UNIVERSIDAD DE SONORA

DEPARTAMENTO DE MEDICINA Y CIENCIAS DE LA

SALUD
LIC. EN MEDICINA

“Los complejos de nanopartículas de oro y péptido sub-100- nm de

alta densidad mejoran la presentación de vacunas por parte de las
células dendríticas in vitro”

Docente: Dr. Jose Manuel Galván Moroyoqui

Materia: Inmunología clínica

Alumnos:

Valeria Osuna Lopez

Alejandro Pesqueira Bojórquez

Sebastian Preciado Ruiz

Karla Patricia Ramirez Rodriguez

Grupo: 03

4to semestre

Hermosillo Sonora a 17 de marzo de 2022

Resumen
Se han diseñado nuevas nano vacunas a base de oro (AuNV) esto sido posible utilizando
un método simple que consta en la conjugación ascendente de autoensamblaje esto para
generar un suministro de alta densidad de péptidos y respuestas inmunitarias efectivas,
todo esto con toxicidad limitada. Esto ha sido posible gracias a que los portadores que
mejoran la entrega de antígenos tumorales a las células dendríticas son atractivos ya que
las nanopartículas de oro son inertes y no tienen toxicidad por lo que pueden tener
endocitosis con las células dendríticas fácilmente. Las nanovacunas a base de oro han
mostrado una conjugación peptídica exitosa y viable con un rendimiento del 90% mientras
que permanece con un diámetro inferior a 80 nm. Por lo antes mencionado tienen un gran
potencial como portadores de varios tipos de vacunas.

Antecedentes
En los últimos veinte años, el uso de nanopartículas en la medicina ha aumentado
constantemente. Sin embargo, su seguridad y su efecto en el sistema inmunológico humano
sigue siendo una preocupación importante. Los linfocitos B, son responsables de la
producción de anticuerpos por lo tanto es un blanco interesante para el desarrollo de
vacunas preventivas y terapéuticas. Las nanopartículas pueden formar un vehículo de
protección para las vacunas y administrarlas específicamente donde puedan ser más
eficaces, sin afectar a otras células. Este objetivo también permite el uso de una dosis más
baja de inmunoestimulante mientras se mantiene una respuesta inmunológica efectiva.
Aumenta su eficacia y reduce los efectos secundarios, siempre que las nanopartículas sean
inofensivas para todas las células inmunitarias.
Las nanopartículas de oro pueden usarse para tratar tumores. Cuando se exponen a una
fuente de luz, liberan calor y destruyen las células cancerosas vecinas. También podríamos
adherir un medicamento a la superficie de las nanopartículas para liberarlo a un lugar
específico.

Métodos

Síntesis de AuNV en dos pasos

Primero, se agregaron carboxil-PEG-tioles a una solución coloidal de oro de 30 nm (2 × 10
partículas/ ml) con una concentración final de 5 μM e incubadas durante 24 h. La solución
se elevó a NaCl 0,1 M, fosfato de sodio 10 mM y Tween 20 al 0,1 %.gramo durante 20 min
con solución salina tamponada con fosfato (PBS). El sedimento de partículas final se diluyó
con 2-(NORTE-tampón de ácido morfolino)etanosulfónico (MES). Se añadieron EDC (4,25
mg) y enlazador sulfo-NHS (6,4 mg) a la solución de partículas-MES y se incubó durante 15
min a temperatura ambiente. El exceso de enlazadores se eliminó de la solución mediante
centrifugación en un filtro de corte de peso molecular 10.000 a 2.000xgramodurante 15 min
y diluyendo las partículas con PBS. Luego se agregaron los péptidos (50 μg) a las partículas
por mililitro de solución y la mezcla se incubó durante 30 min, 1 h, 2 hy 24 h a temperatura
ambiente. La variación del tiempo de incubación fue para la optimización del esquema de
conjugación. Se añadió hidroxilamina (10 mM) para extinguir cualquier EDC/NHS no unido
durante una hora más. A continuación, las partículas recubiertas con péptido se
centrifugaron y lavaron tres veces con PBS. Después del ciclo final de lavado/centrifugado
con PBS, se eliminó el sobrenadante y el sedimento de partículas se resuspendió en 200 µl
de PBS. La muestra fue sonicada y almacenada a 4-C hasta que se use.

Sintesis de AuNV en un solo paso

Se agregaron 5 μl de EDC 44 mM y 5 μl de conectores sulfoNHS 59 mM por mililitro de
solución de partículas-MES y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente. El
proceso de recolección fue el mismo que antes. Para evaluar el tamaño del núcleo de
nanopartículas de oro en la eficacia de AuNV, se utilizaron AuNP de 15 nm y 80 nm para
sintetizar AuNV. Para los AuNV de 15 nm y 80 nm, la concentración de partículas de stock
comenzó en 1,4 × 10y 1,1 × 10partículas/ml, respectivamente, según lo proporcionado por
Ted Pella. El proceso de conjugación fue el mismo.

Protocolo de recolección de esplenocitos

Se recogieron el fémur y la tibia de ambos lados de un ratón C57BL/6 y se lavaron en una
placa de Petri. Después de lisar los glóbulos rojos, las células se cultivaron en una placa de
10 cm durante 48 h a 37-C en medios de células dendríticas derivadas de médula ósea.
Después de 2 días se aspiro el medio. Las BMDC se lavaron con PBS para eliminar
cualquier partícula libre y se diluyeron a 500.000 células/ml.

Cálculo del rendimiento de la conjugación

Los valores de absorbancia de 280 nm de los péptidos Trp-2 se usaron para generar una
curva estándar de concentración. Los valores máximos de absorbancia en el rango visible
(400 a 800 nm) de las diluciones del stock de coloide de oro de 30 nm (2 × 10 partículas/ml)
para trazar frente a los valores de absorbancia de 280 nm.

Protocolo de prueba de toxicidad

Se añadieron cien microlitros de células JAWS II, una línea celular BMDC, a una placa de
96 pocillos (500.000 células/ml). Ovoalbúmina (OVA) o gp100 AuNV (1 a 10 μl de 10
partículas/ ml) se añadieron a las células durante 24 h a 37-C. Luego se agregaron diez
microlitros de alamarBlue a cada pocillo y se incubaron durante 2 horas a 37ºC.-C.

Estudio de degradación de lisado

Del protocolo AuNV de un paso, se agregaron 25 μg de péptidos fluorescentes de
isotiocianato de fluoresceína (FITC) a la solución antes de la hidroxilamina. Este paso
permite que los péptidos fluorescentes estén en la capa exterior de los AuNV. Se lisaron
células JAWS II (500.000) en 1 ml de tampón de lisis CHAPS. Las partículas (10) se
añadieron al tampón de lisis CHAPS o al lisado JAWS II durante 24 h. Las partículas se
eliminaron por centrifugación a 7000xgramo durante 20 min. Los sobrenadantes se
transfirieron a una placa de 96 pocillos y se midió la fluorescencia FITC a 520 nm
(excitación a 485 nm).

Resultados y discusión

Síntesis de partículas AuNV autoensambladas

En primer lugar, los carboxil-PEG-tioles se autoensamblaron en coloides de oro de 30 nm

estabilizados con citrato para formar una monocapa. Se eligió PEG por sus propiedades
bioinertes y no tóxicas y la capacidad de proteger las AuNP durante el proceso de
conjugación. Las partículas se transfirieron al tampón PBS y posteriormente se añadieron
los péptidos vacunales o la hidroxilamina (control). Después se verificó la conjugación de
péptidos y se indicó una conjugación exitosa del péptido en la superficie de la nanopartícula.
Después de la conjugación de péptidos, las imágenes de AuNV TEM mostraron
engrosamiento y bordes ásperos en la superficie de AuNP, que pueden ser causados por el
enlace peptídico a la molécula de PEG y la autopolimerización.

Caracterización AuNV

El tamaño de las partículas es importante para el drenaje linfático del sitio de inyección, la
biodistribución y la endocitosis celular. En este caso, se demostró que los AuNV de OVA
tenían menos de 80 nm de diámetro. Por lo tanto, se espera un mejor drenaje linfático
cuando se inyecta por vía subcutánea. Así mismo, se calculó que el rendimiento de la
conjugación (al usar péptidos) era aproximadamente del 90 %.
Captación de células dendríticas de AuNV

El siguiente paso fue evaluar su interacción con las células dendríticas y se demostró que
las DC cargadas con AuNV mostraron una dispersión significativamente mayor debido a las
AuNP en comparación con las DC no tratadas. La toxicidad de los nanoportadores ha sido
una limitación significativa para las formulaciones tradicionales, como los nanoportadores
liposomales o poliméricos. Sin embargo, alamarBlue mide la salud celular mediante la
división del metabolito en moléculas fluorescentes. La actividad metabólica mejorada puede
aumentar la cantidad de subproducto fluorescente. Por lo tanto, los resultados sugieren que
las AuNV pueden haber causado la activación de las células dendríticas al aumentar la
actividad celular, lo que también puede mejorar las respuestas inmunitarias antitumorales.

Evaluación funcional y optimización de AuNV utilizando IFN-γ ELISPOT

La caracterización funcional de los AuNv se realizó en dos partes: 1) ensayos ELI-SPOT de

IFN-y de esplenocitos simples para la prueba inicial y 2) ELISPOT de CD a esplenocitos
para la optimización del diseño.
● Optimización del diseño:
○ Optimización del método de conjugación
○ Optimización del enlazador
○ Efectos del tamaño del núcleo de AuNp
○ Modificaciones del conjunto de péptidos

Los ensayos ELI-SPOT miden indirectamente CD8 específicos de antígeno + Capacidad de

CTL para secretar IFN-γ, que se correlaciona altamente con la inmunogenicidad antitumoral.
A partir de este estudio, llegamos a la conclusión de que los AuNV fueron capaces de
inducir fuertes liberaciones de IFN-γ a partir de células T pmel-1 con una eficacia
aproximadamente cuatro veces superior a la de los péptidos libres.

Optimización de diseños de AuNV con DC-a-esplenocitos IFNγELISPOT:

Para el estudio de la eficacia de esta técnica fue fundamental imitar las condiciones
fisiológicas que suceden en el organismo ya que cuando se expusieron las nanovacunas a
base de oro (AuNV) a los esplenocitos directamente no se logró apreciar una respuesta
inmunitaria concluyente, sin embargo, cuando se cultivaron células dendríticas derivadas de
la médula ósea con AuNV y dichas células se usaron como estimuladoras en los
esplenocitos (más acorde a lo que sucede en el organismo de forma convencional) se
lograron mejores resultados. En este último caso resultante importante revisar 2 factores
relevantes para mejorar la conjugación de péptidos en las AuNv, la duración de la
conjugación y el esquema de conjugación:

● Duración: Se estableció que el tiempo de conjugación con mayor resultados fue de

una 1 hora con 52 Spot forming cells (SFC) en ELISPOT y formó los conjugados
péptidos más grandes (70 nm, que puede significar una ventaja al entrar al drenaje
linfático tisular)
● Esquema de conjugación: Se diseñó un esquema de conjugación de un solo paso el
cual fue significativamente más efectivo para inducir la secreción de IFN-γ que el de
dos pasos (231 SFC vs 182 SFC)

Comparación de las eficacias del enlazador de ADN y el enlazador de PEG AuNV:

Dado que PEG no es degradable, el uso de PEG como enlazadores plantea la

preocupación de si los péptidos se liberaron de las nanoparticulas de oro (AuNP), lo cual es
fundamental para la subsecuente respuesta inmunológica y para ello se estudió
comparativamente el uso de enlazadores de ADN.
El uso de enlazadores de ADN, supondría que las enzimas ADNasas celulares degradarán
los espaciadores y se liberan por ende los péptidos de la superficie de las AuNV, sin
embargo, en este caso existen aminas en su superficie (en lugar de los carboxilos que
existen cuando se usan PEG como enlazadores), lo cual disminuye el rendimiento de la
conjugación peptídica y aunado a que el uso de PEG ha demostrado clínicamente que si
existe una respuesta inmunológica adecuada, lo convierte en la mejor opción como
enlazador.

Evaluación de AuNV con varios tamaños de núcleo de partículas:

El tamaño de las partículas de AuNV es relevante por el papel que juega en la migración
hacia los ganglios linfáticos gracias al drenaje linfático tisular. El tamaño total de las AuNV
se puede modificar gracias al tamaño del núcleo de AuNP, en el laboratorio se lograron
sintetizar AuNV con ovoalbúmina de diferentes tamaños, de 15, 30 y 80 nm. Por la
naturaleza fisiológica del drenaje linfático, es imposible evaluar la capacidad de drenaje
subcutáneo de las partículas de AuNV en el laboratorio, por lo que se requeriría un estudio
con algún individuo invivo en lugar de invitro. Sin embargo, los resultados de las pruebas
realizadas en el laboratorio, sugieren que el tamaño de partícula no altera significativamente
la eficacia de IFN-γ (puesto que todas son más pequeñas que 100 nm donde ya se pensaría
en alguna dificultad para el drenaje linfático).

AuNV de grupos de péptidos:

El diseño de las AuNV tienen una gran versatilidad, de forma que permite la adhesión de
péptidos muy largos o mezclas de péptidos de diferentes antígenos tumorales en una
misma AuNP. Claro es el ejemplo, del péptido usado en los estudios de laboratorio, los
péptidos gp 100, los cuales son proteínas presentes en melanomas que liberan una
consistente respuesta inmune antitumoral y la cual posee 15 aminoácidos y superposiciones
de 11 aminoácidos.

Los péptidos que recubren los nanotransportadores permiten su acumulación en el

endosoma, gracias a su similitud a los patógenos en lo que respecta a su tamaño,
madurando las DC, para que posteriormente presenten los antígenos, según la cantidad de
antígenos tumorales presentados, la respuesta será mayor o menor de forma directamente
proporcional. Es importante que estos péptidos se desprendan una vez ingresados en el
endosoma, para entrar a la ruta de MHC de clase 1 o citosólica.

Conclusión

El uso de la inmunoterapia es una alternativa que ha estado demostrando su viabilidad para

el tratamiento tumoral, gracias al desarrollo u optimización de métodos, en la biomedicina el
oro es la nanopartícula de mayor interés por su baja citotoxicidad siempre y cuando se
mantenga un tamaño adecuado menor a 100 nanómetros para su administración eficaz,
dando como resultado una maduración y activación de células dendríticas.

Bibliografía:
● Lin, A. Y. et al.(2013). High-density sub-100-nm peptide-gold nanoparticle
complexes improve vaccine presentation by dendritic cells in vitro.
High-density sub-100-nm peptide-gold nanoparticle complexes improve
vaccine presentation by dendritic cells in vitro, 8(72), 1–11.
https://nanoscalereslett.springeropen.com/track/pdf/10.1186/1556-276X-8-72.
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