MONTAJE DE MUESTRAS PARA MICROSCOPÍA LEGAL.

MICROSCOPÍA

Hay muchas formas diferentes de microscopía, pero la más utilizada es la microscopía de

“campo claro”, donde la muestra se ilumina con un haz de luz que pasa a través de ella
(en lugar de un haz de electrones como en la microscopía electrónica). Los requisitos
generales para que una muestra se examine correctamente mediante microscopía de
campo claro son:

 Que las células y otros elementos de la muestra se conserven en estado “similar al

de la vida” (este proceso se denomina “fijación”)
 Que la muestra sea transparente en lugar de opaca, de modo que la luz pueda
pasar a través de ella
 Que la muestra sea delgada y plana, de modo que solo contenga una capa de
células
 Que algunos componentes se hayan coloreado (teñido) de forma diferenciada para
que puedan distinguirse claramente

PREPARACIÓN DE LA SECCIÓN

La mayoría de los tejidos frescos son muy delicados, y se deforman y dañan con facilidad.
Por lo tanto, es imposible preparar secciones finas (cortes) a partir de ellos a menos que
sea con algún tipo de soporte mientras se corta. Por lo general, la muestra también debe
conservarse o “fijarse” antes de preparar las secciones. En términos generales, hay dos
estrategias que se pueden emplear para proporcionar este soporte.

1.- El tejido puede congelarse rápidamente y mantenerse congelado mientras se cortan

secciones con un micrótomo de criostato (un micrótomo en una cámara de congelación).
Estas se denominan “secciones congeladas”. Las secciones congeladas se pueden
preparar muy rápidamente y, por tanto, se utilizan cuando se requiere un diagnóstico
intra-operatorio para guiar un procedimiento quirúrgico o cuando se debe evitar cualquier
tipo de interferencia con la composición química de las células (como en algunas
investigaciones histoquímicas).

2.- Alternativamente, las muestras pueden infiltrarse con un agente líquido que
posteriormente puede convertirse en un sólido que tiene propiedades físicas apropiadas
que permitirán cortar secciones finas de él. Se pueden utilizar varios agentes para infiltrar
y soportar las muestras, incluidas las resinas epoxi y metacrilato, pero las ceras
histológicas basadas en parafina son las más populares para la microscopía óptica de
rutina. Esto produce las llamadas “secciones de parafina”. Estas secciones se suelen
preparar con un micrótomo “de rotación”. “De rotación” describe la acción de corte del
instrumento. En todos los laboratorios de histopatología, las secciones de parafina se
preparan de forma rutinaria a partir de casi todas las muestras y se utilizan en el
diagnóstico.

Los siguientes párrafos describen los pasos principales en la preparación de secciones de

parafina. Estos pasos generalmente dictan el diseño y el flujo de trabajo en grandes
laboratorios especializados en histopatología donde se manipulan cientos de muestras
cada día.
FIJACIÓN

La fijación es un paso crucial en la preparación de muestras para el examen

microscópico. Su objetivo es evitar la descomposición y preservar las células y los tejidos
en un estado “similar al de la vida”. Esto se consigue deteniendo la actividad enzimática,
matando microorganismos y endureciendo la muestra mientras se mantiene una
estructura molecular suficiente para permitir la aplicación de métodos de tinción
adecuados (incluidos los que implican reacciones antígeno-anticuerpo y los que dependen
de la conservación del ADN y el ARN). Cuanto antes se inicie la fijación tras la separación
de una muestra de su riego sanguíneo, mejor será el resultado. El agente fijador más
popular es el formaldehído, normalmente en forma de solución tamponada con fosfato (a
menudo denominado “formol”). Idealmente, las muestras deben fijarse mediante
inmersión en formol de seis a doce horas antes de ser procesadas.

PROCESAMIENTO

Cuando se procesan grandes lotes de muestras para la preparación de secciones de

parafina, se utilizan instrumentos automatizados denominados “procesadores de tejidos”.
Estos instrumentos permiten infiltrar las muestras con una secuencia de diferentes
disolventes que terminan en parafina derretida. Para empezar, las muestras se
encuentran en un entorno acuoso (basado en agua) y deben someterse a múltiples
cambios de disolventes deshidratantes y aclaradores (normalmente etanol y xileno) antes
de que puedan colocarse en parafina fundida (que es hidrofóbica e inmiscible con agua).
La duración y los detalles del paso del “programa de procesamiento” elegido para un lote
concreto de muestras dependerán de la naturaleza y el tamaño de las muestras. Las
programaciones pueden ser de tan solo una hora para muestras pequeñas o de hasta
doce horas o más para muestras grandes. En muchos laboratorios, la mayor parte del
procesamiento se realiza durante la noche. En la actualidad, existe una presión
considerable sobre los laboratorios para utilizar procesadores rápidos en un esfuerzo por
mejorar el flujo de trabajo y reducir los tiempos de procesamiento.

INCLUSIÓN

Tras el procesamiento, las muestras se colocan en un centro de inclusión, donde se

retiran de sus casetes y se colocan en moldes rellenos de parafina. En esta fase, las
muestras están cuidadosamente orientadas porque esto determinará el plano a través del
cual se cortará la sección, lo cual, puede acabar determinando si un área anormal será
visible en el microscopio. El casete en el que se ha procesado el tejido lleva los detalles
de identificación de la muestra, y ahora se coloca sobre el molde y se fija añadiendo más
parafina. El “bloque” de la muestra ahora se solidifica en una superficie fría y, cuando se
haya asentado, se retira el molde. El casete, ahora lleno de cera y formando parte del
bloque, proporciona una base estable para la sujeción en el micrótomo. El bloque que
contiene la muestra ya está listo para ser cortado.

CORTE

Las secciones se cortan en un instrumento de precisión llamado “microtomo” con hojas de

acero extremadamente finas. Las secciones de parafina se cortan normalmente con un
grosor de 3 - 5 μm, lo que garantiza que solo incluyan una sola capa de células (un
eritrocito tiene un diámetro de aproximadamente 7 μm). Una de las ventajas de la cera de
parafina como agente de inclusión es que a medida que se cortan las secciones, estas se
pegan de borde a borde, formando una “cinta” de secciones. Esto facilita la manipulación.

Ahora las secciones se “ponen a flotar” sobre la superficie de agua caliente en un baño de
flotación para aplanarlas y luego se recogen en preparaciones de microscopio. Después
de un secado completo, están listas para la tinción.

TINCIÓN

Aparte de algunos pigmentos naturales como la melanina, las células y otros elementos
que componen la mayoría de las muestras son incoloros. Para poder revelar los detalles
estructurales mediante microscopía de campo claro, se requiere cierta tinción. La tinción
rutinaria utilizada universalmente como punto de partida para proporcionar información
estructural esencial es la tinción con hematoxilina y eosina (H&E). Con este método, los
núcleos celulares se tiñen de azul, y el citoplasma y muchos componentes extracelulares
en tonos de rosa. En histopatología, muchas afecciones pueden diagnosticarse mediante
una sola tinción de H&E. Sin embargo, a veces se requiere información adicional para
proporcionar un diagnóstico diferencial completo, y esto requiere técnicas de tinción más
especializadas. Estas pueden ser “tinciones especiales” que utilizan colorantes o
impregnaciones metálicas para definir estructuras o microorganismos particulares,
o métodos inmunohistoquímicos (IHC) que implican la localización de proteínas útiles
desde el punto de vista diagnóstico mediante anticuerpos marcados. También pueden ser
necesarios métodos moleculares como la hibridación in situ (ISH) para detectar
secuencias específicas de ADN o ARN. Todos estos métodos pueden aplicarse a
secciones de parafina y, en la mayoría de los casos, las preparaciones producidas son
completamente estables y pueden conservarse durante muchos años

Después de la tinción, las secciones se cubren con un cubreobjetos de vidrio y luego se

envían a un patólogo que las analizará con un microscopio para realizar un diagnóstico
adecuado y preparar un informe.

OPCIONES DE PREPARACIÓN

Debido a los requisitos de microscopía, las opciones para preparar las muestras están
limitadas a las siguientes:

 Montajes completos, donde un organismo o estructura completo es lo

suficientemente pequeño o lo suficientemente delgado como para colocarse
directamente en un portaobjetos de microscopio (p. ej., un pequeño organismo
unicelular o multicelular o una membrana que se puede estirar finamente sobre un
portaobjetos)
 Preparaciones “de aplastamiento”, en las que las células se aplastan
intencionadamente en un portaobjetos para revelar su contenido (p. ej., muestras
botánicas en las que las células se rompen para revelar cromosomas)
 Frotis, en los que la muestra consta de células suspendidas en un líquido (p. ej.,
sangre, semen, líquido cefalorraquídeo o un cultivo de microorganismos) o en los
que las células individuales se han raspado, cepillado o aspirado (succionado) de
una superficie o de un órgano (citología exfoliativa). Los frotis son la base de la
 conocida “prueba de Papanicolaou”, que se utiliza para detectar el cáncer
cervicouterino en mujeres.
 Cortes en los que las muestras cuentan con alguna forma de soporte para que se
puedan cortar cortes muy finos de ellas, montar la preparación en el portaobjetos y
teñirse. Las secciones se preparan utilizando un instrumento llamado “micrótomo”.

De estas opciones, solo los montajes completos y las secciones conservan las relaciones
estructurales entre células individuales y componentes extracelulares. Las preparaciones
de frotis y de aplastamiento proporcionan detalles sobre células individuales y números de
células relativos, pero se pierden las relaciones estructurales. La preparación de
secciones es el método más complicado desde el punto de vista técnico de estos
métodos, ya que requiere equipos especializados y una experiencia considerable. El
examen microscópico de las secciones por parte de un patólogo forma la piedra angular
del diagnóstico de cáncer. Aunque la metodología para preparar secciones de material
animal y vegetal es similar, la siguiente descripción se refiere a tejidos animales
(humanos).

MONTAJE
El montaje de las muestras en el microscopio es a menudo crucial para la visión exitosa.
El problema se ha prestado mucha atención en los últimos dos siglos y es una zona muy
desarrollada con muchas técnicas especializadas y, a veces muy sofisticados.
MONTAJE EN SECO
En un montaje en seco, el tipo más sencillo de montar, el objeto no es más que colocar en
la diapositiva. Una hoja de cubierta se puede colocar en la parte superior para proteger la
muestra y el objetivo del microscopio y para mantener la muestra y se presiona todavía
plana. Este montaje se puede utilizar con éxito para ver las muestras como el polen,
plumas, pelos, etc. también se utiliza para examinar las partículas atrapadas en los filtros
de membrana transparente.
EN FRESCO O MONTAJE TEMPORAL
En un montaje húmedo, la muestra se coloca en una gota de agua u otro líquido
contenido entre la corredera y la hoja de la cubierta por la tensión superficial. Este método
se utiliza comúnmente, por ejemplo, para ver los organismos microscópicos que crecen
en el agua del estanque o de otros medios líquidos, especialmente cuando el estudio de
su movimiento y el comportamiento. Se debe tener cuidado para eliminar las burbujas de
aire que puedan interferir con la visualización y dificultar los movimientos de los
organismos. También se utiliza para investigaciones rápidas que no se requiera un
registro permanente, así como para examinar líquidos fisiológicos como la sangre, la
orina, la saliva, el semen, y la secreción vaginal.
MONTAJE PREPARADO O MONTAJE PERMANENTE
Para la investigación patológica y biológicas, la muestra por lo general se somete a una
preparación histológica compleja que puede involucrar el corte en secciones muy finas
con un micrótomo, que se fijan a prevenir la caries, la eliminación de cualquier agua
contenida en ella, la tinción partes específicas del mismo, la limpieza para que sea
transparente, e impregnando o infiltrante con alguna sustancia sólida transparente. Como
parte de este proceso de la muestra por lo general termina bien conectado a la
diapositiva.
MONTAJE STREW
MEDIOS DE MONTAJE
El medio de montaje es la solución en la que se incrusta la muestra, generalmente bajo
una cubierta de vidrio. Líquidos simples como agua o glicerol pueden considerarse
medios de montaje, aunque el término generalmente se refiere a compuestos que se
endurecen en un montaje permanente. Los medios de comunicación populares de
montaje incluyen Permount, glicerol gelatina y medio de montaje de Hoyer. Propiedades
de un buen medio de montaje incluyen tener un índice de refracción cercano al del vidrio,
no reactividad con la muestra, estabilidad en el tiempo sin cristalizar, oscurecimiento, o el
cambio de índice de refracción, la solubilidad en el medio de la muestra se preparó en, y
no causar la muestra de la mancha a desaparecer o lixiviación.
EJEMPLOS DE MEDIOS DE MONTAJE ACUOSO
Popularmente se emplea en cito química inmunofluorescencia donde la fluorescencia no
puede ser archivado. El almacenamiento temporal debe hacerse en una cámara húmeda
oscura. Los ejemplos más comunes son:

 El glicerol-PBS con antiquench por ejemplo, cualquiera de los siguientes

 p-fenilendiamina
 galato de propilo
 1,4-diazabiciclo-octano
 El ácido ascórbico
 Mowiol o Gelvatol
 Gelatina
 Monte
 Vectashield
NO ACUOSA:
Se utiliza cuando se requiere un montaje permanente

 Bálsamo de Canadá
 DPX
 DPX nueva
 Entellan
 Entellan nueva
 Neo-Mount
EN CONTRASTE CON OTROS TIPOS/SIGNIFICADOS DE "MONTAJE"
A diferencia de montaje necesario para cubreobjetos de vidrio, montaje algo similar se
puede hacer para la conservación de la muestra más voluminoso en contenedores de
vidrio en los museos. Sin embargo, un tipo totalmente diferente de montaje está hecho
para Electron_microscope # Sample_preparation que puede ser para los materiales
biológicos o no biológicos, y se subdivide en los procesos de montaje de tipo "frío"
"caliente" y. Aunque el nombre "montaje", que se asemeja más a la incorporación de la
histología y no debe ser confundido con el montaje descrito anteriormente. El montaje en
otros campos término tiene muchos otros significados que están parcialmente indexadas
en esta página de desambiguación en el montaje.