Universidad Distrital Francisco José de Caldas

Facultad de Ciencias Matemáticas y Naturales

Programa Académico de Biología

TÉCNICAS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO, MORFOLOGÍA

COLONIAL Y TINCIÓN BACTERIANA
Alvarado-Bautista, Ana*; Aponte-Quevedo, Laura* & Cutiva-Daza, Gabriela*
*
Programa Académico de Biología, Microbiología, 2023-1
Docente: Luz Andrea García Caycedo, M.Sc.
Marzo 15 de 2023

Resumen
Andrew
La siembra y2023-04-16
posterior20:26:43
identificación de cepas bacterianas es uno de los procesos más
importantes, abarca todas las ramas de microbiología y la implementación de las diferentes
--------------------------------------------
técnicas tanto RESUMEN:
de siembra 4.5/5.0
como tinción
Muy buen es necesaria y funcional para determinar características
resumen, faltó
específicas de profundizar
los microorganismos. Mediante la
un poco sobre los medios empleados, ejecución de diferentes tipos de métodos de
siembras, tanto masivas como por agotamiento, en diferentes medios de cultivo indicados para
es importante usar palabras clave más
bacterias u hongos, así como también la tinción bacteriana diferencial de gram, verde malaquita
generales para facilitar la ubicación del
y tinta china; se busca establecer las principales características morfológicas y funcionales en las
documento.
cepas bacterianas, para obtener un básico de información sobre la composición a nivel celular de
pared o estructuras adyacentes como endosporas y cápsulas. Todos los medios de crecimiento
bajo diferentes técnicas dieron un resultado nulo, por lo que no se analiza morfología colonial.
La tinción diferencial de gram resultó positiva para B. subtilis, S.aureus, B. licheniformis, se
descarta la presencia de endosporas en B. subtilis, y finalmente se corrobora la formación de
cápsula para B. subtilis. La disminución del error experimental en los métodos de siembra es
fundamental para la obtención de resultados óptimos, así mismo, se destaca la efectividad en el
método de tinción gram para todas las muestras, este permite evidenciar las morfologías de
bacilos y cocos dependiendo de la cepa. El método de ticha china es efectivo pues permite
observar estructuras como la cápsula la cual es fundamental para comprender el
funcionamiento de las cepas en el medio. La no observación de endosporas se atribuye a la
ausencia de las mismas o errores experimentales en el proceso de tinción con verde malaquita.
Se recomienda la verificación del estado de los medios de cultivo y mejoramiento de técnicas de
cultivo y tinciones, esto con el objetivo de reducir los resultados negativos o inconclusos.
Palabras clave: cápsula, endosporas, inoculación microbiana, medios de cultivo, tinción de
Gram

Abstract
The seeding and subsequent identification of bacterial strains is one of the most important
processes, covering all branches of microbiology and the implementation of different techniques
both seeding and staining is necessary and functional to determine specific characteristics of
microorganisms. Through the execution of different types of seeding methods, both massive and
exhaustion, in different culture media indicated for bacteria or fungi, as well as differential
bacterial staining of gram, malachite green and India ink, we seek to establish the main
morphological and functional characteristics in bacterial strains, to obtain basic information
about the composition at the cellular level of the wall or adjacent structures such as endospores
and capsules. All growth media under different techniques gave a null result, so colonial
morphology is not analyzed. Differential gram staining was positive for B. subtilis, S.aureus, B.
licheniformis, the presence of endospores in B. subtilis is ruled out, and finally capsule
formation is corroborated for B. subtilis. The reduction of the experimental error in the sowing
methods is fundamental to obtain optimal results, likewise, the effectiveness of the gram
staining method for all the samples is highlighted, as it allows evidencing the morphologies of
bacilli and cocci depending on the strain. The Chinese stain method is effective because it allows
observing structures such as the capsule, which is essential to understand the functioning of the

Página 1 de 14
 strains in the medium. The non-observation of endospores is attributed to the absence of
endospores or experimental errors in the staining process with malachite green. The verification
of the state of the culture media and improvement of culture and staining techniques are
recommended in order to reduce negative or inconclusive results.
Keywords: capsule, endospores, microbial inoculation, culture media, Gram staining

Introducción En la microbiología se utilizan diferentes tipos de

Dentro
Andrew de las disciplinas pertenecientes a la biología, se técnicas de siembra y aislamiento de poblaciones de
2023-04-16 20:31:04
encuentra la microbiología, ciencia que se encarga del microorganismos, dentro de las cuales se encuentran: la
--------------------------------------------
estudio de los organismos microscópicos siembra en picadura o por punción, utilizada para
INTRODUCCIÓN: que
(microorganismos) 4.8 Excelente
se encuentrantrabajopor
en debajo de la conocer el comportamiento de los microorganismos en
el levantamiento
capacidad de información,
de resolución del ojosolo faltó (Triviño Rojas
humano presencia de oxígeno y su movilidad; en esta se utiliza
explicar
A, 2011). más sobre los medios
La microbiología de cultivo.
inició su desarrollo a partir un asa recta con el inoculo en punta, la cual se introduce
del siglo XIX cuando en 1670 Antonie van Leeuwenhoek en un tubo conteniendo agar en columna, evitando tocar
diseñó el microscopio y haciendo uso de este observó las paredes del tubo y en forma; la siguiente técnica
por primera vez a las bacterias, luego Louis Pasteur en conocida es la siembra en estrías utilizado para el
1876, alcanzó el mayor desarrollo y reconocimiento de cultivo de microrganismos aerobios y aerobios
los microorganismos como protagonistas de una gran facultativos, en esta se toma el material con el asa en
diversidad de procesos (Reynoso María. M et al, 2015). anillo y se siembra en estrías en un medio específico; la
Como resultado del tamaño pequeño de los siguiente metodología es la siembra por agotamiento en
microorganismos, el estudio de las características de los estrías que se realiza para obtener colonias aisladas en
mismos requiere de dos procesos fundamentales, el las últimas estrías, separadas unas de otras,
aislamiento, que se define como la separación de un permitiendo a partir de las mismas la obtención de
microorganismo de las poblaciones mixtas existentes en cultivos puros mediante resiembra en otro medio de
el ambiente, y el cultivo o siembra, que se define como cultivo, en esta se realiza una serie de estrías paralelas
el crecimiento de poblaciones microbianas en ambientes no superpuestas, sobre una parte de la superficie que
artificiales (medios de cultivo para hongos y bacterias), contiene el medio de cultivo; se tiene la siembra con
bajo condiciones de laboratorio (Stanier R.Y et al, espátula de Drigalsky que permite sembrar inóculos
2005). sobre superficies grandes, con la cual se busca obtener
Actualmente en la microbiología moderna se sigue un crecimiento confluente para estudiar los efectos de
haciendoAndrew
uso de los fundamentos en siembra (cultivo) y los antimicrobianos y hacer un recuento de colonias,
2023-04-16 20:28:08 haciendo disoluciones seriadas de la muestra; otra de
aislamiento de microorganismos. La siembra es una de
--------------------------------------------
las técnicas más utilizadas actualmente, esta se las técnicas más comunes es la siembra con hisopo, con
fundamenta Buenaprincipalmente
información, peroen se debe resumir más,
la transferencia de la cual se siembran inóculos abundantes sobre
pues no aportademucho
microorganismos un aambiente
los objetivosa deotro
la con el superficies grandes, para como la siembra de Drigalsky
propósito práctica.
de cultivarlos. Una vez que el medio de cultivo estudiar los efectos antimicrobianos, esta se diferencia
está debidamente preparado se procede a inocular la porque se hace uso de un hisopo de algodón estéril en
muestra deseada (Reynoso María. M et al, 2015). un tubo que contiene un cultivo previamente
Mientras que el aislamiento de cepas microbiológicas homogenizado; finalmente se tiene la siembra en placa
permite seleccionar y separar de poblaciones mixtas invertida, la cual permite el desarrollo de
existentes en el medio, al microorganismo por observar, microorganismos aerobios, aerobios facultativos y
para conocer e identificar las principales características microaerófilos, en esta se lleva un volumen de inóculo a
del mismo (Triviño Rojas A, 2011). El trabajo con un tubo que contiene agar fundido para continuamente
microorganismos hace uso de técnicas que permiten verter el contenido en un placa de Petri vacía y estéril, se
obtener un cultivo puro, y luego cultivar a mayor escala homogeniza y se deja solidificar el contenido (Reynoso
dicho microorganismo; para obtener dichos cultivos María. M et al, 2015).
puros es necesario utilizar instrumentos estériles, libres
de otros microorganismos contaminantes. La esterilidad
se alcanza mediante la aplicación de métodos como:
calor seco, calor húmedo, filtración, esterilización
química, radiación. Los medios de cultivo utilizados
deben poseer los nutrientes necesarios para el
crecimiento de los mismos (Covadonga A.M & Serrano
M.I, 2011). Figura 1. Siembra por agotamiento o por estrías.
Fuente: Rojas, A.

Página 2 de 14

Figura 2. Siembra por cuadrantes
Fuente: Rojas, A.
Figura 3. Siembra masiva.
Fuente: Rojas, A.
Figura 4. Siembra por punción.
Fuente: Rojas, A.
La siembra y aislamiento de cepas microbianas
permite el reconocimiento de algunas características
morfológicas del organismo observado. Así mismo,
adicionalmente al uso de las diferentes técnicas de
siembra y aislamiento, se utilizan tinciones específicas,
que permiten mejorar la imagen observada mediante el
microscopio, al incrementar el contraste entre la célula y
su entorno. Las técnicas de tinción con diversos
colorantes facilitan la observación al aumentar
notablemente el contraste (Covadonga A.M & Serrano
M.I, 2011). Tal y como en el método de siembra, de igual
manera para las tinciones existen diferentes tipos como:
la tinción de Gramm, es un tipo de tinción diferencial,
ya que utiliza dos colorantes y clasifica a las bacterias en
dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y
bacterias Gram positivas, de acuerdo a la composición
química de su pared celular (López L et al, 2014).
Continuando con la tinción de Ziehl-Neelsen, empleada
comúnmente para el diagnóstico de tuberculosis, esta
tinción permite diferenciar a las bacterias en dos
grupos: aquellos que son capaces de resistir la
decoloración con alcohol-ácido y aquellos que no lo son
(López L et al, 2014). Así mismo se cuenta con las
tinciones simples o bacterianas en las cuales se hace uso
de colorantes como el azul de metileno o el verde de
malaquita que tiñen de color azul y verde
respectivamente (Ducon V & Rincón J, 2010). Para el
caso de los cultivos fúngicos, se hace uso de la tinción de
azul algodón de lactofenol la cual posee características
tintoriales que permiten observar cada uno de los
componentes fúngicos y apreciar fácilmente las
estructuras para una adecuada identificación (López L
et al, 2014).
Actualmente es posible observar e identificar
mediante la aplicación de técnicas de siembra,
aislamiento y tinción las características de diferentes
microorganismos, esto al hacer uso de cepas como:
Pseudomonas aeruginosa, es un patógeno ubicuo
es un patógeno ubicuo, oportunista y bastante
persistente en el medio ambiente. A nivel morfológico,
esta bacteria se caracteriza por tener una forma de
bastón, con un flagelo polar que confiere la motilidad
necesaria. Es una aerobia facultativa debido a la
capacidad que tiene para crecer en medios anaerobios
tomando el nitrógeno o arginina como terminal de
aceptación de protones. Crece en temperaturas óptimas
entre 20 y 43 ° C. No pueden fermentar lactosa, pero sí
pueden hacer uso de fuentes de carbono como acetato y
de nitrógeno como amoniaco. En cuanto a su
patogenicidad, es uno de los principales
microorganismos relacionados con las infecciones
nosocomiales (Zarza VM et al, 2019).
Klebsiella pneumoniae, es un bacilo Gram-
negativo que pertenece a la familia Enterobacteriaceae;
esta se caracteriza principalmente por dar formación y
desarrollo a una cápsula que actúa como factor
determinante en la virulencia de la bacteria, esta brinda
protección al microorganismo de la fagocitosis por parte
de los polimorfonucleares y de los factores bactericidas
séricos (López J & Echeverri L, 2010). A nivel de
patogenicidad K. pneumoniae es un patógeno
bacteriano asociado a infecciones nosocomiales,
especialmente en pacientes inmunocomprometidos. Las
cepas de K. pneumoniae pueden llegar a causar
morbilidad y mortalidad, particularmente en las
unidades de cuidados intensivos pediátricos y servicios
quirúrgicos (González A et al, 2013).
Staphylococcus aureus es un coco gram-
positivo que se caracteriza por no ser esporulado,
carecer de cápsula y ser anaerobio facultativo
(Cervantes E et al, 2014). Esta es la principal causa de
bacteriemia nosocomial, este patógeno se caracteriza
por generar infecciones en piel y tejidos blandos como
los músculos, tendones, vasos sanguíneos y tejidos
grasos (Pasachova J et al, 2019).
Penicillium janthinellum es un hongo que se
encarga principalmente de llevar a cabo la solubilización
del fósforo en los suelos (Ñústez C & Acevedo J, 2005).
Bacillus subtilis forman colonias, de 2 a 4 mm de
diámetro, son bacterias beta hemolíticas con hemólisis
completa, por lo que pueden tener un aspecto liso,
mucoide o rugoso; los bordes pueden ser ondulados o
extendidos en el medio y ocasionalmente dan la
apariencia de cultivos mixtos (Realpe M et al, 2002). B.
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 licheniformis, perteneciente también al género de
Bacillus (Villarreal M et al, 2018).
En microbiología es indispensable el
conocimiento de las técnicas de siembra y aislamiento
de poblaciones (capas) bacterianas. Así mismo la
realización de tinciones, permite la identificación de
características morfológicas mediante la observación
microscópica de diferentes cepas de diversos
microorganismos.
Objetivos
Andrew
— Utilizar
2023-04-16 las
20:31:27 diferentes técnicas de inoculación
microbiana en medios de cultivo, a través de la
------------------------------------------
práctica
-- 5.0/5.0 de las diversas técnicas de sembrado, para
la correcta selección de estas técnicas según se
requiera en los estudios microbiológicos.
— Conocer las características macroscópicas de la
morfología colonial bacteriana.
— Caracterizar los diversos microorganismos así
como sus estructuras internas y externas realizando
diferentes preparaciones húmedas y fijas para la
observación y clasificación de los microorganismos
por sus propiedades tintoriales y su morfología
microscópica, con apego a las normas de
bioseguridad.
Materiales y métodos
Andrew
Para
2023-04-16 el desarrollo
20:33:09 de la presente práctica de laboratorio
-------------------------------------------- materiales: una caja de Petri
se emplearon los siguientes
Materialescony medio
métodos: de 4.9
cultivo Agarpresentación
Excelente Nutritivo, una caja de Petri
con medio de cultivo
de los materiales, protocolos claros queBHI, una caja de Petri con medio
permitende cultivo
replicar Manitol,
la práctica. una caja de petri con medio de
Recomendación:
cultivo
incluir los PDA,y referencia
fabricantes una caja de deagares.
petri con medio de cultivo
Sabouraud, un tubo pico de flauta con medio de cultivo
PDA, Asa curva y recta, hisopos estériles, solución
salina, solución de alcohol al 705, mechero, Toallas de
papel, Frasco lavador, Cristal violeta, Lugol, Alcohol
acetona, Fuccina de gram, Verde de malaquita, Vaso de
precipitado, Plancha de calentamiento, Rejillas para
coloración, Microscopio, Aceite de inmersión, tinta
china negra, nigrosina, levadura, yogurt, azul de
metileno, muestra de cepario de Bacillus licheniformis y
Bacillus subtilis, muestra casera de hongo de
habichuela, muestra de cepario de Penicillium
janthinellum, muestras de Klebsiella pneumoniae,
Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa.

Figura 1.Metodología para la siembra masiva de frotis en

medio agar nutritivo.
Fuente: autores.

Página 4 de 14
 Figura 3.Metodología para la siembra de Klebsiella
pneumoniae y staphylococcus aureus en medio selectivo
Figura 2.Metodología para la siembra por estría múltiple de manitol
Pseudomonas aeruginosa en medio BHI. Fuente: autores.
Fuente: autores.

Página 5 de 14
Figura 4.Metodología para la siembra de muestra casera
de hongo de habichuela en medio Sabouraud
Fuente: autores.
Figura 5.Metodología para la siembra de de
Penicillium janthinellum en medio PDA (caja).
Fuente: autores.
Página 6 de 14
Figura 6.Metodología para la siembra de Penicillium
janthinellum en medio PDA (tubo pico flauta)
Fuente: autores.

Figura 7.Metodología general para la tinción de gram

aplicada a cepas de B. subtilis, S. aureus y B.
licheniformis .
Fuente: autores.

Página 7 de 14
Figura 8.Metodología general para la tinción verde
malaquita aplicada a B. subtilis.
Fuente: autores.
Figura 8.Metodología general para la tinción con
tinta china/nigrosina (cápsula) aplicada a B.
subtilis y.
Fuente: autores.

Página 8 de 14
 la falta de crecimiento podría también relacionarse con
laAndrew
baja presencia de microorganismos en el lugar de la
toma de muestra,
2023-04-16 20:34:50 esto debido a que probablemente
hacía poco tiempo se habría realizado limpieza y
--------------------------------------------
saneamiento de estos baños por parte del personal de
Excelente consideración.
limpieza encargado de ello.
En el caso de la siembra de P. aeruginosa, tampoco
se observó
Andrew
crecimiento de colonias, lo cual podría
relacionarse
2023-04-16 también con el caso del cambio de medio,
20:35:50
pues esta cepa debía sembrarse en medio nutritivo y fue
--------------------------------------------
sembradaEn este caso el cambio de mediode
en medio BHI, además no esto
es también se
deben significativo
considerar condiciones en las
al considerar que era una muestra cuales
del el asa
utilizada en la siembra pudiera estar muy caliente y
cepario, pudo ser efectivamente un error en el
afectar la cepa.
uso del asa.
La siembra en el medio de manitol de dos cepas,
cada una en una mitad de la caja, tampoco mostró
resultado positivo, en el caso de K. pneumoniae bacteria
gram negativa, (Tártara, 2017), este es un resultado
esperado puesto que el agar manitol es un medio
selectivo que inhibe el crecimiento de bacterias Gram
negativas, mientras que promueve el desarrollo de
bacterias gram positivas, (Rodríguez Martínez et al.,
2018). A pesar de esta última característica del medio,
en el lado en el que se sembró S. aureus bacteria gram
positiva , (Garzón et al., 2019), tampoco se obtuvo
crecimiento, estos resultados pueden asociarse con las
condiciones del medio pues generalmente para este tipo
de técnicas las condiciones de los reactivos no son las
adecuadas dentro del laboratorio por lo que cabe la
posibilidad de que el medio pudiera estar afectado,
además de esto se han de considerar condiciones de
estrés para la cepa, Andrew asociadas a condiciones de
2023-04-16 20:37:39
incubación, humedad, entre otras. Finalmente la
--------------------------------------------
siembra en tubo pico de flauta de penicillium
Aunque es posible, no es caso, pues ya se ha
janthinellum tampoco tuvo ningún resultado positivo.
hecho control de calidad
El único resultado positivo reportado fue el crecimiento al medio. Podría ser
error en el manejo
del hongo de habichuela sembrado en agar Sabouraud, del asa.
este está al pendiente de identificación.
Los errores prácticos al sembrar también deben ser
considerados en el caso de todos los tipos de siembras y
medios pues estos pueden ser aleatorios y atribuidos a
Figura 9.Metodología general para la tinción de levadura y la falta de habilidad y práctica en el momento de la
yogurt con azul de metileno. siembra. Cabe resaltar que el análisis de morfología
Fuente: autores. colonial respectivo no se realizó en esta práctica debido
a la ausencia de colonias de cualquier tipo.
faltan materiales
Tinción bacteriana
Resultados y discusión
Andrew
Técnicas de siembra
2023-04-16 20:42:51 Tinción Gram
--------------------------------------------
Inicialmente
4.5/5.0 Excelentetraspresentación
el tiempo adecuado deyincubación; en
de resultados La tinción para la cepa B. subtilis muestra una
Andrew
el caso de
análisis, pero
2023-04-16 la muestra tomada de
hace falta la comparación con
20:34:26 la perilla del baño de coloración violeta fuerte lo que indica que es una
mujeres
otras del edificio
fuentes/autores de
para laboratorios
tener una Macarena
discusión B, no se bacteria gram positiva, (Fig. 10), la coloración referida
--------------------------------------------
observa crecimiento alguno en el medio nutritivo, este en esta cepa se genera mediante el mecanismo de acción
completa.
Es una buena observación considerando que
resultado de los reactivos sobre la pared celular de las bacterias,
BHI tiene máspuede estar
nutrientes queasociado con que
el agar nutrivito y inicialmente
este frotis debía sembrarse en medio en este caso el lugol de gram es el que hace que el tinte
por tanto facilita mejor el crecimiento de BHI, sin embargo morado forme complejos en la pared de peptidoglicano,
por cuestiones
microorganismos. metodológicas y de error práctico se
terminó sembrando en medio nutritivo. Además de esto, se establezca en ella y perdure la coloración violeta

Página 9 de 14
fuerte. En el caso de las gram positiva esta pared es
mucho más gruesa, por lo que el tinte se mantiene más
en la pared en comparación con las gram negativas las
cuales tienen una capa de peptidoglicano más delgada,
(Cowan & Smith, 2020). En la Figura 10, se puede
observar la morfología característica de este género de
bacterias, (Villarreal-Delgado et al., 2018). Mediante
esta tinción solo es posible indicar características en
cuanto a clasificación entre gram-positivas y
gram.negativas, además se pueden describir ciertas
características básicas en cuanto a forma de las cepas.
Cabe destacar la presencia de cocos gram-positivos en la
muestra, esto debido a una contaminación del medio de
cultivo, (Fig 10).

Figura 11. Tinción diferencial de gram para S. aureus.

Muestra resultados gram-positivos por coloración
violeta, forma de cocos agrupados en racimos. Fuente:
autores

En el caso de B. licheniformis la coloración también

Figura 10. Tinción diferencial de Gram para B.
subtilis. Muestra resultados gram-positivo por
coloración violeta, forma en bacilos, muestra
contaminada por cocos gram-positivos. Fuente:
autores
es violeta, indicando que es una bacteria gram-positiva,
en algunos casos la coloración varía dentro del mismo
frotis (Fig 13) , en este caso se asoció con el uso del
microscopio y el manejo de la fuente de luz, aunque
también puede referirse a problemas con los reactivos o
errores durante la tinción. Estas bacterias tienen una
organización en forma de bacilos en cadenas largas,
(Riedel et al., 2020). La cepa también se encontraba
contaminada con cocos gram-positivos, (Fig 13).

S. aureus también es una bacteria gram-positiva,

(Fig 11). Su coloración es violeta, es característico de
este género la organización en racimo de las células,
(Garzón et al., 2019). Una observación general es que en
otras muestras analizadas como la descrita
anteriormente, se muestra presencia de cocos gram-
positivos, teniendo esto en cuenta no se puede afirmar o
negar que estos sean de la especie S. aureus, para Figura 13. Tinción diferencial de gram para B.
determinar esto se requieren nuevos repiques en medios licheniformis. Muestra resultados gram-positivos por
diferenciales además de pruebas químicas que indiquen coloración violeta. A. Coloración más clara asociada a
la naturaleza de estos cocos. un amplio espectro de luz. B. Coloración violeta con
espectro de luz regular. Fuente: autores

Tinción verde malaquita

Técnica también conocida como tinción selectiva de

Schaeffer Fulton, se fundamenta en que el colorante
tiene una carga positiva débil lo cual facilita la unión
con el microorganismos, el proceso de calentamiento
genera que su capacidad de penetrar aumente
resultando así en la tinción de las endosporas cuando

Página 10 de 14
las hay, (Ramírez & Lozano, 2020). En el caso de B.
subtilis, no se evidenció la presencia de endosporas
asociadas a condiciones de estrés del microorganismo,
esto puede ser debido a que las condiciones en el medio
y ambientales eran óptimas para este, o bien puede
relacionarse con errores al momento de realizar la
tinción. La presencia de endosporas normalmente está
asociada a condiciones extremas en el medio, tales como
pH o temperaturas muy altas o muy bajas, (Quintana et
al., 2015).
Tinción tinta china
La tinción mediante este método se considera un
método no invasivo, puesto que se encarga de teñir el
fondo del frotis, dejando libre de tinción a los
microorganismos, lo que hace que podamos verlos está
dado por el contraste con la luz, (Vásquez et al., 2016).
En este caso la tinción es empleada para determinar la
presencia o ausencia de cápsula en B. subtilis, en este
caso fue posible evidenciar la cápsula formada alrededor
de las células, (Fig 14). Esta se caracteriza por
presentar bordes oscuros y en el medio de ella se
encuentra el bacilo.
Figura 14. Tinción de tinta china en B. subtilis,
Andrewde formación de cápsula. Fuente: autores .
evidencia
2023-04-16 20:40:49
--------------------------------------------
Tinción azul de metileno
Falta contraste en la tinción, por ende NO es
concluyente en azul de metileno se realiza una tinción
Inicialmente
de una muestra de yogur y levadura posteriormente
activada con azúcar y agua. La funcionalidad de esta
tinción es principalmente establecer la presencia y/o
ausencia de microorganismos en la muestra, en el caso
del yogurt (Fig. 15), se pueden observar grandes
acumulaciones de microorganismos, estos no se pueden
distinguir mediante esta tinción, sin embargo, de
acuerdo a las especificaciones nutricionales de este
yogurt las cepas a encontrar deberían ser Lactobacillus
gasseri, Lactobacillus coryniformis, Streptococcus
salivarius subsp thermophilus. La tinción de levaduras
con azul de metileno es una técnica ampliamente
empleada, esta advierte la presencia de levaduras
aunque no distingue entre levaduras vivas o muertas,
(Martínez et al., 2016). En este caso, aunque no se
puede saber a simple vista qué levadura estamos
observando, se esperaría que esta correspondiera a
Saccharomyces cerevisiae, (Mesas & Alegre, 2001).
Figura 15. Tinción con azul de metileno. A. Yogurt. B.
Levadura de pan. Fuente: autores.
Andrew
2023-04-16 20:41:33
Cuestionario
--------------------------------------------
¿Nombre científico?
— ¿Por qué las cajas se deben incubar en forma
invertida?
— Las cajas petris deben incubarse de manera invertida
para que se evite que el agua condensada caiga sobre
la superficie del agar (medio de cultivo), lo que
perjudica la composición y aislamiento de las
colonias.
— ¿Por qué se debe quemar el asa entre cada
grupo de estrías en aislamiento por estría
múltiple?
— Debe quemarse el asa entre cada grupo de estrías en
aislamiento para esterilizarla y evitar la
contaminación de la siembra, para lograr obtener
microorganismos aislados.
— De las técnicas de inoculación utilizadas en
las placas de agar, ¿Con cuál de ellas cree
usted que obtendría mejor aislamiento de
microorganismos? ¿Por qué?
— La técnica de aislamiento por estría de agotamiento,
debido a que al tomarse un pequeña muestra para
realizar el estriado y realizar calentamiento del asa
entre estrías se reduce la carga microbiana presente
en el asa, de manera que es más probable que se
de la formación de colonias aisladas de
microorganismos a un crecimiento masivo difícil de
identificar.
— ¿Con qué fin se inocula atravesando el medio
semisólido, y que prueba es?
— Los medios semisólidos se utilizan para realizar
pruebas de movilidad, mediante la técnica para
inocular tubos con medio sólido.
— En la técnica de sembrado con hisopo, solo la
muestra se coloca con el hisopo, pero se
estría con asa. ¿Por qué?
— Esto es debido a que el hisopo puede contaminarse
fácilmente con otros agentes externos al encontrarse
impregnado con solución salina, asimismo este
cuenta con una carga microbiana muy alta que
dificultaria la formación de colonias que permitan
identificar los microorganismos muestreados,
Página 11 de 14
 mientras que con el asa se trabaja una carga
microbiana más baja.
— ¿Cuáles son los procedimientos para analizar
los resultados del cultivo?
— Para realizar el análisis de los resultados de un
cultivo se debe realizar inicialmente una
identificación de la morfología colonial,
posteriormente identificación mediante tinción,
también se pueden realizar pruebas bioquímicas.
— ¿Para qué es necesario revisar la morfología
colonial de todas las colonias que crecieron
en el medio de cultivo?
— La morfología de las colonias presenta características
que varían según el microorganismo en crecimiento
como lo es el color, el borde de colonia, la elevación,
la forma, el brillo, la transparencia, la textura, etc.
Este tipo de análisis permite orientar en la
identificación del organismo a una escala
macroscópica y en algunos casos identificar
contaminación.
— ¿Por qué no es recomendable revisar la
morfología colonial de un crecimiento en
tubo?
— Los tubos pueden dificultar la adecuada
identificación de las características coloniales, puesto
que estos no poseen una amplia superficie a
diferencia de las placas, es muy probable que no se
de un crecimiento de colonias aisladas sino un
crecimiento masivo lineal, y esto puede dificultar
procesos como el recuento de unidades formadoras
de colonias etc.
— ¿Cuál es la diferencia en cuanto al
crecimiento colonial entre un agar inclinado
en tubo y una placa de agar?
— Los cultivos sembrados en tubo pico de flauta
usualmente tienen un crecimiento en línea que
puede caracterizarse por la abundancia de
crecimiento, la pigmentación , opacidad, forma
sobre la línea, etc. Mientras que en las placas Petri el
crecimiento se da en forma de colonias aisladas,
normalmente formadas a partir de una sola célula.
— Después de revisar y describir sus
observaciones en los cultivos, ¿Qué haría
para identificar de que bacteria se trata?
— Procedimientos de tinción para la identificación de
características de composición membranal, uso de
medios de cultivo selectivos y pruebas bioquímicas.
— ¿Cuál es la importancia de los medios de
cultivo en un laboratorio de microbiología?
— Los medios de cultivo permiten brindar una solución
nutritiva que pueda ser utilizada para crear un
ambiente adecuado para el crecimiento de los
microorganismos
— Defina el término de cepa pura.
— Una cepa pura es aquella población de organismos
de una misma especie que se origina a partir de una
sola célula o provienen de una muestra con un
aislamiento previo.
— ¿Qué es el agar y cuál es su función en un
medio de cultivo sólido?
— Se conoce como el Agente Solidificante que cumple
con la función principal de otorgar solidez al medio
de cultivo
— ¿Cuáles son las principales macronutrientes
que las bacterias y los hongos necesitan para
desarrollarse?
— Carbono, hidrógeno, nitrógeno, fósforo, azufre,
potasio y magnesio.
— ¿Qué implicaría la deficiencia de algún
nutriente en el medio de cultivo?
— Implicaría que no se diera el crecimiento óptimo de
las células cultivadas, ya sea por deficiencia de
crecimiento o nulo crecimiento, esto debido a que los
microorganismos no podrán suplir sus necesidades
nutricionales básicas para llevar a cabo funciones
vitales.
— ¿Por qué se debe sembrar en pico de flauta en
el medio servido en el tubo de ensayo?
— Al inclinarse el tubo se obtiene una mayor superficie
para el desarrollo de las células cultivadas, y
asimismo disminuye la pérdida de agua en el agar.
— ¿Cuál es la diferencia entre una tinción
simple y una diferencial?
— Las tinciones simples funcionan para identificar la
morfología celular, mientras que, las tinciones
diferenciales utilizan más de un reactivo para
identificar diferencias entre las células bacterianas o
entre partes de una misma célula (composición
química).
— ¿Qué tipo de tinción es la Gram?
— La tinción de Gram es de tipo diferencia, debido a
que permite identificar las diferencias a nivel de
composición química de las paredes celulares de los
microorganismos.
— ¿Cuál es el fundamento? Reactivos utilizados
en la tinción Gram
— Tienen un fundamento mucopéptido, etanol y
diferencias de color. En el cual las bacterias Gram
negativas pierden un colorante (el cristal violeta) con
mayor facilidad que las Gram positivas. La razón
es la menor cantidad de mucopéptido de las paredes
de las bacterias Gram negativas. Se hace uso de
reactivos como: cristal violeta, lugol de gram, alcohol
acetona y fucsina de Gram
— ¿Qué otro tipo de tinciones puede
mencionar?
— Tinción de cápsula a partir de tinta china
— Azul de metileno
— Tinción de Ziehl-neelsen para identificación de
tuberculosis (bacilos ácido-alcohol resistentes)
— Tinción azul de lactofenol para la observación de
hongos de interés clínico.
— ¿Cuáles son algunas limitaciones de las
tinciones?
— Algunas de las limitaciones de las tinciones puede
ser la contaminación de las muestras con otros
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 microorganismos y la imposibilidad de a veces lograr
observar a los microorganismos.
Conclusiones
Las condiciones de siembra, errores experimentales o
condiciones del medio de cultivo pueden ser factores
claves que expliquen los resultados nulos obtenidos en
cuanto a la siembra de microorganismos tanto en tubo
como en placa. También se tienen en consideración las
condiciones ambientales necesarias para el crecimiento
de las bacterias, tales como temperatura de incubación,
pH, humedad, entre otras. Debido a la negatividad de
los resultados el análisis de morfología colonial no se
realizó.
Los diferentes tipos de tinción diferencial están
indicados para ciertas características específicas de las
células, en el caso de tinción gram se relaciona con la
capa de peptidoglicano presente en la pared celular, a
partir de esta característica es posible clasificar las cepas
B. subtilis, S.aureus, B. licheniformis como gram-
positivas, lo que indica que tienen una pared de
peptidoglicano estratificada y gruesa. La identificación
de esporas mediante tinción de verde malaquita no es
posible en B. subtilis lo cual podría ser de manera más
acertada a errores experimentales, pues las condiciones
del cultivo indican la necesidad de las endosporas en el
microorganismo, esto considerando que se encuentra en
un medio contaminado con otros microorganismos y
existe una presión externa sobre el bacilo. En
consecuencia con lo anterior, se corrobora la presencia
de cápsula en B. subtilis mediante la técnica de tinción
con tinta china. En el caso de la tinción con azul de
metileno cabe destacar que simplemente se corrobora la
presencia de microorganismos en las dos muestras, sin
embargo, son necesarias múltiples pruebas bioquímicas
para llegar a identificar esto organismos a nivel de
género o especie. Finalmente se genera la
recomendación de el mantenimiento adecuado de los
medios de cultivo, preferiblemente no utilizar medios
vencidos y realizar siempre el ajuste de pH
correspondiente para cada medio.
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