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Ao de la Consolidacin del Mar de Grau

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO


FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL Y RECURSOS
NATURALES

MICROBIOLOGA GENERAL
OBSERVACION E IDENTIFICACION MICROSCOPICA DE BACTERIAS
EXAMEN DIRECTO Y COLORACION SIMPLE

ALUMNO:

Aguirre Torres Roger Alvaro

PROFESORA: Suyo Loayza Beatriz.


SEMESTRE:

2016-B

OBSERVACION E IDENTIFICACION MICROSCOPICA DE BACTERIAS


EXAMEN DIRECTO Y COLORACION SIMPLE
MARCO TERICO
COLORANTE: Un colorante es una sustancia que es capaz de teir las fibras vegetales y
animales. Los colorantes se han usado desde los tiempos ms remotos, emplendose para
ello diversas materias procedentes de vegetales (crcuma, ndigo natural, etc.) y de
animales (cochinilla, moluscos, etc.) as como distintos minerales.
CROMOGENO: Los agentes cromgenos son sustancias coloreadas, finamente divididas
y, como consecuencia de ello, con un fuerte poder de tincin de las restantes partculas a
las que se fijan superficialmente.
CROMOFORO: Los grupos cromforos son los grupos funcionales de la molcula
responsables de la absorcin. Principalmente son: dobles y triples enlaces carbonocarbono, sistemas aromticos, grupo carbonilo, imino (C=N), diazo (N=N), nitro y enlaces
C-Y (Y es un tomo con pares libres).
CLASES DE COLORANTES:
De acuerdo a su origen
COLORANTES NATURALES:
La distincin entre natural y artificial, trminos muy utilizados en las polmicas sobre la
salubridad de los alimentos, es de difcil aplicacin cuando se quiere hablar con propiedad
de los colorantes alimentarios. En sentido estricto, solo sera natural el color que un
alimento tiene por s mismo. Los colorantes naturales son considerados en general como
inocuos y consecuentemente las limitaciones especficas en su utilizacin son menores
que las que afectan a los colorantes artificiales.
COLORANTES ARTIFICIALES:
Como ya se ha indicado, el coloreado artificial de los alimentos es una prctica que data de
la antigedad, pero alcanz su apogeo con el desarrollo en el siglo XIX de la industria de
los colorantes orgnicos de sntesis; ya en 1860 se coloreaba el vino en Francia con
fucsina; ms adelante se colorearon los macarrones y la mantequilla con dinitrocresol, etc.
En los ltimos aos la preocupacin por la seguridad de los alimentos, y la presin del
pblico, ha llevado a muchas empresas a revisar la formulacin de sus productos y
substituir cuando es tecnolgicamente factible los colorantes artificiales por otros naturales.
Adems, aunque en general son ms resistentes que los colorantes naturales, los
colorantes sintticos presentan tambin problemas en su uso; por ejemplo, en muchos
casos se decoloran por accin del cido ascrbico, efecto importante en el caso de las
bebidas refrescantes, en que esta substancia se utiliza como antioxidante.
De acuerdo a su composicin
Bsicos: son sales en las que la base aporta el color, mientras que la parte cida es
incolora. Tienen apetencia por sustancias cidas del tejido como el ADN o ciertos
componentes de la matriz extracelular como los glicosaminoglicanos. As, ponen de

manifiesto el ncleo y el ARN, sobre todo el ARNr presente en los ribosomas por ser muy
abundante, as como ciertas matrices extracelulares ricas en componentes cidos.
Ejemplos de colorantes bsicos son la tionina, safranina, azul de toluidina, el azul de
metileno o la hematoxilina
cidos: son sales con el anin coloreado y la base incolora. Tienen apetencia por
sustancias bsicas, sobre todo estructuras proteicas localizadas en el citoplasma celular y
tambin por el colgeno de la matriz extracelular. Ejemplos de colorantes cidos son la
fucsina cida, verde rpido, naranja G o la eosina.
Neutros: poseen una porcin cida y otra bsica, ambas con capacidad para aportar color.
Por tanto, un mismo colorante puede teir tanto las partes bsicas como las cidas de los
tejidos. Por ejemplo, el eosinato de azul de metileno.

METODOS DE COLORACION
COLORACION SIMPLE
La TINCIN SIMPLE es la tincin en que se utiliza un solo colorante. Como colorantes
utilizaremos el azul de metileno o la safranina, ambos de naturaleza bsica. La tcnica es
la siguiente:
1. Hacer el frotis, secarlo y fijarlo.
2. Cubrir con colorante la preparacin y dejarlo actuar durante un minuto.
3. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.
4. Secar al aire y observar al microscopio con el objetivo de inmersin (100x) empleando el
aceite apropiado.
Esta tcnica permite observar la morfologa y tamao de las bacterias, as como los tipos
de agrupaciones que forman.
Azul de metileno (Tincin positiva). Permite teir el interior celular. Tie microorganismos
procariticos (vivos o muertos). Los eucariticos slo se tien si estn muertos. Algunas
estructuras, como los corpsculos metacromticos, se tien ms intensamente con este
colorante que el resto de la clula.
Tincin negativa:
Es una tcnica que permite contrastar las muestras mediante una sustancia opaca a los
fotones (microscopa ptica) o a los electrones (microscopa electrnica). Este mtodo de
tincin utiliza colorantes neutros o cidos ya que tienen poca afinidad por la clula
bacteriana.
La tincin negativa facilita las observaciones de la morfologa y tamao de las bacterias as
como la observacin de la cpsula en algunas especies bacterianas. La cpsula es una
estructura superficial mucosa, ms o menos gruesa que envuelve la pared celular formada
por polisacridos o polipptidos, que confiere proteccin a las bacterias contra la
desecacin y la fagocitosis. A consecuencia de su elevado contenido en agua, se tien
dbilmente por los colorantes.

Azul de Lactofenol
La tincin de Azul de lactofenol se emplea para observar hongos.
Es una tincin simple (un slo colorante) y como tal est basada en la afinidad del
colorante por componentes de las clulas, en este caso por las estructuras fngicas.
El azul de lactofenol tiene tres caractersticas que lo hacen especial para observar dichas
estructuras en los hongos del tipo moho obtenidos en los cultivos por aislamiento.

CUESTIONARIO
1. Mencione los factores que afectan toda tcnica de tincin.
Pureza del colorante. - a mayor grado de impurezas mayor error y menor calidad
de tincin.
Concentracin del colorante. - a mayor concentracion mayor error en la tincion;
igual que a menor concentracin.
El pH del colorante. - este es un factor fundamental ya que depende de las
estructuras que se desee observar para elegir el pH adecuado.
Conservacin del colorante. - se debe conservarse en lugares frescos, secos, y
obscuros; envasados y etiquetados.
Tcnica Empleada. - se deber seguir rigurosamente paso a paso cada tcnica de
tincin.
Temperatura. - en la mayora de los casos se utiliza la temperatura ambiental, pero
si existe algunas tcnicas que requieran de temperatura adecuada.
Cantidad de la muestra. - Deber ser representativa y homognea pero no muy
grande.
Realizar correctamente el frotis.- se debe fijarse bien para que cuando se les
aada los colorantes mordientes y decolorantes no arrastren a los microorganismos
que se desee observar.
Soluciones mordientes. - en ciertos casos son necesarios ya que actan como
fijadores y ayudan a la fijacin del colorante a las correspondientes estructuras.
Tiempos de Tincin. - es necesario que todas las sustancias se mantengan en la
preparacin un tiempo preciso y variable segn la tincin.
2. Describa los componentes de un colorante.
Los colorantes son los elementos principales de las tinciones generales. Son
molculas que poseen tres componentes importantes: un esqueleto incoloro, que
normalmente es un anillo aromtico de benceno, al cual se le unen dos tipos de
radicales: uno que aporta el color, denominado cromforo, y otro que posibilita la
unin a elementos del tejido denominado auxocromo. Al conjunto de estos tres
elementos unidos en una molcula se denomina cromgeno.
Las molculas de colorante deben reaccionar con componentes celulares bien por
uniones no covalentes (innicos, puentes de hidrgeno, hidrofbicas) o covalentes.
El pH de la solucin del colorante puede determinar la extensin de la tincin

mientras que la reactividad de una molcula colorante con el tejido es dependiente a


mendudo del cambio.
Las tinciones no covalentes, particularmente asociaciones inicas, cueden ser
inestables y el colorante puede perderse del tejido, resultado en una tincin dbil.
Adems, las diferencias en el pH y la concentracin en sales dentro del tejido
pueden dar como resultado en tinciones diferenciales. Por tanto, la interaccin
inica de la molcula colorante al componente del tejido puede ser inherentemente
inespecfica, y depende del estado inico de la molcula diana (componente celular)
y el ambiente en el cual la diana resida.
Los colorantes catinicos ("colorantes bsicos") son atrados a los componentes
celulares que son cidos de forma natural (cargados negativamente, basoflicos).
Ejemplos son la Safranina O, Cristal Violeta, acetocarmn, y Azul de Toluidina O.
Colorantes aninicos ("colorantes cidos") son atrados por componentes celulares
que son bsicos (cargados positivamente; acidfilos). Un ejemplo es el Verde
Rpido FCF, que preferentemente tie componentes tales como la celulosa y el
citoplasma. Otros colorantes cidos son el Naranja G y el Azul de Anilina.
3. Indique a que se denomina MORDIENTE, mencione algunos ejemplos.
El trmino mordiente se refiere a cualquier compuesto, aadido antes o despus de
la tincin, que realza las propiedades de tincin de un colorante. Los mordientes son
generalmente metales como el manganeso, crmico, alumnico. Sin embargo, un
mordiente tambin debe ser un compuesto tal como el cido actico o el pcrico que
es aadido para lavar la solucin para realzar el brillo de una tincin como la eosina
o el eritrosin (cido actico) o colorante violeta (cido pcrico). Los tomos metlicos
(ligando) pueden formar un complejo multitomo con molculas de agua in situ.
Durante la tincin, algunas de estas molculas de agua pueden ser intercambiadas
por los grupos ligando de la molcula colorante formando un quelato entre el
colorante y el metal, al que se refieren algunas veces como "lago".
Tradicionalmente, los metales quelantes se han denominado mordientes, y han sido
usados para facilitar la tincin principalmente de cidos nucleicos. Los dos
complejos colorantes/mordiente ms comunes son las tinciones nucleares
Hematoxilina y Gallocianina, y el metal quelante usado puede ser Al3+, Fe3+/2+ o
Cr3+. El agente quelante puede determinar la selectividad del colorante. La
Hematoxilina-cromica es especfica para cidos nucleicos, pero tie ms bien poco.
La Hematoxilina Frrica tie rpidamente, pero puede producir una tincin de fondo
mayor.
4. Por qu es importante el colorante y las coloraciones.
Paul Ehrlich (1879) fue el primero en teorizar sobre los mecanismos de la tincin
histolgica al informar que tanto los colorantes como los componentes del tejido
deban presentar sitios cargados elctricamente y que sera natural que interacten
por unin inica. Sin embargo, el investigador fundamentalista Gustav Mann (1902)
puntualiz que los mtodos de tincin slo tienen importancia cuando permiten

observar y analizar las diversas estructuras del tejido y agreg que aquel concepto
general no puede constituir la base terica de las coloraciones, debido a la gran
variabilidad molecular que hay en el tejido y al escaso avance terico que la qumica
haba desarrollado hasta entonces, por falta de precisin metodolgica.

5. Realice esquemas de lo observado.

COLORACIN TINTA
CHINA

AZUL DE LACTOFENOL, USADO


PARA OBSERVAR LOS
ESPORANGIOS EN LOS RHIZOPUS.