Criostato o criotomo:
Colocado en un mueble frigorfico con una tapadera en la parte superior y tiene una
manivela que se mueve desde fuera consta de un micrtomo de tipo Minot. Semejante al
convencional de parafina que est incluido en una cmara de congelacin permite obtener
cortes de material sin fijar a -20C o incluso a -60.
La manivela que controla la realizacin del corte est fuera mientras que la cuchilla y el
mecanismo de avance est dentro de la cmara fra. La obtencin de secciones seriadas es
posible gracias a la existencia de un sistema antienrrollamiento que obliga al corte a
deslizarse sobre la superficie de la cuchilla, en los mas modernos es posible optar por el
corte manual o motorizado, as como enfriar rpidamente la muestra, a menos 60C por
medio de isopentano o nitrgeno lquido.
Ventajas:
1. Con el se obtienen cortes mas delgados que con el micrtomo de congelacin de 4
micras o incluso 2 que se utiliza no solo para intras en estudios histoenzimticos o
inmunohistoqumicos o en grasas. Se realiza primero 1 debastado de 10-20 micras se corta
generalmente a 5. En ste caso la pieza saldr al revs que con el microtomo de rotacin, o
de tipo Minot.
Criotomo, criostato (microtomo de congelacin)
El microtomo de congelacin (llamado tambin criostato o criotomo) corta rebanadas de
material congelado, encajado en un microtomo de rotacin estndar encerrado en un a
cmara fra. Los tejidos estn congelados (generalmente -35C) y encajados en una matriz
soporte basada en agua. A diferencia de las microtcnicas estndar, el tejido no est
infiltrado con la matriz sino que ms bien est rodeada y soportada por ella. Los cortes se
realizan en una cmara fra establecida generalmente a -14 a -20C (dependiendo del
contenido en agua; menor temperatura para menor contenido en agua/mayor contenido en
lpidos). Los cortes pueden realizarse tan finos como 12 mm hasta 40 mm (o ms). Los
cortes congelados son tiles para la inmunolocalizacin o estudios de localizacin de
enzimas. Una buena temperatura para la tincin para material vegetal son -14C. Los tejidos
frgiles deben ser imbibidos antes de su congelacin bien en gelatina (10% acuosa) o
agarosa (2% acuosa). Infiltra los tejidos, fijar con fijador PFA para entrecruzar el tejido a la
matriz, despus encastrar en OTC como sigue.
Para preparar los tejidos para cortes con el criotomo, cortar en piezas pequeas y ponerlas
en una gota de compuesto de soporte en una matriz de soporte. La mayora de criostatos
tiene una plataforma externa fra de montaje sobre la que se asientan las matrices de
montaje durante la preparacin. Los tejidos pueden ser previamente congelados en
nitrgeno lquido y a continuacin encastrados en OTC. Como el OTC enfra, manipular
cuidadosamente el tejido para corregir la orientacin (derechas para realizacin de cortes
transversales, horizontales para cortes longitudinales). Continuar aadiendo un poco de
OTC al tiempo hasta que el tejido est completamente encastrado en una matriz congelada.
Una vez que la matriz est completamente congelada, recorta el bloque en un cuadrado o un
trapezoide. Deberr recordar dnde estaba el tejido aproximadamente dentro del bloque, ya
que el OTC se torna opaco cuando se congela. despus del encastrado, equilibrar el bloque
dentro de la cmara del criostato hasta que el tejido congelado en LN
2
est congelado. Si el
tejido muestra dao severo por congelacin, considerar el incluir un crioprotector como el
DMSO, glicerol, PVP soluble, o hidroxietil almidn (HES).
Para cortar el tejido, transferir el bloque al microtomo y permitir su equilibrado a la
temperatura de la cmara antes de empezar a cortar. Durante ese tiempo, Poner la cuchilla
de microtomo (equilbrada a la temperatura) en el portacuchillas y ajustar la placa
antirotacin. La placa antirotacin es una placa de plstico que est configurada en seccin
transversal de forma parecida a una viga en I. Cuando la placa est puesta tocando la
cuchilla del microtomo, y directamente sobre la superficie del microtomo, el centro de la
"I" forma una fina ranura a travs de la cual el corte fresco resvala. Los cortes congelados
se enrollan completamente cuando la paca est ausente o mal colocada.
Cuando las rebanadas con cortadas forman tiras cortas que se deslizan sobre la cuchilla.
Evitar hacer tiras que sean demasiado largas, ya que probablemente se caern antes de que
tengas una oportunidad de cogerlas. Las tiras o los cortes deben cogerse con un frceps
enfriado o fijadas a portaobjetos calentados. Poner el portaobjetos clido sobre los cortes y
ellos saltarn al portaobjetos y se fundirn sobre ellos. Los cortes deben ser fijados
entonces qumicamente o tratado para ensayos enzimticos o para inmunolocalizacin. Las
criosecciones no estn consideradas como permanentes, pero pueden hacerlas
semipermanentes aadiendo al margen el cubreobjetos laca de uas o vaspar.
Funcionamiento
1. Enfriar la escena de montaje a -35C presionando el botn de "enfriamiento rpido" y
esperar 10-15 minutos hasta que la escena alcance temperatura.
2. Verter una pequea cantidad del compuesto OCT en la matriz de montaye de manera que
se enfriar y crear una plataforma.
3. Una vez que la plataforma se ha congelado, aadir ms OCT a la plataforma y poner el
tejido dentro del OTC. Cuando el OTC se congele, manipular cuidadosamente el tejido para
corregir la orientacin (vertical para secciones transversales, horizontal para cortes
longitudinales). continuar rodeando el tejido hasta que la muestra est completamente
encastrada en OCT slido.
4. Con una cuchilla fra, desbastar el bloque a un cuadrado o trapezoide amplio. Debers
recordar aproximadamente dnde est el tejido dentro del bloque, ya que el OCT se vuelve
opaco cuando est congelado.
5. Transferir el bloque al microtomo y dejar unos 10 minutos para que el bloque se
equiilbre a la temperatura de la cmara. Con la mayora del material vegetal empezar a
cortar a -14C.
6. Ajustar la placa antienrollamiento pulsando directamente contra la cara de la cuchilla y
ligeramente bajo el margen de la cuchilla.
7. Realizar cortes de 15-40 mm de grosor.
8. Las tiras o los cortes deben ser cogidas con un forceps fro o fijadas a portaobjetos de
cristal calentados. Poner los portaobjetos a temperatura ambiente sobre los cortes y ellos
saltarn al portaobjetos y se fundirn sobre l.
