FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

PROGRAMA DE BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICO

COLORACIONES SIMPLES Y COMPUESTAS

Competencias

 Conoce el fundamento de las coloraciones utilizadas durante la práctica.

 Identifica algunas estructuras bacterianas por métodos especiales de coloración.
 Identifica técnicas de coloración específicas para reconocimiento de estructuras especiales.

INTRODUCCIÓN

Debido a su pequeño tamaño, las bacterias no pueden poseer toda la arquitectura y los
componentes de una célula eucariota, la mayoría de las células bacterianas resultan difíciles de
ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el
medio que las rodea, por tal razón la forma más simple de aumentar el contraste es la utilización
de colorantes que tengan afinidad con las células, para así observarlas más fácilmente. Estos
colorantes pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la
presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas,
paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.

La observación de los microorganismos puede hacerse con tinción o sin tinción (fresco de la
muestra entre lámina y laminilla, o coloración de Gram para identificar la morfología). La
observación de bacterias sin tinción se hace para establecer la motilidad bacteriana y puede
provenir de un medio líquido o una suspensión bacteriana en solución salina fisiológica, la
preparación se visualiza colocando el inóculo entre lámina y laminilla. La observación de las
bacterias fijas sobre una lámina portaobjetos debe hacerse mediante el empleo de tinciones.

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica
por algún componente celular. Existen varios tipos de colorantes, pero los más usados en
microbiología son: las sales colorantes y los colorantes liposolubles.
La mayoría de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son colorantes derivados de las
anilinas, sales orgánicas intensamente pigmentadas que proceden del alquitrán. Se denominan
colorantes básicos si el cromóforo (porción coloreada) de la molécula está cargada positivamente,
por ejemplo, cristal violeta y azul de metileno son colorantes básicos. Otros colorantes de esta
categoría utilizados con frecuencia en bacteriología son safranina, fuchina básica y verde
malaquita. Bajo condiciones normales de crecimiento, la mayor parte de los procariotas tienen un
pH interno próximo a la neutralidad (pH 7.0) y una superficie celular cargada negativamente, así
los colorantes básicos son los más eficaces. Colorantes ácidos con rojo Congo, rosa de bengala,
eosina y fuchina ácida tiene un cromóforo cargado negativamente y son utilizados para teñir
positivamente ciertos componentes como las proteínas.

La mayoría de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son colorantes derivados de las
anilinas, sales orgánicas intensamente pigmentadas que proceden del alquitrán.
Se denominan colorantes básicos si el cromóforo (porción coloreada) de la molécula está cargada
positivamente, por ejemplo, cristal violeta (Fig. 5) y azul de metileno son colorantes básicos. Otros
colorantes de esta categoría utilizados con frecuencia en bacteriología son safranina, fuchina
básica y verde malaquita. Bajo condiciones normales de crecimiento, la mayor parte de los
procariotas tienen un pH interno próximo a la neutralidad (pH 7.0) y una superficie celular cargada
negativamente, así los colorantes básicos son los más eficaces. Colorantes ácidos con rojo
Congo, rosa de bengala, eosina y fuchina ácida tiene un cromóforo cargado negativamente y son
utilizados para teñir positivamente ciertos componentes como las proteínas

Coloración de estructuras: Permite la visualización e identificación de elementos

estructurales dentro de la célula.

Coloraciones especiales: Permiten la observación de estructuras especiales como

esporas (Wayson), glicocalix-capsula (tinta china, rojo congo), flagelos (Lefson),
gránulos (Van Stoltemberg).

TINCIONES ESPECIALES DE USO HABITUAL

Tinción de capsulas

La cápsula se puede definir como una estructura superficial que presentan muchas
bacterias en sus ambientes naturales, consistente en una acumulación de material
mucoso o viscoso, situado externamente respecto de la pared celular. Las cápsulas se
pueden clasificar en función del grado de

Asociación con la superficie celular, o por su consistencia:

 Cápsula rígida: con suficiente consistencia estructural como para evitar la

entrada de partículas como las de tinta china o nigrosina. Suele tener un límite
exterior definido.
 Cápsula flexible: poca consistencia, de modo que no excluye partículas.
Además, es deformable y carente de límites precisos.

La tinción negativa fue desarrollada originalmente para microscopia de luz con el fi n de

rodear y delinear las bacterias no teñidas u otros materiales biológicos. Este método es
muy útil, aunque está limitado por la presencia de un fondo oscuro que no permitirá la
correcta identificación de forma nítida y detallada de los componentes de dichas
estructuras.
COLORACIÓN DE ESPORAS
Esta tinción permite poner de manifiesto la endospora bacteriana, una forma de resistencia
producida por algunos géneros de bacterias gram positivas. Las endosporas aseguran la
supervivencia de estas bacterias en condiciones desfavorables (altas temperaturas, desecación,
radiaciones ultravioletas, gamma y agentes químicos), durante largos periodos de tiempo.
Diferentes grupos bacterianos que incluyen géneros aerobios como Bacillus sp y anaerobios
como Clostridium sp, son ejemplos de organismos que tienen la capacidad de existir como
célula vegetativas metabólicamente activas o como tipos celulares metabólicamente inactivos
llamados esporas. Debido a la composición química de las cubiertas de la espora esta es
resistente a los colorantes comúnmente utilizados en bacteriología. La coloración de Schaeffer-
Fulton, utiliza como colorante primario el verde de malaquita; para que el colorante penetre la
espora se requiere la aplicación de calor.

Coloración de bacterias Ácido Alcohol Resistentes (BAAR)

Los miembros del género Mycobacterium sp son resistentes a la coloración y pueden ser
visualizados únicamente por el método de coloración de Ziehl Neelsen. La diferencia
característica entre Mycobacterias y otras es la presencia de una pared celular muy compleja con
abundancia de lípidos que dificultan su coloración. La pared de celular de las bacterias acido
alcohol resistente está compuesta por (peptidoglicano y arabinogalactano) y ácidos micolicos.
Esta coloración utiliza tres reactivos diferentes.
La sensibilidad de esta tinción para identificar bacilos ácido-alcohol resistentes es del 74% y la
especificidad del 98%,26 teniendo un límite de detección de 5,000-10,000 bacilos/mL de muestra

Colorante primario- FUCSINA FENICADA:

Es un colorante fenólico rojo, la penetración del colorante se aumenta por la emisión de calor
logrando una emisión de vapores ir agregando colorante si es necesario para que esta no se
seque ni se debe dejar hervir de 3 a 5 minutos, esto permite que la fucsina atraviese la pared
lipídica y entre al citoplasma celular. La célula se torna de color rojo.
Decolorante -ALCOHOL ACIDO: Las BAAR deben ser resistentes a la decoloración se decolora
por un minuto ya que el colorante primario es más soluble en los lípidos de la pared que el alcohol
ácido. El colorante primario es retenido y el microorganismo permanece rojo.

Coloración de gránulos

Algunos microorganismos acumulas grandes reservas de fosfato inorgánico en forma de gránulos

de polifosfato. El fenómeno de coloración se denomina Metacromasia (cambio de color). El azul
de Metileno de Löffler, colorea los gránulos metacromáticos de color azul intenso, violeta o azul
rojizo, el colorante debe ser añejo para permitir que se formen dímeros y trímeros de moléculas
de azul de metileno que son las que causan el efecto de tinción múltiple (Metacromasia).

Coloración rojo congo

La molécula de Rojo Congo, dado a su tamaño de 21 amstrong, tiene un tamaño similar al de la

proteína amiloide, el cual es de 19 amstrong, el componente glúcido (asociado a la sustancia P)
será el que actuará en esta reacción.
Por lo tanto, ambas estructuras se unirán a través de puentes de hidrógeno, entre los grupos
Carboxilos (COOH) de la proteína amiloide y el grupo Amino (NH2) que se encuentra en la
molécula del colorante

Coloración de flagelos

Muchas bacterias son móviles y su capacidad para moverse en forma independiente se debe
generalmente a la presencia de estructuras especiales, los flagelos. Son apéndices largos,
delgados, de forma helicoidal, libres en un extremo y unidos a la célula por otro. Son tan delgados
que solo se pueden ver al microscopio luego de una coloración especial (Leifson) que hace uso
de un mordiente. Este promueve la fijación de las moléculas de colorante al flagelo dando lugar
a la formación de un precipitado a lo largo del flagelo, haciéndolo visible.
La célula bacteriana puede tener uno o más flagelos dispuestos en distinta manera y en base a
eso se clasifican:
Polar: flagelo en un extremo del cuerpo celular.
Anfitrica flagelos: en ambos extremos.
Lofotrica penacho: de flagelos en un extremo.
Peritrica flagelos: alrededor de toda la célula sin distribución

FUENTE:http://books.google.com.co/books?id=5RjS6B0X5RgC&pg=PA22&dq=ubicuid
ad+bacteriana&hl=es&sa=X&ei=aPKaUI3lFJOQ8wTpsoHwDQ&ved=0CDAQ6AEwAQ#
v=onepage&q=ubicuidad%20bacteriana&f=false

RODAMINA AURAMINA

Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los
fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de
color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado
como contraste, evita la fluorescencia inespecífica. Todos los microorganismos ácido-alcohol
resistentes, incluyendo los esporozoarios parásitos, se tiñen con estos colorantes.
Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden ser
reteñidos con la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tinción con el
fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersión. De esta forma, los resultados positivos
pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que además permiten la
diferenciación morfológica.

NARANJA DE ACRIDINA

El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma nativa o

desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia
puede variar, dependiendo del pH y de la concentración. El naranja de acridina ha sido empleado
como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si está
muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el ácido nucleico, el germen viable se
inactivará poco tiempo después de la tinción.
El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha sido
ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de estudios han demostrado que la tinción
de hemocultivos con naranja de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la
detección inicial de hemocultivos positivos.

PRE-LABORATORIO

1. En que consiste el Método de fijación y que otras técnicas se emplean para fijar una
muestra.
2. Cuáles son las disposiciones de las esporas en las bacterias.
3. Revisar el protocolo de la Secretaria de Salud e indicar como se realiza el frotis para la
identificación de Mycobacterium spp.
4. Revisar la ficha técnica de los colorantes que se van a requerir en la práctica
5. Complete el cuadro

Coloración Fundamento Estructura Estructura (Dibujo)

Coloración de Gram
Schaeffer fulton
Ziehl Neelsen
Kinyoun
Tinción Negativa

MATERIALES

 Material personal de bioseguridad.  Asa bacteriológica recta

 Microscopio óptico compuesto*  Papel kraft
 Toallas de papel  Cultivos bacterianos*
 Solución salina  Mechero
 Lápiz de cera o marcador de vidrio  Fósforos
 Alcohol  Muestra de esputo
 Láminas porta objetos  Mechero de alcohol
 Lancetas
 Laminillas cubreobjetos
 pinzas
 Aceite de inmersión*
 Asa bacteriológica curva

METODOLOGÍA

1. Desinfecte su sitio de trabajo con alcohol y lleve el microscopio asignado y realice

el siguiente procedimiento.

Prepare un frotis bacteriano

Para el procedimiento de coloración es indispensable realizar un previo frotis, donde se fijen
los microorganismos en la lámina

Microorganismos: Streptococcus pneumoniae, Bacillus cereus, Bacillus subtilis,

Coloración para esporas (Schaeffer TINCIÓN NEGATIVA PARA CAPSULAS

Fulton) : Bacillus cereus, Bacillus Microorganismos: Bacillus sp.
subtilis.

1. Coloree la lámina con Verde 1. Coloque una gota de Tinta china o nigrosina en un
Malaquita, caliente con el mechero extremo del portaobjetos.
hasta emisión de vapores por 5
minutos.

2. Coloque muestra el cultivo bacteriano.

2. Deje enfriar la preparación.

3. Mezcle la preparación con ayuda del Asa

bacteriológica.
3. Leve con agua a chorro.
4. Coloque una laminilla sobre la muestra y deje que
se extienda por capilaridad, posteriormente realice
un extendido a lo largo de la lámina utilizando la
técnica de frotis sanguíneo.
4. Aplique safranina como colorante de
contraste por 1 minuto.

5. Deje secar la preparación

5. Lave con agua a chorro.

6. Cubra con safranina por 10 segundos y enjuague
con mucho cuidado.

6. Deje secar y observe al microscopio

con objetivo de 100X.
7. Deje secar y observe con objetivo de inmersión.
 Coloración para bacterias acido alcohol resistentes (Ziehl Neelsen).

1. Lávese las manos

2. Utilizar láminas nuevas, sin marcas y desengrasadas.
3. No tocar los frotis con las manos, goteros, varillas o grifos
4. Colocarse la bata (de manga larga y con botones), guantes (doble guante),
gorro, tapabocas N95 o N100.
5. Ubicar en la mesa, bandeja o papel humedecido con hipoclorito de sodio al
1%.
6. Seleccionar la partícula más purulenta.
7. Extender homogéneamente suficiente cantidad de la partícula útil, sin
exceso, en un pequeño ovalo centrado en el portaobjetos (2cmx2cm o
2cmx1cm)

8. Filtrar la fucsina fenicada en el momento de uso, dejarla actuar 5 minutos calentando

3 veces hasta desprender vapores, sin hervir.
9. Lavar con abundante agua, eliminar el agua sobrante de los lavados
10. Adicionar Alcohol ácido por 3min.
11. Lavar con abundante agua, eliminar el agua sobrante de los lavados
12. Adicionar azul de metileno por 1 min
13. Lavar con abundante agua, eliminar el agua sobrante de los lavados.
14. Dejar secar y observar al microscopio.

Una vez terminada la práctica deje el microscopio en perfectas condiciones de limpieza;

ubique en el revólver el objetivo de menor aumento, baje completamente la platina, cierre
totalmente el diafragma y el regulador de luz déjelo en cero. Solamente cumplidas estas
condiciones guarde los instrumentos.

Post- Laboratorio
1. De acuerdo con los estándares nacionales ¿Cómo es el reporte de baciloscopias?
2. Revisar la coloración de auramina rodaminapara bacterias ácido alcohol resistente
(fundamento y procedimiento)
3. Realice un cuadro indicando qué otras muestras pueden ser empleadas para la
identificación de tuberculosis.
 Muestra Recipiente Recolección Volumen de Conservación
muestra
requerida

4. Realice un cuadro comparativo entre los lineamientos antiguos y nuevos para

realizar baciloscopias.

Bibliografía
 DELGADO, Alberto. Manual de Laboratorio Clínico Básico. Editorial Mc Graw Hill.
Santafé de Bogotá. 1999.
 FREEMAN. Bob; microbiología de Burrows. Editorial Interamericana. México.
 [Anónimo]. Técnicas de tinción. Fundamentos. Citado el [19-03-2011]. Disponible
en: http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm
 Lynch, M. J., Raphael, S. S., Mellor, L. D., Spare, P. D., & Inwood, M. J.
(1987). Métodos de laboratorio. Interamericana

 MADIGAN, M., MARTINKO, J. Biología de los microorganismos. Editorial Prentice

Hall. 2000 BERNAL Dora Cecilia. Manual de Laboratorio de Biología celular para
Ciencias de la Salud. CIPADE. Universidad de Boyacá. 2003
 Myrvik, Q. N., & Weiser, R. S. (1997). BACTERIOLOGÍA Y MICOLOGÍA
MÉDICAS, Ed. Mac Graw_Hill
 López-Jácome, L. E., Hernández-Durán, M., Colín-Castro, C. A., Ortega-Peña, S.,
Cerón-González, G., & Franco-Cendejas, R. (2014). Las tinciones básicas en el
laboratorio de microbiología. Laboratorio de Infectología, Centro Nacional de
Investigación y Atención a Quemados (CENIAQ), Instituto Nacional de
Rehabilitación, 3, 10-18.
 Vázquez, C., Martín, A., de Silóniz, M., & Serrano, S. (2011). Técnicas básicas de
Microbiología. Observación de bacterias. REDUCA (Biología), 3(5).