Resumen

El uso de nanopartículas de plata (AgNP) en productos comerciales ha aumentado

significativamente en los últimos años. Sin embargo, los hallazgos sobre los efectos
tóxicos de los AgNP aún son limitados. Este artículo informa una investigación sobre el
potencial citotóxico y genotóxico de los AgNP en las células de la raíz de Allium
cepa. También se determinaron la germinación (GI), elongación de la raíz (REI), mitótica
(MI), anormalidad nuclear (NAI) e índice de micronúcleos (MNI) para semillas expuestas
a varios diámetros de AgNP (10, 20, 51 y 73 nm) en cuanto al volumen de plata (AgBulk)
(partículas de tamaño micrométrico) a una concentración de 100 mg · L -1. La
microscopía electrónica de transmisión (TEM) proporcionó la distribución del tamaño de
partícula, mientras que la dispersión dinámica de la luz (DLS) se usó para obtener el
tamaño hidrodinámico, el índice de polidispersidad y el potencial zeta de los AgNP. La
espectroscopía de descomposición inducida por láser (LIBS) y la espectrometría de
emisión óptica / plasma acoplada inductivamente (ICP OES) se aplicaron para
cuantificar la absorción de contenido de AgNP por las raíces. La disolución de plata se
determinó mediante un experimento de diálisis. Los resultados mostraron que los AgNP
penetraron las raíces, afectando MI, GI, NAI y MNI en células meristemáticas. Los
cambios en estos indicadores fueron dependientes del diámetro de AgNP, de modo que
los efectos citotóxicos y genotóxicos en Allium cepa aumentaron con la reducción del
diámetro de partícula.

1. Introducción
Hoy en día la sociedad ha sido testigo de la creciente implementación de nanomateriales
y aplicaciones de nanotecnología. La producción emergente de materiales a nanoescala
se basa en su potencial socioeconómico,beneficios ambientales y beneficios para la
salud humana. Aunque NPs (nanoparticulas) tienen muchas funciones, surge una gran
preocupación debido a sus posibles efectos adversos en los organismos humanos,
animales y vegetales .
Los mecanismos de toxicidad de las nanopartículas aún no se comprenden
completamente. Los investigadores han informado que los efectos tóxicos de los NP
están relacionados con el diámetro reducido de los NP, lo que hace posible la
penetración y translocación en tejidos y membranas celulares, la biomagnificación en
trófico superior nivel ya que los NP pueden transportarse a lo largo de cadenas tróficas
en condiciones ecológicas sistemas ,y la bioacumulación porque la mayoríade los NP
modificados genéticamente no son biodegradables
Varias preguntas sobre el destino, el comportamiento y las implicaciones de los NP en
las plantas todavía están abiertos. Por ejemplo, poco se sabe de la ruta de entrada de
las NP en los tejidos vasculares, el papel de las paredes celulares en la
internalización,la influencia de los NP sobre los mecanismos de evapotranspiración y el
rendimiento fotosintético, y sus efectos citotóxicos y genotóxicos.las plantas superiores
son organismos más sensibles para detectar el citotóxico y los efectos genotóxicos de
los contaminantes ambientales, lo que los convierte en excelentes bioindicadores para
examinar el potencial nocivo de los NP. Allium cepa, Vicia faba, Zea mays, Tradescantia,
Nicotiana tabacum, Crepis capillaris y Hordeum vulgare se encuentran entre las
especies de plantas superiores más frecuentes utilizadas como bioindicador para
evaluar la contaminación ambiental. Sin embargo, A. cepa ha sido señalado como
favorable para evaluar los daños y alteraciones cromosómicas en el ciclo mitótico debido
a las buenas condiciones cromosómicas (es decir, una reducciónnúmero de
cromosomas grandes).
Además, ha demostrado una alta sensibilidad en la detección de contaminantes
ambientales . Tambien, se deben evaluar los impactos de las nanopartículas en las
plantas considerando que juegan un papel clave en ecotoxicología debido a su
inmovilidad, red de raices y función en los ecosistemas como productores primarios .

Estudios recientes han demostrado que los NP inhiben la germinación y crecimiento de

las plantas e informaron que los NP penetran en los tejidos vivos y migran a otras
regiones de la planta, siendo recogida por las raíces y llevada a la parte aérea a través
de sistemas vasculares; estos procesos dependen de la composición química, forma,
diámetros de NP y anatomía de la planta .
Entre las nanopartículas de ingeniería, las nanopartículas de plata (AgNP) son los más
comercialmente disponibles y utilizados para aplicaciones comoagentes
antimicrobianos, antivirales y antifúngicos , ungüentos para prevención de infecciones
relacionadas con quemaduras y heridas abiertas, drogas y biosensores . La exposición
ambiental de las plantas a los AgNP puede ocurrir debido a derrames accidentales,
tratamiento de aguas residuales, uso de agroquímicos (por ejemplo, nanoplaguicidas,
fertilizantes y herbicidas), lavado y envejecimiento de productos que contienen plata .
A pesar de la literatura existente sobre morfología y fisiología efectos de los AgNP en
las plantas (germinación, crecimiento de las plantas, desarrollo y operación del
fotosistema II, etc.) hay pocos trabajos sobre los efectos citotóxicos y genotóxicos de
los AgNP se han reportado en plantas. Kumari (?) y sus colegas presentaron que AgNPs
menores de 100 nm alteraron la división celular de las células de la punta de la raíz de
A. cepa aunque observaron una reducción en el índice mitótico en función de la
concentración de AgNPs, la influencia de una variedad de diámetros de AgNPs en los
citotóxicos y genotóxicos.No fue investigado.
Teniendo en cuenta la falta de un examen metódico sobre la dependencia de la toxicidad
del tamaño de AgNP, este trabajo informa un análisis detallado del potencial citotóxico
y genotóxico de AgNP con diferentes diámetros (10,20, 51 y 73 nm) y AgBulk en las
células de la raíz de A. cepa usando un fijo concentración de partículas tóxicas de 100
mg · L − 1. Aunque los AgNP pueden producir toxicidad a concentraciones más bajas,
sí será tóxico a concentraciones más altas (es decir, para concentraciones de 100 mg ·
L − 1) dependiendo del tamaño de partícula y las especies de plantas . Por ejemplo,
álamo (Populus deltoides × nigra) solo fue susceptible a los efectos tóxicos cuando se
presente a los 25nm a 100 mg · L − 1

2. Materiales y métodos
- Preparacion de AgNPs
AgNP recubiertos con PVP en solución acuosa a 1 mg.mL − 1 (BioPure Silver Las
nanoesferas - PVP) se compraron de nanoComposix (nominaldiámetro de 5, 25, 50 y
75 nm), mientras que Sigma-Aldrich proporcionó plata micropartículas (AgBulk) con
diámetros en el rango de 5–8 μm. Un fijo se usó una concentración de 100 mg · L-1 en
todos los experimentos; se obtuvo diluyendo AgNP o AgBulk en agua destilada. El
agbulk la solución acuosa se preparó dispersando el polvo en destilado yagua usando
agitación ultrasónica durante 30 minutos
- Caracterizacion de AgNPs

La caracterización de AgNPs se realizó por transmisión de microscopía electrónica

(TEM) con espectroscopia de energía dispersiva (EDS) que emplea un microscopio
FEI Tecnai G2 que funciona a 200 kV.
Las soluciones de AgNP se dispersaron por ultrasonido durante 10 minutos. Luego,
una pequeña cantidad de cada solución se vertió en una película carbón holey usando
una rejilla de cobre para microscopía y secada durante 24 h mediciones previas. Los
 análisis de la morfología y la distribución del diámetro de las partículas se determinaron
utilizando el software ImageJ. El escaneo de electrones se realizó en un microscopio
JEOL JSM6380LV.
El polvo se colocó directamente sobre una cinta adhesiva conductora de carbón
distribuyendo el tamaño hidrodinámico e índice de polidispersidad (PDI) de los AgNP
que se lograron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) en un equipo Malvern
Zetasizer Nano ZS90.
Estos análisis se realizaron por triplicado a temperatura ambiente, cada uno con 15
carreras de 10 s con un período de estabilización térmica de 120 s. potencial zeta
Las mediciones proporcionaron las propiedades de superficie de las nanopartículas
antes y después de la exposición a las raíces de A. cepa. Se realizaron experimentos
por triplicado utilizando agua como dispersante.

- Ensayo de Allium cepa

Los ensayos de A. cepa se realizaron con semillas libres de pesticidas. (Variedad Baia
Periforme) y comprado en Isla (Isla Sementes Ltda., Brasil). Para cada grupo
estudiado, se colocaron 30 semillas de A. cepa continuamente sobreexpuestas en
cada solución acuosa que contenía AgNP con un diámetro dado o AgBulk a una
concentración de
100 mg · L − 1
Luego, se colocaron para germinar a 23 ± 2 ° C con un fotoperíodo de 12:12 h durante
96 h. Semillas y radículas fueron expuestos a los AgNPs cuando las radículas
comenzaron a emerger 48 h.
Después de colocar las semillas para la germinación. Un grupo de control negativo
basado en semillas sumergidas en agua destilada durante la germinación fue también
considerado. Todas las pruebas se realizaron por triplicado, totalizando 90
semillas por grupo.
El índice de germinación (IG) se calculó después de 96 h utilizando la ecuación
𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑒𝑚𝑖𝑙𝑙𝑎𝑠 𝑔𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑎𝑠
GI = 𝑇𝑜𝑡𝑠𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑒𝑚𝑖𝑙𝑙𝑎𝑠 𝑢𝑡𝑖𝑙𝑖𝑧𝑎𝑑𝑎𝑠
𝑥 100

El índice de alargamiento de la raíz (REI) de las semillas con protrusión de la radícula

visible se midió con un calibrador digital Digimess pasado 96 h de germinación.
Para determinar el índice mitótico (IM), índice de anormalidad nuclear (NAI) e índice
de micronúcleos (MNI) utilizando las ecuaciones. (2), (3) y (4), respectivamente, las
raíces se recogieron y fijaron en la solución 3: 1 de Carnoy (alcohol / ácido acético)
durante 8 h, después de lo cual se transfirieron a Carnoy fijador y almacenado a 4 ° C.
Las raíces fijas se lavaron con agua destilada e hidrolizada en HCl 1 N a 60 ° C durante
10 min. Más tarde, fueron lavadas nuevamente y se tiñó con reactivo de Schiff durante
2 h. Después de la tinción, los meristemos de la raíz se cubrieron con un cubreobjetos
y se rompieron ligeramente en una gota de 45% de carmín acético. Para cada
tratamiento, se prepararon 5 diapositivas y se fotografiaron utilizando un microscopio
óptico Nikon a un aumento de 400 × para que se verificaran 1000 células por
portaobjetos, lo que resulta en un total de 5000 celdas.
𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑒𝑛 𝑑𝑖𝑣𝑖𝑠𝑖𝑜𝑛
MI = 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑎𝑠 𝑥 100 (2)

𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑎𝑛𝑜𝑟𝑚𝑎𝑙𝑒𝑠

NAI = 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑎𝑠 𝑥100 (3)

𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑛 𝑚𝑖𝑐𝑟𝑜𝑛𝑢𝑐𝑙𝑒𝑜𝑠

MNI = 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑎𝑠
𝑥100 (4)
- Análisis de la absorción de AgNPs por raíces

Espectroscopía de ruptura inducida por láser (LIBS) se llevaron acabo en la

espectrometría de emisión de plasma / óptico acoplado (ICP OES) para estudiar la
captación de contenido de AgNPs por las raíces de A. cepa.
Nd: YAG Quantel Brillante láser que emite a 1064 nm con pulsos de 5 ns y se usó
energía de 50 mJ para la generación de plasma durante las mediciones de LIBS. El
haz de radiación se centró en las raíces mediante un foco de 50 mm. lente de cuarzo
(¿?)
La señal de plasma generada fue recogida por un conjunto de lentes de cuarzo en un
monocromador Horiba Jobin Yvon iHR550, que tiene una rejilla de difracción de 2800
g / mm, ángulo de quemado de 400 nm y una ranura de entrada de 10 μm, lo que
conduce a una resolución espectral de 0.05 nm. El detector 340 T-18-H-03 ICCD se
acopló a la salida del monocromador.
La adquisición de datos se realizó sincronizando el disparo láser con el detector
ajustando un tiempo de retraso de 500 ns en la lectura de la señalcon respecto al pulso
de excitación. Cada espectro se obtuvo con un solo pulso láser y registrado en la
ventana espectral de 326 a329 nm para observar el pico de emisión de Ag (I) a
alrededor de 328 nm