Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Departamento de Bioquímica
Sistemas de Control de calidad

Practica 2: Inducción de mutantes en Escherichia coli

Alumnos:

Maldonado Godoy Martha Daniela

Melgarejo Jiménez Rebeca
Manrique Abad Zuri Jahdai

EQUIPO 8
SECCIÓN: 2

Grupo: 5QV2

.
Fecha de entrega: 24 de Septiembre del 2019

INTRODUCCIÓN
La idea de que las mutaciones eran espontáneas no se aceptó hasta después de la
década de1940, antes de eso se creía que las mutaciones ocurrían en poblaciones de
bacterias en respuesta a condiciones particularmente selectivas. Fue hasta 1943 que
Luria y Delbruck demostraron mediante experimentos con cepas de Escherichia
coli sensibles a ser infectadas por un fago (T1) que las mutaciones que daban la
resistencia a este fago no dependía de si estas estaban expuestas al fago o no. Si no,
que dependían de que si las cepas eran crecidas en cultivos pequeños e individuales o
en un cultivo masivo y grande.
Las mutaciones son cambios debidos a una modificación heredable en el DNA, una
mutación en una cepa silvestre de cualquier célula genera una cepa mutante, el termino
mutante se refiere a un organismo en el cual la secuencia de bases de DNA ha sido
cambiada causando o no un fenotipo. Dichos cambios pueden originarse por varias
causas, sin embargo, las dos causas más probables son las siguientes:
1. Errores que ocurren durante la replicación y que la enzima Pol III no pudo corregir.
2. La alteración espontánea de un nucleótido.
Las mutaciones son eventos aleatorios, y no hay manera de saber cuándo o en que
célula va a ocurrir una mutación, además de esto las mutaciones son consideradas
aleatorias en el sentido de que la ocurrencia no está relacionada con alguna ventaja
adaptativa que le pueda conferir al organismo en su ambiente.
Dado que las células mutantes son raras en condiciones naturales, estas son inducidas
mediante un proceso llamado mutagénesis, usualmente la mutación en un gene dado es
de 10-6 el hecho de encontrar una mutación en un organismo equivale a buscar a ese
organismo entre un millón (o más) de individuos los “cazadores de mutantes” tratan los
cultivos con sustancias mutagénicas, aumentando así la frecuencia de mutación.
La estimación de rangos de mutación en bacterias es complicada, por el hecho de que
ocurren en bajas proporciones, el rango de mutación es la probabilidad de que un gene
sea mutado en una sola generación, la medida de los rangos de mutación es importante
sobre todo en estudios de evolución, y análisis del efecto del ambiente, la probabilidad
de no obtener mutantes en un cultivo de N número de células puede ser estimada
mediante una distribución de Poisson..
OBJETIVOS
● Conocer el manejo de agentes mutagénicos, como luz ultravioleta e hidroxilamina,
para producir mutaciones en Escherichia coli W 3350.
● Emplear parámetros como la frecuencia de mutación y la relación dosis-respuesta
para entender los procesos que realizan los agentes mutagénicos empleados.
● Proponer el daño que puede producir la hidroxilamina y la luz ultravioleta a nivel
de DNA, empleando diferentes mutágenos o antibióticos como revertantes de la
mutación.
RESULTADOS
Tabla 1. Cuantificación de colonias y títulos de células viables de Escherichia coli W3350
tratadas con Hidroxilamina a diferentes concentraciones.

Dilución
Equipo [HA] Título %Sobrevivencia
10−4 10−5 10−6
0.0 - 1556,1435 487, 357 1.74𝑥109 100%

0.2 - 1032, INC 280, 306 1.35𝑥109 77.34%

8 0.4 INC 398, 478 - 4.38𝑥108 25.13%

0.6 597,470 164, 132 - 6.19𝑥107 3.55%

0.8 725, 690 290, 164 - 8.49𝑥107 4.87%

0.0 - 434, 471 92, 103 5𝑥108 100%

0.2 - 305,312 71, 98 3.5𝑥108 71.4%

10 0.4 INC 266,239 - 2.52𝑥108 50.5%

0.6 INC 194, 187 - 1.90𝑥108 38.1%

0.8 INC 177, 206 - 1.91𝑥108 38.3%

0.0 - INC 111, 166 1.38𝑥108 100%

0.2 - INC 56, 92 7.40𝑥108 53.62%

12 0.4 INC 355, 332 - 3.43𝑥108 24.85%

0.6 INC 194,229 - 2.11𝑥108 15.28%

0.8 INC 334,345 - 3.39𝑥108 24.56%

 100

90 Equipo 8

80 equipo 10

70 Equipo 12
% sobrevivencia

60

50

40

30

20

10

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
[HA]

Figura 1. Relación de la concentración de HA con el porcentaje de sobrevivencia de

Escherichia coli W3350.

Tabla 2. Cuantificación de colonias y títulos de células viables de Escherichia coli W3350

expuestas a luz ultravioleta a diferentes tiempos.

Tiempo Dilución
Equipo −4 Título %Sobrevivencia
luz UV 10 10−5 10−6
0 - 350, 390 75, 72 4.03𝑥108 100%

15 - 1080, 1116 206, 192 1.17𝑥109 290.32%

7 30 - 170, 179 37, 39 1.93𝑥108 47.89%

45 - 54, 56 14, 16 6.36𝑥107 15.78%

60 336,- 84, 58 - 3.98𝑥107 9.87%

0 - 896, 1126 324, 229 1.70𝑥109 100%

9 15 - 500, 448 81,140 5.54𝑥108 32.58%

30 - 322, 295 424, 21 4.87𝑥108 28.65%

 45 - 22,28 5,6 2.77𝑥107 1.63%

60 49, 56 8,5 - 5.36𝑥106 0.32%

0 - 63,63 1.03𝑥109 100%

15 - - 1.14𝑥108 11.06%

11 30 - 5,7 6.2𝑥107 6.01%

45 - 12,10 6.7𝑥107 6.50%

60 96,85 - 1.07𝑥107 1.03%

300
Equipo 7

250 Equipo 9

Equipo 11
% Sobrevivencia

200

150

100

50

0
0 15 30 45 60

Tiempo (seg)

Figura 2. Relación del tiempo de exposición con Luz UV con el porcentaje de

sobrevivencia de Escherichia coli W3350.
 Figura 3. Referencia ante los diferentes agentes mutagénicos, en donde se muestra el
procesos de reparación de los microorganismos, en donde una menciona la “no
reparación” y la “reparación”

Tabla 3. Frecuencia de Mutación de Escherichia coli W3350 con tratamiento de

Hidroxilamina
M
u
E ta
Dilución Frec
q n
uenc
u %Sobre te Títul
[HA] Título ia de
i vivencia s o
Muta
p
ción
o
10−3 10−4 10−5 10−6 10−7 10−3

720, 125,
0.0 - - 24 7.48𝑥108 100% - - -
650 135
0.2 - 318,360 85,122 16 - 4.08𝑥107 5.45% - - -
8 2.48𝑥107
0.4 - 218,222 65, 41 3 - 3.31% - - -
0.6 420,442 56, 57 13 - - 4.47𝑥106 0.59% 2, 0 1𝑥104 0.0022
0.8 112,166 10, 15 4 - - 1.39𝑥106 0.18% 0,1 5𝑥103 0.0036
0.0 - - 256,288 - 3 2.73𝑥108 100 % - - -
0.2 - 375,351 41,45 25,31 - 3.69𝑥107 13.51 % - - -
10
0.4 - 91, 101 13,12 4 - 9.81𝑥106 3.59% - - -
0.6 207,215 13,29 2 0 - 2.11𝑥106 0.77% - - -
 0.8 INC 72,76 7 - - 7.38𝑥106 2.7% 1,0 1x106 0.135
1.68x1
0.0 - - 208,350 45,49 3 2.96𝑥108 100% 0,1 5x105
0-3

1.75x1
0.2 - 526,572 75,78 7 - 5.69𝑥107 19.22% 1,1 1x105
0-3
12 4.58x1
0.4 - 107, 97 16,23 0 - 1.09𝑥107 3.68% 1,0 5x105
0-2

0.6 - 53,40 0,0 0 - 4.65𝑥106 1.57% - - -

0.8 - 38,34 7,4 0 - 3.75𝑥106 1.26 - -
-

0.135
0.14

Equipo 8
Frecuencia de Mutación

0.12
Equipo 10

0.1 Equipo 12

0.08

0.06
0.0458

0.04

0.02
00
0.00168 00
0.00175 00 0.0022 0.0036
0 0
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8
Concentración de Hidroxilamina (M)
Figura 4. Relación de la concentración de HA con la frecuencia de mutación de
Escherichia coli W3350.
 Tabla 4. Frecuencia de Mutación de Escherichia coli W3350 con tratamiento de Luz UV.
M
u
E t
a Frecu
q Dilución %Sobr n encia
u Luz
Título eviven t Título de
i UV
cia e Muta
p
s ción
o
10−4 10−5 10−6 10−7 10−5

0 - 572,584 56,50 0 5.7𝑥108 100% - - -

8
15 - 45,51 7,4 127 1.05𝑥10 18.42% - - -
7 30 - 115,119 26,21 0 1.27𝑥108 22.3% 1,1 1𝑥106 0.0078
45 - 40,36 4,2 0 3.71𝑥107 6.5% - - -
60 - 136,184 34,28 0 1.75𝑥108 30.7% 1,0 5𝑥105 0.0028
0 - 208, 135 1 1.73𝑥108 100% - - -
15 - 89,49 1 6.1𝑥107 35% - - -
9 30 - 20,24 0 2.04𝑥107 11.79% 1,0 1𝑥106 0.049
45 - 57,36 0 4.6𝑥106 26.59% - - -
60 357,479 58,57 - 4.32𝑥106 24.97% - - -
0 - 261,84 3 1.67𝑥108 100% - - -
15 - 117,98 1 1.10𝑥108 65.86% - - -
30 - 153,168 1 1.53𝑥108 91.61% - - -
11
45 567,621 194,75 - - 6.38𝑥107 38.2% 2,0 2𝑥106 0.013
-
60 481, 567 50,60 - - 5.27𝑥107 31.55% - -
 0.05 0.049

0.04
Frecuencia de mutación

0.03

Equipo 7
0.02
Equipo 9
0.013
Equipo 11
0.01 0.0078
0.0028
0 0 0 0 0
1E-17
0 10 20 30 40 50 60

-0.01
Tiempo (seg)

Figura 5. Relación del tiempo de exposición con luz UV con la frecuencia de mutación
de Escherichia coli W3350.
Tabla 5. Registro del efecto de reversión con diferentes mutágenos o antibióticos en la
cepa de Escherichia coli tratada con HA y luz UV.
Tratamiento Equipo Sm 9-AA NTG 5-BU HA Agua
estéril
Luz UV 7 - - - - - -
9 - - - - - -
11 - - - - - -
Hidroxilamina 8 - - - - - -
10 - - - - - -
12 - - - - - -
“Sm”: Estreptomicina; “AA”: Amino Acridina; “5-BU”: 5 Bromo Uracilo; “+”: Reversión; “-“:
No reversión.

Tabla 6. Valores esperados y de comparación para el efecto de reversión con diferentes

mutágenos o antibióticos en la cepa de Escherichia coli tratada con HA y luz UV.
Tratamiento Equipo Sm 9-AA NTG 5-BU HA Agua
estéril
Luz UV 7 - + + + + -
Hidroxilamina 8 - + + - -
DISCUSIÓN:

La hidroxilamina (HA) es un compuesto químico que, al introducirse en la célula, actúa

como un modificador de las bases nitrogenadas del DNA, induciendo una sustitución
(preferentemente) de un par de Guanina-Citosina (G-C) por una Adenina-Timina (A-T),
estas modificaciones se expresan fenotípicamente en las colonias bacterianas después
de 2 generaciones. Estas modificaciones de las bases nitrogenadas se esperaba que
produjesen un cambio en el gen que codifica a la producción de lactato deshidrogenasa,
la enzima que le permite a la bacteria hidrolizar a la lactosa para usarla como fuente de
carbono en la síntesis de más enzimas, carbohidratos, etc. También se esperaba un
efecto letal de la bacteria, ya que las modificaciones a nivel de bases podrían traer
consecuencias negativas para la bacteria.
En cuanto a la luz ultravioleta, es un agente mutagénico físico de tipo de radiación no
ionizante, ya que rompe enlaces π de las bases pirimídicas y forma dímeros de éstas
tales como: Timina-Timina (T-T), Timina-Citosina (T-C) y Citosina-Citosina (C-C), siendo
la de T-T la que se presenta en mayor proporción; el efecto que se esperaba era el mismo
que con el tratamiento con HA.
En las bacterias se producen mutaciones espontáneas aproximadamente en una
frecuencia de 1:1x1010 generaciones, y de manera inducida en una frecuencia de 1:1x10 7
generaciones; en esta experiencia se esperaba que cada equipo obtuviese, por lo
menos, una colonia mutante a lo largo del procedimiento.
Se calculó el % de sobrevivencia de Escherichia coli cepa W3350 en dos tratamientos
mutagénicos diferentes, se hablará acerca de cuan letal fueron estos tratamientos,
entendiéndose por efecto letal a la efectividad para causar la muerte de este
microorganismo.
Tomando como el 100% de sobrevivencia a los tratamientos a 0 segundos de para el
caso del efecto de la exposición a la luz UV y como el 100% de sobrevivencia para el
caso de una concentración de 0 M para el tratamiento con Hidroxilamina.
Para ambos casos se esperaba que conforme aumentara el tiempo (tratamiento con luz
UV) o la concentración (tratamiento con Hidroxilamina) la población de células
disminuyera. Esto se cumple al menos para el tratamiento con Hidroxilamina, al graficar
los porcentajes de sobrevivencia representados en la Figura 1, se observa cómo es que
el % de sobrevivencia decae a medida que la concentración del agente químico
incrementa, el decremento del % de sobrevivencia causado por el incremento de la
concentración de Hidroxilamina se puede deber al aumento en el número de moléculas
de Hidroxilamina que reaccionan con las bases citosina en el DNA, debido a este
incremento en las reacciones se pueden estar causando daños irreparables en la
estructura del DNA, generando fallas letales en la replicación y por lo tanto disminuyendo
por estas causas la población de células a medida que la concentración aumenta.
Comparando los porcentajes de sobrevivencia del tratamiento con hidroxilamina con la
grafica de referencia representada en la figura 3, se pudo apreciar que el equipo 8 obtuvo
una curva muy similar a la obtenida bibliográficamente, donde se hace evidente que a
mayor concentración menor número de sobrevivientes.
Por otro lado, los resultados de la exposición a luz UV no fueron los esperados, en la
gráfica del porcentaje de sobrevivencia contra el tiempo de exposición representada en
la figura 2 se puede apreciar que en el caso del equipo 7 se muestra que conforme a
mayor tiempo de exposición, en algunos casos, la población sobreviviente incrementa,
en el segundo 15 de exposición, el % de sobrevivencia aumenta drásticamente, este
valor se puede deber a que durante la experimentación pudieron confundir algunos
tubos, en este caso el tubo 1 y el tubo 2, o probablemente invirtieron los resultados
obtenidos durante este experimento.
De igual forma, comparando los resultados de los demás equipos, los valores obtenidos
son más parecidos a la curva de “no reparación” localizada en la figura 3, usada como
referencia.
Las causas podrían deberse a que el tiempo de exposición para la placa fuera mayor
que el indicado para los resultados no concordantes, en cuanto a los datos del equipo 9
y 11, los cuales se notan de manea inmediata un efecto letal casi inmediato y de manera
precipitada.
Estos errores son de tipo sistemático, posiblemente, pues en todo el tratamiento para luz
UV se observa la misma tendencia de incremento en % de sobrevivencia a medida que
el tiempo pasa, dichos errores fueron causados por el mal funcionamiento del sistema
eyector de la punta de la micropipeta utilizada.

Frecuencia de mutación
La frecuencia de mutación espontánea es de 1x10^7 a 1x10^10 en cambio la inducida
es de 1x10^4 a 1x10^7 que es mayor, en la gráfica podemos ver que la frecuencia de
mutantes aumenta conforme la concentración de hidroxilamina lo hace, sin embargo los
resultados no son los esperados para la exposición a luz UV pues son muy variables esto
puede deberse a que los equipos 7, 9 y 10 que trabajaron con luz UV no realizaron bien
la diluciones lo que se puede ver en la tabla 4 de frecuencia de mutacióno simplemente
no cubrieron correctamente con aluminio los tubos, lo que provocó la activación de
mecanismos de fotorreparación que repararon una mutación sobre el marcador seguido.

Por último, se realizó un tratamiento con diferentes mutágenos y antibióticos, (los cuales
eran nitrosoguanidina, 5-Bromouracilo, Estreptomicina, 9-aminoacridina, Hidroxilamina y
agua estéril) para producir un efecto de reversión en las colonias mutantes para
determinar el tipo de daño que realiza la HA y la luz UV.
Como se sabe una reversión es una segunda mutación en donde se restaura el fenotipo
y/o el fenotipo. Y este se divide a su vez reversiones verdaderas y no verdaderas, en
donde las verdaderas se restaura el fenotipo y el genotipo. Y en las reversiones no
verdaderas se restaura el fenotipo, pero no se restaura el genotipo.
Los resultados esperados en el tratamiento con Hidroxilamina, son que aparezcan
revertantes (estos con presencia de un halo alrededor de los discos impregnados con el
agente, con un césped bacteriano y crecimiento de colonias bien definidas alrededor de
los discos).
Se sabe que este agente mutagénico provoca transiciones unidireccional GC-AT. Se
esperaba la presencia de revertantes en 5-bromouracilo, debido a que provoca
transiciones bidireccionales, al igual en Nitrosoguanidina, que provoca transiciones.
En los reactivos que no se esperaba la presencia de revertantes son, 9-Aminoacridinica,
en Hidroxilamina, estreptomicina y agua estéril. Esto debido a que en el caso de 9-
Aminoacridina se provocan inserciones y deleciones, en el caso de la Hidroxilamina,
como ya se mencionó con anterioridad, son transiciones pero están son unidireccionales,
por lo tanto no provoca una reversión. La estreptomicina es un antibiótico, que hasta lo
que se conoce hasta el momento, provoca únicamente una lectura incorrecta en el RNA,
por lo cual no se podría considerar un agente mutágeno verdadero.
Existen una serie de artículos en donde se discute si la estreptomicina podría llamarse
agente mutágeno, en el artículo leído, se revisaron 4 antibióticos, los cuales fueron
penicilina, estreptomicina, cloranfenicol y aureomicina. En donde se buscaba conocer y
comprobar que estos antibióticos actuaban como agente mutagénicos, se llegó a la
conclusión, que la estreptomicina es una alteración en el marco de lectura y no afecta el
DNA, además no es hereditaria la modificación observabada. Por lo que se dedujo que
no influía a ser un agente mutagénico, ya que estos afectan el ADN y son heredables.
En el caso del tratamiento con Luz UV, la cual se sabe que provoca inserciones y
deleciones en el DNA por la formación de dímeros de pirimidina y como efecto secundario
provoca transiciones y transversiones. Este agente físico provoca reversiones en casi
todos los agentes mutagénos usados, como lo son nitrosoguanidina, el cual al ser un
agente alquilante, puede revertir la luz UV, el 5-Bromouracilo que puede revertir la luz
UV, así como 9- aminoacridina que es un agente intercalante que provoca inserciones y
deleciones. Se esperaban revertantes de hidroxilamina de igual forma.
Y en el caso de los que no se esperaba era en estreptomicina, por las mismas razones
explicadas en hidroxilamina y tampoco en el agua estéril. Estos resultados se presentan
en la tabla 6, para verificar cuales son los que se esperaban y cuales no.
En la tabla número 5 se presentan los resultados obtenidos en la experimentación y aquí
se puede decir que no fueron los esperados, debido a que no se encontraron revertantes
en ninguno de los agentes y en ningún tratamiento con hidroxilamina ni luz UV. Esto se
puede deber, a que los discos que se utilizaron, quizás no estaban impregnados con la
sustancia o bien estos eran demasiado viejos, esto se puede deducir debido a que desde
el momento que se sujetaron los discos con las pinzas, los papeles estaban adheridos
unos con otros y era muy difícil separarlos. Otra situación que pudo ocurrir pudo ser que
la sustancia a utilizar estaba caducada, esto provocaría que se encontraran estos
valores.
CONCLUSIONES
La frecuencia de mutación aumenta conforme la dosis del mutágeno es más alta
La hidroxilamina es un mutágeno que forma transiciones en el DNA
A mayor concentración de Hidroxilamina mayor número de mutantes
La radiación UV forma dímeros de pirimidinas que provocan inserciones y deleciones
La radiación UV es más eficiente para producir una mutación en un organismo.

Bibliografía
Snyder, L. Peters, J. (2013). Molecular genetics of bacteria. Washington D.C: ASM
PRESS. Pp 434-438.
González, A. (1994). Los efectos biológicos de las dosis bajas de radiación
ionizante: Una visión más completa. Informes especiales. Pp 39-40.
Malling, H., V. (1966). Hidrocilamine as a mutagenic agent for Neurospora crassa.
Biology division, Oak Ridge National Laboratory. Tennessi, U.S.A. Pp 470-476.