VECTORES DE CLONACIÓN Y EXPRESIÓN DE

PROTEÍNAS RECOMBINANTES

María Vanessa Gómez Ramírez

 Clonación del ADN
Un clon es una copia idéntica.

La clonación de ADN involucra separar un gen específico

o un segmento desde un cromosoma más largo o el
genoma, unirlo a una pequeña molécula transportadora
de ADN, y entonces replicar el DNA modificado cientos o
millones de veces a través del incremento del numero
celular y la creación de múltiples copias de ADN clonado
en cada célula.
 Pasos de la Clonación
1. Cortar el ADN
2. Seleccionar pequeñas moléculas capaces
de autoreplicarse (vectores de clonación)
3. Unir el ADN con el vector
covalentemente (ADN recombinante).

4. Llevar el ADN recombinante al interior

de una célula para usar maquinaria
enzimática para la replicación.

5. Seleccionar o identificar las células

hospederas que contienen el ADN
recombinante.
Vector de clonación de ADN
 Clonación
Tamaño Tamaño
Gen del Gen Secuencia de Primers Fragmento
(pb) Amplificado (pb)
S 5’-cgcGGATCCATGGTAAGGGCCCCAAAGTTAGTG-3’
SmB 390 415
AS 5’-ataagaatGCGGCCGCTTACCCTTTGACTTTGCTTTTGGC-3’

S 5’-cgcGGATCCATGACCATAACGGCTCCGATTCAG-3’
SmD3 273 298
AS 5’-ataagaatGCGGCCGCTTAAATTTTGCGATTTCCCTGCTT-3’
Sitio de Corte BamHI
Sitio de Corte NotI

+
Gen de
Giardia

VECTOR pGEMT
PCR sobre
Rastreo Colonias
SmB SmD3 . Plásmidos plásmido
PCR RT-PCR M 1 (-) 1 2 3 4 5 6 7 (-) (+) M B D3 M B D3
M B D3 (+) (-) M B D3 (+) (-)

4000pb
3000pb

400pb 400pb
500pb
300pb 300pb 400pb
300pb

500pb
400pb
300pb
 Metodología

+
Gen

VECTOR pGEMT
 Tag= 26kDa

Digestión
Rastreo Colonias pGEX-SmB Rastreo
. Colonias pGEX-SmD3
pGEXT .
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (-)
M ND D B D3 M’ M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (+) (-)

4000pb
3000pb

400pb

300pb

400pb
300pb
Otro vectores
Inducción Proteína
Recombinante SmB

SDS-PAGE 12% Western blot. anti-GST 1:3000

TOP10 TOP10 TOP10 TOP10
M NT NI 1h 2h 4h 7h 20h M NT NI 1h 2h 4h 7h 20h

66KDa
45
36
29
24
20

14

26KDa + 14 = 40 KDa
 Inducción Proteína
Recombinante SmD3
SDS-PAGE 12% Western blot. anti-GST 1:3000
TOP10 TOP10 TOP10 TOP10
M NT NI 1h 2h 4h 7h 20h M NT NI 1h 2h 4h 7h 20h

66KDa
45
36
29
24

20

14

26KDa + 9 = 35 KDa
 Determinación de la Solubilidad de
las Proteínas Recombinantes
A600nm= 0.6
22 ° C
IPTG 100mM overnight
Sonicación

M SmB SmD3 M SmB SmD3

S I S I S I S I

45kDa
36kDa 40KDa
29kDa 35KDa
24kDa
 Purificación SmB
Extracto inicial 15mL
Glutatión Agarosa
30min a 4°C
Lavados: PBS T
Elución: Glutatión reducido

M EI NR L1 L2 L3 E1 E2 E3 M EI NR L1 L2 L3 E1 E2 E3
 Purificación SmD3
Extracto inicial 20mL
Glutatión Agarosa
30min a 4°C
Lavados: PBS T
Elución: Glutatión reducido

M EI NR L1 L2 L3 E1 E2 E3 M EI NR L1 L2 L3 E1 E2 E3
APLICACIONES DE PROTEINAS
RECOMBINANTES
 Ventajas

• Permite obtener proteínas humanas, o de cualquier origen, en

organismos fácilmente cultivables.

• Se obtienen grandes cantidades del producto, de una forma

más fácil y sobre todo reproducible, en comparación con el
obtenido por extracción a partir de su fuente natural.

• Se obtienen productos libres de patógenos y otros riesgos

potenciales. Por ejemplo, los factores de coagulación o la
hormona de crecimiento

• Pueden producirse proteínas que no existen en la naturaleza.

Producción de Insulina
 Producción de Proteínas
Recombinantes para detección y/o
localización en organismos de interés
 Spliceosoma

Will and Lürhmann, 2010

 Localización de SmB y SmD3
DAPI Merge

SmB
FITC
1:250

SmD3
FITC
1:250

TMG
FITC
1:50
 Inmunoprecipitación

SDS-PAGE de inmunoprecipitados
Sefarosa-
Proteína A

Anticuerpo anti-Sm
Obtención de Taq polimerasa
Bioremediación
Bioremediación
 En la
industria de
alimentos
Biosensores
Otras aplicaciones