Espectrofotometría:​ ​Espectros

de​ ​absorción​ ​y​ ​cuantificación

espectrofotométrica​ ​de
biomoléculas

David​ ​Santiago​ ​Tovar​ ​Romero 1 ​ ​,​ ​Manuel​ ​Camilo​ ​Mendoza​ ​Salazar 2

DEPARTAMENTO​ ​DE​ ​INGENIERÍA​ ​QUÍMICA,​ ​UNIVERSIDAD​ ​DE​ ​LA​ ​SABANA.

08​ ​de​ ​agosto​ ​del​ ​2017
OBJETIVOS
Aplicar​ ​la​ ​ley​ ​de​ ​Lambert-Beer​ ​y​ ​realizar​ ​una​ ​recta​ ​de​ ​calibrado​ ​para​ ​ácido​ ​gálico
Calcular​ ​gráficamente​ ​el​ ​valor​ ​de​ ​coeficiente​ ​de​ ​extinción​ ​molar​ ​para​ ​el​ ​ácido​ ​gálico
Determinación​ ​cuantitativa​ ​de​ ​polifenoles​ ​en​ ​una​ ​muestra​ ​problema

RESUMEN
En estudios de Bioquímica, las moléculas deben
ser analizadas para su caracterización cualitativa
y cuantitativa; un método que permite llevar a
cabo dicha caracterización es ​la espectroscopía
UV-Vis la cual está basada en el proceso de
absorción de la radiación ultravioleta-visible
(radiación con longitud de onda comprendida
entre​ ​los​ ​160​ ​y​ ​780​ ​nm)​ ​por​ ​una​ ​molécula.
En este proceso la cantidad de luz que absorben
las moléculas depende de forma lineal de la
concentración. En la espectroscopia se emplea
un espectrofotómetro, en el que se puede
seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa
por una solución y medir la cantidad de luz
absorbida por la misma.En esta práctica de
laboratorio se realizó una espectroscopia UV-VIS
para clorofila en cápsula con la finalidad de
determinar su λ​max (​​ Longitud de onda de mayor
absorbancia),​seguido de la elaboración de una
curva de calibración para esta.Como un proceso
adicional fue medida la absorbancia en muestras
problema en este caso la hierbabuena, y por
último se determinó el porcentaje de humedad
dichas​ ​muestras.
Palabras clave:
espectrofotometría, curvas de calibración,
solución​ ​patrón,​ ​clorofila,​ ​muestras​ ​vegetales.
ABSTRACT
In studies of Biochemistry , molecules must be
analyzed for qualitative and quantitative
characterization ; a method to perform such
characterization is the UV-Vis spectroscopy which is
based on the absorption process of ultraviolet - visible
radiation ( with wavelength of from 160 to 780 nm ) by
a molecule.In this process the amount of light
absorbing molecules depends linearly on the
concentration . spectrophotometer is used in a
Spectroscopy procedure ​, which can select the
wavelength of light passing through a solution and
measuring the amount of light absorbed by the same
is​ ​used.
In this lab UV - VIS spectroscopy it was performed to
chlorophyll capsule in order to determine their ​λ​max​(
wavelength greater absorbance) , followed by the
development​ ​of​ ​a​ ​calibration​ ​curve​ ​for​ ​this​ ​.
As an additional process ​was measured absorbance in
test sample peppermint​, and finally ​the moisture these
samples​ ​was​ ​determined​ ​.
Keywords​:​ ​Absorbance,​ ​spectrophotometry,
calibration​ ​curves,​ ​standard​ ​solution,​ ​chlorophyll,​ ​plant
samples,​ ​solvent,​ ​transmittance.
​Absorbancia,
INTRODUCCIÓN
En el siguiente informe trabajaremos la
espectrofotometría identificando los espectros de
absorción y cuantificación de biomoléculas; un
método que permite la determinación e
identificación cuantitativa y cualitativa de una
biomolécula es la espectroscopia.
espectroscopia es el estudio y medición de la
cantidad de energía radiante que absorbe una
solución en función de la longitud de onda, en
otras palabras es la medición de la absorción y
emisión de la radiación electromagnética por la
materia, la radiación electromagnética tiene
carácter ondulatorio y está formada por fotones;
el instrumento que permite la cuantificación de
energía absorbida o transmitida por una solución.
(Anzola Velasco & López Rico, 2005, págs.
129-132)
La espectrofotometría o espectrometría
ultravioleta-visible implica la espectroscopia de
fotones en la región de radiación UV-Vis, en otras
palabras estudia la absorción de la radiación
ultravioleta-visible por una molécula, al incidir la
radiación de energía las moléculas pasan de un
estado fundamental (basal) a un estado de mayor
energía (excitado). El paso de un haz de
radiación a través de un medio transparente va a
acompañado de la absorción parcial de aquélla, y
que también la absorción de radiación
electromagnética es equivalente a una absorción
de energía, entonces cuando una molécula
absorbe un fotón la energía que recibe da como
resultado una alteración de su estado, se dice
que la especie en cuestión está excitada y dicha
excitación puede consistir en la transición de un
electrón a un nivel energético, o en el cambio en
el modo de vibración de la molécula, o en la
alteración en su modo de rotación. (Skoog &
West,​ ​2002,​ ​pág.​ ​502)
La ley de Lambert-Beer dice que cuando un haz
de radiación monocromática atraviesa una
solución que contiene una especie absorbente, la
energía radiante del haz se
progresivamente como consecuencia de la
absorción de parte de la energía por las partículas
de dicha especie química. La disminución de la
energía depende de la concentración de la
substancia responsable de la absorción así como
de​ ​la​ ​longitud​ ​del​ ​recorrido​ ​del​ ​haz​ ​a​ ​través​ ​de
la solución lo que expresa la ley de Lambert-Beer es
cuantitativamente dicha relación. Una manera mejor
de expresar la ley de Beer-Lambert es establecer que
la absorbancia de una solución es directamente
proporcional a la concentración de la solución. Por
tanto, la espectrometría UV/VIS puede usarse para
La determinar la concentración de una solución. Es
necesario saber con qué rapidez cambia la
absorbancia con la concentración. Esto puede ser
obtenido a partir de referencias (las tablas de
coeficientes de extinción molar) o, con más exactitud,
determinando​ ​a​ ​partir​ ​de
una curva de calibración. La expresión matemática de
la​ ​ley​ ​de​ ​Lambert-Beer​ ​es:
A=Absorbancia​ ​de​ ​la​ ​muestra
C=concentración​ ​del​ ​cromóforo
L=Longitud​ ​del​ ​paso​ ​óptico​ ​que​ ​contiene​ ​la​ ​muestra
En la ecuación de absorbancia 𝜀 representa la
constante de extinción molar. El logaritmo decimal de
la razón de la intensidad incidente a la transmitida
recibe el nombre de absorbancia de la solución y se
simboliza por la letra A, la absorbancia de la
sustancia absorbente y con longitud del camino
atravesado por el haz. La Transmitancia es la fracción
de la radiación incidente transmitida por la solución;
en general se expresa como tanto por ciento (%), la
transmitancia está relacionada directamente con la
absorbancia​ ​por​ ​la​ ​siguiente​ ​expresión:
La existencia de una relación lineal entre la
absorbancia y el espesor de la capa de solución
atravesada, a concentración constante, es una ley
general de la cual no se han encontrado excepciones,
pero se encuentran frecuentemente desviaciones de
la proporcionalidad directa entre la absorbancia y la
concentración, a espesor de capa constante, algunas
reduce de estas desviaciones son de naturaleza
fundamentas​ ​o​ ​desviaciones​ ​instrumentales
representando una limitación de la ley de
Lambert-Beer.​ ​(Skoog​ ​&​ ​West,​ ​2002).
MATERIALES​ ​Y​ ​REACTIVOS absorbancia​ ​y​ ​realizamos​ ​su​ ​curva​ ​de​ ​calibración.
Se usará un vidrio de reloj previamente pesado y
una estufa a 60°C donde se introducirá el vidrio RESULTADOS​ ​Y​ ​DISCUSIÓN
de reloj, este se sacará con pinzas de crisol y se Al realizar la curva de calibración para la muestra
dejará​ ​enfriar​ ​en​ ​un​ ​desecador. patrón, diluida en agua y restando el blanco, con
Se usa una balanza para pesar la muestra, luego ayuda del espectrofotómetro se obtiene los siguientes
una tabla para cortar finamente la muestra, luego resultados:
se utilizara un tubo Falcon de 50 mL protegido de
la luz con papel aluminio, se agita la solución en
un Vortex. Se usa filtración con algodón y un Concentración Absorbancia
matraz​ ​para​ ​recoger​ ​lo​ ​sobrante. ( μg/mL )
También,​ ​se​ ​utilizara​ ​una​ ​baño​ ​de​ ​ultrasonido.
5 0,978
Usar tubos de eppendorf para preparar las
soluciones y finalmente utilizar gráfica de 10 0,895
absorbancia vs concentración. Determinar la
absorbancia​ ​usando​ ​lector​ ​de​ ​microplacas. 20 0,934

METODOLOGÍA 40 0,936
Teniendo en cuenta los objetivos dichos
anteriormente, se presenta a continuación la 80 0,937
metodología que fue seguida en la práctica de
laboratorio: 160 0,939
Tabla N°1: ​Datos de concentración y absorbancia
Determinaciòn​ ​de​ ​humedad para​ ​una​ ​muestra​ ​diluida​ ​en​ ​etanol.
Pesar 2 g de muestra problema, seguidamente Al graficar los valores de absorbancia en función de
dejarlo en la estufa por 24 horas, luego enfriar en la​ ​concentración,​ ​se​ ​obtiene​ ​la​ ​siguiente​ ​gráfica:
el​ ​desecador​ ​y​ ​calcular​ ​el​ ​porcentaje​ ​de​ ​humedad

Extracción de polifenoles en muestra

problema
- Vortex
En un tubo falcon de 50 mL adicionar 5 g de
hojas de hierbabuena cortadas protegido con
papel aluminio seguidamente agregar 20 mL de
etanol. Agitar 5 veces en vortex durante 20 min,
finalmente recoger el sobrenadante en un matraz
aforado​ ​de​ ​25​ ​mL​ ​y​ ​llevar​ ​a​ ​volumen​ ​con​ ​etanol.
Gráfica N°1: Absorbancia vs concentración
- Ultrasonido muestra​ ​problema​ ​diluida​ ​en​ ​etanol.
Repetir el proceso anterior hasta los 20 mL de De​ ​esta​ ​gráfica​ ​se​ ​obtiene​ ​la​ ​siguiente​ ​ecuación
etanol y adicionalmente meterlo en el baño de Y = 0, 00003 x + 0, 9341 ,mediante una regresión lineal;
ultrasonido​ ​4​ ​veces​ ​durante​ ​10​ ​segundos. teóricamente se sabe que el coeficiente de extinción
molar es la pendiente obtenida al graficar la
Curva​ ​de​ ​calibración​ ​de​ ​la​ ​hierbabuena absorbancia en función de la concentración; ya que
Con el patrón que se realizó en la primera parte, son​ ​directamente​ ​proporcionales.
se realizaron diluciones de 1 ​m​g/mL de 5, 10, 20, Nota: Los valores de absorbancia a la concentración
40,​ ​80,​ ​160​ ​µg/mL​ ​en​ ​etanol;​ ​determinamos​ ​su de 5, 10 ​µg/mL estaban desfasados por esto, no
fueron​ ​tomados​ ​en​ ​cuenta​ ​en​ ​la​ ​gráfica.
Se cumple la ley Lambert- Beer para
soluciones diluidas; para valores
concentración altos, ε varía con la
concentración ya estas dos son inversamente
proporcionales, debido a fenómenos de
dispersión de la luz, agregación de moléculas,
cambios​ ​del​ ​medio,​ ​etc.
por tanto se obtiene que el coeficiente
extinción molar experimental del ácido gálico
es​ ​:
ε = 0, 00003
Se utiliza la ecuación de la recta para
determinar las concentración del polifenol
presente en la en la muestra problema,
(diluida en etanol). Despejamos x para
determinar la concentración de ácido gálico
que posee la hierbabuena, asumiendo a Y
como un promedio de los valores de
absorbancia​ ​utilizados​ ​en​ ​la​ ​Gráfica​ ​1​.
Despejando​ ​x:
x = Ym−b
y≈0,9365
Concentración promedio de polifenoles en
la​ ​muestra​ ​problema
0,9365−0,9341
x = 0,00003 = 80 μg/mL
Los resultados para hierbabuena
similares a lo informado por Guzmán et al.
(2005), quienes reportan valores de 70 y 250
µg​ ​eq.​ ​AG/mL,​ ​respectivamente.
La variación en el contenido de fenoles entre
la hierbabuena se puede atribuir a variabilidad
genética de las plantas, la composición del
suelo, el clima, el método de cosecha,
almacenamiento poscosecha, así como al
muestreo y las prácticas de elaboración
(Friedman​ ​et​ ​al.,​ ​2009).
Porcentaje​ ​de​ ​humedad
El contenido de humedad de los alimentos
varía enormemente. El agua es un
constituyente principal en la mayoría de los
productos​ ​alimenticios.
Para calcular el porcentaje de humedad
presente en la hierbabuena se utilizará la
siguiente​ ​ecuación:
(peso inicial−peso f inal)
porcentaje de humedad = peso inicial
En el primer crisol el peso inicial fue de 2,0185
g​ ​y​ ​el​ ​peso​ ​final​ ​de​ ​0,2934​ ​g;​ ​en​ ​el​ ​segundo
crisol su peso inicial fue 2,0007 g y el peso
de final​ ​0,2907​ ​g.
Primer​ ​crisol
(2,0185−0,2934)g
% de humedad = 2,0185 g x100 = 85, 46%
Segundo​ ​crisol
% de humedad =
(2,0007−0,2907) g
x100 = 85, 47%
2,0007 g
Dado los resultados la hierbabuena tiene una
gran cantidad de humedad, se debe a que es
vegetal y los vegetales presentan en la
mayoría gran cantidad de humedad,
analizando los resultados, vemos que la
humedad es inversamente proporcional a la
concentración de polifenoles presentes en la
muestra problema, entonces la humedad es
un factor que afecta directamente la
concentración y también el coeficiente de
extinción​ ​experimental​ ​obtenido.
Por ende vemos el porque la cantidad tan
relativamente poca de polifenoles presentes
en​ ​la​ ​muestra​ ​problema​ ​(hierbabuena).
La cantidad de polifenoles promedio que se
son presentó fue de 80 μg/mL y el un porcentaje
de​ ​humedad​ ​alto​ ​(80%).
Respecto al coeficiente de extinción del ácido
gálico sabemos que a concentraciones altas la
linealidad se pierde y los resultados se
encontraron dos desfases muy grandes y por
ende esto afecta en gran parte al coeficiente
de extinción del ácido gálico, además la
cantidad de polifenol presente en la muestra
problema.
Para tener más claro cuál es el verdadero
coeficiente de extinción experimental se debe
emplear la fórmula de Lambert-Beer A= ε *c*l
porque el obtenido por la pendiente dela recta
da ε = 0, 00003 y este es un valor muy
pequeño, los posibles errores fueron
sistemáticos o experimentales al realizar mal
la concentración de la muestra problema
(hierbabuena).
x100 Nota:​A = Absorbancia de la muestra ,
c = concentración del cromóf oro, ,I​ ​= Longitud
del​ ​paso​ ​óptico​ ​que​ ​contiene​ ​la​ ​muestra.
CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA

Se concluye que la humedad es inversamente - Anzola Velasco, C., & López Rico , E. (2005).
proporcional a la concentración de polifenoles Guía de laboratorio de bioquímica. Bogotá,
en la muestra; ya que la humedad se Colombia: Universidad Nacional de Colombia,
encuentra entre los factores que alteran la Unilibros.
concentración​ ​de​ ​polifenoles.
Christian Gary, D. (2009). ​Química analítica.
El uso del espectrofotómetro permite McGraw-Hill. Obtenido de Tomado de
determinar la longitud de onda óptima de las http://www.ebooks7-24.com​.
soluciones.
Harris, D. (2001). ​Análisis Químico
Para la extracción de polifenoles es óptimo Cuantitativo.​ ​Barcelona,​ ​España:​ ​Reverté.
utilizar un disolvente polar prótico como el Skoog, D., & West , D. (2002). ​Introducción a
etanol​ ​,​ ​por​ ​su​ ​afinidad​ ​al​ ​ácido​ ​gálico. la Química Analítica. Barcelona, España:
Reverté,​ ​S.A.
La ley de Lambert- Beer se cumple para
solución diluidas; para valores de Bárcena Ruiz Antonio, N. A. (2009).
concentración altos, ε varía con la Espectrofotometría: Espectros de absorción y
concentración, debido a fenómenos de cuantificación colorimétrica de biomoléculas.
dispersión​ ​de​ ​la​ ​luz. Menéndez Pidal - Córdoba: Departamento de
Bioquímica​ ​y​ ​Biología​ ​Molecular.
Se observó experimentalmente que la l​ey de
Lambert-Beer establece que la absorbancia Guzmán, M. S. H.; Torres, P. I,;A.; Acosta, G.
está directamente relacionada con las J. A.; Miranda, L. R. y Guevara, L. R.
propiedades intrínsecas del analito, con su 2005.Potencial de plantas de uso común en
concentración y con la longitud de la México como fuente de compuestos fenólicos,
trayectoria del haz de radiación al atravesar la hierro y vitamina C. Agric. Téc. Méx.
muestra. 31(2):115-123.

Friedman,M.;Levin, C. E.; Lee, S. U. and

Kozukue, N. 2009. Stability of green tea
catechins in commercial tea leaves during
storage​ ​for​ ​6​ ​months.​ ​J.​ ​Food​ ​Sci.​ ​74(2):47-51.