Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias

Biológicas.

Genética microbiana.

Practica I “Inducción de mutantes en Escherichia coli

“

5QM01
Sección: 1 Equipo: 6

Alumnos:
Introducción:
Las mutaciones son un concepto muy importante en biología hoy, conducen a
variaciones en los genes. Estos genes pueden tener una buena o mala
influencia en las características de un organismo. Las variaciones también son
muy importantes en la evolución. Sin las variaciones la evolución no sería
posible y los cambios en cualquier parte del entorno podrían hacer que el
organismo se extinga. Una mutación es cualquier cambio heredable en la
secuencia de ADN. Esto puede o no afectar el fenotipo del organismo. El
término "mutación" fue acuñado por Hugo de Vries, que deriva de la palabra
latina "cambiar"
El proceso de mutación se llama mutagénesis y el agente que induce
mutaciones es llamado mutágeno. (Los organismos seleccionados como cepas
de referencia se denominan tipo salvaje, y su la progenie con mutaciones se
llama mutantes).
Tipos de mutaciones.
Las mutaciones pueden clasificarse por los tipos de alteraciones en el ADN, o
si la mutación fue espontánea o inducida por un mutágeno en el medio
ambiente. El emparejamiento incorrecto es principalmente debido a procesos
celulares como el cambio tautomérico de bases, daño oxidativo al ADN,
depuración y desaminación o causado por el "medio ambiente", es decir,
productos químicos, radiación, virus, dieta y estilo de vida (mutágenos).
Mecanismos de mutación.
a. Sustitución de un nucleótido: la sustitución de la base, también llamada
mutación puntual, implica el cambio de una sola base en la secuencia de
ADN. Este error es copiado durante la replicación para producir un cambio
permanente. Si una purina [A o G] o pirimidina [C o T] se reemplaza por la
otro, la sustitución se llama transición. Si una purina se reemplaza por una
pirimidina o viceversa, la sustitución se llama transversión. Este es el
mecanismo más común de mutación.
b. Supresión o adición de un nucleótido: eliminación o adición de un
nucleótido durante la replicación de ADN. Cuando un transposón se inserta en
un gen, conduce a una ruptura del gen y se llama mutación de inserción.
Irradiación ultravioleta
La luz ultravioleta hace que se formen enlaces entre residuos de la pirimidina
adyacente en la misma cadena poli nucleotídica. Estos se llaman dímeros de
pirimidina. La irradiación UV puede dar lugar a la formación de enlaces
covalentes entre dímeros de pirimidina. Estos enlaces distorsionan la
conformación del ADN e inhiben la replicación y transcripción del ADN.
Mutágenos químicos
Se ha identificado una variedad de mutágenos químicos que se clasifican en
tres grupos basados en su función.
El primer grupo son aquellos agentes que actúan modificando químicamente
una base en el ADN que se asemeja a una base diferente. Por ejemplo, el ácido
nitroso provoca una desaminación oxidativa en la que los grupos amino se
convierten en grupos ceto y, por lo tanto, residuos de citosina, serán
convertidos a uracilo. El uracilo será capaz de emparejarse con adenina,
causando así un cambio de un par C–G a T–A. Del mismo modo, la
desaminación de adenina crea bases hipoxantinas, que se emparejarán con
citosina. Algunos tipos de agentes químicos no son incorporados en el ADN,
pero en cambio altera una base, causando un mal emparejamiento específico.
Actúan contra el ADN dentro de las células, en lugar de contra el ADN
aislado. Ciertos agentes alquilantes, tales como etilmetanosulfonato (EMS) y
nitrosoguanidina (NG), agregan grupos alquilo a muchas posiciones en las
cuatro bases, la mutagenicidad se correlaciona mejor con una adición al
oxígeno en la posición 6 de guanina. Esta adición lleva a un mal
emparejamiento directo con timina y daría como resultado transiciones GC→
AT.
Prueba de Ames
La prueba de Ames utiliza varias cepas de la bacteria Salmonella
typhimurium que portan mutaciones en genes implicados en la síntesis de
histidina, es decir, es un mutante auxotrófico, por lo que requieren histidina
para crecer. El método prueba la capacidad del mutágeno para crear
mutaciones que pueden resultar en una reversión a un estado no auxotrófico
para que las células puedan crecer en un medio sin histidina. Las bacterias se
propagan en una placa de agar con una pequeña cantidad de histidina. Esta
pequeña cantidad de histidina en el medio de crecimiento permite a las
bacterias crecer por primera vez y tener la oportunidad de mutar. Cuando la
histidina se agota, solo sobrevivirán las bacterias que han mutado para obtener
la capacidad de producir su propia histidina. La placa se incuba durante 48
horas. La mutagenicidad de una sustancia es proporcional al número de
colonias observadas.
Objetivos:
 Conocer el manejo de algunas técnicas para producir mutaciones.
 Analizar algunos parámetros que caracterizan el proceso de mutación,
como la frecuencia de mutación y la relación dosis-respuesta.
 Caracterizar el daño producido por la luz UV y la hidroxilamina,
mediante pruebas de reversión.
Resultados:
A. Producción de mutantes
a) Tratamiento con Hidroxilamina
Equip Concentració Dilución
-4
o n 10 10-5 10-6
M
2 0.0 - - 425 465 45 70
0.2 - - 231 205 42 35
0.4 INC INC 440 420 - -
0.6 420 431 185 169 - -
0.8 525 410 133 169 - -
4 0.0 - - - 560 314 315
0.2 - - 124 130 0 0
0.4 466 500 30 45 - -
0.6 170 190 22 25 - -
0.8 448 205 116 48 - -
6 0.0 - - 447 339 85 76
0.2 - - 672 692 135 146
0.4 588 526 141 421 - -
0.6 428 416 172 169 - -
0.8 416 414 102 119 - -
Tabla 1. Colonias sobrevivientes al tratamiento con Hidroxilamina a
diferentes concentraciones. 1ra siembra

Eq. Conc. Dilución

 M 10-2 10-3 10-4 10-6 10-7 10-8
2 0.0 - - - 96 11 5 2 2
0.2 INC INC 598 551 95 - - -
0.4 INC INC 328 301 48 - - -
0.6 INC INC 251 235 52 - - -
0.8 INC INC 628 592 125 - - -
4 0.0 - - - 127 95 5 11 0
0.2 INC INC INC 600 199 - - -
0.4 INC INC 303 328 54 - - -
0.6 INC INC 260 264 36 - - -
0.8 INC INC 552 569 15 - - -
6 0.0 - - - 105 10 14 1 2
0.2 INC INC 588 567 152 - - -
0.4 557 553 432 416 52 - - -
0.6 INC INC 282 236 118 - - -
0.8 INC INC 926 714 134 - - -
Tabla 2. Colonias sin mutágeno, tratamiento con Hidroxilamina a
diferentes concentraciones. 2da siembra

Siembra Concentración M Titulo

1 0.0 8.05x108
0.2 1.41x109
0.4 2.81x108
0.6 1.70x108
0.8 1.11x108
2 0.0 1.05x109
0.2 1.52x107
0.4 5.2x106
0.6 1.18x107
0.8 1.34x107
“Mutantes esperadas” 0.0 2x105
0.2 3x105
0.4 5x105
0.6 6x105
 0.8 4x105
Tabla 3. Títulos

b) Tratamiento con luz UV

Equip Tiempo Diluciones
-4
o Seg. 10 10-5 10-6
1 0 - - 147 183 21 22
15 - - 41 110 11 11
30 - - 100 104 8 10
45 - - 100 251 35 29
60 32 31 3 1 - -
3 0 - - 318 228 27 38
15 - - 83 77 11 13
30 - - 65 60 18 17
45 - - 8 15 13 12
60 5 1 1 0 - -
5 0 - - 371 365 46 44
15 - - 145 189 13 12
30 - - 168 178 15 18
45 - - 35 36 2 4
60 - - 113 116 8 15
Tabla 4. Colonias sobrevivientes al tratamiento con Luz UV a diferentes
tiempos. 1ra siembra

Equip Tiempo Diluciones

o Seg. 10-5 10-6 10-7 10-8
1 0 - - INC 328 330 40 41
15 257 - 45 26 5 6 - -
30 239 - 21 21 2 3 - -
45 453 33 75 21 18 - -
60 INC 197 158 23 18 - -
3 0 - - - - - - - -
15 212 18 26 3 5 - -
30 287 13 24 3 2 - -
 45 131 130 3 12 1 - -
60 263 209 25 28 1 - -
5 0 - - 76 - 9 8 0 0
15 INC - 68 56 4 4 - -
30 246 28 36 3 1 - -
45 258 215 25 27 0 - - -
60 236 251 25 17 3 - - -
Tabla 5. Colonias sin mutágeno, tratamiento con Luz UV a diferentes
tiempos. 2da siembra

B. Determinación del tipo de mutación producida por la luz UV y la

Hidroxilamina
Mutágeno o antibiótico Eq. 1 Eq. 2 Eq. 3 Eq. 4 Eq. 5 Eq. 6
Estreptomicina y 9-aminoacridina (-) (-) (-) (-) (+) (-)
Nitrosoguanidina y 5-bromouracilo (-) (-) (-) (-) (-) (-)
Hidroxilamina (-) (-) (-) (-) (-) (-)
Agua estéril (-) (-) (-) (-) (-) (-)
Tabla 6.

Discusión:
Conclusiones:
 La estreptomicina no es un mutágeno.
 La hidroxilamina y la luz UV son mutágenos unidireccionales.
Bibliografía:
 Mohammad B. Habibi Najafi Parnian Pezeshki. (diciembre 2013).
“BACTERIAL MUTATION; TYPES, MECHANISMS AND MUTANT
DETECTION METHODS: A REVIEW”. European Scientific Journal,
4, 628,629,631,632,636. 13 de marzo de 2020