INSTRUMENTACION EN ESPECTROFLUORÍMETRO

Como la mayor parte de los instrumentos utilizados en los métodos espectroscópicos, los
componentes principales de un fluorímetro son: una fuente de radiación, un sistema selector de
longitudes de onda (filtro o monocromador), una célula conteniendo la muestra, y un detector. Sin
embargo, una diferencia importante entre la fluorimetría (también la fosforimetría) y los demás
métodos espectroscópicos es la presencia de dos filtros (o dos monocromadores); uno para
seleccionar la longitud de onda de excitación y otro para la de emisión.

En la figura 4.4. se han representado los componentes básicos de un fluorímetro.

En espectrómetros de luminiscencia se necesitan fuentes de radiación más intensas que las

lámparas de volframio o de deuterio que se utilizan en las medidas de absorción. Anteriormente
se indicó que la intensidad de fluorescencia es directamente proporcional a la potencia del haz
incidente.

La lámpara de arco de xenón presenta un espectro esencialmente continuo que se extiende

por las regiones ultravioleta y visible, siendo muy utilizada en espectro-fluorímetros de red. Por
otra parte, en los fluorímetros de filtro, suele utilizarse la lámpara de arco de mercurio, la cual
emite un intenso espectro de líneas sobre un fondo continuo. El uso de esta fuente puede implicar
una mayor sensibilidad, debido a la alta intensidad de las líneas del mercurio.

Los sistemas para seleccionar la longitud de onda más empleados en instrumentos de

luminiscencia son filtros y redes. De hecho, los instrumentos se clasifican en florímetros de filtro
y espectrofluorímetros de red. De los primeros, los más utilizados son los filtros de interferencia,
por proporcionar pequeñas anchuras de banda.

Por lo que respecta a las redes, ofrecen las ventajas de presentar resolución uniforme y
dispersión lineal a todas las longitudes de onda. El mayor inconveniente es que pasan varios órdenes
espectrales, lo cual puede evitarse usando filtros en el camino óptico.

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 Los prismas se usan poco en instrumentos para luminiscencia, porque, aunque proporcionan
una gran dispersión en el ultravioleta, es en el visible donde se realizan muchas medidas, y, además,
para obtener una sensibilidad adecuada se necesitaría un prisma muy grande, lo cual no es
económico.

Las cubetas utilizadas para contener la muestra suelen ser de cuarzo, para permitir el paso
de la radiación ultravioleta. Las más típicas son de 1 cm de espesor, como las utilizadas para
medidas de absorción, excepto que todas las caras son transparentes a la radiación (están pulidas),
ya que generalmente las medidas de fluorescencia se realizan en un ángulo de 90º respecto a la
radiación incidente; a otros ángulos, la dispersión por la disolución y las propias paredes de la
cubeta puede originar mayor ruido de fondo.

En cuanto a los detectores, la mayor parte de los fluorímetros y espectrofluorímetros

actuales usan tubos fotomultiplicadores como sistemas para detectar la radiación de
fluorescencia.

Finalmente, mencionar que mientras que los más precisos espectrofotómetros de absorción
ultravioleta y visible utilizan un dispositivo de doble haz, esta operación no es práctica en
instrumentos de luminiscencia. Por ello, hay que tener en cuenta siempre los problemas inherentes
al empleo de haz sencillo.

1. Transferencia de energía de fluorescencia por resonancia (RET)

La transferencia de energía de fluorescencia por resonancia (RET) se basa en la

transferencia de energía entre un grupo donante y un aceptor. Deriva de la capacidad del donante
fluorescente de excitar al aceptor, si ambos se encuentran a una distancia apropiada (entre 1 y 10
nm). La excitación de moléculas de aceptor puede ocurrir por transferencia directa de energía de
las moléculas donor excitadas y esta se manifiesta como una reducción en la intensidad de emisión
de la fluorescencia del donor y un correspondiente incremento en la intensidad de emisión del
aceptor de fluorescencia (Figura 6). El fluoroforo donante excitado presenta fluorescencia a una
determinada longitud de onda. La aproximación estrecha de un segundo fluoroforo con una banda
de absorción que se superpone con la banda de emisión del donante, conduce a la excitación del
aceptor por el donante y la fluorescencia resultante es de mayor longitud de onda.

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2. Espectros de excitación y emisión

Debido a la presencia de dos monocromadores, pueden registrarse dos tipos de espectros:

el espectro de excitación (intensidad de fluorescencia observada en función de la longitud de
onda de excitación a una determinada longitud de onda de emisión) y el espectro de emisión
(intensidad de la emisión fluorescente en función de la longitud de onda de emisión, a longitud de
onda de excitación fija). Esto es, si se fija la λex y se mide la radiación emitida a las diferentes
λem se obtiene el espectro de emisión. En cambio, si se mantiene constante la λem y se van variando
las λex , se obtiene el espectro de excitación. Este es ligeramente diferente del espectro de
absorción, pero muy semejante a él.

El espectro de emisión aparece, evidentemente, a longitudes de onda más largas que el de

excitación (absorción) (figura 4.5.). Solamente las bandas de mayor longitud de onda del espectro
de absorción suelen estar superpuestas con las bandas de menores longitudes de onda de la
emisión*. Además, debido a que los espaciados entre los niveles vibracionales son similares en el
estado fundamental y en el primer estado singulete excitado, el espectro de fluorescencia es
aproximadamente una imagen especular del espectro de absorción.

Para aplicaciones analíticas se usa el espectro de emisión, aunque corrientemente, cuando se

trabaja con un espectrofluorímetro, se obtiene primero un espectro de excitación, con objeto de
confirmar la identidad de la sustancia y seleccionar la longitud de onda óptima de excitación.

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3. Espectro verdadero y aparente

Debido a que los espectrómetros de luminiscencia suelen ser de haz sencillo, todos los
problemas inherentes a esta forma de operar (fluctuaciones de la fuente de radiación,
inestabilidad del detector, etc.) están potencialmente presentes. Hay dos problemas
particularmente molestos y son, que tanto la intensidad de la fuente de radiación como la
sensibilidad de cualquier detector pueden variar con la longitud de onda.

Cuando se obtienen espectros que dependen de las características del instrumento utilizado
se denominan aparentes (tanto de excitación como de emisión, si bien, las distorsiones debidas a
parámetros instrumentales se ponen de manifiesto fundamentalmente en el espectro de
excitación). Cuando es posible corregir el espectro aparente considerando las características de
la fuente y del detector se obtiene el espectro verdadero o corregido. La corrección puede
hacerse de forma manual si se conocen las características de la fuente y del detector, si bien,
existen instrumentos especialmente diseñados para llevar a cabo la corrección de forma
automática.

4. Espectro de fluorescencia

En espectroscopia de fluorescencia se registran espectros de excitación y de emisión. El

espectro de excitación se corresponde con el espectro de absorbancia. Ambos espectros son una
representación de la intensidad de fluorescencia en unidades arbitrarias en función de la longitud
de onda en nm. Para registrar el espectro de emisión se fija una longitud de onda de excitación y
para el de excitación se fija una longitud de onda de emisión. Una característica llamativa de los

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espectros de excitación y emisión de fluorescencia es que para algunas moléculas estos son
imágenes especulares uno del otro, a esto se llama “regla del espejo” (Figura 3).

Alteraciones de esta regla se pueden deber a impurezas fluorescentes de la muestra o, en

muestras muy diluidas, a una banda “Raman” que es la banda de vibración del agua. Además
existen muchas sustancias que no siguen esta regla (Figura 4) y esto se debe a una diferencia de
arreglos geométricos del núcleo en el estado excitado si se compara con el estado basal.

Otra característica de los espectros de fluorescencia es que el espectro de emisión es

independiente de la longitud de onda de excitación (λexc), debido a la disipación parcial de
energía de excitación que ocurre durante la duración del estado excitado (Figura 5).

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 El espectro de emisión de fluorescencia varia marcadamente con la estructura química del
fluoróforo y del solvente en el que esta disuelto.

5. Relación entre intensidad de fluorescencia y concentración

La intensidad de fluorescencia, If, es directamente proporcional a la concentración, C, de la

sustancia absorbente, pero solo a concentraciones relativamente bajas, lo cual puede demostrarse
como sigue: la fracción de radiación transmitida, según la Ley de Beer, es:

La fracción de radiación absorbida es:

y la cantidad de radiación absorbida es:

La intensidad de la radiación fluorescente, If, está relacionada con la cantidad de radiación

absorbida de la forma siguiente:

donde k es una constante de proporcionalidad, que depende de parámetros instrumentales

(eficacia del sistema detector y geometría) y φf es el rendimiento cuántico de la fluorescencia
(relación entre el número de fotones emitidos y los absorbidos por unidad de tiempo).

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 Para bajas concentraciones, cuando el término εbC sea menor que aproximadamente 0.05,
todos los términos de la ecuación [I], excepto el primero, son muy pequeños, y la expresión se
reduce a

Así, para disoluciones muy diluidas, la intensidad de fluorescencia será directamente

proporcional a la concentración:

En la figura 4.4. se muestra una representación gráfica de la variación de la intensidad de

fluorescencia con la concentración.

A concentraciones relativamente altas, los términos de mayor orden de la ecuación [I] pueden
ser lo suficientemente importantes para que se pierda la linealidad, como ya se comentó
anteriormente. Sin embargo, existen otras causas para la no linealidad a concentraciones altas.
Son las siguientes:

* Autoatenuación. Se produce como consecuencia del choque entre moléculas excitadas, lo cual
origina una desactivación en forma de energía no radiante. Lógicamente, al aumentar la
concentración, aumentará la probabilidad de que se produzcan esas colisiones.

* Autoabsorción. En este caso, la fluorescencia de una molécula es absorbida por otra molécula del
mismo soluto en estado fundamental, y la probabilidad de tales eventos crece al aumentar la
concentración. La auto-absorción reduce la intensidad de fluorescencia, salvo que φf sea la unidad.

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Por ello, la representación gráfica de If frente a C puede hacerse incluso descendente para altos
valores de C.

* Como ya se vio, If es proporcional a la absortividad molar: a mayor absorción, mayor

fluorescencia. Sin embargo, cuando la absorción es demasiado grande y la disolución bastante
concentrada, la porción de la disolución más próxima a la fuente luminosa absorbe mucha radiación,
de forma que queda muy poca disponible para el resto. Si la concentración es tan grande que toda
la radiación incidente es absorbida, If = k φf (Po – P) = k φf Po, en cuyo caso, If tiende al valor de
k Po (ver figura 4.4.).

* Muchas moléculas aromáticas (especialmente aquellas con grupos funcionales capaces de unirse
por enlaces de hidrógeno) forman dímeros u otros agregados en disolución. Esta tendencia,
lógicamente será mayor a altas concentraciones de soluto. Considerando que, con frecuencia, los
dímeros son menos fluorescentes que el correspondiente monómero, se observará un descenso de
If como consecuencia de la formación de estas especies dímeras.

Por otra parte, ciertos compuestos en estado singulete excitado tienen tendencia a formar
asociaciones con moléculas de su misma especie en estado fundamental. El espectro de emisión de
estas asociaciones suele estar desplazado hacia mayores longitudes de onda respecto al del
correspondiente monómero.

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