UNIVERSIDAD PRIVADA DEL NORTE

CURSO
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BIOQUIMICA Y TOXICOLOGIA
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GRUPO Nº 3.

PROYECTO FINAL DE LA TRADUCCION DEL LIBRO BIOCHEMICAL

ECOTOXICOLOGÍA. DE LOS CAPÍTULOS 3 Y 8

INTEGRANTES.

BRICEÑO POLO DILMER DANTE N00182056

CHÁVEZ MARÍN FAUSTO ELVIS N00165135

JULCAMORO CARRASCO ÁLVARO N00168276

RAMIREZ ESQUEN LICETT N00186492

DOCENTE.

ING, FERNANDO CAMILO JOAQUIN RODRIGUEZ

CAJAMARCA, JULIO
DEL 2021.
 I. TÍTULO: “Biorremediación de hidrocarburos en aguas residuales con cultivo
mixto de microorganismos”
II. OBJETIVOS:
II.1. OBJETIVO GENERAL:
 Determinar la transformación ideal de los hidrocarburos por parte los
cultivos de microorganismos.
II.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
 Resumir en un informe sobre el tema de biorremediación de
hidrocarburos en aguas residuales con cultivo de microorganismos.
 Determinar los procesos por los cuales remediar las aguas residuales con
cultivos de microorganismos.
 Proponer soluciones y dar recomendaciones para la recuperación del agua
residual mediante cultivo de microorganismos.
III. JUSTIFICACIÓN:
Las aguas residuales y su tratamiento son un tema de gran importancia, hoy en
día debido al cambio desmedido de la temperatura ha provocado sequías de
agua, Por eso se requiere cuidar el agua e insistir en aplicar un correcto
tratamiento de aguas para así contribuir con el cuidado de la misma. Al
implementar la biorremediación de aguas residuales mediante el cultivo de
microorganismos se mejorará la calidad de vida de los habitantes cercanos a la
zona y esto ayudará al desarrollo de la ciudad. Por ende, se decide a realizar un
informe mediante el cual se determinará cual es el mejor proceso para el cultivo
de microorganismos que remediaran el agua residual contaminada por
hidrocarburos.

IV. INTRODUCCIÓN:
En la actualidad el agua es el fundamento de la vida: un recurso crucial para la
humanidad y para el resto de los seres vivos. Todos la necesitamos, y no solo
para beber. Nuestros ríos y lagos, nuestras aguas costeras, marítimas y
subterráneas, constituyen recursos valiosos que es preciso proteger. Pero su
disponibilidad disminuye paulatinamente a medida que aumenta su
contaminación, esto afecta las condiciones de saneamiento ambiental de una
comunidad disminuyendo la calidad de vida de esta.
 Para disminuir estos índices de contaminación, es indispensable brindar un
tratamiento adecuado a las aguas residuales por medio de una planta de
tratamiento de agua residual para poder minimizar el impacto del vertimiento de
aguas residuales a las fuentes de agua. La eliminación de aguas residuales no
tratadas produce impactos ambientales negativos en los cursos de agua
receptores, en función de la concentración de contaminantes que dichas aguas
contengan (Ingeniería Química, 2012)
El crecimiento de las ciudades provoca un incremento del parque automotor, y
por ende el aparecimiento de servicios alrededor de la industria automotriz, así
aumenta el número de lubricadoras-lavadoras de autos en los distintos puntos de
la localidad. 
Las bacterias que crecen en presencia de hidrocarburos producen una serie de
sustancias con propiedades tenso-activas llamadas biosurfactantes, capaces de
solubilizar compuestos no polares, como los contenidos en el petróleo. Además,
estas moléculas tienen la propiedad de estimular el crecimiento microbiológico
ayudando así a acelerar la biorremediación en las zonas contaminadas.
Los biosurfactantes son más biocompatibles, más fácilmente biodegradables y
por lo tanto menos tóxicos, menos perjudiciales al ambiente y más activos a
bajas concentraciones (Araujo et al., 2008; Ron y Rosenberg, 2002)
El objetivo de este trabajo consiste en evaluar el proceso de biorremediación de
hidrocarburos totales de las aguas residuales de las lubricadoras, aplicando
microorganismos degradadores de hidrocarburos y sus derivados, mediante la
técnica de la bioaumentación.
V. MARCO TEÓRICO
V.1. PREPARACIÓN Y MANTENIMIENTO DE TEJIDOS VIVOS Y
CULTIVOS PRIMARIOS PARA ESTUDIOS DE TOXICIDAD:
 Los estudios de toxicología in vitro o cultivo de tejidos o células se
llevan a cabo utilizando partes de un organismo que se han aislado y
cultivado o mantenido en condiciones controladas. La principal
ventaja es que permite la investigación de componentes individuales
de este sistema complejo y el estudio de funciones biológicas
fundamentales en las células. Sin embargo, esta simplificación de
estos sistemas muy complejos también es una desventaja es que para
que los resultados puedan validarse con el animal completo en
 relación con el objetivo de la investigación. De hecho, los sistemas in
vitro son alternativas reconocidas para reducir el uso de animales en
las pruebas de toxicidad, refinar la evaluación de la toxicidad y
reemplazar los estudios. (Gagné, 2014)
V.1.1. REACTIVOS NECESARIOS Y PREPARACIÓN DE LA
SOLUCIÓN
 Agua de cultivo celular estéril, sal sódica de rojo fenol, sal sódica,
sulfato de kanamicina, cloruro de sodio, gentamicina, Pronasa, 3-
(4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2H-tetrazolio bromuro, solución
de azul tripán, isopropanol y dimetilsulfóxido se obtuvieron de
Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemania). Suero fetal de ternera,
glutamina, penicilina-estreptomicina y el medio Leibovitz L-15 se
adquirieron de Gibco. Los medios de cultivo en particular se
desarrollan para parecerse lo más posible a la hemolinfa del animal
cultivado. (Gagné, 2014)
V.1.2. PROCEDIMIENTO
V.1.2.1. RECOLECCIÓN Y MANTENIMIENTO DE
ANIMALES
Como los bivalvos se alimentan por filtración y pueden contener una
gran cantidad de contaminantes, deben depurarse en el laboratorio antes
de cultivarlos. Los animales deben estar lo más sanos posible para el
cultivo de tejidos, y los animales extraídos del medio silvestre deben ser
reemplazados cada 2 semanas con nuevos individuos frescos. Los
animales deben recolectarse con una mínima interferencia cortando los
hilos de bisal (sin romperlos), transportados rápidamente de regreso al
laboratorio y mantenidos en instalaciones adecuadas que reflejen su
entorno natural. (Gagné, 2014)
V.1.2.2. PREPARACIÓN DE CULTIVOS DE CÉLULAS
PRIMARIAS
Todos los procedimientos de cultivo celular deben realizarse en
condiciones estériles en una campana de flujo laminar utilizada
exclusivamente para fines de cultivo celular. Todo el material de vidrio y
el equipo utilizado para el cultivo se autoclava antes de su uso y todas las
soluciones se esterilizan por filtración. Se debe mantener una buena
 técnica aséptica en todo momento para asegurar que no haya
contaminación. Todo el procedimiento para el cultivo de células en
suspensión y explantes de tejido de las branquias y la glándula digestive.
(Gagné, 2014)
V.1.3. APLICACIÓN A LAS PRUEBAS DE TOXICIDAD
Las células en suspensión se utilizan convenientemente para las pruebas
de citotoxicidad para medir los efectos letales de una sustancia química o
contaminante.

El ensayo de viabilidad celular MTT es un ensayo colorimétrico basado

en el método desarrollado por Mosmann para las evaluaciones de la
viabilidad de los linfocitos, que determina la actividad de las
mitocondrias, proporcionando así información sobre el metabolismo
energético celular.

Los criterios de valoración crónicos que investigan la expresión de

proteínas o biomarcadores enzimáticos también pueden investigarse in
vitro, ya que estos estudios toxicológicos in vitro pueden proporcionar un
buen mecanismo para estudiar las vías metabólicas, que son difíciles de
investigar in vivo. Sin embargo, también es útil investigar los efectos
toxicológicos potenciales en los explantes de tejido, ya que estos
fragmentos de tejido pueden preservar mejor el metabolismo específico
del tejido asociado con el tejido original y pueden ser más representativos
del animal completo in vivo.

V.1.4. CÁLCULOS / MANEJO DE DATOS

Cálculo de la densidad y viabilidad celular con Neubauer Hemocitómetro

Densidad celular: Se cuantificó con un hemocitómetro o cámara de

Neubauer y con un microscopio. Previamente se evaluó la duración de
cada fase de crecimiento en los tres tratamientos, con el objetivo de
establecer los intervalos de muestreos para cada uno (datos no
reportados).

Viabilidad celular: el número de células vivas se divide por el número

total de células contadas (vivas 1 muerta) y se multiplica por 100 (para
dar un porcentaje).
VI. MÉTODOS, TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS

VI.1. MATERIALES
 Libro de Biochemical Ecotoxicology
 Recopilación de adicional de bases de datos tales como Scielo,
Redalyc, Google Académico y Alicia
VI.2. METODOS
VI.2.1. Tipo, Diseño, Método y Técnica usado para el proyecto

 Tipo de Estudio: Descriptivo

 Diseño de la Investigación: No Experimental, es descriptivo.
 Método y Técnica: Cualitativo y Observacional
VI.3. PROCEDIMIENTO
 Lo primero que se hace es el recojo de las muestras de estudio
pertenecen a las aguas residuales de la Lavadora y
Lubricadora que se encuentra a lado del puente amarillo
ubicado en Cajamarca, tomadas en el punto de descarga al
alcantarillado público. Luego se hará una caracterización
inicial evaluando parámetros físicos y químicos característicos
de estas aguas residuales. En el caso de Hidrocarburos Totales
de Petróleo (TPH, por su sigla en inglés) se tomaran muestras
puntuales durante siete días. El resto de los contaminantes se
analizaran a una sola muestra compuesta.
 Luego de eso el objetivo de la determinación del caudal nos
permitirá conocer el volumen de descarga de aguas residuales
que tiene la lubricadora para la dosificación exacta de los
microorganismos.
 Ilustración 1 Parámetros y métodos de ensayo

 El sistema de tratamiento aplicado: Se utilizara en el tratamiento

biológico donde habrá una mezcla de bacterias encargadas de la
degradación de varios tipos de hidrocarburos: Acinetobacter sp.,
Pseudomonas sp. y Mycobacterium sp. Según García y Aguirre
(2014), cuando se intenta hacer simulaciones.
 Las aguas provenientes del lavado de vehículos son direccionadas por
canaletas perimetrales hacia la primera trampa de grasa, en donde se
retienen los lodos residuales conforme van pasando por las distintas
trampas de grasa, en este caso estas aguas van al río.
 Evaluación del tratamiento: Durante el mes de aplicación del
tratamiento con los microorganismos, se tomaran muestras
compuestas semanalmente. Se analizara la cantidad de TPH y se
graficó su variación temporal y el % de remoción. El resto de los
parámetros se analizara a una sola muestra compuesta al finalizar el
tratamiento y se comparara con los límites permisibles.

Ilustración 2 Fórmula del porcentaje de remoción

VII. ENSAYOS BIOQUIMICOS
 APLICACIÓN A LAS PRUEBAS DE TOXICIDAD: La evaluación de la
toxicidad in vitro debe realizarse siguiendo los mismos principios que las
exposiciones in vivo, con el uso apropiado de controles, controles de solventes
y replicación en el diseño experimental. La glándula digestiva y las branquias
son los tejidos más comúnmente utilizados en las pruebas de toxicidad debido a
su participación en la desintoxicación y la exposición continua al medio
ambiente, respectivamente y patógenos.
 Normalmente, por motivos de eficacia, se utiliza una placa de 96 pocillos como
recipiente de cultivo y estas placas se pueden centrifugar con adaptadores. Este
formato permite la prueba de numerosas concentraciones químicas y se miden
los efectos citotóxicos. Los métodos más comunes para evaluar la citotoxicidad
son el MTT y las pruebas de exclusión con azul tripán
 El ensayo de viabilidad celular MTT es un ensayo colorimétrico basado en el
método desarrollado por Mosmann para las evaluaciones de la viabilidad de los
linfocitos, que determina la actividad de las mitocondrias, proporcionando así
información sobre el metabolismo energético celular.
 La prueba de exclusión con azul tripán evalúa la integridad de la membrana
celular proporcionando información sobre la viabilidad celular y ha sido
realizado por muchos autores tanto en hemocitos en cultivo y otros tipos de
células de invertebrados. Esta técnica ofrece un método muy simple de utilizar
un hemocitómetro Neubauer para evaluar la viabilidad celular en función de la
captación del tinte azul por las células dañadas (muertas).
 Ilustración 3 Método desarrollado para el cultivo de suspensiones de tejido del mejillón cebra y su uso en pruebas de
toxicidad aguda y crónica, respectivamente.

VIII. DISCUSIÓN
- Por cultivos mixtos nos referimos a que se encuentran presentes desde un
inicio más de una especie/raza de microbio. Los cultivos mixtos que crecen
en mezclas de sustratos juegan un papel fundamental en la bioingeniería. El
método más usual es la siembra por estría sobre un medio de cultivo sólido
adecuado dispuesto en una placa de petri. Para ello se toma una pequeña
cantidad de muestra con un asa de platino y se reparte sobre la superficie del
 medio de cultivo. Sobre el medio quedan separadas e inmovilizadas las
células bacterianas.
- (Araujo, Gómez, Barrera, N, et al., 2008; Romaniuk et al., 2007) en un
estudio con cepas bacterianas observaron que las concentraciones de crudo
disminuyeron rápidamente durante los primeros 30 días, período durante el
cual los microorganismos degradaron entre un 50 % y un 60 % del
hidrocarburo. Otros autores, afirman que durante la biodegradación de los
hidrocarburos del petróleo las bacterias oxidan el petróleo a dióxido de
carbono, agua y energía, y plantean que aproximadamente 50 % del carbono
en el petróleo es usado para biomasa bacteriana. En los trabajos de (Araujo,
Gómez, Barrera, N, et al., 2008) con la adición de biosurfante y la aplicación
de un cultivo mixto se obtuvo porcentajes de remoción de hidrocarburo del
81 %.
- También es posible a la segregación de biosurfante propio del metabolismo
de los cultivo de las bacterias, hace que se incremente la cantidad de tenso
activos en las aguas residuales.
IX. CONCLUSIONES
- En conclusión la aplicación de la biaumentación mediante un cultivo mixto
para la biorremediación de las aguas residuales de una lubricadora es de
resultado eficiente obteniéndose porcentajes de remoción del Hidrocarburo
Total de Petróleo por encima del 86 %.
- Por otro lado los mejores resultados de remoción del TPH se obtuvieron a la
tercera semana de aplicado los microorganismos con un 92 %.
- Además, los microorganismos remueven el DQO (40 %), aceites y grasas
(50 %), tensoactivos (43 %), lo que evidencia que es una alternativa
técnicamente factible, viable y de bajo costo.
X. BIBLIOGRAGÍA:

Araujo, I., Gómez, A., Barrera, M., Angulo, N., Morillo, G., Cardenas, C., & Herrera,
L. (2008). Surfactantes biológicos en la biorremediación de aguas contaminadas
con crudo liviano. Scielo, 33(4). http://www.scielo.org.ve/scielo.php?
script=sci_arttext&pid=S0378-18442008000400004#fig3

Araujo, I., Gómez, A., Barrera, M., N, A., Morillo, G., Cárdenas, C., & Herrera, L.
(2008). Surfactantes biológicos en la biorremediación de aguas contaminadas con
 crudo liviano. Scielo. http://ve.scielo.org/scielo.php?
script=sci_arttext&pid=S0378-18442008000400004

Gagné, F. (2014). Biochemical Ecotoxicology: Principles and Methods. Elsevier, 282.

Ingeniería Química. (2012). Introducción al tratamiento de aguas residuales. Ingeniería

Química. https://www.ingenieriaquimica.org/comment/21450

Romaniuk, R., Brandt, J. F., Rios, P. R., & Giuffré, L. (2007). Atenuación natural y
remediación inducida en suelos contaminados con hidrocarburos.
https://www.suelos.org.ar/publicaciones/vol_25n2/25_2_romaniuk_139_149.pdf

Ron, E., & Rosenberg, E. (2002). Biosurfactants and oil bioremediation. Elsevier
Science Ltd.
 UNIVERSIDAD PRIVADA DEL NORTE

CURSO
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BIOQUIMICA Y TOXICOLOGIA
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GRUPO Nº 3. SEMANA 7 TEMA 8

PROYECTO FINAL DE LA TRADUCCION DEL LIBRO BIOCHEMICAL

ECOTOXICOLOGÍA. DE LOS CAPÍTULOS 3 Y 8

INTEGRANTES.

BRICEÑO POLO DILMER DANTE N00182056

CHÁVEZ MARÍN FAUSTO ELVIS N00165135

JULCAMORO CARRASCO ÁLVARO N00168276

RAMIREZ ESQUEN LICETT N00186492

DOCENTE.

ING, FERNANDO CAMILO JOAQUIN RODRIGUEZ

CAJAMARCA, JULIO
DEL 2021.

I. TÍTULO: “Aplicación de microorganismos anaerobias y aerobias para la

biorremediación ambiental”
II. OBJETIVOS:
II.1 Objetivo general:
 Describir la reacción de la asignación de energía celular frente a la
contaminación ambiental para ser usada como posible solución.
II.2 Objetivos específicos:
 Analizar cada una de las características de la reserva energética en la
asignación de energía celular cuando este se enfrente a la
contaminación ambiental.
 Explicar las actividades del citocromo c oxidasa en la asignación de
energía celular en casos donde el área este contaminada.

III.JUSTIFICACIÓN:
La presente investigación se enfocará en la descripción de la asignación de
energía celular en la bioquímica y toxicología, ya que la bioquímica estudia la
química de los procesos vitales clasificando en grupos conde la célula convierte
energía en formas biológicamente útiles y en grupos donde se aporta energía
para su funcionamiento , además de ello se requiere de la energía celular para
desintoxicar y reparar daños inducidos por los xenobióticos a costa de las
reservas energéticas destinadas al crecimiento, supervivencia y reproducción;
siendo estos procesos fundamentales para la reproducción de un organismo.
(Berg et al., 2007) Según (De Coen & Janssen, 2003) los organismos gastan
energía para metabolizar, defenderse y eliminar los xenobióticos, donde en el
último proceso se pierde mucha más energía, disminuyendo la posibilidad de
supervivencia, crecimiento y reproducción; como ejemplo la contaminación
ambiental por cadmio, cloruro de tributilestaño y sulfonato de
alquilbencenolineal, se demuestra el gasto de reserva de energía reducida en
forma de lípidos, azúcares y proteínas en los dáfnidos. Por ende, se elaborará el
siguiente informe, con el fin de analizar las características de como la célula
reserva energía y que actividades realiza en el citocromo para dar energía celular
cuando el área se encuentre contaminada.

IV. INTRODUCCIÓN:
La característica general de los seres vivos es la autoconservación, la cual
involucra 2 mecanismos muy importantes para su correcto funcionamiento,
donde los seres vivos intercambian sustancias y energía con el medio externo,
funcionando como un sistema abierto. La energía que ingresa al ser vivo, en
forma de luz solar o energía química se almacenan en los alimentos, la cual es
transformada y usada por cada célula, adoptando diversas formas, para conjugar
reacciones químicas y transformaciones de energía que involucran la síntesis y
degradación de la molécula. (Benites, 2019)

La gran cantidad de compuestos tóxicos, ingresados al ambiente de manera

natural o antropogénica, son absorbidos por organismos, afectando sus procesos
metabólicos, disminuyendo su capacidad de producción, almacenamiento y
metabolismo de energía. (Gagné, 2014) El metabolismo es la totalidad de los
procesos químicos que realiza un organismo, conocida también como el “mapa
de rutas” de miles de reacciones químicas que suceden en la célula, donde el
guía son las enzimas acelerando varias de las reacciones determinadas. Los
procesos de degradación durante el metabolismo se pueden dar de manera
catabólica o anabólica. (Ripa, 2018)

Los microorganismos anaerobios y aerobios, son sistemas de descontaminación,

los cuales se basan en la digestión de sustancias orgánicas, del cual obtienen una
fuente de energía y el crecimiento de sus células a partir de una fuente de
carbono. La base fundamental de este método se encuentra en la cadena
respiratoria o transportadora de electrones de las células, del cual se van a
realizar una serie de reacciones de óxido-reducción, con el fin de obtener
energía. (Maroto & Rogel, 2002)

Por ello el objetivo de la presente investigación consiste en describir la reacción

de la asignación de energía celular, cuando esta se encuentra en un ambiente
contaminado, para así analizar y explicar las características de la reserva de
energía y actividades que realiza el citocromo cuando se realice la
biorremediación.
 V. MARCO TEÓRICO:
5.1. Asignación de energía celular:
El equilibrio entre los gastos de energía y las reservas es una vía crítica de toxicidad
para muchos xenobióticos. Se requiere energía celular para desintoxicar y reparar el
daño inducido por xenobióticos a expensas de las reservar de energía destinadas al
crecimiento, supervivencia y reproducción. (Jager et al., 2006) Los compuestos
tóxicos son absorbidos por organismos donde afectan los procesos metabólicos,
involucrado en la producción, almacenamiento y metabolismo de energía.
5.2. Reservas energéticas:
5.2.1. Carbohidratos totales:
Los carbohidratos totales están determinados por la reacción de la antrona, que
forma un color verde proporcionalmente fuerte en presencia de azúcares.
(Jermyn, 1975) Este se puede expresar en gramos, combina varios tipos de
carbohidratos: fibra dietética, azúcares y otros carbohidratos. Estos
carbohidratos son fuente disponible de energía más importante la vida humana y
los microorganismos. (Jane et al., 2012)

5.2.2. Lípidos:
Los lípidos se consideran una forma de energía más calórica y susceptible de
almacenamiento a largo plazo en los organismos. Estos podrían movilizarse
fácilmente de acuerdo a la demanda del organismo. Los niveles de los lípidos se
determinan mediante el ensayo espectrofotométrico mediante el método de sufo-
fosfo-vainillina; siendo este método el más sensible y confiable para un análisis
gravimétrico. (Frings et al., 1972)
5.2.3. Análisis de perfiles lípidos por HNMR:
La Resonancia magnética nuclear basada en protones o espectroscopía HNMR,
es una de las formas más poderosas de determinar los niveles de varios
metabolismos en los tejidos biológicos. Una ventaja que nos brinda este método
es que se puede usar para determinar metabolitos específicos y una desventaja es
que no es suficientemente sensible por lo que se requiere secado y evaporación
para concentrar la muestra. El principio de la RMN de protones se basa en la
observación de que una carga giratoria genera un campo magnético.
La HRMN se basa en el principio de la frecuencia a la que resuenan los grupos
metilo de las partículas lipoproteicas. Dependiendo del tamaño que tengan esos
 grupos resonarán a unas frecuencias ligeramente diferentes y podrán ser
detectados y cuantificados.(Mallol et al., 2015)
5.2.4. Contenido de proteínas:
El contenido de proteínas, está definido como los niveles de proteínas totales, los
cuales se determinan en varios ensayos que varían en grados de complejidad. La
evaluación del nitrógeno total del método de Kjeldahl en proteínas fraccionadas es
un ensayo definitivo para proteínas, pero el método es menos adecuado para
propósitos de cribado a gran escala. El contenido de proteína total podría
determinarse mediante un ensayo de unión de colorante de proteína simple, rápido y
económico. (Bradford, 1976)
5.2.5. Actividades de transporte de electrones de las mitocondrias y dependencia
de la temperatura:
Las células han de desarrollar un trabajo para crecer y desarrollarse. La
capacidad de aprovechar la energía y canalizarla en trabajo biológico es una
propiedad de los seres vivos. Las células utilizan la oxidación de los nutrientes
como fuente de energía para la obtención de ATP. (Ilmo & Pérez, 2013) El
ensayo se basa en la relación entre las tasas de respiración de las mitocondrias
(CO2 producción) y la actividad de transporte de electrones, que se puede
determinar fácilmente mediante un cromóforo aceptor de electrones.
5.2.6. Actividades de citocromo c oxidasa:
La enzima citocromo c oxidasa o complejo IV es el eslabón final en la cadena de
transporte de electrones de la membrana interna mitocondrial. El citocromo c
oxidasa o CCOX es la última enzima en los pigmentos de la cadena de
transporte de electrones mitocondriales, acepta un electrón del citocromo c,
proteínas y las transfiere a una molécula de oxígeno para formar agua. Durante
este proceso, la enzima transloca protones (H) a través de la membrana y
contribuye al gradiente electroquímico transmembrana necesaria para la síntesis
de ATP.
VI. MÉTODOS, TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS:

6.1. MATERIALES
 Libro de Biochemical Ecotoxicology
 Recopilación de adicional de bases de datos tales como Scielo,
Redalyc, Google Académico y Alicia
6.2. METODOS
 Tipo, Diseño, Método y Técnica usado para el proyecto

 Tipo de Estudio: Descriptivo

 Diseño de la Investigación: No Experimental, es descriptivo.
 Método y Técnica: Cualitativo y Observacional
6.3. PROCEDIMIENYOS:
Para realizar el proyecto, se usarán diversos métodos para determinar los
carbohidratos totales, lípidos y el contenido de proteínas.
 Para el caso de los carbohidratos totales se usarán el reactivo de
antrona y ácido sulfúrico concentrado, este ensayo es
inespecífico, barato y rápido, con el que se pretende verificar si
se desecha o no el carbohidrato analizado. Si se desecha, se
tendrán que tomar las medidas de seguridad para desechos
ácidos. Para que se realice dicho ensayo se homogenizan los
tejidos sin ningún tratamiento. Usando una microplaca
transparente o un tubo de ensayo se agregan 10 μL de muestra
biológica, blanco y patrón de sacarosa de trabajo (50 μg / mL);
45 μL de agua SQ y 150 μL del reactivo antrona. Luego de ello
se calienta a 80 - 85 °C en un baño de agua durante 15 min,
enfriar a temperatura ambiente durante 5 min y secar el fondo
de la microplaca. Determine la absorbancia a 620 nm.
 Para determinar los niveles de lípidos totales de sulfo-fosfo-
vainillinas se usará el ensayo espectrofométrico mediante el
método de sulfo-fosfo-vainillina, siendo este método más
sensible y confiable que el análisis gravimétrico para lípidos
totales de cloroformo, donde se usarán reactivos como el ácido
sulfúrico concentrado, reactivo de fosfo-vainillina y estándares
de lípidos. Todos los ensayos realizados para este paso, se
 realizan en una campana extractora con un EPP adecuado,
luego en la microplaca transparente se mezclan 20 μL de
blanco, estándar o muestra; 30 μL de ácido sulfúrico
concentrado; y 150 μL de reactivo de fosfo-vainillina. Incubar
10 min a 75 - 80 C, enfriar a temperatura ambiente durante 5 min
y secar el fondo de la microplaca. Finalmente se mide la
absorbancia a 540 nm. Se observará la aparición de un color
rosado a medida que aumente el contenido de lípidos.
 Después de realizar el análisis los lípidos totales, se analizará el
perfil de los lípidos mediante HNMR, el cual trata de una
resonancia magnética nuclear basada en protones, para determinar
los niveles de varios metabolitos en los tejidos, pero este método no
es suficiente porque no tiene la sensibilidad suficiente, por lo que se
requiere de pasos de secado/evaporación para concentrar la muestra,
para este método se usa un tampón de homogenizado (KCl),
disolvente de extracción (cloroformo o diclorometano). Para el
análisis de lípidos, es digno de mención determinar el área bajo la
banda de metil CH3- / CH2 (justo después de la señal de TMS) y la
presencia de glicerol conjugado (fosfolípidos) en 4,3 4,5 y 5.3 5.5
ppm para H en C2 y C1 / C3 de la molécula de glicerol.

Ilustración 4.
Típica Espectro de H-
NMR de extractos lipídicos.
  Para evaluar el contenido de proteínas, se usa el método de Kjeldahl
evaluando el nitrógeno en las proteínas fraccionadas cuando es a una
escala pequeña. Para determinar el contenido total de proteínas, se
evalúa mediante un ensayo de unión de colorante de proteína simple,
rápido y económico. El ensayo se adecua en microplacas y la
preparación de tinte y también se podría usar para la tinción de
proteínas en electroforesis en gel, usando reactivo azul de
Coomassie, este proceso de realiza por triplicado, usando 10
microlitros de la muestra y 10 μL de solución de NaOH, luego de
esperar 15 minutos se agrega 140 μl de agua y 40 μl de reactivo azul
de Coomassie, se mezcla bien y se lee la absorbancia a 595 nm
después de 5 min. La adición de NaOH sirve para desnaturalizar las
proteínas para favorecer una unión más homogénea del tinte en la
muestra, pero aumenta la absorbancia de fondo (blanco).
 Para evaluar el transporte de electrones de las mitocondrias y
dependencia de la temperatura, se deben aislar una densidad
suficiente para su detección, para su mejor observación en el
microscopio se tinturan al menos a 500 mg de tejidos con tijeras y se
homogeniza en 2,5 mL con un tampón helado usando un triturador
de tejidos con mortero de teflón. El sedimento se retira del
sobrenadante y se suspende en una pequeña cantidad de tampón de
homogenizado.

VII. ENSAYOS BIOQUÍMICOS:

La presencia de microorganismos forma parte de un proceso fundamental en el
cual contribuye al mantenimiento de la vida misma. Dentro del metabolismo
para la descomposición de macromoléculas, las bacterias anaerobias realizan
diversos procesos, como lo son: la hidrólisis, acetogénesis y metanogénesis. La
utilidad del metabolismo de estas bacterias y su proceso bioquímico que
realizan, se reflejan en diferentes situaciones del planeta, por ello en los
diferentes ciclos en los que participan se pueden desarrollar de manera óptima,
como lo es el proceso de fijación, amonificación y nitrificación para los ciclos de
nitrógeno. (Constanza et al., 2015)
 Los ensayos que se deben realizar para este tipo de proyectos, se deben realizar
in vitro ya que solo se estudia una parte del ser vivo o microorganismo en este
caso, aislando la parte del sistema que se va analizar. Este tipo de ensayos se
realizan con más frecuencia, ya que tiene la ventaja de controlar las variables
que se van a estudiar, midiendo por ejemplo el pH, temperatura, concentración
de sustancias, carbohidratos, lípidos, proteínas.
 Métodos para determinar la sensibilidad:
a) Dilución en agar.
b) Microdilución en caldo.
c) Sistemas comercializados, donde se encuentran las microplacas con
diferentes antibióticos con actividad frente a bacterias anaerobias.
d) E-test
e) Controles de calidad.
f) Detección de β- lactamasas

Ilustración 5. Comparación en los procesos químicos de digestión aerobia y anaerobia

VIII. DISCUSIÓN
- El impacto que causan las actividades antropogénicas en el ambiente, se
viene dando desde décadas pasadas, siendo de gran importancia la aplicación
de tratamientos eficaces y que estos al ser aplicados, no deterioren otros
ecosistemas. La necesidad de remediar el medio ambiente, demanda
tecnologías verdes que desintoxiquen y destruyan los contaminantes, por ello
se recomienda la biorremediación como una alternativa prometedora frente a
las técnicas físico- químicas que se realizan de manera convencional.
- Al emplear microorganismos para desintoxicar contaminantes, ya sea en el
suelo o aplicado en algún ecosistema, este actuará transformando los
contaminantes, en unos de menor riesgo. Existen diversos microorganismos
que tienen la capacidad metabólica de degradar por completo el
contaminante, para esto el contaminante debe estar disponible para que el
microorganismo cumpla su función, además de tener las condiciones
adecuadas, para que crezca y se desarrolle de manera óptima. (Montenegro
et al., 2019,pp. 11-12) La eficiencia del microorganismo seleccionado para la
biorremediación, dependerá del contaminante que se pretende tratar y su
capacidad metabólica.
- En el estudio de (Ferrera et al., 2006) se evaluó la contaminación de suelo y
agua, generada por derrames accidentales de hidrocarburos de petróleo,
implementando diversos sistemas biológicos, buscando la recuperación de
las áreas impactadas. Para la fitorremediación de suelos contaminados por
hidrocarburos, se usaron microorganismos asociados a la rizosfera y
simbióticos obligados, ya que representan una alternativa biológica para
aumentar su potencial de remediación. Para la fitorremediación en agua, se
usaron microalgas y cianobacterias, ya que juegan un papel importante frente
a la remediación de dichos contaminantes. Para ello se debe evaluar las
condiciones de donde se va implantar el sistema, ya que de esto depende la
eficiencia del proceso.
- Muchos de los estudios que se han realizado acerca de la biorremediación,
pueden demostrar que si aplican en el medio donde se pueden desarrollar de
 manera óptima, estas pueden realizar su trabajo, ya que se introducen en el
ambiente contaminado y se reproducen para que ocupen toda el área.

IX. CONCLUSIONES
- En conclusión, la aplicación de la microorganismos anaerobios y aerobios
para la biorremediación ambiental, es factible, por su alta eficiencia,
comprobada en diversas investigaciones. Tiene una alta capacidad para
degradar aceites, PCB’s, contaminantes en el suelo y agua, siendo el proceso
de selección de acuerdo al contaminante que se encuentre en el área
afectada.
- Para la biorremediación en microorganismos aerobios y anaerobios, se deben
realizar monitoreos semanales para analizar las muestras que se pretende
remediar. Si estos se aplican de manera adecuada, los resultados serán
bastante favorables cuando se aplique para la recuperación de un ecosistema.
- Este tipo de biorremediación aeróbica puede ser aplicada para la
recuperación de suelos contaminados por hidrocarburos, lodos de aguas
residuales y aguas residuales (PTAR) provenientes de aguas domésticas o
industriales, usando macro y micronutrientes, alcanzando un nivel de
remoción de casi el 65% de acuerdo a estudios realizado en laboratorio.
- La técnica propuesta es altamente eficiente, ecoamigable y sobre todo de
bajo costo, cumpliendo con la normativa del país, dando resultados a
mediano y corto plazo.
X. BIBLIOGRAFÍA:
Benites, J. (2019). Metabolismo celular [Universidad Nacional de Trujillo].
https://dspace.unitru.edu.pe/bitstream/handle/UNITRU/15765/BENITES LUIS
JUAN RAFAEL.pdf?sequence=1&isAllowed=y
Berg, J. M., Stryer, L., & Tymoczko, J. L. (2007). Bioquímica. Reverté.
https://books.google.es/books?
hl=es&lr=&id=HRr4MNH2YssC&oi=fnd&pg=PA1&dq=energía+celular+bioquí
mica+&ots=LWrGI4xics&sig=rEeaNRV83LxA-
pwOcoP0Rnk2JNs#v=onepage&q=energía celular bioquímica&f=false
Bradford, M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem,
72, 54–248.
Constanza, L., Antolinez, D. M., Bohórquez, J. A., & Corredor, A. M. (2015). Bacterias
anaerobias: procesos que realizan y contribuyen a la sostenibilidad de la vida en el
 planeta. NOVA, 13(23), 55–81.
http://www.scielo.org.co/pdf/nova/v13n24/v13n24a06.pdf
De Coen, W. M., & Janssen, C. R. (2003). The missing biomarker link: relationships
between effects on the cellular energy allocation biomarker of toxicant-stressed
Daphnia magna and corresponding population characteristics. Environ Toxicol
Chem, 22(7), 1632–1641.
Ferrera, R., Rojas, N. G., Poggi, H. M., Alarcón, A., & Cañizares, R. . (2006). Procesos
de biorremediación de suelo y agua contaminados por hidrocarburos del petróleo y
otros compuestos orgánicos. Revista Latinoamericana- Microbiología, 48(2), 179–
187. https://www.medigraphic.com/pdfs/lamicro/mi-2006/mi062s.pdf
Frings, C., Fendley, T., Dunn, R., & Queen, C. (1972). Determinación mejorada de los
lípidos séricos totales por la reacción sulfo-fosfo-vainillina. Clin Chem, 18(4), 673.
Gagné, F. (2014). Biochemical Ecotoxicology: Principles and Methods. Elsevier, 282.
Ilmo, S., & Pérez, A. (2013). Cadena de transporte de electrones mitocondrial, una
nueva versión.
https://www.academiadefarmaciadearagon.es/docs/Documentos/Documento52.pdf
Jager, T., Heugens, E., & Kooijman, S. (2006). Dar sentido a los resultados de las
pruebas ecotoxicológicas: hacia la aplicación de modelos basados en procesos.
Ecotoxicología, 15(14), 305.
Jane, M., Benton, M., & MPH. (2012). Los carbohidratos y el azúcar. KIDSHEALTH.
https://kidshealth.org/es/parents/sugar-esp.html#:~:text=Carbohidratos totales%3A
Este número%2C que,muchos beneficios para la salud.
Jermyn, M. (1975). Aumento de la sensibilidad del método de antrona a los
carbohidratos. Bioquímica, 68(5), 332.
Mallol, R., Amigó, N., Rodríguez, M., Heras, M., Vinaixa, M., & Plana, N. (2015).
Liposcale: a novel advanced lipoprotein test based on 2D diffusion-ordered 1H
NMR spectroscopy. J Lipid Res, 56(3), 46–737.
Maroto, M., & Rogel, J. (2002). Aplicación de sistemas de biorremediación de suelos y
aguas contaminadas por hidrocarburos.
http://aguas.igme.es/igme/publica/con_recu_acuiferos/028.pdf
Montenegro, S. P., Yamile, S., & Calderón, L. F. (2019). Prácticas de biorremediación
en suelos y aguas.
https://hemeroteca.unad.edu.co/index.php/notas/article/download/3451/3723/
Ripa, M. (2018). Metabolismo celular [Universidad de Lomas de Zamora].
http://agrarias.unlz.edu.ar/archivos_descargables/rvmaterialdebiologaparaelccf/Met
abolismo celular.pdf