MANUAL

PRÁCTICO
DEL
LABORATORIO
DE
ANATOMÍA PATOLÓGICA

2n CURS.
 RECEPCIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA.

Cuando el laboratorio recibe una muestra para analizar se procederá de la

siguiente manera:

1) La fijaremos en formol en proporción 1:20 para detener los fenómenos de

autólisis y putrefacción derivadas de la muerte celular con el fin de minimizar los
cambios en su estructura y lograr que el patólogo pueda valorarla.

Corazones de cordero fijados en formol

2) Mientras se completa el proceso de fijación, procederemos al registro de la

muestra.
Se reflejara, de forma inmediata, en el libro de registros del laboratorio la filiación
del paciente, el servicio de procedencia y la fecha y hora de procedencia del
material. Imprescindible otorgar a cada muestra un número correlativo por orden
de recepción.

3) Una vez tenemos nuestra muestra totalmente fijada continuamos con

su preparación. Dependiendo del tipo de muestra se procederá a abrirla y vaciar su
contenido en un recipiente de medición, extraer el líquido de los quistes y
sustituirlo por líquido fijador.

4) Tallado. Es en este paso donde se realiza el estudio macroscópico de la

muestra, la descripción de esta detalladamente (dimensiones, lesiones, morfología,
aspecto, coloración...) y por último la selección de las áreas representativas.
Los fragmentos tienen que tener un tamaño no superior a 3/5 m.m. de espesor para
facilitar la infiltración de la parafina.
Posteriormente se introducirán en cestillas.

2
 Selección de áreas representativas. Bisturí.

Cestillas/Casetes.

5) En el caso de que se requiera, se le aplicará a la muestra un decalcificante (a

excepción de Bouin, líquido decalcificante y fijador).

PREPARACIÓN DE DECALCIFICANTE (KOH Hidróxido Potásico):

- 5 gr. de KOH.
- 50 c.c. de agua destilada.

3
 INFILTRACIÓN EN PARAFINA.

Comenzamos el protocolo con la fijación en formaldehido al 4%, la cual se

encarga de detener los procesos de autolisis y putrefacción.

En segundo lugar introduciremos los fragmentos de tejido en casetes identificados

para posteriormente pasarlos a la procesadora.

Procesadora.

En este aparato se llevaran a cabo las siguientes etapas:

- Final de la fijación: El formol termina de infiltrarse en el tejido.
- Deshidratación: Mediante una serie de alcoholes en graduación creciente se
elimina el agua del tejido para su mejor conservación.
- Aclaramiento: Dos baños de xilol se encargan de eliminar el alcohol de la
muestra, ya que no es miscible con la parafina.
- Infiltración: Se sumerge el tejido en dos baños de parafina líquida caliente para
que esta se infiltre en el tejido.

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Cálculo de concentraciones alcohol-agua.
- 70%: (70·200)/100=140 ml OH y enrasar con H2O hasta 200 ml.
- 80%: (80·200)/100=160 ml OH y enrasar con H2O hasta 200 ml.
- 96%: (96·200)/100=192 ml OH y enrasar con H2O hasta 200 ml.
- 100%: (100·200)/100=200 ml OH.
Para finalizar, extraemos el cestillo de la procesadora.

Cestillo de la procesadora con las muestras en sus casetes

Trasladamos los casetes a la estación de confección de bloques y llevamos el

cestillo de la procesadora a la estufa para limpiar la parafina.

5
 CONFECCIÓN DEL BLOQUE.

La estación de confección de bloques de parafina tiene como finalidad solidificar

la muestra a fin de proporcionarle la consistencia y homogeneidad adecuadas para
obtener secciones translúcidas muy delgadas aptas para la coloración y
observación microscópica.

Estación de inclusión en parafina.

Los pasos a seguir normalmente son:

1) Cogemos las muestras ya embebidas en parafina del casete, situado en la parte

izquierda del aparato (una zona caliente).
Desechamos la tapa e introducimos los fragmentos de tejido en un molde metálico
adecuado a su tamaño.

Abrimos el casete para sacar la muestra.

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2) Se debe orientar las muestras de forma correcta teniendo en cuenta su posterior
corte.
Colocar el molde bajo el dispensador de parafina líquida. Regular adecuadamente
la cantidad de parafina que se desea para cada momento.
En este caso solo deseamos crear una fina capa de parafina en el fondo.

Aplicación de la base de parafina.

3) Trasladamos el molde a la zona fría y presionamos con las pinzas ligeramente,

le colocamos el casete de la forma indicada en la fotografía y, sujetándolo en el
aire sin tocar de nuevo la zona caliente, se rellena hasta arriba de parafina.

Orientación de la muestra

4) Por último lo trasladamos a la placa fría para su solidificación.

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 Dispensador de parafina rellenando un molde y placa de frío.

Antes de retirar el molde metálico, debemos de asegurarnos que la parafina está

sólida, de lo contrario se estropearía el bloque.

*Son necesarios el mantenimiento y limpieza de los instrumentos (eliminación de

tejidos y parafina).

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 EL MICROTOMO.

Un microtomo es un instrumento que provoca el corte gracias a una

transformación de un movimiento de rotación en otro de ascenso y descenso del
portamuestras. En el movimiento de bajada del portabloques se produce un
acercamiento hacia la cuchilla según el espesor del corte seleccionado.

Microtomo de rotación de cara y perfil.

Procederemos a enumerar las diferentes partes del microtomo:

a) Cuchilla fija a un pedestal

b) Bloque de inclusión (parafina o celoidina) fijado a un brazo móvil en la

vertical.

c) La pinza portabloques efectúa un movimiento vertical delante del filo de la

cuchilla (gracias al movimiento del volante)

d) Un volante movido a mano da la oscilación vertical y la regularidad.

e) Un sistema de ruedas dentadas regulares asegura el avance o retroceso del

bloque. Se encarga de la igualdad de grosor de los cortes.

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 Pinza de sujeción del bloque.

Cuchilla.

Material necesario:

1) Pinzas, de punta gruesa y fina.

2) Punzón.

3) Pinceles.

4) Brocha.

5) Palancana con hielos.

6) Cuenco con agua fría.

7) Baño de agua caliente (50ºC). Es recomendable tener un termómetro para

controlar su temperatura.

10
 Material necesario.

Pasos a seguir:
1) Dejar enfriar el bloque en la palancana con hielos.

2) Montar ajustar el bloque sobre el microtomo y preparar la cuchilla.

3) Desbastado de la muestra a 15 micras para dejar la superficie totalmente lisa.

4) Volver a dejar enfriar el bloque.

5) Una vez enfriado y vuelto a colocar, se pueden obtener mediante el corte

secciones individuales o seriadas unidas por las caras paralelas a las cuchillas.

6) Manipularlas con pinceles o lancetas.

7) Corta fragmentos de la cinta que contengan 1 o 3 cortes.

8) Llevar las tiras hasta el baño de agua fría para que se extiendan (hidrofobia de
la parafina).

9) Recogerlos con un porta y llevarlos a otro baño con agua caliente.

10) Recoge sobre el portaobjetos definitivo orientándolo como proceda.

11) Apoyar el porta sobre una placa calefactora (el borde del baño) durante 10
minutos para que se adhiera el pegamento.

12) Si es posible deja los cortes en la estufa overnight para que se sequen y
adhieran completamente.

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 Muestra enfriándose en palangana con hielos.

Alumno cortando con el microtomo de rotación.

Ventajas e inconvenientes del microtomo de rotación:

- Ventajas: Muy preciso. Permite obtener cortes/secciones seriados muy finos.
- Inconvenientes: Es muy caro. No permite cortar tejidos incluidos en celoidina,
gelatina ni propilenglicol.

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 PROTOCOLOS DE TINCIONES
HEMATOXILINA EOSINA.

Esta tinción es una de las más utilizadas en laboratorios de anatomía patológica.

Consta de dos colorantes:
 Hematoxilina
De carácter catiónico o básica, por lo que tiñe estructuras ácidas (basófilas) en
tonos azul y púrpura.
 Eosina.
Tiñe componentes básicos (acidófilas) en tonos de color rosa, gracias a su
naturaleza aniónica o ácida.

Reactivos hematoxilina y eosina.

Estructuras que tiñe:

 Núcleo celular: Violeta
 Citoplasma: Rosa
 Musculatura: Rojo, rosa o fucsia
 Glóbulos rojos: Rojo, anaranjado
 Fibrina: Rosa

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Protocolo:

1) Previamente tendremos que elaborar un filtro para la hematoxilina.

2) Desparafinar las muestras.

Este paso se realiza en dos tandas: la primera en la estufa 60ºC durante 10 min.
y posteriormente líquido intermedio, Xilol, tres baños de 10 min. cada uno.
Asegurarse durante todo el proceso que los diferentes reactivos cubran por
completo las muestras de no ser así, agitar el cestillo con las muestras de forma
vertical, de arriba a abajo.

Una vez finalizado este paso, no olvidar escurrir el cestillo en papel empapante
con la intención de evitar contaminar los diferentes reactivos.

Estufa.

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 Muestras en la estufa a 60ºC

3) Hidratar con una batería de alcoholes a concentraciones decrecientes (de 100%

al 50%) tres minutos por cada coplin de alcohol.
Ir observando la superficie del cristal.

Un par de coplins de alcoholes.

4) Agua, en nuestro caso la utilizamos del grifo ya que el agua de Palma es rica en
calcio.
En este paso es imprescindible prestar atención a la superficie del cristal. Agitar
enérgicamente el cestillo hasta que en esta no se encuentre uniforme.

5) Hematoxilina, tiempo estimado de 3-5 min.

Unos segundos antes de que finalice el tiempo tendremos que transportar el coplin
con la hematoxilina y las muestras a la pila, donde pasaremos el cestillo a otro
coplin y rellenaremos este de agua del grifo a chorro constante hasta que el agua
salga transparente.

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 Hematoxilina en la pila con el chorro de agua cayendo.

Tener la precaución de evitar que el chorro de agua no incida directamente en las

muestras, ya que esto podría dañar las muestras.

El chorro a un lado sin dañar las muestras

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 Añadir agua hasta que salga transparente.

Una vez el agua del coplin se aprecie transparente se trasladará de nuevo a la mesa
de tinción para continuar con el protocolo.

6) Diferenciación con ácido clorhídrico.

En este caso, la estancia de las muestras en el reactivo será muy rápida.

7) Neutralización con bicarbonato.

Debido a nuestra localización geográfica, en nuestro laboratorio utilizamos agua
del grifo.

8) Eosina, de 30 segundos a 3 min.

9) Lavar en agua corriente.

Este proceso también será con la mayor rapidez posible, de lo contrario se podría
perder el color.

10) Deshidratación a concentraciones crecientes de alcohol (del 50% al 100%).

Desde los 50-96% las muestras estarán en contacto con el líquido una vez durante
30 segundos, mientras que al 100% se dejarán reposar las muestras en tres coplins
diferentes durante 10 min cada uno.

11) Líquidos intermedios, Xilol.

Tres coplins diferentes y cinco min. por cada coplin.

12) Para finalizar montaremos las muestras con líquido de montaje Eukitt.

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 Líquido de montaje.

Muestras recién montadas.

DIFERENCIACIÓN (elegir una de las siguientes mediante pases por):

a) Ácido clorhídrico:
- Alcohol 70 º + 0.25 c.c. HCl.
b) Agua Amoniacal (NH3):
- 8 a 10 gotas amoníaco en agua destilada.
c) Alcohol Ácido 1 %:
- Etanol 95 º (97 c.c.) + Ácido Clorhídrico (3 c.c.)
d) Ácido acético 2 %: 10 a 20 seg.

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Protocolo esquemático:

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 TRICRÓMICO DE MASSON.

Es una técnica de coloración especial que permite visualizar claramente las fibras
de colágeno tipo I, también evidencia, aunque en menor intensidad, las fibras
reticulares.

En esta técnica se emplean tres colorantes para diferenciar el núcleo celular,

el citoplasma y las fibras de colágeno: Hematoxilina, fucsina de Ponceau y azul de
Anilina.

Mesa de tinción tricrómico.

 Núcleos: AZUL OSCURO.

 Citoplasmas, queratina, fibras musculares, eritrocitos: ROJO (rosado).
 Colágeno y fibras de reticulina (colágeno III): AZUL CLARO o verde
(depende del colorante).

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Protocolo:

1) Desparafinación en la estufa 60ºC durante 10 min. y posteriormente en líquido

intermediario, Xilol, en tres coplins diferentes durante 5 min. cada uno.

2) Hidratación con alcoholes en concentraciones decrecientes, del 96%, 80% y

60%, un min. cada uno.

3) Lavar con agua corriente.

Es conveniente mirar la superficie de los cristales para asegurarse de que la
muestra está totalmente hidratada.

4) Hematoxilina durante 5 min.

Previamente filtrada.
Unos segundos antes de que acabe el proceso trasladar el coplin a la pila, rellenar
otro coplin con agua del grifo donde depositaremos las muestras y aplicaremos el
chorro de agua hasta que ésta salga transparente.

Chorro de agua incidiendo en esquina del coplin.

Posteriormente volver a la bancada de tinciones con el coplin y las muestras.

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5) Fucsina de Ponceau 5 min.
A continuación se aplicará un baño de agua corriente hasta eliminar el exceso de
colorante y después otro de agua acética 1% muy rápido.

6) Ácido fosfomolibdico 5 min.

Posteriormente baño en agua acética 1%

7) Azul de Anilina 10 min.

A continuación se aplicará un baño de agua corriente.
Después otro de agua acética 1%.
Y para finalizar agua corriente.

8) Deshidratar con alcoholes a concentración creciente, 60%, 60% y 80% rápido y

un baño de 100% durante 5 min.

9) Xilol tres pasos de 5 min. cada uno.

10) Medio de montaje.

22
Esquema:

23
 MAY-GRÜNWALD GIEMSA (MGG)

La tinción de May-Grünwald Giemsa es utilizada por la mayor parte de los

citólogos que estudian preparaciones por PAAF.

Esta técnica combina los principios de coloraciones desarrollados por May-

Grünwald y Giemsa, usando 2 soluciones colorantes:

a) Solución May-Grünwald: Contiene eosina (colorante aniónico/ácido) y azul de

metileno (colorante catiónico), en solución alcohólico, concretamente disueltos en
metanol.

b) Solución Giemsa: Contiene Eosina, azul de metileno y productos derivados de

la oxidación del azul de metileno.

Los componentes celulares se clasifican por esta tinción en:

a) Componentes aniónicos (ácidos): al unirse a los tintes catiónicos se tiñen en

tonos azules. Serán estructuras basófilas.

b) Componentes catiónicos (básicos): se unirán a la eosina, tiñendo en varios

tonos rojizos o anaranjados. Son los componentes acidófilos o eosinófilos.

Estructuras que tiñe:

 Núcleos: azul púrpura

 Citoplasmas: violeta pálido o marrón.
 Si la aplicamos sobre sangre, veremos:
 Gránulos de los neutrófilos: violeta marrón
 Gránulos de los eosinófilos: naranja
 Gránulos de los basófilos: azul-negro
 Gránulos de linfocitos: púrpura

24
Protocolo:

1) Prepararemos una bandeja con varillas para apoyar las extensiones citológicas.

2) Fijación: Aplicar a los frotis secos (secados al aire) con una micropipeta
solución de May-Grünwald durante 3 minutos.

3) Sin lavar, aplicar agua destilada para diluir la solución de May-gründwald*1 y

dejar actuar otros 3 minutos.

4) Giemsa: Sin lavar, escurrir el colorante sobre la preparación y aplicar solución

de Giemsa durante 20 minutos. Retirar y escurrir.

5) Lavar el frotis con abundante agua destilada.

6) Limpiar el dorso de la preparación.

7) Secar al aire dejando las preparaciones inclinadas con un ángulo de unos 45º y
la extensión por la parte interior (minimizamos “gotas” sobre la muestra).

8) Montar de la manera habitual.

*Debemos saber que la solución de May-Grünwald se prepara a partir de MG

comercial en polvo, a una concentración del 0,25% en metanol (P/V) y la solución
extemporánea de Giemsa se preparar a partir de Giemsa comercial líquido, a razón
de 1 gota por cm3.

25
Esquema:

26
 PANÓPTICO RÁPIDO

Se utiliza principalmente para la tinción de frotis sanguíneos, y en AP para las

PAAFs.

Esta técnica permite diferenciar los principales tipos celulares que encontramos en
sangre o en citologías.

Se comercializa como un kit que incluye 3 líquidos diferentes:

1. Líquido 1 FIJADOR: Solución alcohólica de triarilmetano.
2. Líquido 2 Colorante ÁCIDO (rojo): Solución tamponada de
xanteno.
3. Líquido 3 Colorante BÁSICO (azul): Solución tamponada de
tiazina.

Reactivos.

a) Los colorantes catiónicos (básicos) se unirán a las estructuras ácidas-basófilas,

y quedarán en tonos azulados.
b) Los colorantes aniónicos (ácidos) —fundamentalmente la eosina— se unirá a
las estructuras básicas-acidófilas-eosinófilas.
c) Los componentes celulares que tienen afinidad por ambos tipos de colorantes,
quedaran en tonos violeta.

Resultado en muestras hematológicas:

 Eritrocitos: color rosa pálido a beige.

 Plaquetas: color violeta claro.
 Neutrófilos: núcleo violeta oscuro, citoplasma violeta claro con gránulos
violeta oscuro.
 Basófilos: núcleo violeta oscuro, gránulos violeta oscuro.
 Eosinófilos: núcleo violeta oscuro, citoplasma violeta con gránulos
rojizos- violeta.
 Linfocitos: núcleo violeta oscuro, citoplasma un poco más claro.
 Monocitos: núcleo violeta oscuro, citoplasma un poco más claro.

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 Citología

Protocolo para extensiones de sedimento urinario:

1) Obtener orina en un bote de recogida (bote de boca ancha con tapón

habitualmente verde o rojo).

2) Descartar la primera parte de la micción y recoger el resto.

3) Tomar 8 ml. de orina y transferirlos a un tubo de centrífuga.

28
4) Centrifugar a 1500-2000 r.p.m. durante 10 minutos.

5) Eliminar el sobrenadante (con una pipeta Pasteur iremos eliminando

progresivamente y lo devolveremos al bote de orina).

6) La última gota la usaremos para resuspender el sedimento, lo recuperaremos

SIN DESPEGAR LOS DEDOS TOTALMENTE DE LA PIPETA, y la
depositaremos sobre un porta, cerca del extremo.

7) Con ayuda de otro porta, la extenderemos.

8) Dejamos secar al aire.

9) Teñimos con panóptico rápido.

Protocolo tinción:

1) Realizaremos una buena extensión de orina, que dejaremos secar al aire.

2) Preparamos la batería de tinción etiquetando tres cubetas Coplin, que llenamos

con los líquidos del kit en el orden establecido o cuatro cubetas en el caso que
deseemos lavar con agua en esta última.

Reactivo 1: Fijación: 5 inmersiones de 1 segundo (introducir el porta en la cubeta

durante un segundo y sacar, repetir 5 veces), escurrir en papel empapante.
Reactivo 2: 5 inmersiones de 1 segundo, escurrir en papel empapante.
Reactivo 3: 5 inmersiones de 1 segundo, escurrir en papel empapante.

3) Lavado: Ponemos el porta bajo el chorro del agua, de manera que no incida
directamente sobre las células para no deteriorar la extensión o sumergimos en la
cuarta cubeta llena de agua.

4) Secado: al aire, posición 45º inclinada y con la extensión hacia la cara interior.
No es necesario montar. Si se desea conservar, llevar a xilol y montar con resina
(Eukit).

29
Esquema:

30
 PAPANICOLAOU (PAP)

La tinción policrómica de Papanicolaou, ha sido y sigue siendo la tinción de rutina

por excelencia para citología y citopatología.

Reactivos:

1) Hematoxilina:
Colorante básico que tiñe el núcleo por el carácter ácido que le proporcionan los
ácidos nucleicos. Tiñe principalmente el núcleo de las células, y el citoplasma
queda ligeramente manchado.

2) Orange G:
Colorante ácido que tiñe el citoplasma de algunas células que son un poco más
densas, como las queratinizadas y los hematíes (por la hemoglobina que
contienen). Los citoplasmas quedan teñidos de tonos naranjas.
Cuanto más anaranjado quede teñido el citoplasma, más “vieja” y terminal es la
célula.

Resultado:
 Núcleos celulares: azules, negros, a veces violeta oscuro.
 Cromatina nuclear: azul.
 Núcleos de leucocitos (generalmente macrófagos): azul oscuro (los
citoplasmas no se aprecian).
 Citoplasma de las células eosinófilas superficiales (y acidófilas en
general): rosa, a veces rosarojizo/anaranjado.
 Citoplasma de las células con queratina: rojo-anaranjado o naranja.
 Citoplasma de las células cianófilas intermedias o superficiales (basófilos):
azul, a veces verdoso.
 Eritrocitos: rojos.

31
Protocolo:

Previamente tendremos que elaborar un filtro para filtrar la hematoxilina.

Utilizaremos células de muestra vaginal que citocentrifugaremos.
Fijaremos en etanol 96ºC durante 15-30 minutos.

Citocentrífuga.

A continuación aplicaremos la tinción:

1) Hidratar con una batería de alcoholes a concertaciones decrecientes (de 100% a

50%) tres minutos por cada coplin de alcohol, ir observando la superficie del
cristal.

2) Agua, utilizaremos la del grifo ya que el agua de Palma es rica en cal. Será muy
importante observar la superficie del cristal, hasta que este quede uniforme.

3) Hematoxilina de Harris. De 3 a 5 minutos (depende de su maduración).

Unos minutos antes de que finalice el tiempo, tendremos que transportar el coplin
con la hematoxilina y las muestras a la pila, donde pasaremos el cestillo a otro
coplin que llenaremos con agua del grifo a chorro constante (sin que incida
directamente sobre la muestra) hasta que el agua salga trasparente, es entonces
cuando lo llevaremos de vuelta a la mesa de tinción.

32
4) Diferenciar con alcohol clorhídrico 5 segundos.

5) Neutralizar con Carbonato de Litio 45 segundos o en nuestro caso, al tener

aguas tan ricas en calcio, utilizaremos agua del grifo.

6) Lavar con agua del grifo rápidamente ya que de no ser así podrían haber
perdidas de color.

7) Deshidratar con alcoholes a concentraciones crecientes (del 50% a 100%)

dejaremos actuar en cada coplin 30 segundos, mientras que en los alcoholes al
100% dejaremos actuar 10 minutos cada uno.

8) Orange G, de 3-6 min o 3 pases de 2 min.

9) Alcohol al 96% 2 pases de 1 min.

10) EA-50 o 65 de 3-6 minutos.

11) Etanol 96º 2 pases de 1 minuto.

12) Xilol 2 pases de 1 minuto.

13) Montar con Eukit.

33
Esquema:

34
 TINCIÓN DE GIEMSA

Es un método habitual para el examen de frotis sanguíneos, cortes histológicos y

otro tipo de muestras biológicas.

Resultados:
 Eritrocitos: Rojo ladrillo
 Núcleos celulares: Morado
 Granulaciones especificas: Rojo, rosa o morado
 Citoplasmas: De rosa al azul (efecto giemsa)
 Hueso: Azul
 Bacterias y parásitos: Azul, menos las rikettsias que se ven violetas

Protocolo:

1) Desparafinar.
En la estufa 10 min a 60ºC o toda la noche a 37ºC.

2) Líquido intermediario, Xilol.

3) Hidratar aplicando alcoholes en concentraciones decrecientes (96% - 50%).

4) Sumergir en agua destilada (o de grifo) para que la muestra se hidrate, ya que la

mayoría de los tintes tienen una base acuosa.

5) Solución de Giemsa (filtrada y comercial, o al 30% en agua destilada) durante

1 hora, a Tª ambiente.

6) Se lava con agua hasta que rebose.

7) Lavar con agua acética al 2% varias veces rápidamente, aunque puede llegar
hasta 30 segundos (diferenciación).

8) Se lava con agua corriente hasta que rebose.

35
9) Deshidratar con alcohol isopropílico (propanol) (2 cambios al menos) No usar
etanol.

10) Se sumerge en las distintas cubetas de xilol durante 5 minutos cada una.

11) Tras este proceso, ya se puede montar. En el montaje, la muestra teñida y

humedecida (del coplin de xilol) se cubre con un cristal (cubre) que se pega con
producto llamado Entellan®, intentando la formación de burbujas de aire, lo que
daría lugar a artefactos al observar en el microscopio.

36
 TINCIÓN PAS (PERIÓDICO ÁCIDO DE SCHIFF)

La modificación química del tejido consiste en la oxidación mediante el ácido

periódico (HIO4) de los enlaces entre los carbonos próximos que contienen grupos
hidroxilos (glicoles vecinales).

Esto provoca la formación grupos aldehídos que serán reconocidos por el reactivo
de Schiff, el cual se combinará con ellos para dar un color rojizo brillante.

Entre los componentes del reactivo de Schiff está la pararosanilina, un

componente de la fucsina básica, tratada con ácido sulfúrico; el compuesto final se
denomina ácido sulfofucsídico.

Oxidamos los alcoholes que están en posición 1,2 glicol a carbonilo, que
reaccionarán con el reactivo de Schiff al haberse convertido en grupos aldehído.

Una gran ventaja de la tinción histoquímica P.A.S. es su capacidad de

discriminación de tipos de glúcidos distintos, con pequeñas modificaciones de la
técnica.

Reactivos:
1. Ácido Periódico: 0.5 % p/v.
2. Reactivo de Schiff: o Fucsina básica (CI: 42510): 1g.
3. Solución de agua sulfurosa: o Baño de Ácido Sulfuroso o Agua
sulfurosa: o Ácido Clorhídrico (HCl) 1N: 5 ml.
4. Metabisulfito sódico 10 %: 6 ml.
5. Agua (d): 100 ml.
6. Colorante de contraste: Hematoxilina, Orange G o Van Gieson.

Preparación:

1) Fijación: Formol al 4 % o Líquido de Carnoy o Bouin.

2) Disolver la fucsina en 200 ml de agua destilada hirviendo.

3) Dejar enfriar hasta aproximadamente 50º C. y filtrar.

4) Posteriormente agregar 20 ml de HCl 1N. Después enfriar hasta 25º C y añadir

1g de Bisulfito sódico o Metabisulfito potásico (sódico).

5) Mantener en la oscuridad. El liquido tarda unos 2 días o a veces 24h en tornarse

de color amarillo que indica que está listo para su uso.

6) Añadir 2g de carbón activado, mezclar y filtrar hasta que desaparezca el color.

7) La solución debe conservarse en el refrigerador protegido de la luz.

37
Técnica de Tinción:

1) Desparafinar e hidratar (xilol y decrecientes alcoholes).

2) Ácido periódico 0.5 % durante 5 min.

3) Lavar en agua destilada.

4) Reactivo de Schiff durante 15- 30 min.

5) Aclarar en 3 baños de agua sulfurosa durante 2 min. Cada uno.

6) Lavar en agua corriente.

7) Colorante de contraste.

8) Lavar con agua corriente.

9) Deshidratar, aclarar y montar.

Resultados:

Material PAS +: rojo oscuro a magenta.

Compuestos PAS +
 Polisacáridos simples: como el glucógeno y la celulosa.
 Mucopolisacaridos neutros: se encuentran en el epitelio gástrico, en
glándulas del duodeno y en cápsulas bacterianas, también en intestino y estómago.
 Mucoproteínas como son algunas mucinas del tubo digestivo y del árbol
respiratorio o bronquial, también la tiroglobulina que está en el tiroides y otras
hormonas
 Glucoproteínas del suero
 Glucolípidos: como los gangliósidos y cerebrosidos.

* Los mucopolisacaridos ácidos no pueden ser oxidados por el ácido periódico y

por eso son PAS - (ya que no aparecen los grupos carbonilos).

Controles de la técnica del PAS:

Es imprescindible realizar preparaciones testigo o de control que confirmen los
resultados obtenidos, para ello suelen ser muy útiles las técnicas de bloqueo:
 Bloqueo de grupos aldehídos en general
 Acetilación de grupos aldehídos situados en posición 1,2 glicol.

38
 TINCIÓN HEMATOXILINA EOSINA INTRAOPERATORIA

1.- Se sumerge el corte con Hematoxilina durante 1 min.

2.- Pases de agua corriente.
3.- Eosina durante 30 seg.
4.- Pases en alcohol de 96 º.
5.- Pases en alcohol de 96 º.
6.- Pases por alcohol absoluto.
7.- Pases por alcohol absoluto.
8.- Pases por xilol.
9.- Pases por xilol.
10.- Montar en D. P. X.1

TINCIÓN RÁPIDA DE HEMATOXILINA EOSINA

1.- Agua destilada.

2.- Hematoxilina de Harris 60 seg.
3.- Lavar en agua corriente.
4.- Pases rápidos en alcohol ácido de 3 a 4 seg.
Alcohol ácido 1 % = etanol 95 º (97 c.c.) + Ácido clorhídrico (3 c.c.)
5.- Lavar con agua corriente.
6.- Pases en agua amoniacal de 5 a 7 seg.
7.- Lavar con agua corriente.
8.- Eosina 30 seg.
9.- Alcohol 96 º.
10.- Alcohol 96 º.
11.- Alcohol 100 º.
12.- Alcohol 100 º.
13.- Xilol.
14.- Xilol.
15.- Montar con DPX.

1
Del inglés Distyrene Plasticizer Xylene.

39
 TINCIÓN DE GRAM
Las bacterias poseerían una cápsula rica en grupos sulfhidrilos, susceptibles de
formar enlaces estables con el violeta de metilo.
Reactivos:
a) Solución acuosa de violeta de metilo al 1%.
b) Solución yodada de Gram:
Yodo sublimado: 1 gr.
Yoduro potásico: 2 gr.
Agua destilada: 100 ml.
Tintura de yodo:
Yodo sublimado: 2 gr.
Yoduro potásico: 2 gr.
Agua destilada: 2 gr.
Alcohol etílico 90º: 74 ml.
Disolver el yoduro potásico en el alcohol en caliente. Añadir el yodo y disolver.
d) Solución alcohólica yodada:
Tintura de yodo: 1 ml.
Alcohol etílico absoluto: 99 ml.
e) Rojo nuclear al 1%.
Procedimiento:
1. Desparafinar los cortes histológicos.
2. Hidratar hasta llegar al agua destilada.
3. Aplicar Violeta de metilo al 1% durante 3 minutos.
4. Añadir solución yodada de Gram durante 3 minutos.
5. Lavar bien los cortes con agua corriente.
6. Diferenciar con solución alcohólica yodada hasta que deje de salir color.
7. Lavar en agua corriente durante 3-5 minutos.
8. Contrateñir con rojo nuclear al 1% durante 2 minutos.
9. Lavar con agua corriente.
10. Aclarar con alcohol absoluto hasta eliminar el exceso de rojo nuclear. Secar
con papel de filtro.
Resultados:
- Bacterias Gram +: Azul-Negro.
- Bacterias Gram -: Rojo.
- Núcleos: Rojo.

40
 TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN
Control
1.- Carbol-Fucsina 30 minutos en estufa2 a 60 º C.
2.- Lavar en agua corriente de 3-5 minutos.
3.- Alcohol-ácido
- 990 c.c. 70º
- 10 c.c. HCl.
(Muy bien lavado; cambiarle hasta que deje de soltar colorante que éste quede
transparente).
4.- Lavar bien con agua.
5.- Si se contrasta con azul de metileno durante 1 minuto; y si utiliza
hematoxilina biopsias durante 30 segundos.
Solución stock o madre:
- Azul de metileno 1.4 c.c.
- Alcohol de 96º 98.6 c.c.
Solución de trabajo:
- Stock 1 c.c.
- Agua destilada 9 c.c.
6.- Lavar con agua.
7.- Deshidratar.
8.- Montar.
La tinción de Zielh-Neelsen permite diferenciar la composición celular de la pared
bacteriana. En la decoloración éste es el punto crítico, en esta etapa se establece la
diferencia entre las bacterias ácido-alcohol-resistente de las que no lo son. Con la
decoloración se arrastra la fucsina fenicada al exterior de las células las No ácido
alcohol resistentes, éstas quedan incoloras, mientras que las bacterias ácido
alcohol resistentes, el colorante no sale de la célula, por lo que quedan de un color
rosa3.

2
Los reactivos que se utilizan en estufa su tiempo de reacción se reduce, pero el reactivo pierde
calidad y su cambio debe ser más frecuente.
3
Referencia: el tejido del portaobjetos, debemos verlo bien transparente.

41
 Método de Mowry

El método de Mowry es una técnica de tinción descrita por Mowry para la

demostración de la presencia de mucopolisacáridos.

Fundamento
Ciertas mucinas del tejido conjuntivo son capaces de absorber el hidróxido férrico
coloidal, poniendo el hierro de manifiesto por medio del azul de Prusia. Esta
técnica se combina en la actualidad con el PAS. Se deben realizar secciones
dobles, puesto que en determinadas ocasiones esta tinción se ve dificultada debido
a otras sustancias diferentes como los mucopolisacáridos, que se ven atraídos por
las partículas metálicas, perdiendo su utilidad histoquímica. Se utiliza
extensivamente en el estudio de neoplasias epiteliales renales, así como
granulomas en la piel.

Preparación de la muestra
Los mejores resultados se obtienen cuando la preparación está fijada en formol,
incluida en parafina y seccionada a 6 micras.

Reactivos
Los reactivos necesarios para la realización de esta técnica son los siguientes:
1. Solución de hidrato de hierro acético (solución stock):
1. 250 cc de agua destilada en ebullición.
2. 4,4 cc de solución acuosa de cloruro férrico 39%.
2. Solución de trabajo:
1. 4 cc de solución stock.
2. 1 cc de ácido acético 12%.
3. 3 cc de agua destilada.
3. Solución de ferrocianuro clorhídrico (mezclar a partes iguales):
1. Ferrocianuro potásico 2%.
2. Ácido clorhídrico 2%.

Procedimiento
1. Desparafinar e hidratar muestras.
2. Enjuagar en ácido acético 12%, 30 segundos.
3. Añadir solución de trabajo, 1 hora.
4. 4 baños en ácido acético 12%, 3 minutos cada uno.
5. Añadir solución de ferrocianuro clorhídrico, 20 minutos.
6. Añadir agua corriente, 5 minutos.
7. Tinción de contraste con rojo nuclear, 5 minutos.
8. Lavar con agua destilada.
9. Deshidratar, aclarar y montar.

Resultados
 Mucopolisacaridos ácidos: azul.
 Núcleos: rojo.
 Citoplasma: amarillo.

42
 TÉCNICAS DEL AZUL DE PERLS
METODOS PARA LA IDENTIFICACION Y TINCION DE PIGMENTOS E
IONES METÁLICOS (HIERRO).
En el interior de los tejidos el hierro se puede depositar de 2 formas: En forma
iónica, o formando sales ferrosas y férricas, por lo general en forma de cloruros o
hidróxidos. Como hierro ligado a proteínas.
La técnica del azul de Perls es la de mayor importancia para detectar hierro, ya
que el hierro férrico es el más frecuente en los tejidos. El fundamento de esta
técnica se basa en la propiedad que tiene el ferrocianuro potásico, para
transformarse en presencia de hierro férrico en ferrocianuro férrico, o azul de
Prusia por acción del ácido clorhídrico que actúa como desencadenante de la
reacción.
CL3Fe Ferrocianuro potásico + HCL Ferrocianuro férrico.
TÉCNICA.
Fijación: cualquier fijador es válido. Se pueden utilizar secciones en parafina o
improntas.
Soluciones:
Ferrocianuro K al 10 % (conservar en nevera).
Ácido clorhídrico:
- Ácido clorhídrico concentrado................ 2 ml.
- Agua destilada.................................... 98 ml.
Solución de ferrocianuro K, ácido clorhídrico: mezclando a partes iguales la
solución 1 y 2. Se debe preparar inmediatamente antes de su uso.
Procedimiento:
Desparafinar e hidratar.
Tratar con la mezcla de ferrocianuro K, ácido clorhídrico............ 10 min.
Lavar con agua destilada (el Fe se ve azul). Se puede contrastar con una solución
rojo nuclear al 1 %........... 2 - 3 min.
Deshidratar, aclarar y montar.
Resultados:
- Hierro férrico: azul.
- Núcleos: rojo.
Observaciones: el tiempo de tinción depende de la cantidad de hierro existente en
los tejidos.

43
 CONFECCIÓN DE BLOQUE CELULAR

Material necesario:

- Centrifugadora.
- Agar comercial listo para usar.
- Formol, agua destilada.
- Casete.
- Tubo de ensayo.
- Microondas.
- Pipeta y pinzas.

Procedimiento:

- Disolver el agar en el microondas.

- Fijar el sedimento, después de centrifugar y eliminar el sobrenadante con formol
o líquido de Bouin.
- Coger el material con pinzas o pipeta y ponerlo en un molde metálico junto con
el agar líquido.
- Esperar que se solidifique.
- Con ayuda de una pinza o la pipeta, sacar la muestra del molde, colocarla en un
casete.
- Al salir de la máquina hay qué deshidratar (70 º, 80 º, 96 º, 100 º).
- Procesar como un bloque histológico.

Aquí describimos la técnica de agar americano:

- Para bloques de biopsia.

- 100 c.c. de agua bidestilada + 3 gr. de Agar Americano. Hervir cuando es
nuevo, dejar enfriar un poco y mezclar con el sedimento.

El agar debe estar a 60 ºC. Comprobar con termómetro. Dejar enfriar, poner
número de biopsia y procesar en máquina —procesador de muestras tisulares—
para posteriormente ser incluidas en parafina y para poder ser cortadas con el
microtomo, cómo si se tratara de una muestra tisular.

AGAR:
- 25 c.c. de agua destilada + 0.8 gr. de Agar; 30 c.c. de agua destilada + 0.96
gr. de Agar.
- Llevar a Ebullición.
- Dejar enfriar.

44
 DESTEÑIR UNA CITOLOGÍA

1.- De xilol4 a alcoholes decrecientes

2.- Alcohol Absoluto 5 min.

3.- Alcohol Absoluto 5 min.

4.- Alcohol 96º 5 min.

5.- Alcohol 96º 5 min.

6.- Alcohol 70º 5 min.

7.- Agua destilada 10 min.

8.- Empezar de nuevo la técnica o hacer una técnica especial.

Otra manera de hacerlo:

1.- De xilol5 a alcoholes decrecientes

2.- Alcohol Absoluto 5 min.

3.- Alcohol Absoluto 5 min.

4.- Alcohol 96º 5 min.

5.- Alcohol 96º 5 min.

6.- Alcohol 70º 5 min.

7.- Agua destilada 10 min.

8.- Meter en alcohol ácido hasta que se destiña o permanganato potásico 0.5 %
durante 5 min.

9.- Lavar con agua.

10.- Ácido oxálico 2 % durante 1 min.

11.- Lavar con agua.

12.- Empezar de nuevo la técnica o hacer una técnica especial.

4
Si es antigua, dejar que el xilol actúe, haciendo los cambios necesarios. Dejar que el
cubreobjetos caiga por si sólo y poner de nuevo un xilol limpio.
5
Si es antigua, dejar que el xilol actúe, haciendo los cambios necesarios. Dejar que el
cubreobjetos caiga por si sólo y poner de nuevo un xilol limpio.

45
 ELIMINACIÓN DE RESIDUOS

AMARILLO/ CONTENEDOR BIOLÓGICO DE SEGURIDAD: materiales

punzantes y cortantes.

GARRAFA BLANCA: reactivos.

GARRAFA AZUL: citostáticos (Formol en una garrafa).

CONTENEDOR CUADRADO NEGRO: restos orgánicos y/o casetes o tapas de

casetes con parafina.

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