nitrogenados en sus propios ejemplo, el efecto de fermentación de
mecanismos metabólicos, lácteos, o la resistencia hacia los
transformando estos compuestos fármacos que presentan ciertas
peligrosos en sustancias más bacterias patógenas).
inofensivas, es una alternativa
eficiente para aumentar la calidad de
los suelos.
 El utilizar consorcios bacterianos
conlleva a una suma de esfuerzos
conjuntos que permiten la
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