Las suspensiones lavadas de Escherichia coli oxidaron el succinato cuando se cultivaron previamente en

succinato pero no en glucosa. Se produjo una tasa de oxidación más lenta con bacterias cultivadas con peptona
como fuente de carbono. Estas diferencias se debieron a alteraciones en el nivel de actividad de la succinato
deshidrogenasa. La glucosa reprimió la biosíntesis de la enzima, mientras que el succinato actuó como un
inductor específico y no aumentó la actividad de fumarato hidratasa, malato deshidrogenasa o NADH.
deshidrogenasa. El crecimiento aeróbico también incrementó los niveles de succinato deshidrogenasa unida a
la membrana. La inducción de succinato deshidrogenasa por succinato añadido siguió la cinética esperada. La
adición de glucosa causó una disminución en la tasa de biosíntesis de la succinato deshidrogenasa. La
succinato deshidrogenasa parece desempeñar un importante papel respiratorio ya que amytal (un inhibidor de
la NADH-oxidasa) inhibió el crecimiento solo levemente cuando se usó succinato como fuente de carbono en
comparación con la fuerte inhibición del crecimiento cuando se usó glucosa como fuente de carbono.

La succinato deshidrogenasa es la única enzima unida a la membrana del ciclo del ácido tricarboxílico en
Escherichia coli (Marr, 1960) y, por lo tanto, puede participar en la respiración además de funcionar en el ciclo
del ácido tricarboxílico. Los cambios en el medio ambiente pueden afectar la actividad respiratoria y el
funcionamiento del ciclo del ácido tricarboxílico.
La influencia de las condiciones de crecimiento en la biosíntesis y la actividad de las deshidrogenasas unidas a
la membrana y los citocromos de las bacterias está bien documentada (Gray, Wimpenny & Mossman, 1966;
Cavari, Avi-Dor & Gressowicz, 1968; Rufz-Herrera y De MOSS, 1969).
Los estudios preliminares (RubHerrera, 1968) han sugerido que el sustrato de crecimiento de carbono fue
importante para controlar la síntesis de la succinato deshidrogenasa en E. coli. Este estudio
presenta datos adicionales sobre los mecanismos que controlan la biosíntesis del succinato.
deshidrogenasa en esta bacteria.

Metodos
Organismo y condiciones de crecimiento. Escherichia coli HfrH, obtenida de J. A. de MOSS,
La Universidad de California, San Diego, EE. UU., Se mantuvo en agar nutriente (Difco) y se cultivó en el medio
descrito por Sypherd & Strauss (1963) con 5 pug de tiaminelm1 y
ya sea 1% de glucosa o 0,5% de succinato. Este medio se conoce como "medio sintético"; para "medio
complejo", se añadió caldo de nutrientes (Difco) al 0,4%. Las bacterias se cultivaron en
37 “C durante 4 a 5 h, el medio se roció con aproximadamente 2 volúmenes de aire estéril / volumen de cultivo
/ min. Para las condiciones anaeróbicas, los cultivos se rociaron con una mezcla de 95% de N2 + 5% de COz.
La densidad bacteriana se midió por medio de un fotocolorímetro Klett utilizando un verde
El filtro y el contenido de proteína se calcularon a partir de la turbidez con una curva de calibración adecuada.

Preparación de extractos libres de bacterias y envolturas bacterianas. Las bacterias se centrifugaron, se lavaron
con 0,05 w de tampón fosfato, pH 7,3 y se rompieron con un Branson Sonifier (Heat Systems Ultrasonics,
Plainview, Nueva York, EE. UU. EE. UU.) Durante tres períodos sucesivos de 15 s cada uno. El extracto se
centrifugó a 4008 durante 15 minutos y el sobrenadante se usó como extracto crudo. Las envolturas bacterianas
se aislaron resuspendiendo las bacterias en 0,5 ml de tampón 0,05 M-tris-HCl, pH 8,3, que contenía 20% de
sacarosa y 2 mg de lisozima (Sigma Chemical Co. Inc., St. Louis, Missouri, EE. UU.) Jml y se congelaron en
una mezcla de acetona-sólido CO2. Después de descongelar a 37 "C, el tratamiento se repitió cuatro veces. Se
agregaron cinco ml de tampón fosfato 0,05 M que contenía 10 pg de DNasa (Sigma Chemical Co) / ml y se
mezclaron rápidamente hasta que la viscosidad disminuyó. El extracto crudo se centrifugó a 50000 g durante
10 min, el sobrenadante se eliminó y el residuo se resuspendió en 1 ml de tampón fosfato y se centrifugó a 5008
en un gradiente de sacarosa lineal (50 a 20%) durante 20 min. Las envolturas bacterianas aparecieron como
una banda opalescente dentro del gradiente.

Determinación de la actividad respiratoria. La captación de oxígeno se midió con un electrodo de oxígeno Clark
(Yellow Spring Instrument Co. Inc., Ohio, EE. UU.), Unido a un cilindro cilíndrico Perspex.
Cámara con una capacidad de 3-2 ml.
Medición de la absorción de succinato. Muestras (5 ml) de suspensiones bacterianas en 0,05 Mphosphate
buffer, pH 7-3, a una turbidez de 360 unidades Nett (= 1.4 mg de bacterialml de peso seco)
se incubaron con 0-2 ml0,05 M- [I, 4-14Cz] succinato (sp.act. 0,01 pCi / pmol) (Calbiochem Inc., La Jolla,
California, EE. UU. A). A intervalos, se retiraron muestras de 1 ml y se mezclaron con 1 ml de 0.1 M-KCN (a o
"C) y se filtraron a través de filtros de membrana (0.47 pm de diámetro de poro, Millipore Corporation, Bedford,
Massachusetts, EE. UU.). Las bacterias se lavaron con 5 ml de hielo frío en M-KCN I. La radioactividad de las
células se midió con un contador Geiger
Cphillips, modelo 4035) que tuvo una eficiencia absoluta de 2.5% para 14C. No se hizo ninguna corrección para
la auto-absorción.

Actividades enzimáticas. La succinato deshidrogenasa se midió por el método de Ells (1959).

La velocidad de reducción del dicloroindofenol se midió con un espectrofotómetro Maroc V (Jobin et Ivon,
Arcueil, Francia) acoplado a un registrador Photo-Volt Model 43. La actividad se expresó como bE ,,,, / min / mg
de proteína. La hidratasa de fumarato se midió por el método de Massey (1955), y la actividad se expresó como
AE ,,, / min / mg de proteína. La malato deshidrogenasa se midió como se describe en el folleto Enzimas,
reactivos enzimáticos de Worthington Biochemical Corp., Freehold, New Jersey, EE. UU. La actividad se
expresó como AE, proteína Jrnin / mg. La NADH deshidrogenasa se midió de la siguiente manera: se mezclaron
0,2 ml de 0,0015 M-NADH con 2,7 ml de tampón fosfato 0,05 M, pH 7,3 y 0,2 ml de extracto bacteriano. La
actividad se midió como se describe para la succinato deshidrogenasa y se expresó como
AE ,, proteína Jmin / rng. La proteína se midió por el método de Lowry, Rosebrough, Farr & Randall (1951).

RESULTADOS
El succinato no era una fuente de carbono tan buena como la glucosa para el crecimiento de Escherichia coli.
Cuando ambos sustratos se agregaron a un medio sintético, se produjo un crecimiento diauxico con el uso de
glucosa en primer lugar. El efecto de la glucosa se atribuyó a las alteraciones en la actividad respiratoria, ya
que las bacterias cultivadas en la glucosa no oxidaron el succinato (Tabla I). Las diferencias en la actividad
respiratoria entre la glucosa y las bacterias cultivadas con succinato se correlacionaron con la actividad de la
succinato deshidrogenasa en extractos de los dos tipos de bacterias (Tabla I).
Sin embargo, la permeabilidad al [1,4- ~ qC; lsuccinato no se vio afectada en gran medida por las condiciones
de
Crecimiento (Fig. I)

Fig. I. Captación de [1,4-W,] succhate en Escherichiu coli. Las bacterias se cultivaron durante 4 h en complejo.
Medio solo o con succinato o glucosa añadida. La captación de [1,4J'Cajsuccinate se siguió como se describe
en Métodos. 0. Bacterias cultivadas en succinato; 0, bacterias cultivadas con glucosa; x, bacterias
Cultivado en medio complejo solo.

Las envolturas bacterianas aisladas oxidan fácilmente el succinato y el NADH, pero no la glucosa.
La oxidación de NADH mediante envolturas de bacterias cultivadas con glucosa y succinato fue sobre el
Lo mismo, pero el succinato se oxidó más rápidamente con envolturas de bacterias cultivadas con succinato.
Estas diferencias se relacionaron con la actividad de las eves correspondientes (ver Tabla 2).
El efecto del succinato como inductor de la succinato deshidrogenasa fue específico, ya que su adición al medio
complejo incrementó significativamente la síntesis solo de la succinato deshidrogenasa.
mientras que fumarato hidratasa y malato deshidrogenasa no se vieron afectados (Tabla 3). Glucosa
No reprimió las dos últimas enzimas tanto como lo hizo con la succinato deshidrogenasa (Tabla 3).
La ausencia de oxígeno durante el crecimiento también afectó la actividad respiratoria y los niveles de succinato
deshidrogenasa. Las bacterias crecieron pobremente con el succinato como fuente de carbono en condiciones
anaeróbicas y tuvieron un 25% de la actividad respiratoria con succinato y solo un 8% de la actividad de la
succinato deshidrogenasa en comparación con las bacterias cultivadas de forma aeróbica.
La cantidad de succinato deshidrogenasa presente en las células cultivadas con glucosa fue independiente de
la concentración de oxígeno

La cinética de la inducción de la succinato deshidrogenasa se midió en condiciones en las que el succinato no

era el factor limitante para el crecimiento (Fig. 2). Después de agregar el succinato al medio de crecimiento, la
inducción de la enzima siguió la cinética clásica descrita por Jacob & Monod (I 961) para un sistema inducible.
Cuando se añadió cloranfenicol (50 µg / ml) simultáneamente con succinato, no hay aumento de la actividad de
la succinato deshidrogenasa fue obtenido.
En un experimento adicional, se siguió la represión por glucosa del sistema enzimático en bacterias que crecen
en succinato (Fig. 3). La síntesis de la succinato deshidrogenasa se detuvo inmediatamente después de agregar
la glucosa al medio y la enzima existente decayó rápidamente
lo que indica que tiene una tasa de rotación rápida o que la glucosa favorece su degradación
o inactivación.

Cuando se eliminó la glucosa del medio que contiene succinato, la síntesis de enzimas se restauró
inmediatamente siguiendo una cinética similar a la que se muestra en la Fig. 2.
El papel de la succinato deshidrogenasa en la respiración de la bacteria se investigó mediante la observación
del efecto de amytal en el crecimiento. Amytal inhibe la NADH deshidrogenasa de las mitocondrias (Chance &
Hollunger, 1963) y también la NADH oxidasa de Agrobacterium tumefaciens (Kurup, Vaidyanathan &
Ramasarma, I 966). Con una preparación de envoltura de Escherichia coli, el amytal 0,6 mM inhibió la oxidación
de NADH en un 40%, pero no tuvo efecto sobre la oxidación del succinato. Si el amytal inhibiera la oxidación
de NADH, pero no la oxidación por succinato, la adición de amytal a un medio con sustratos que se oxidaron a
través de NAD provocaría una inhibición más fuerte que cuando se agregó a un medio donde el sustrato
respiratorio era succinato. Por lo tanto, 0,1 mwarnytal inhibió el crecimiento de E. coli en medio complejo en un
30% cuando estaba presente glucosa, pero solo en un 10% cuando se añadió succinato en lugar de glucosa.
Cuando se usó I mmamytal, la inhibición del crecimiento fue de 60% y 20% respectivamente

DISCUSIÓN
La formación de succinato deshidrogenasa en Escherichia coli está controlada por las condiciones ambientales.
Su represión por la glucosa es otro ejemplo de una enzima sujeta a la represión del catabolito (Magasanik,
1961). La glucosa tuvo poco efecto sobre la síntesis de malato deshidrogenasa y el sistema de permeabilidad
del succinato. La glucosa reprime la síntesis de succinate deshidrogenasa en Haemophilm paraintuenzae
(White, I 967) y Staphylococcus
aureus (Collins y Lascelles, 1962). Con E. coli cultivada en un medio complejo, la formación de enzimas del
ciclo del ácido tricarboxílico también es reprimida por la glucosa (Gray et al. 1966).
Encontramos un efecto más específico de la glucosa ya que el hidrato de fumarato no fue reprimido por el
carbohidrato.
La inducción de succinato deshidrogenasa en Escherichia coli HfrH por succinato es similar a la reportada por
Cavari et al. (1968), quienes encontraron que la actividad de la succinato deshidrogenasa aumentó
aproximadamente seis veces cuando se cultivó E. coli en un medio que contenía succinato como
en comparación con la actividad mostrada por bacterias cultivadas en un medio que contiene fumarato o manitol.
Nuestros datos sobre los niveles de succinato deshidrogenasa en células de crecimiento aeróbico y anaeróbico
concuerdan con los informados por Gray et al. (1966), Hino y Maeda (1966) y Cavari.
et al. (1968). La ubicación dentro de la membrana le confiere características especiales a la succinato
debidrogenasa, como se ha discutido en Cerletti, Gioveno, Testolin y Binotti (I 968); de especial
El interés es que la succinato deshidrogenasa puede tener una función respiratoria de acuerdo con nuestros
resultados.
Este trabajo se realizó con la ayuda financiera de la C.O.F.A.A. del Instituto Politécnico Nacional y una donación
de la Corporación de Investigación, Brown Hazen Fund.

Fig. I. Captación de [1,4-W,] succhate en Escherichiu coli. Las bacterias se cultivaron durante 4 h en medio
complejo solo o con succinato o glucosa añadida. La captación de [1,4J'Ca] succinato se siguió como se
describe en Métodos. 0. Bacterias cultivadas en succinato; 0, bacterias cultivadas con glucosa; x, bacterias
cultivadas en medio complejo solo

Fig. 2. Inducción de succinato deshidrogenasa en Escherichia coli. Se cultivó Escherichia coli en medio
complejo aireado durante 130 minutos y luego se añadió succinato al 0,5%. Las muestras se retiraron, se
lavaron en un tampón que contenía 50 µg de cloranfenicol / ml y se sometieron a sonicación. La actividad
específica de la succinato deshidrogenasa, 0, se expresa como E ,,, / min / mg de proteína. La actividad total,
0, es para medio de cultivo de 1 ml.

Fig. 3. Represión de la succinato deshidrogenasa por la glucosa en Escherichia coli. Las bacterias se
cultivaron en un medio complejo durante 3 hy se añadió glucosa al 0-75%. A intervalos, las muestras se
retiraron y se trataron como se describe en la Fig. 2. La actividad específica, 0, y la actividad total, 0, se
expresan como en la Fig.2
 La mayoría de los electrones que se van a utilizar en la cadena transportadora de electrones provienen de la acción de las
deshidrogenasas, que recogen los electrones de los distintos procesos catabólicos y los canalizan hacia los aceptores universales de
electrones (principalmente NAD+ y FAD). Entonces los electrones fijados por estas coenzimas se transfieren a una serie de
transportadores asociados a la membrana interna de la mitocondria conocidos como complejos. Estos complejos transportadores de
electrones son de naturaleza proteica y poseen diversos grupos prostéticos capaces de aceptar y de donar electrones. En la cadena
respiratoria intervienen tres tipos de moléculas capaces de transferir electrones. La ubiquinona o coenzima Q (una quinona hidrofóbica),
los citocromos (proteínas que tienen como grupos prostéticos grupos hemo con hierro) y las proteínas con agrupaciones sulfo-férricas
(centros Fe-S). El tránsito de electrones a través de los complejos se produce en orden creciente de afinidad electrónica, transfiriendo
los electrones desde las coenzimas reducidas hasta el oxígeno, aceptor final de los electrones. Los complejos implicados en la
transferencia de electrones son:

 El complejo I, también llamado NADH-ubiquinona oxidorreductasa o NADH deshidrogenasa, que transporta los electrones del NADH
a la ubiquinona.
 El complejo II es la succinato deshidrogenasa, única enzima del ciclo de Krebs unida a membrana, que pasa los electrones del
FADH2 a la ubiquinona.
 El complejo III, también llamado citocromo bcj o complejo ubiquinonacitocromo c oxidorreductasa, que acopla la transferencia de
electrones desde la ubiquinona al citocromo c.
 El complejo IV, también llamado citocromo c oxidasa, es la última etapa de la cadena de transporte electrónico de la respiración y
conduce a los electrones desde el citocromo c hasta el último aceptor de los electrones, el oxígeno, que se reduce a agua.
 El complejo V, también conocida como ATP sintasa, es el complejo proteico encargado de la síntesis de ATP en la membrana
mitocondrial, aprovechando el transporte de protones, producto del ciclo de Krebs.
 Los electrones del NADH + H+ se transportan al complejo I, y allí son aceptados por el nucleótido de flavina FMN;
posteriormente se transfieren a una serie de centros Fe-S, que, finalmente, trasladan los electrones a la ubiquinona. El paso de
los dos electrones del NADH + H+ por el complejo I permite el tránsito de un total de cuatro protones al espacio intermembrana.
La ubiquinona reducida difunde libremente por la membrana transportando los electrones hasta el complejo III; en este complejo
los electrones se transfieren de uno en uno a través de un proceso complejo de varios pasos. El hecho de que los electrones
pasen individualmente hace que se genere ubisemiquinona (molécula de ubiquinona reducida por un solo electrón) que, gracias
a los citocromos b del complejo II, se reduce nuevamente y cede el segundo electrón. Al final, los dos electrones son cedidos
a dos citocromos c (cada citocromo c transporta un electrón): durante este proceso se logran transportar otros cuatro protones
 al espacio intermembrana. Los citocromos c se encargan de transferir los electrones desde el complejo III al complejo IV. Dicho
complejo IV es el responsable de reducir una molécula de oxigeno a agua, proceso para el cual necesita cuatro electrones y
en el que es importante la presencia de varios citocromos a y de dos átomos de cobre que colaboran en la reducción de la
molécula de oxigeno. El citocromo IV, al transferir los cuatro electrones al oxígeno, logra transportar cuatro protones hacia el
espacio intermembrana; si bien, como el NADH + H+ cedió solo dos electrones por cada molécula, el complejo IV únicamente
transfiere dos protones, lo cual supone un total de diez protones por molécula de NADH + H + reoxidada a NAD+. La principal
fuente de NADH + H+ son los diversos pasos del ciclo de Krebs.



 Los electrones de las moléculas de FADH2 entran en la cadena transportadora de electrones a través del complejo II (complejo
succinato deshidrogenasa del ciclo de Krebs) que transfiere los electrones a la ubiquinona. Otras enzimas como la acil CoA
deshidrogenasa también transfieren los electrones del FADH2 a la ubiquinona, aunque estos procesos no logran trasladar
ningún protón al espacio intermembrana. A partir de la ubiquinona, los electrones del FADH 2 siguen el mismo camino que los
electrones del NADH + H+, siendo transferidos al complejo III, al citocromo c, al complejo IV y, finalmente, cedidos al oxígeno
formándose agua. El trasiego de los electrones procedentes del FADH2permite el paso de un total de seis protones por molécula
al espacio intermembrana.



 La utilización de la cadena transportadora de electrones y del oxígeno implica una serie de riesgos para la célula; estos riesgos
son consecuencia de la capacidad oxidante del oxígeno y de la formación de radicales libres que pueden originar daño oxidativo
a las biomoléculas.