COLORACIONES EN HEMATOLOGÍA

I. INTRODUCCION
las coloraciones empleadas en Hematología, muestran bondades
policromatófilas permitiendo describir numerosas características en las células,
pero debemos igual establecer tiempos y equilibrios adecuados para obtener
los tonos adecuados que favorezcan la visualización de las células y por ende
el diagnóstico microscópico.

II. METODOLOGIA

Materiales y equipos requeridos

 Colorante Wright
 Colorante Giemsa
 Alcohol metílico (100 ml)
 Agua destilada
 Bandeja de coloración
 Láminas portaobjetos
 Tubos de ensayo 13x 100
 Gradillas

TINCIÓN CON COLORANTE DE WRIGHT

Fundamento
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar la sangre
y determinar las variaciones y anormalidades de estructura, forma y tamaño de
los eritrocitos, su contenido de hemoglobina y sus propiedades de coloración. La
información obtenida de un frotis de sangre periférica depende en gran parte de
la calidad del extendido y la coloración.

Materiales
Colorante de Wright.
Solución amortiguada tamponada / agua destilada fresca
COLORANTE DE WRIGHT
Reactivos
Colorante de Wright ………………… 0.6 g
Metanol (CH3 OH) ………………… 100.0 ml

Buffer para Wright y Giemsa

Solución madre:
 Solución A: KH2PO4 ……………….. 9.40 g
 Solución B: Na2HPO4 ………………………. 9.07 g

 Buffer pH.7.2 para Giemsa: mezclar 39.0 ml de solución A con 61.0 de

solución B y agregar 900.0 ml de agua destilada.

 Buffer pH 6.8 para Wright: mezclar 50 ml de solución A y 50 ml de solución

B y agregar 900.0 ml de agua destilada.
Procedimiento de coloración
el frotis en un soporte y se cubre con el colorante de Wright.

1. Inmediatamente se añade solución amortiguada

tamponada o agua destilada en partes iguales hasta
obtener un brillo metálico, se sopla suavemente para
mezclar ambas soluciones dejando 8-10 minutos. ( el
tiempo se determina con una coloración piloto)

2. Finalmente se lava con agua corriente, se limpia los residuos de colorante

y se deja secar.

3. Revisar con objetivo X100 y aceite de inmersión

 Observación microsópica (Obj. X100)

TINCIÓN DE GIEMSA:
Reactivos
Colorante Giemsa (polvo)……………… 1.0 g
Glicerina calentada………………………66.0 ml (*50° C por 2 horas)
Alcohol metílico…………………………. 66.0 ml
 Disolver el colorante com glicerol
 Adicionar el metanol, mesclar bien y dejar a temperatura ambiente 7 a 14
días (maduración)
 Filtrar antes de su empleo (conservar em frasco color caramelo)

Dejar madurar entre 7 a 14 días. Filtrar antes de usar.

Agua tamponada
Ortofosfato disódico anhidro (Na2HPO4) 4 g
Ortofosfato monopotásico (KH2PO4) 5 g
Tomar 1 g de la mezcla de las sales y disolver en 1 litro de agua destilada, agitar
y ajustar a pH 7,2
Recomendaciones
Las sustancias amortiguadoras actúan como un elemento químico inactivador
de cantidades variables de ácido o álcali. En términos generales la reacción de
los diluyentes que había dado mejores resultados se acercaba al punto de
neutralidad (pH 7,0). En la práctica, la escala oscila generalmente entre un pH
6,6 - 7,4 que es por coincidencia, la escala del indicador rojo de fenol.
El ortofosfato disódico y el ortofosfato monopotásico son las sales
amortiguadoras que se usan con más frecuencia. En la práctica, se puede
preparar rápidamente soluciones amortiguadoras eficaces agregando 1 g de
mezcla de sales de sodio y de potasio por cada litro de agua destilada en la
proporción de 4:5 ó en cualquier otra proporción que haya resultado satisfactoria.
Se mezclan perfectamente dichas sales en las proporciones seleccionadas, se
pesa el polvo homogéneo en lotes de un gramo.
 Preparación de colorante diluido
Procedimiento
Utilizar una probeta de vidrio para diluir el colorante.
Preparar la solución de trabajo diluyendo la solución "madre" 1/10, con agua
destilada o solución amortiguadora de pH 7,2
Solución "madre" Giemsa 100 ml.
Agua destilada 900 ml.

Una forma sencilla de preparar la dilución es agregando 2 gotas de solución

"madre" por mililitro de agua destilada o solución amortiguadora
Coloración

1. Secar el frotis.
2. Fijar con alcohol metílico durante 3 minutos. En caso de que la preparación
del colorante ya posea metanol, este paso queda obviado.

3. Solución de trabajo: 1 volumen de colorante y 9 de agua Tamponada. Se

prepara antes de la coloración.
4. Sumergir en solución de Giemsa o cubrir el frotis
durante 10 minutos (en este caso soplar para
mezclar correctamente).

5. Lavar con abundante agua y dejar secar antes de observar al microscopio.

Tinción de Gota gruesa (Hemoparásitos)
1. Cubrir con colorante Giemsa diluido 1:50 con agua tamponada pH7.0 por 45
minutos
2. Lavar con agua tamponada por 3 minutos y secar en posición vertical

Con esta técnica se destruyen los hematíes, observándose sólo los parásitos
teñidos, de citoplasma de color azulado y la cromatina rojiza.
Control de calidad de las coloraciones:
Una extensión de sangre bien teñida debe caracterizarse por una buena
diferenciación de las estructuras subcelulares en los leucocitos, una coloración
rosada de los hematíes y la ausencia de precipitados.
Los defectos más frecuentes observados en la tinción del frotis sanguíneo son:
Coloración excesivamente azul, debido a:
Frotis excesivamente grueso, Lavado insuficiente, Tinción muy prolongada,
Empleo de colorante excesivamente alcalino.
Coloración con una tonalidad rosada:
El colorante, el tampón o el agua de lavado tienen un pH demasiado ácido.
Presencia de precipitados:
se puede evitar con la filtración.

Observación microsópica (Obj. X100)

 ESTUDIO DE RETICULOCITOS

I. INTRODUCCION

Los reticulocitos, eritrocitos inmaduros, existen en la sangre en una proporción

de cinco a diez por mil hematíes. Su tamaño es el de los demás hematíes y se
caracteriza por contener una pequeña cantidad de ARN (ribosomas) formando
un retículo granulofilamentoso observable al ser teñido con colorantes llamados
vitales como son el azul de Cresil Brillante o el azul de metileno nuevo. La
cantidad de ARN es tanto menor cuanto más madura es la célula.
El recuento de reticulocitos es la técnica más simple actualmente disponible para
valorar la actividad eritropoyética de la médula ósea. Cuando una anemia se
acompaña de un elevado número de reticulocitos circulantes (reticulocitosis) se
considera regenerativa, mientras que cuando el número es normal o disminuido
se denomina arregenerativa.
En condiciones normales, los reticulocitos permanecen en la médula durante 2-3
días y terminan su maduración en 24 horas, aproximadamente, una vez ya en la
sangre periférica.
El recuento de reticulocitos debe realizarse a partir de sangre total con
anticoagulante (EDTA) a ser posible, dentro de las 24 primeras horas de la
extracción cuando la sangre se conserva a temperatura ambiente. Si se mantiene
a 4º C, el recuento puede realizarse hasta 48 horas después de la extracción.

II METODOLOGIA

Materiales y equipos requeridos

 Láminas portaobjetos.
 Tubos de ensayos de 12 x 75 mm.
 Gradillas
 Parafilm
 Pipetas Pasteur con chupones / goteros.
 Solución de azul de cresil brillante (filtrada).
 Baño María
 Microscopio
 Aceite de inmersión
Colorante:
 Azul de Cresil Brillante……………… 1.0 gr (* se puede emplear azul de metileno fresco)
 Solución salina (ClNa al 9%0) …… 100.0 ml
 Citrato de sodio…………………… 0.4 gr
 Mezclar bien y filtrar antes de usar.

Procedimiento:
a) Colocar 3 gotas de colorante filtrado en un tubo
b) Añadir 3 gotas de sangre bien homogenizada. (En caso de valores muy bajos
de hematocrito debe colocarse doble cantidad de sangre total que, de
solución colorante).
c) Mezclar bien e incubar por 15´ a 37° C o a temperatura ambiente.
d) Realizar en láminas, frotices delgados y secar al medio ambiente.
e) Contar 1000 glóbulos rojos con objetivo de inmersión y contar los glóbulos
que contengan gránulos y filamentos como redes de color azul oscuro
(reticulocitos).

Observación microsópica (Obj. X100)