PROCESO DE TEJIDOS Y CITOPREPARACIÓN

UNIDAD DIDÁCTICA 13

INCLUSIÓN DE PARAFINAS, MÁQUINAS PARA LA INCLUSIÓN

AUTOMÁTICA, DESPARAFINACIÓN.

1.- INCLUSIÓN EN PARAFINA. IMPREGNACIÓN.

2.- INCLUSIÓN EN PARAFINA. OBTENCIÓN DE BLOQUES.

3.- ORIENTACIÓN DE TEJIDOS PARA SU INCLUSIÓN.

3.1.- Consideraciones generales.

3.2.- Estructuras tubulares.
3.3.- Estructuras quísticas.
3.4.- Identificación de márgenes y superficies.
3.5.- Superficies epiteliales.
3.6.- Especimenes grandes y sólidos.
3.7.- Múltiples especimenes.

4.- INCLUSIÓN RÁPIDA.

5.- INCLUSIÓN AUTOMÁTICA. AUTOTECHNICON.

6.- DESPARAFINACIÓN.

7.- INCIDENTES MÁS COMUNES EN EL PROCESO DE INCLUSIÓN.

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1. INCLUSIÓN EN PARAFINA. IMPREGNACIÓN.

Las parafinas son mezclas complejas de carburos procedentes de la destilación del

petróleo. Son sustancias blancas, untuosas al tacto, insolubles en agua, en alcohol son
inactivas por lo que se pueden conservar indefinidamente y son sustancias sólidas a
temperatura ambiente y líquidas entre 45-60 ºC.

Una buena parafina debe ser homogénea, compacta y cortarse limpiamente. La impregnación
por la parafina se realiza al calor en una estufa regulada entre 56-60ºC.

La temperatura de la estufa debe ser constante, con el fin de permitir una penetración
homogénea de la parafina y evitar el cocido de las piezas.

Un termostato y un termómetro bien visibles son indispensables en la práctica.

Una impregnación, si está bien realizada, con dos baños de parafina nueva es suficiente.

2. INCLUSIÓN EN PARAFINA. OBTENCIÓN DE BLOQUES.

Para obtener los bloques de parafina se empieza por licuar perfectamente la parafina,
después utilizaremos unos moldes metálicos llamados paramoles o cápsulas en los cuales,
una vez bien limpios e impregnados en su interior con glicerina, se vierte la cantidad
necesaria de parafina licuada y colocamos inmediatamente la pieza dentro de esta parafina
con la ayuda de unas pinzas, dándole la orientación adecuada. En general, la superficie de la
pieza debe estar dispuesta plana sobre el fondo del recipiente y si se trata de múltiples
fragmentos se procurará reunirlos en un mismo plano.

La parafina se solidifica e inmoviliza la pieza junto con la etiqueta que le acompaña con su
número correspondiente, evitando así su pérdida. Para que la parafina adquiera una dureza
y consistencia uniforme es necesario un tiempo de 20-30 minutos.

Para obtener una solidificación rápida e intensa introduciremos el molde con su contenido
de parafina líquida, pero cuando su superficie este coagulada, en un recipiente con agua fría
o agua con hielo. Nosotros usamos la placa fría de la estación de inclusión.

Las dimensiones y forma del fragmento incluido están condicionados en general a las
dimensiones de los moldes. Normalmente se les da la forma de paralelepípedo rectangular,
dejando entre los bordes de la pieza 2-5 mm, de esta manera podrán hacerse bloques en
cinta.

El bloque, que es menos frágil que los cortes, guarda el documento base de una
enfermedad. Tenerlo localizado es imprescindible llegado el caso de tener que obtener
nuevas cortes o muestras.

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Cuando los cortes han sido realizados, el bloque debe ser sellado y cuidadosamente
ordenado y clasificado. La mejor clasificación es la numérica y horizontal en archivadores
especiales.

3.- ORIENTACIÓN DE TEJIDOS PARA SU INCLUSIÓN.

3.1.- Consideraciones generales.

Las secciones de tejido son incluidas perfectamente planas para asegurarse de que se
obtenga una sección completa. Use la presión justa para mantener la sección plana contra la
superficie del molde. Debe tenerse mucho cuidado para que después no aparezcan
artefactos causados por un manejo inadecuado de las muestras de tejido.

La orientación debe ser tal que la resistencia que el tejido ofrece a la cuchilla vaya de un
grado menor a uno mayor a medida que se vaya cortando el bloque. Esto hace que los
tejidos más duros no compriman los tejidos más blandos evitando por lo tanto secciones
irregulares. Debe tener un margen adecuado (2 mm mínimo) de medio de inclusión rodeando
el tejido por todos lados para que el apoyo al cortar sea el máximo posible.

3.2.- Estructuras tubulares.

Estructuras tubulares tales como vaso deferente, venas, arterias y oviducto deben ser
incluidas en una forma tal que la cuchilla corte a través de la luz tubular. La orientación
debería ser tan vertical corno sea posible. La cuchilla, entonces, deberá hacer los cortes en
una forma que sea perpendicular al eje longitudinal del tubo.

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3.3.- Estructuras quísticas.

Después de la disección, los quistes pequeños adoptan una forma de cúpula. Por lo tanto, los
quistes deben ser incluidos con la superficie de corte hacia abajo para que así la cuchilla
corte a través de todas las capas de la pared del quiste. Hay que asegurarse de que la
cúpula no atrape burbujas de aire.

3.4.- Identificación de márgenes y superficies.

Los tejidos que tienen los márgenes marcados con tinta china o con colorante deben ser
colocados en una forma tal que la tinta se pueda ver en el borde de la sección. Si hay
secciones múltiples, estas deben ser incluidas con la tinta siempre mirando hacia el mismo
lado del bloque para que las láminas queden mejor organizadas y para facilitar su estudio
bajo el microscopio.

La superficie que haya sido marcada con tinta china, es la que debe ser incluida en forma
opuesta a la superficie que se va a cortar con la cuchilla. La tinta, entonces, no se va a ver
en las secciones.

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3.5.- Superficies epiteliales.

Aquellos tejidos que tienen una superficie epitelial, como la piel, el intestino, la vesícula
biliar, la vejiga urinaria y el útero, deben ser colocados en forma tal que el plano de sección
pase a través de todas las capas del tejido. La superficie epitelial debe colocarse en la
parte más alta del bloque para que así sea la última en ser cortada. El acto de llegar al
epitelio al final de la moción de corte va a minimizar la presión que es causa de distorsión
de la capa epitelial. El cortar de último la capa de queratina reduce la compresión, los
rasguños y las cortadas de las capas subcutáneas.

Los especimenes, cuando son múltiples, deben ser incluidos uno junto al otro con sus
superficies epiteliales orientadas en la misma dirección.

Puede ser difícil el identificar la superficie epitelial cuando las biopsias de tejido son muy
pequeñas. Nosotros añadimos 5 ml de solución matriz de eosina alcohólica a la segunda de
tres soluciones de alcohol al 100 % en nuestro procesador de tejidos para teñir las capas
tisulares de un modo tal que las superficies epiteliales sean más fáciles de identificar. La
eosina se lava de las secciones de tejido durante la fase de rehidratación sin que esto
interfiera con el resto del proceso de tinción.

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3.6.- Especimenes grandes y sólidos.

Los especimenes rectangulares grandes o sólidos como el útero, la próstata, la glándula

tiroides, y el tejido óseo deben ser incluidos con un ligero ángulo en relación al borde de la
cuchilla. Esta comienza el corte con menos resistencia, reduciendo así la posibilidad de
desplazar el tejido fuera del bloque. La vibración e inestabilidad del borde de la cuchilla o
del bloque también se minimizan notablemente.

3.7.- Múltiples especimenes.

Múltiples fragmentos de tejidos blandos y ganglios linfáticos deben ser colocados uno junto
al otro con suficiente espacio entre ellos. Si los tejidos se colocan uno encima del otro,
existe la posibilidad de que el tejido de abajo distorsione el tejido que está encima. La
organización metódica de los tejidos hace que la lámina sea más fácil de estudiar y que se
vea más profesional que si los fragmentos se incluyen en desorden.

Los tejidos rectangulares pequeños deben ser orientados con su eje longitudinal casi
paralelo al borde de la cuchilla para minimizar los pliegues y la distorsión causados por
presión.

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4.- INCLUSION RÁPIDA.

El proceso de inclusión en parafina de una forma rápida debe ser realizado intentando
recortar o reducir la duración de las distintas fases del proceso de inclusión.

Las piezas para este fin tienen 3 mm de espesor, con este procedimiento se obtienen
preparaciones de calidad suficientemente buena para una buena orientación.

5. INCLUSIÓN AUTOMÁTICA. AUTOTECHNICON.

En los aparatos automáticos de inclusión, los diversos líquidos se encuentran en recipientes

dispuestos en círculo (unos 12 recipientes) con capacidad aproximada de un litro cada uno.

El transporte automático de las piezas de un recipiente a otro se realiza por medio de un

sistema cuyo programa se determina de antemano, y se puede variar según las necesidades.

Los dos últimos recipientes contienen parafina y pueden ser calentados, las piezas se
colocan en pequeñas cápsulas que a su vez se introducen en una cestilla. Esta cestilla tiene
un movimiento suave de rotación a fin de facilitar y acelerar el movimiento suave de
rotación a fin de facilitar y acelerar el proceso de impregnación de las piezas con los
distintos líquidos.

Con el aparato automático funcionando es posible incluir un gran número de piezas.

Después de este recorrido, cada pieza esta en condiciones de ser incluida en parafina.

6.- DESPARAFINACIÓN.

La desparafinación se realiza de dos maneras:

1º Pasando la pieza cortada del bloque por la estufa, y por medio del calor eliminamos
una cantidad importante de la parafina que contienen el corte.

2º Realizando una serie de baños, normalmente tres de varios minutos de duración

cada una con Xilol o Tolueno, eliminando de esta manera la parafina que pueda
quedar en los cortes antes de proceder a su rehidratación y coloración.

Entre baño y baño se recomienda el secado de la muestra para contaminar lo menos posible
el baño siguiente.

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7. INCIDENTES MÁS COMUNES EN EL PROCESO DE INCLUSIÓN.

6.1.- La pieza tiende a agrietarse y desengastarse del bloque.

Ocurre como consecuencia de:

¾ La pieza ha sido deshidratada mal.

¾ La pieza ha sido deshidratada muy rápidamente.
¾ La parafina estaba demasiado fría en el momento de la inclusión.
¾ La parafina del bloque se ha enfriado demasiado lentamente.

Solución:

¾ Rectificar los tiempos de deshidratación y aclaramiento.

¾ Comprobar temperatura de la parafina durante la inclusión.
¾ Proceder a un enfriamiento de la parafina más rápido.

6.2.- Los bloques son friables, granulosos y sembrados de manchas blancuzcas.

Ocurre como consecuencia de:

¾ La parafina es de mala calidad.

¾ La parafina ha sido utilizada muchas veces antes.
¾ Mezcla no homogénea de varias parafinas.
¾ Presencia de vapores de formol en el dispensador.

Solución:

¾ Rechazar esta parafina y realizar la inclusión en otra nueva.

6.3. Pasadas algunas semanas los bloques se incurvan y se agrietan.

Ocurre como consecuencia de:

¾ El Alcohol y/o el Xilol utilizados en la deshidratación y aclaración eran de mala

calidad, estaban contaminados o quizás estropeados.

Solución:

¾ En estos casos la pieza está generalmente perdida, no obstante intentar realizar

una nueva inclusión.

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