Facultad de Ciencias de la Salud

Departamento de Ciencias

COLORANTES Y COLORACIONES EN MICROBIOLOGIA

SECCIÓN DE POSTGRADO DE CIENCIAS DE LA COMUNICACIÓN

 OBJETIVOS
• Que el alumno aprenda las técnicas de preparación
de frotis, fijación y coloraciones más utilizadas en el
estudio microbiológico ya sea a partir de muestras
directas o de cultivos bacterianos.
• Identifique las diferentes formas bacterianas y de
importancia clínica.
• Conocer el fundamento de las respectivas
coloraciones asi como la aplicabilidad de las mismas.
 FLUJOGRAMA DEL TRABAJO EN MICROBIOLOGIA MEDICA

MUESTRA

COLORACION Y
OBSERVACION
MICROSCOPICA
Ex. Directo:
Coloración Gram IDENTIFICACION DEL
AGENTE PATOGENO Y
AISLAMIENTO DETERMINACION DE SU
CULTIVO SUSCEPTIBILIDAD A
ANTIBIOTICOS

IDENTIFICACION
PRUEBAS BIOQUIMICAS

PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD
ANTIBIOGRAMA
 ¿Por qué colorear las muestras?
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de
ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste
entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el
contraste es la utilización de colorantes.
IMPORTANCIA
Gracias a las tinciones podemos examinar mejor la forma y el tamaño de los
microorganismos lo cual es tarea difícil en una observación directa.
Nos permite además, por medio de tinciones especiales, estudiar diferentes
estructuras de las células tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares
Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células
 COLORANTE: DEFINICIÓN
Son compuestos orgánicos cuyos iones tienen alguna afinidad
específica por fijarse a algún componente de la célula.

Los colorantes son compuestos químicos utilizados para aumentar el

contraste Cristal Violeta
COLORANTES DE MAYOR APLICACIÓN Eosina, wright
Son derivados de las anilinas Fucsina Básica
Actúan mejor en presencia de mordientes
(aumentan la permeabilidad de la pared y membrana,
Safranina
penetran a la celula por fenomeons osmoticos) Azul de Metileno
Verde de Malaquita
 Colorantes

Son compuestos químicos utilizados para aumentar el contraste poseen 3 componentes:

ANILLO BENCENICO Esqueleto incoloro al cual se unen dos radicales

grupo cromóforo que otorga color a la molécula y

grupo auxocromo tienen la función de intensificar la formación de color (aumenta

la intensidad del color)
otorga al colorante la capacidad de disociarse electro-líticamente y por lo tanto formar
sales, es el que facilita la unión del colorante a otras sustancias con carga eléctrica.

Los colorantes más usados son sales, constituidas por

1. ion cargado positivamente (Parte básica)
2. ion cargado negativamente (Parte acida)
 COLORANTES: Tipos
a) Sales colorantes: más comúnmente usados
 básicos: Consisten en un catión coloreado unido a un anión incoloro. Es decir
la base aporta el color, mientras que la parte ácida es incolora.
 Son atraídas por sustancias ácidas del tejido como los acidos nucleicos
(cromatina nuclear de pro y eucariotas y los ribosomas) o ciertos
componentes de la matriz extracelular polisacáridos acidos
glicosaminaglicanos
 Tiñen la célula bacteriana uniformemente (más usados en citología bacteriana).
• Ej: clorhidrato (-) de azul de metileno (+). la safranina, la fucsina básica, el cristal violeta,
hematoxilina

 ácidos: Tienen el catión(base) incoloro unido a un anión(acida) coloreado.

Tienen apetencia por sustancias básicas, sobre todo estructuras proteicas
localizadas en el citoplasma celular y también por el colágeno de la matriz
extracelular. No tiñen la célula bacteriana, pueden usarse como color de contraste
(coloración negativa). Tiñen estructuras citoplasmáticas de las células eucariotas(Rx
básicas)
Ej: eosinato (-) de sodio (+),la fucsina ácida y el rojo Congo, naranja G
 COLORANTES: Tipos
Colorantes liposolubles
• Realmente no se unen a elementos de los tejidos
por afinidad química sino porque se disuelven
en ellos.
• Se combinan con los componentes lipídicos de la
célula, usados para revelar la localización de los
depósitos de grasa. Ej. Sudán.
 COLORACIONES

Son técnicas que permiten

OBSERVAR MICROORGANISMOS

Químicamente es la unión de las moléculas del colorante (iones) con

los elementos constituyentes de la célula

Depende de carga de célula y colorante


SIMPLES
•Un solo colorante
•Tiñe o no la célula
•Proporciona información
acerca de la forma, tamaño
y tipo de agrupación de los
microorganimsos
Ej.:
Azul de Metileno
Safranina
Nigrosina
TIPOS DE TINCIONES
Pueden ser
DIFERENCIALES SELECTIVAS
•Más de un colorante •Uno o más colorantes
•Células con diferente •Estructuras celulares
composición química con distinta composición
Se utiliza para distinguir química
tipos de microrganismos Ej.:
•Importancia taxonómica Tinción de Esporas
Ej.: Tinción de Flagelos
Tinción GRAM Tinción de Paredes Cel.
Tinción BAAR Tinción de Corpúsculos
Metacromáticos
 COLORACIONES : Tipos
• Vitales
– Son aquellas que se practican sobre células que están
vivas, mediante la introducción de un colorante en la
circulación de un organismo vivo.
– Ejem: el verde Jano y el azul de metileno.
• Supravitales
– son aquellas que se realizan sobre células o tejidos vivos,
pero que están aislados del organismo del que proceden.
• No vitales
– se realizan sobre células muertas.
 TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIÓN COLOREADA
a) Frotis o película (extensión)

b) La fijación

c) Coloración.
 TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIÓN COLOREADA
a) Frotis o película (extensión)
• Utilizar portaobjetos limpios y desengrasados
 TÉCNICAS PARA REALIZAR UNA
PREPARACIÓN COLOREADA
b) La fijación:
Los microorganismos queden adheridos al portaobjeto ( coagula las sustancias proteicas)
TIPOS
– CON CALOR (O MÉTODO DE KOCH)
– FIJACIÓN QUÍMICA: alcohol metílico, formalina al 5 % (v/v), licor de Hoffman (partes iguales
de etanol absoluto y éter)

Metanol
 Lunes
TINCIÓN SIMPLE DE AZUL DE METILENO: PROCEDIMIENTO
Frotis y fijación

2.- Tomar la muestra con el asa de 3.-Extender sobre el agua y fijar a

MUESTRA siembra la llama del mechero

Tinción

1.- Cubrir la preparación con Azul de 2.- Lavar con agua, dejar secar y observar al
Metileno 1’ microscopio Micrococcus
luteus
Observación de bacterias en muestras teñidas con coloración simple
(colorante Básico azul de metileno)

Observacion de
levaduras en
muestras teñidas con
coloracion simple
(colorante acido
Nigrosina)
 Lunes
Tinción negativa.

1.- Colocar una gota de

Nigrosina en un porta
2.- Tomar muestra del
microorganismo con el
asa, flamear el tubo y tapar
3.- Mezclar con la
Nigrosina y extender por
todo el porta. Secar al
aire y observar

cápsulas tanto bacterianas como de levaduras, esporas que se observan como cuerpos
refringentes y espiroquetas
 Lunes

Tinción
L-3.2.3.- Tinción de Gram
Frotis y fijación

MUESTRA

2.- Tomar la muestra con 3.- Extender sobre el

el asa de siembra agua y fijar a la llama 1.- Cubrir la 2.- Añadir Lugol
del mechero preparación con (mordiente) durante 1’
Cristal Violeta 1’

3.- Decolorar con

4.- Lavar con agua 5.- Teñir con Safranina 1’ 6.- Lavar con agua,
Alcohol 96º hasta que no
suelte colorante dejar secar y observar
al microscopio
Coloración Gram
 Diferencias en las estructura de la pared celular en
Gram Positivas y Gram Negativas

Gram positiva Gram negativa

 Tinción GRAM: Bacterias Gram-Positivas
Cocos Gram-positivos
Racimos: forma típica de Staphylococcus sp, como S. aureus

Cadenas: forma típica de Streptococcus sp, como S. pneumoniae, Streptococcus grupo B

Tetradas: forma típica de Micrococcus sp

Bacilos Gram-positivos
• Gruesos: forma típica de Clostridium sp, como C. perfringens, C. septicum

Finos: forma típica de Listeria sp

Ramificados: forma típica de Actinomycetes y Nocardia, como A. israelii

Tinción GRAM: Bacterias Gram-Negativas
Cocos Gram-negativos

• Diplococos: forma usual de Neiseria sp, como N. meningitidis

• También Moraxella sp y Acinetobacter sp aparecen con morfología de diplococos.

Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae, como E. Coli

TINCIÓN GRAM: OBSERVACIONES MICROSCOPICAS
Curvados: forma usual de Vibrio sp, como V. cholerae, y
Campylobacter sp, como C. jejuni