Genotoxicidad y citotoxicidad de las nanopartículas de oro in vitro: función de la

funcionalización de la superficie y el tamaño de las partículas.

Resumen:
Varios estudios sugirieron que las nanopartículas de oro (NP) podrían ser genotóxicas in vitro e in vivo Sin
embargo, las NP de oro que se han producido en la actualidad presentan una amplia gama de tamaños y
funcionalizaciones, que podrían afectar sus interacciones con el medio ambiente o con estructuras biológicas
y, por tanto, modificar sus efectos tóxicos. En este estudio, investigamos el papel de la carga superficial en la
determinación del potencial genotóxico de las NP de oro, medido por la inducción de daño en el ADN (ensayo
cometa) y daño cromosómico (ensayo de micronúcleos) en células BEAS-2B del epitelio bronquial humano.
La captación celular de NP de oro se evaluó mediante imágenes hiperespectrales. Se examinaron dos
tamaños de núcleo (~ 5 nm y ~ 20 nm) y tres funcionalizaciones que representan cargas superficiales
negativas (carboxilato), positivas (amonio) y neutras (poli (etilenglicol); (PEG) iladas). Los NP de oro y amonio
catiónico eran claramente más citotóxicos que sus homólogos aniónicos y neutrales, pero la genotoxicidad no
dependía simplemente de la funcionalización o el tamaño, ya que el daño del ADN era inducido por NP de
amonio de 20 nm y oro PEGilado, mientras que la inducción de micronúcleos se incrementaba en 5 nm. NP de
amonio y oro PEGilado de 20 nm. Las NP de oro carboxilado de 5 nm no fueron genotóxicas, y la evidencia
sobre la genotoxicidad de las NP de oro carboxilado de 20 nm se limitó a un resultado positivo a la dosis más
baja en el ensayo de micronúcleos. Al interpretar los resultados, debe tenerse en cuenta que la citotoxicidad
limitó las dosis disponibles para las NP de oro funcionalizadas con amonio y que se ha descrito anteriormente
que las NP de oro interfieren con el procedimiento de ensayo del cometa, lo que posiblemente da como
resultado un resultado falso positivo. En conclusión, nuestros hallazgos muestran que la captación celular y la
citotoxicidad de las NP de oro mejoran claramente con la carga superficial positiva, pero ni la funcionalización
ni el tamaño pueden explicar por sí solos los efectos genotóxicos de las NP de oro.

1. Introducción.
Los nanomateriales de ingeniería (ENM) han despertado un enorme interés debido a sus propiedades únicas
asociadas con la nanoescala. El auge de la nanotecnología está teniendo un impacto significativo en una
amplia gama de campos. Las nuevas aplicaciones, la eficiencia mejorada y los nuevos procesos industriales
ofrecen nuevas herramientas y oportunidades, desde la medicina y el diagnóstico hasta la tecnología de
baterías y nuevos materiales [1]. Sin embargo, las propiedades que hacen que los nanomateriales sean
interesantes son también las que plantean preocupaciones sobre el potencial toxicológico durante su
interacción con los sistemas biológicos. Debido a su pequeño tamaño, los ENM pueden entrar fácilmente en
las células y trasladarse a través de células, tejidos y órganos [2]. A medida que disminuye el tamaño, la
relación entre la superficie y el total de átomos o moléculas aumenta exponencialmente. Debido a su mayor
reactividad superficial, se espera que los nanomateriales tengan mayores efectos biológicos por masa dada
en comparación con las partículas más grandes [3].
El oro ha sido históricamente apreciado como moneda y joyería debido a su naturaleza lustrosa, no oxidada y
escasa. En su mayoría, se ha considerado principalmente un elemento inerte en su forma a granel [4]. Los
ENM de oro muestran aplicaciones prometedoras principalmente en el campo de la biomedicina, debido a sus
propiedades especiales a nanoescala. Los ENM de oro tienen un alto coeficiente de absorción de rayos X, con
facilidad de manipulación sintética (lo que permite un control preciso sobre las propiedades fisicoquímicas de
la partícula), una fuerte afinidad de unión a tioles, disulfuros y aminas, y propiedades ópticas y electrónicas
únicas sintonizables [5], que los hacen muy interesantes para biosensores y plataformas de detección, así
como para inmunoensayos, administración de fármacos dirigida, aplicaciones de bioimagen y ablación
fototérmica en el infrarrojo cercano de microorganismos y células cancerosas [6-8]. Dado que muchas de las
posibles aplicaciones en biomedicina se basan en una interacción directa entre los ENM de oro y la estructura
biológica objetivo, también es importante determinar los efectos potenciales sobre la salud de los ENM de oro.
Los estudios toxicológicos muestran que el impacto tóxico potencial de las nanopartículas de oro (NP) puede
ser multifacético y, en consecuencia, difícil de predecir. Los NP de oro pueden causar efectos tóxicos
nanoespecíficos que difieren de los efectos de sus homólogos a granel [9] y, además del tamaño de las
partículas, la química de la superficie y los grupos funcionales de la superficie cargados también pueden
desempeñar un papel crucial en la determinación de los efectos tóxicos. Por lo tanto, un conocimiento
profundo de los efectos tóxicos dependientes del tamaño y las propiedades de la superficie de los NP de oro
es esencial para predecir la toxicidad de los NP de oro [10], con el objetivo de poder correlacionar los
parámetros de las partículas, los diseños experimentales y los efectos biológicos observados [ 11].
En el presente estudio, investigamos el papel de la carga superficial en la determinación del potencial
genotóxico de las NP de oro in vitro, mediante el análisis de su capacidad para inducir el ADN y el daño
cromosómico en células BEAS-2B del epitelio bronquial humano. Se utilizaron dos tamaños de núcleo
nominales (~ 5 nm y ~ 20 nm) y tres funcionalizaciones que representan diferentes cargas superficiales:
carboxilato de alquil sodio para carga negativa, bromuro de alquilamonio para carga positiva y poli
(etilenglicol) (PEG) para carga neutra. en este estudio. Además, la captación de nanopartículas se investigó
mediante microscopía hiperespectral, para evaluar el efecto de la dosis intracelular sobre los posibles efectos
genotóxicos y citotóxicos de las NP de oro.

2. Materiales y métodos.
2.1. Nanopartículas de oro.
Los NP de oro fueron proporcionados por el consorcio NANOSOLUTIONS como suspensiones listas para
usar en KCL 0,5 M en dos tamaños (NP de oro de ~ 5 nm y ~ 20 nm de núcleo), cada una funcionalizada con
ligandos que representaban aniónicos (alquil carboxilato de sodio; COOHNa), catiónico (bromuro de
alquilamonio; –N (CH3) 3), o carga neutra (terminado en PEG; –PEG). Los procedimientos de síntesis y
funcionalización de las NP, junto con la caracterización de partículas (química de superficie, microscopía
electrónica de transmisión, dispersión dinámica de luz, potencial zeta y espectrofotometría ultravioleta-visible),
se han detallado previamente [12]. Los tamaños promedio de partículas primarias, según lo determinado por
TEM, fueron de 2.5, 4.5 y 3.5 nm para las NP de amonio, carboxilato y oro PEGilado de 5 nm,
respectivamente, y de 15, 14 y 13 nm para el carboxilato de amonio de 20 nm, y NP de oro PEGilado,
respectivamente [12]. El DLS en agua mostró un diámetro hidrodinámico promedio de 47, 77 y 32 nm para las
NP de amonio, carboxilato y oro PEGilado de 5 nm, respectivamente, y de 236, 30 y 20 nm para el amonio de
20 nm, carboxilato, y NP de oro PEGilado, respectivamente [12]. En medio de cultivo celular (con suero), el
diámetro hidrodinámico de las NP de amonio oro y las NP de carboxilato de 5 nm aumentó, presumiblemente
debido a la aglomeración de NP en presencia de proteínas [12].
2.2. Cultivo de células.
Las células BEAS-2B (células epiteliales bronquiales humanas transformadas) se obtuvieron de la American
Type Culture Collection a través de LGC Promochem AB (Borås, Suecia). Las células BEAS-2B se cultivaron
en medio de crecimiento epitelial bronquial sin suero (BEGM; Clonetics, Walkerwille, MD, EE. UU.) A 37 ◦C en
una atmósfera humidificada de CO2 al 5%. En total, se sembraron 60.000 células en placas de 24 pocillos
(para ensayos de citotoxicidad y cometa; Nunc, Roskilde, Dinamarca) 24 h antes del tratamiento. Para el
ensayo de micronúcleos, se sembraron 300.000 células BEAS-2B 24 h antes del tratamiento en placas de seis
pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca).
2.3. Citotoxicidad.
La citotoxicidad se determinó mediante recuentos de células, utilizando azul tripán (Sigma-Aldrich Chemie,
Steinheim, Alemania) para identificar las células muertas. Este ensayo refleja todos los efectos relacionados
con el tratamiento (necrosis, retraso del ciclo celular y apoptosis) que reducen el número de células vivas. Se
expusieron cultivos de células BEAS-2B semiconfluentes en placas de 24 pocillos (área de cultivo 1,9 cm2 /
pocillo) a dispersiones de NP de oro de 1 a 250 µg / ml (volumen de tratamiento 500 µL por pocillo; en BEGM)
durante 24 o 48 h. Se realizaron tres repeticiones por dosis. Después del tratamiento, los pocillos se lavaron
con solución salina tamponada con fosfato (PBS; Corning Inc., Corning, NY, EE. UU.) Y se incubaron con 250
µL de tripsina EDTA (Gibco, Paisley, Reino Unido) al 0,5% a +37 ◦C hasta que las células estaban separados.
Luego, se agregaron 0.5 mL de suero fetal bovino al 10% (FBS; Gibco, Paisley, Escocia) en cada pocillo, y el
contenido se transfirió a tubos Eppendorf que se centrifugaron a 1100 rpm durante 5 min a 4 ◦C. Para cada
tubo Eppendorf, se descartó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 0,5 ml de azul tripán al 0,5%
en PBS y se incubaron en hielo durante 5 min. Para el análisis, se colocó una muestra en una cámara Bürker,
donde se contaron cuatro cuadrados y se calculó el número total de células en el pocillo. Los resultados se
expresaron como el porcentaje de células en comparación con el control negativo.

2.4. Genotoxicidad.
2.4.1. Ensayo del cometa.
El ensayo de cometa (electroforesis en gel de una sola célula) se realizó para estudiar las roturas de la hebra
de ADN y los sitios lábiles alcalinos como lo describen Lindberg et al. (2009) [13]. Brevemente, los cultivos de
células BEAS-2B semiconfluentes en placas de 24 pocillos (área de cultivo 1,9 cm2 / pocillo) se expusieron a
dispersiones de NP de oro de 1 a 250 µg / ml (volumen de tratamiento 500 µL por pocillo; en BEGM) durante
24 h después de lo cual las células se tripsinizaron y centrifugaron a 1100 rpm durante 5 min. Para el control
positivo, las células se trataron con H2O2 (100 µg / mL; Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Alemania) durante
15 min. En total, se resuspendieron de 10.000 a 30.000 células en 75 µL de agarosa fundida (37 ◦C) al 0,5%
de bajo punto de fusión (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.). Las células resuspendidas en agarosa
se colocaron en portaobjetos de microscopio secos (Assistant, Sondheim / Röhn, Alemania) recubiertos
previamente con agarosa de fusión normal al 1% (International Biotechnologies, New Haven, CT, EE. UU.) Y
se dejó solidificar la agarosa durante 10 min. Los portaobjetos se sumergieron en una solución de lisis fría
(NaCl 2,5 M, EDTA 100 mM, Tris 10 mM, Triton X-100 al 1%) durante 1 ha 4 ◦C, después de lo cual se
transfirieron a un tanque de electroforesis que contenía tampón de electroforesis recién preparado. (EDTA 1
mM, NaOH 300 mM; pH> 13), donde se mantuvieron durante 20 min a temperatura ambiente, para permitir
que el ADN se desenrollara. La electroforesis se realizó en el mismo tampón a temperatura ambiente durante
15 min a 24 V y 300 mA (0,8 V / cm). A continuación, los portaobjetos se neutralizaron tres veces con tampón
Tris 0,4 M (pH 7,5), se secaron al aire y se fijaron en metanol (Merck, Darmstadt, Alemania). El ADN se tiñó
con bromuro de etidio (2 µg / ml) en agua durante 5 min. Los portaobjetos se codificaron y un evaluador
realizó el análisis del cometa utilizando un microscopio de fluorescencia (Axioplan 2, Zeiss, Jena, Alemania) y
un contador de cometas automatizado interactivo (Komet 5.5, Kinetic Imaging Ltd., Liverpool, Reino Unido). El
porcentaje de ADN en la cola del cometa de 400 células por experimento (dos réplicas por dosis, dos
portaobjetos por réplica, 100 células por portaobjetos) se utilizó para medir la cantidad de daño en el ADN.
2.4.2. Ensayo de micronúcleos.
El ensayo de micronúcleos se utilizó para determinar el potencial de las NP de oro para inducir daño
cromosómico en las células BEAS-2B. Los cultivos celulares se expusieron a las NP de oro durante 48 h en
2,5 ml de BEGM en placas de seis pocillos para mantener constante el volumen / superficie del pocillo en
todos los ensayos. Se añadió citocalasina B (Cyt-B; 9 µg / ml; Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Alemania) 6
h después de iniciar la exposición, para inducir la binucleación de las células en división. Se utilizó mitomicina
C (150 ng / ml; Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania) como control positivo.
Después de la exposición, las células se enjuagaron con PBS dos veces y se incubaron con 1 ml de tripsina
durante 20 min, se añadió FBS al 10% en PBS y las células se centrifugaron a 1100 rpm durante 6 min. Se
eliminó el sobrenadante y las células se lavaron con PBS. Después de centrifugar y eliminar el sobrenadante,
las células se incubaron en 5 ml de solución hipotónica, medio 50% Roswell Memorial Park Institute (RPMI)
-1640 (Lonza, Basilea, Suiza) en agua destilada, durante 1 min. Las células se centrifugaron y fijaron en
metanol-ácido acético 3: 1 (Merck, Darmstadt, Alemania) y, después de otra centrifugación y eliminación del
sobrenadante, se fijaron en metanol al 97%-ácido acético al 3%. A continuación, las células se extendieron
gota a gota sobre portaobjetos microscópicos y se dejaron secar durante la noche. Los portaobjetos se tiñeron
con naranja de acridina (32 µg / ml en tampón de Sørensen, pH 6,8; Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim,
Alemania) durante 1 min y se enjuagaron en tampón de Sørensen tres veces durante 3 min. Finalmente, los
portaobjetos se tiñeron con 40,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 5 µg / mL; Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim,
Alemania) durante 5 min, luego se enjuagaron con agua del grifo y se dejaron secar. Los portaobjetos teñidos
y fijados se mantuvieron protegidos de la luz a 4 ◦C hasta el momento del análisis.
Los portaobjetos se codificaron y la frecuencia de células micronucleadas en 2000 células binucleadas por
dosis (1000 células / réplica) se analizó mediante un marcador utilizando un microscopio universal Axioplan
2E (Zeiss, Jena, Alemania). Las células binucleadas se identificaron con una lente de 40x usando un filtro
doble verde / rojo FITC / TRITC (isotiocianato de fluoresceína / isotiocianato de tetrametilrodamina).

2.5. Imágenes hiperespectrales.

Se utilizó el sistema de microscopía de imágenes hiperespectrales CytoViva (CytoViva, Inc., Auburn, AL, EE.
UU.) Montado en un microscopio de campo oscuro Olympus BX43 (Olympus Corporation, Tokio, Japón) para
analizar la internalización de los diferentes NP de oro por las células BEAS-2B. Las células BEAS-2B se
trataron con NP de 5 µg / ml durante 48 h (se añadió Cyt-B 6 h después del inicio del tratamiento), se
citopinaron sobre portaobjetos de microscopio y se fijaron en metanol. Los portaobjetos se prepararon para el
análisis colocando una gota de aceite de inmersión y cubriéndolos con un cubreobjetos. Las imágenes de
campo oscuro se capturaron con un objetivo de 100 × y las imágenes se procesaron subconjuntándolas en las
bandas 27 a 341 (longitudes de onda de 430 a 840 nm), seguido de un suavizado de señal mediante el filtro
Savitzky-Golay (ancho de 11 bandas) y normalización para el espectro de la lámpara. Para identificar los
espectros de los NP de oro en las muestras, se crearon bibliotecas espectrales a partir de cada dispersión de
NP. Se colocó una gota de la dispersión en un portaobjetos y se secó al aire. Se añadió una gota de aceite de
inmersión al portaobjetos que luego se cubrió con un cubreobjetos y se visualizó con el mismo aumento que
las células BEAS 2B. Los portaobjetos de muestras de suspensión de NP se sometieron al mismo
procesamiento que los portaobjetos con las células BEAS-2B. Las bibliotecas espectrales se obtuvieron
mediante filtrado de partículas y se utilizaron imágenes de control negativo para restar posibles espectros
superpuestos, para garantizar que las bibliotecas espectrales solo contuvieran espectros específicos de NP.
Los espectros de NP de oro se detectaron en las imágenes de células obtenidas, utilizando las bibliotecas
espectrales con la herramienta de mapeo de ángulos espectrales, para detectar el conjunto espectral único
del NP de interés. En total, se analizaron 15 células por tipo de NP de oro, seleccionando manualmente la
región de interés (ROI), para abarcar toda el área de la celda y contando el número de píxeles por ROI que
coinciden con la biblioteca. Los resultados se expresaron como un porcentaje de píxeles coincidentes por
celda.

2.6. Análisis estadístico.

Se aplicó ANOVA de una vía para examinar el porcentaje de ADN en la cola en el ensayo Comet. Se utilizó la
prueba de Tukey para una comparación post hoc de las medias. Se utilizó la prueba exacta de Fisher (de dos
colas) para determinar si el tratamiento inducía un aumento estadísticamente significativo en la frecuencia de
micronúcleos en comparación con los cultivos de control no tratados. La dosis-respuesta en ambos ensayos
se evaluó mediante análisis de regresión lineal. La prueba de Kruskal-Wallis y la prueba de Dunn post hoc se
utilizaron para comparar el porcentaje de píxeles coincidentes por celda y entre los diferentes tipos de NM, así
como en comparación con los cultivos de control no tratados. Todos los análisis se realizaron en GraphPad
Prism 7.03

3. Resultados.
Como se muestra en la Figura 1, la citotoxicidad de las NP de oro en las células BEAS-2B fue impulsada por
la funcionalización de la superficie; la modificación de amonio fue claramente la funcionalización más
citotóxica en ambos tamaños de núcleo, con las NP de amonio de 5 nm alcanzando la citotoxicidad máxima
(sin células vivas) a 50 µg / mL y las NP de amonio de 20 nm alcanzando la citotoxicidad máxima a 80 µg /
mL. Las NP carboxiladas y PEGiladas mostraron baja citotoxicidad para ambos tamaños de núcleo, aunque
las NP aniónicas de 5 nm fueron ligeramente más tóxicas que las NP neutrales de 5 nm. La citotoxicidad de
las NP de oro tuvo perfiles muy similares después de los tratamientos de 24 hy 48 h, influenciada
principalmente por la funcionalización. La Figura 2 muestra que las NP de oro PEGilado de 5 nm produjeron
un ligero aumento en el daño del ADN solo a la dosis más alta probada, mientras que ni las NP de 5 nm
funcionalizadas con amonio ni con carboxilato causaron daño en el ADN. Sin embargo, las NP de amonio de
20 nm indujeron un alto porcentaje de daño del ADN en las dosis máximas (5 y 10 µg / mL). Las NP
carboxiladas de 20 nm y PEGiladas de 20 nm no afectaron el nivel de daño del ADN. Sólo las NP de amonio
de 20 nm mostraron una dosis-respuesta lineal significativa para inducir daño al ADN (R 2 = 0,8316; p
<0,001). Nanomateriales 2020, 10, x PARA REVISIÓN POR PARES 5 de 13 NP de 5 nm fueron ligeramente
más tóxicas que las NP neutrales de 5 nm. La citotoxicidad de las NP de oro tuvo perfiles muy similares
después de los tratamientos de 24 hy 48 h, influenciada principalmente por la funcionalización. La Figura 2
muestra que las NP de oro PEGilado de 5 nm produjeron un ligero aumento en el daño del ADN solo a la
dosis más alta probada, mientras que ni las NP de 5 nm funcionalizadas con amonio ni con carboxilato
causaron daño en el ADN. Sin embargo, las NP de amonio de 20 nm indujeron un alto porcentaje de daño del
ADN en las dosis máximas (5 y 10 µg / mL). Las NP carboxiladas de 20 nm y PEGiladas de 20 nm no
afectaron el nivel de daño del ADN. Solo las NP de amonio de 20 nm mostraron una dosis-respuesta lineal
significativa para inducir daño al ADN (R2 = 0,8316; p <= 0,001).
En el ensayo de micronúcleos (Figura 3), las NP de oro de 5 nm funcionalizadas con amonio pudieron inducir
micronúcleos (Figura 3), a pesar de que no produjeron daño en el ADN en el ensayo del cometa. Por otro
lado, las NP funcionalizadas con amonio de 20 nm (que indujeron daño al ADN) no generaron un aumento de
micronúcleos. Las NP PEGiladas de 20 nm indujeron micronúcleos en tres de las cuatro dosis probadas,
incluida la dosis más baja y la más alta, aunque no causaron daño al ADN en el ensayo del cometa . Las NP
carboxiladas de 20 nm aumentaron la frecuencia de micronúcleos solo a la dosis más baja probada (5 µg /
ml). Ninguno de los NP de oro que indujeron micronúcleos mostró una dosis-respuesta lineal estadísticamente
significativa (datos no mostrados).
La microscopía hiperespectral mostró que los seis tipos de NP de oro fueron absorbidos por las células BEAS-
2B. Las NP se vieron principalmente como agrupaciones en el citoplasma pero no en el núcleo, lo que indica
que las NP se habían internalizado. Si las NP se hubieran adherido a la membrana celular, se habría
esperado una distribución más uniforme de las partículas, algunas cubriendo el núcleo o ubicadas en el borde
exterior de la membrana celular. El análisis de imágenes obtenidas por microscopía hiperespectral reveló que
la captación celular dependía tanto del tamaño como de la funcionalización. Como se muestra en la Figura 4a,
las NP de oro carboxiladas y PEGiladas exhibieron diferentes patrones de distribución dentro de las células,
siendo internalizadas las NP de oro PEGiladas en aglomerados más numerosos y más pequeños que sus
contrapartes carboxiladas. En el caso de las NP carboxiladas de 20 nm, la coincidencia de señales solo
reconoció los aglomerados, lo que puede deberse parcialmente a un cambio en el perfil hiperespectral de las
NP de oro carboxilado de 20 nm dentro de las células, en comparación con el medio de dispersión. En la
Figura 4b, se puede observar que las NP de oro amonio se internalizaron en grandes cantidades, impidiendo
la visualización de células individuales. La figura 5 muestra los resultados de la cuantificación del área celular
cubierta por partículas. Los NP PEGilados fueron internalizados por las células en cantidades más altas que
los NP carboxilados (estadísticamente significativamente sólo para el tamaño de 5 nm). Las NP de oro
carboxilado de 20 nm se internalizaron más que sus contrapartes de 5 nm, mientras que no se detectó una
diferencia estadísticamente significativa al comparar las NP de oro PEGilado de 5 y 20 nm. El área de la celda
cubierta por partículas parecía ser mucho mayor para las NP de amonio y oro que para las otras NP, pero
esto no pudo cuantificarse debido a las dificultades para identificar las células individuales.
Nanomateriales 2020, 10, x PARA REVISIÓN POR PARES 6 de 13 El análisis de imágenes obtenidas por
microscopía hiperespectral reveló que la captación celular dependía tanto del tamaño como de la
funcionalización. Como se muestra en la Figura 4a, las NP de oro carboxiladas y PEGiladas exhibieron
diferentes patrones de distribución dentro de las células, siendo internalizadas las NP de oro PEGiladas en
aglomerados más numerosos y más pequeños que sus contrapartes carboxiladas. En el caso de las NP
carboxiladas de 20 nm, la coincidencia de señales solo reconoció los aglomerados, lo que puede deberse
parcialmente a un cambio en el perfil hiperespectral de las NP de oro carboxilado de 20 nm dentro de las
células, en comparación con el medio de dispersión. En la Figura 4b, se puede observar que las NPs de
amonio y oro se internalizaron en números altos, impidiendo la visualización de células individuales. La figura
5 muestra los resultados de la cuantificación del área celular cubierta por partículas. Los NP PEGilados fueron
internalizados por las células en cantidades más altas que los NP carboxilados (estadísticamente
significativamente sólo para el tamaño de 5 nm). Las NP de oro carboxilado de 20 nm se internalizaron más
que sus contrapartes de 5 nm, mientras que no se detectó una diferencia estadísticamente significativa al
comparar las NP de oro PEGilado de 5 y 20 nm. El área de la celda cubierta por partículas parecía ser mucho
mayor para las NP de amonio y oro que para las otras NP, pero esto no pudo cuantificarse debido a las
dificultades para identificar las células individuales.

4. Discusión.
Aunque la citotoxicidad y genotoxicidad de las NP de oro se han examinado en detalle durante los últimos
años, las características detrás del efecto genotóxico potencial y las interacciones biológicas de las NP de oro
aún no se conocen bien. En este estudio, investigamos el papel de la funcionalización, el tamaño y la
internalización de las partículas en la determinación de la genotoxicidad y citotoxicidad de las NP de oro en un
modelo in vitro del epitelio bronquial. Nuestros resultados sugieren que la funcionalización es importante para
determinar la citotoxicidad de las NP de oro, siendo las NP de oro funcionalizadas con amonio citotóxicas en
dosis más bajas que las NP de oro carboxiladas o PEGiladas, independientemente del tamaño de partícula
del núcleo.

La genotoxicidad de las NP de oro no se determinó simplemente mediante una única funcionalización. En el

ensayo del cometa, las NP de oro de 20 nm funcionalizadas con amonio indujeron daño en el ADN a 5 y 10 μg
/ ml, mientras que las otras formas de NP de 20 nm no lo hicieron. Sin embargo, para el tamaño de 5 nm, solo
se obtuvo un aumento en el daño del ADN con la dosis más alta (250 μg / ml) de las NP de oro PEGiladas de
5 nm. Se encontró una disparidad similar en la prueba de micronúcleos donde las NP de oro PEGilado de 20
nm mostraron una clara inducción de micronúcleos, mientras que la forma funcionalizada de amonio de 5 nm
fue capaz de inducir micronúcleos en dos dosis (1 y 5 μg / mL), y el Las NP carboxiladas de 20 nm fueron
positivas a una dosis (5 μg / ml). Estos hallazgos sugieren que ambos tamaños de NP de amonio y oro
PEGilado tienen potencial genotóxico, aunque ninguno de estos tipos de partículas fue positivo en ambos
ensayos de genotoxicidad. Las NP de oro carboxilado de 5 nm no fueron genotóxicas, y la evidencia sobre la
genotoxicidad de las NP de oro carboxilado de 20 nm se limitó a un resultado positivo a la dosis más baja en
el ensayo de micronúcleos. A la hora de interpretar los resultados, hay que tener en cuenta que la
citotoxicidad limitaba las dosis disponibles para el NP de oro funcionalizado con amonio.
La funcionalización de la superficie se considera una característica clave en la interacción, los efectos
potenciales y el destino final de los ENM en los entornos biológicos, ya que las propiedades químicas de la
superficie de las NP desempeñan un papel crucial en su interacción con las células [14]. Se considera que las
propiedades superficiales de las NP determinan la composición de la biocorona alrededor de las partículas,
que a su vez modula la captación celular de partículas y, por tanto, las respuestas biológicas, definiendo en
consecuencia la seguridad y eficacia potencial de los ENM [15]. Nuestro hallazgo de la alta citotoxicidad de las
NP de oro funcionalizadas con amonio está en línea con un estudio reciente sobre el mismo conjunto de NP
de oro, donde las NP de oro y amonio eran citotóxicas para las células THP-1 de leucemia monocítica
humana a 25 g / ml. mientras que las formas carboxilada y PEGilada no fueron citotóxicas dentro del rango de
dosis probado [12]. Un análisis ómico sugirió que las NP de amonio pudieron inhibir significativamente la
respiración mitocondrial. Goodman y col. [16] encontró que las NP de oro catiónico de núcleo de 2 nm
causaron efectos citotóxicos en todas las líneas celulares investigadas, mientras que las NP de oro aniónico
no eran citotóxicas a las dosis incluidas. Sin embargo, algunos estudios sugirieron que los NP de oro con
carga negativa muestran una toxicidad igualmente alta para los NP de oro con carga positiva. En las células
HaCaT de queratinocitos humanos, las NP de oro de 1,5 nm estabilizadas con trifenilfosfina con un ligando de
oro cargado positivamente (trimetilamoniumetanotiol) o cargado negativamente (mercaptoetanosulfonato)
provocaron una mayor respuesta tóxica que las NP de oro neutrales (ligando de mercaptoetoxietoxietanol) del
mismo tamaño [17]. Paino y col. [18] investigaron la genotoxicidad (ensayo cometa) y citotoxicidad de NP de
oro catiónicas (cubiertas con dendrímero de poliamidoamina) y aniónicas (cubiertas con citrato de sodio)
(diámetro ~ 7 nm) en células HepG2 y células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC), y
encontraron que ambos tipos de partículas eran genotóxicas y citotóxicas en dosis muy bajas. Las PBMC
fueron menos sensibles a los efectos citotóxicos y que dañan el ADN de las NP de oro que las células HepG2.
En células A549 de adenocarcinoma de pulmón humano, las NP de oro neutrales y con carga positiva y
negativa (diámetro 2-3 nm) indujeron daño en el ADN después de un tratamiento de 24 h (ensayo cometa),
aunque el efecto genotóxico más fuerte se observó para las NP de oro con carga positiva [19].
En el presente estudio, la fuerte citotoxicidad de las NP de oro amonio catiónico se asoció con una captación
celular extremadamente alta. La cantidad de internalización fue menor para las NP carboxiladas aniónicas que
para las NP PEGiladas neutras de ambos tamaños, mostrando las NP carboxiladas de 5 nm una captación
celular claramente menor que todos los demás tipos de partículas. Sin embargo, el perfil de citotoxicidad fue
similar para las NP carboxiladas y PEGiladas. La distribución de las partículas internalizadas fue visualmente
diferente para las NP PEGiladas y carboxiladas, mostrando las primeras más pequeños aglomerados que las
últimas. Curiosamente, en un estudio sobre la internalización de NP de oro en la misma línea celular (BEAS-
2B; aunque con un 10% de serúmina en el medio de cultivo), los autores observaron que el mecanismo de la
vía de la endocitosis dictaba la localización intracelular y la toxicidad subsiguiente [20]. Se observó
anteriormente que la citotoxicidad de las partículas de oro (longitud ~ 165 nm) con recubrimiento de poli
(acriloil-1 (d) -valina de diferente quiralidad superficial dependía de su captación celular y producción de
especies reactivas de oxígeno intracelulares [21].
En nuestro estudio, los dos tamaños de núcleo (~ 5 nm y ~ 20 nm) de las NP de oro no difirieron notablemente
entre sí en lo que respecta a la citotoxicidad. El tamaño tampoco jugó un papel consistente en la
determinación de la genotoxicidad. Las NP de oro carboxiladas de 5 nm no fueron genotóxicas, pero los otros
tipos de partículas mostraron al menos alguna actividad en cualquiera de los ensayos. El tamaño de los ENM
de oro se relacionó anteriormente con efectos tóxicos diferenciales in vitro. Los racimos de oro Au55 (1,4 nm
de diámetro) eran citotóxicos en dosis bajas a través de una interacción intensa con el ADN [9], pero las NP
de oro de 15 nm requerían dosis de 60 a 100 veces más altas para la citotoxicidad en el mismo entorno
experimental [22]. En células de carcinoma hepatocelular humano HepG2, las NP de 5 nm indujeron un
incremento dependiente de la dosis en el daño del ADN después de una exposición de 24 h utilizando el
ensayo cometa, mientras que las NP de oro de 20 nm y 50 nm no aumentaron el daño del ADN a las dosis
probadas [ 23]. En otro estudio con células HepG2, las NP de oro de 10 nm, 30 nm y 60 nm indujeron daño en
el ADN, y las NP más pequeñas mostraron el mayor efecto [24]. Cuando se inmortalizaron células epiteliales
bronquiales humanas normales HBEC3-kt se expusieron a 1, 10 y 20 μg / ml (0,3 a 6,3μ g / cm2) de NP de
oro (5 y 50 nm) en agua mili-Q durante 48 h, solo las partículas de 5 nm (no las de 50 nm) indujeron daño en
el ADN (ensayo cometa), mientras que ninguno de los tipos de partículas indujo micronúcleos [25].
En cultivos de linfocitos de sangre periférica (PBL) y macrófagos murinos Raw264.7 tratados con NP de oro
cubiertas con citrato, las NP de 5 nm fueron más citotóxicas que las NP de 15 nm, pero el tamaño no jugó un
papel fundamental en la determinación de la citotoxicidad cuando la dosis de NP de oro se expresó como el
número de NP [26]. Sin embargo, para la genotoxicidad, el tamaño fue un factor fundamental tanto para las
métricas de dosis como para los tipos de células, y las NP de oro de 15 nm mostraron una inducción de
micronúcleos más grave que las partículas más pequeñas [26].Enea y col. [27] estudiaron la citotoxicidad de
las NP de oro que difieren en tamaño (14 nm y 50 nm), forma (esferas y estrellas) y recubrimiento (11 ácido
mercaptoundecanoico (MUA) y citrato de sodio; ambos cargados negativamente) en endotelio microvascular
cerebral humano. células (hCMEC / D3), y observaron que las NP de oro más pequeñas eran más citotóxicas
que las NP de oro más grandes en comparación con la misma dosis de oro. Sin embargo, cuando la dosis se
expresó como el número de partículas / ml, se observó un mayor grado de citotoxicidad para los NP más
grandes. Además, la citotoxicidad fue mayor para las NP de oro en forma de estrella que para las esferas, y el
recubrimiento de citrato resultó en una mayor citotoxicidad que el recubrimiento de MUA. Otro estudio que
investigaba las mismas funcionalizaciones (citrato y MUA) de NP de oro de 20 nm en células HepG2 encontró
un aumento en el daño del ADN (ensayo cometa) después de la exposición a NP recubiertas de citrato en
dosis que no eran genotóxicas para las NP recubiertas de MUA [28].
También se observó que el tamaño juega un papel clave en la toxicidad y biodistribución de los ENM de oro in
vivo. Cuando las ratas Sprague-Dawley fueron expuestas por inhalación a NP de oro de 13 nm o 105 nm
durante cinco días (6 h / día), ambos tipos de NP se depositaron principalmente en las orejetas, pero la
translocación de los pulmones a los órganos diana secundarios fue significativamente más alto con los NP de
oro más pequeños que los más grandes [29]. En ratas, la instilación intratraqueal de NP de oro que difieren en
el tamaño de partícula primaria (2, 20 y 200 nm; instilación única de 18 μg en 0,5 ml) no produjo efectos
genotóxicos en los pulmones (ensayo cometa) o en el médula ósea (ensayo de micronúcleos) 72 h después
del tratamiento, aunque no se confirmó si los materiales de prueba alcanzaron la médula ósea [30]. Tampoco
se observaron otros efectos adversos sistémicos o locales a la dosis aplicada. Los NP de oro recubiertos con
PEG (5-60 nm) administrados a ratones machos mediante inyección intraperitoneal mostraron una
acumulación dependiente del tamaño, con partículas de 5 nm y 10 nm que se acumulan principalmente en el
hígado y partículas de 30 nm que se acumulan principalmente en el bazo, mientras que las partículas de 60
nm tenían una acumulación limitada en varios órganos [31]; sin embargo, las NP de 10 nm y 60 nm tuvieron
una mayor influencia que las NP de 5 nm y 30 nm en los marcadores hematológicos estándar. Talamini y col.
[32] estudiaron la biodistribución de las NP de oro terminadas en carboxi (NP esféricas de 10 nm y 50 nm y en
forma de varilla y estrella de 50 nm), y encontraron que no solo el tamaño sino también la forma influían en
gran medida en la cinética de acumulación y la excreción de NP de oro en órganos de filtro, con NP de oro
esféricas y en forma de estrella que muestran el mismo porcentaje de acumulación pero una localización
diferente en el hígado, mientras que solo las NP de oro en forma de estrella pudieron acumularse en los
pulmones. En Daphnia magna, los ENM de oro con carga positiva eran órdenes de magnitud más tóxicos que
los ENM de oro con carga negativa [33]. Los NP de oro que representan diferentes tamaños y cargas
superficiales, inyectados por vía intravenosa en ratas, mostraron una acumulación diferencial en varios
órganos y tejidos, dependiendo de las características de los NP, mediada por la unión e intercambio
dinámicos de proteínas [34]. Cuando las ratas fueron expuestas a NP de oro por instilación intraesofágica, la
mayor acumulación en órganos secundarios se encontró principalmente para NP de 1,4 nm, y las NP
cargadas negativamente mostraron una acumulación mayor que las NP cargadas positivamente. Sin
embargo, las NP de oro de 18 nm se acumularon en el cerebro y el corazón en cantidades más altas que las
NP de otros tamaños [35].
La reactividad de las NP tiene el potencial de interferir con varios ensayos in vitro [36]. Por ejemplo, se
observó que las NP de oro estabilizadas con citrato de 14 nm (carga negativa) tienen la capacidad de interferir
con el ensayo cometa alcalino durante los pasos críticos en los que se lisan las membranas celulares y las NP
intracelulares tienen el potencial de interactuar directamente con el ADN. [37]. Esto puede producir resultados
falsos positivos. La mayoría de los datos sobre la inducción de daño primario al ADN por NP de oro se basan
en el ensayo cometa alcalino. Por ejemplo, en las células A549, las NP de oro con carga positiva de 3 nm
indujeron una respuesta muy fuerte en el ensayo cometa alcalino, pero solo un efecto moderado en la
detección fluorométrica del desenrollamiento del ADN alcalino (FADU) y en el ensayo cometa neutro (que
representa ADN roturas de doble hebra) y ningún efecto en el análisis de inmunofluorescencia de los focos de
H2AX, otra técnica para las roturas de doble hebra del ADN [19]. Se consideró que estos hallazgos sugerían
que las NP de oro inducen predominantemente sitios lábiles a los álcalis que se detectan en el ensayo cometa
alcalino, pero no en los otros tres ensayos [19]. La interferencia de los NP de oro con el procedimiento de
ensayo del cometa podría ser una explicación del alto efecto que observamos a dosis bajas de NP de oro
catiónico de 20 nm. Como se muestra por microscopía de campo oscuro, las células se llenaron con
aglomerados de NP de oro, debido a una internalización extremadamente alta de las NP, lo que les permitió
interactuar con el ADN durante el procedimiento de ensayo del cometa. Además, la elevada inducción de
daño en el ADN por las NP catiónicas de 20 nm no estuvo acompañada de un aumento de micronúcleos.
Sin embargo, se encontró lo contrario para las NP catiónicas de 5 nm que indujeron micronúcleos pero no
daño al ADN, a pesar de que la internalización de estas NP también fue muy alta. Otro hecho notable fue que
las NP de oro PEGilado de 20 nm indujeron micronúcleos, mientras que las NP PEGiladas de 5 nm no lo
hicieron. La formación de micronúcleos no puede explicarse por el mismo problema técnico que puede afectar
el ensayo del cometa. Un aumento de micronúcleos es, por tanto, una indicación de un verdadero efecto
genotóxico. Los micronúcleos se forman a partir de fragmentos cromosómicos (efecto clastogénico resultante
del daño del ADN) o cromosomas enteros rezagados (efecto aneugénico). En PBL humanos y macrófagos
RAW264.7 de ratón, los micronúcleos inducidos por NP de oro de 5 nm y 15 nm fueron con más frecuencia
centrómeros positivos que negativos, lo que sugiere un efecto aneugénico más fuerte que clastogénico [18].
Una influencia clastogénica fue indicada además por el hecho de que los NP de oro aumentaron las
frecuencias de los puentes nucleoplasmáticos (que reflejan reordenamientos cromosómicos estructurales) en
los PBL (NP de 5 nm) o en ambos tipos de células (NP de 15 nm) [18]. Por lo tanto, al menos algunas NP de
oro parecen mostrar una capacidad de dañar el ADN en ensayos que no se ven afectados por el posible
artefacto del ensayo cometa. En el presente estudio, las NP de amonio de 5 nm y de oro PEGilado de 20 nm
fueron capaces de aumentar la frecuencia de micronúcleos y, por lo tanto, deberían considerarse genotóxicas
en nuestro sistema in vitro. El resultado positivo obtenido con las NP de amonio de 20 nm y de oro PEGilado
de 5 nm en el ensayo cometa puede haber sido afectado por la interferencia de NP con el protocolo del
ensayo, y debe considerarse con precaución.

5. Conclusiones
Nuestros hallazgos muestran que la citotoxicidad de las NP de oro en las células BEAS-2B se ve reforzada en
gran medida por la funcionalización del amonio, lo que refleja la muy alta absorción celular de las NP de
amonio y oro. Ni la funcionalización ni el tamaño pueden explicar por sí solos los efectos genotóxicos de los
NP de oro en las células BEAS-2B. Las NP de amonio de 5 nm y de oro PEGilado de 20 nm aumentan la
frecuencia de los micronúcleos y, por lo tanto, son genotóxicas. Las NP de amonio de 20 nm y de oro
PEGilado de 5 nm inducen daño en el ADN, pero no está claro si este efecto es real o se debe a la
interferencia de las NP de oro con el ensayo del cometa. Las NP de oro carboxilado de 20 nm muestran un
efecto equívoco, con una ligera inducción de micronúcleos solo a la dosis más baja, mientras que las NP de
oro carboxilado de 5 nm no son genotóxicas y también tienen la captación celular más baja.