Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
F PDF
F PDF
F PDF
Tema 4
METODOS LUMINISCENTES
X + CALOR
X + hν X*
X + calor + h ν'
absorción emisión
(espectrofotometría) (fotoluminiscencia)
FUNDAMENTO DE LA FOTOLUMINISCENCIA
M = 2S + 1
Muchas moléculas orgánicas tienen un número par de electrones, por lo que S=0 y
M=1. A dicho estado se le denomina singulete. El estado energético más bajo (estado
fundamental) deberá ser uno en el cual todos los electrones estén apareados, y a
dicho estado se le denomina estado singulete fundamental (figura 4.1.a.)
π∗ π∗ π∗
π π π
a b c
singulete fundamental singulete excitado triplete excitado
Relajación vibracional
v2 Conversión interna
S v1
2
v0 Cruzamiento
entre sistemas ..
S1
v2 T
v1 1
v0
E
desactivación no radiante
Absorción
Fluorescencia
Fosforescencia
v2
So v1
v0
λ2 λ1 λ3 λ4
* Las moléculas con electrones desapareados (número impar de electrones) constituyen un estado doblete y
es el caso, por ejemplo, de radicales libres orgánicos.
Claudio González Pérez 5
Una vez adquirido el estado triplete, la molécula puede llegar al nivel vibracional
inferior mediante procesos de relajación vibracional, y posteriormente emitir un fotón
para retornar finalmente al estado fundamental. Esta emisión se denomina
fosforescencia.
* En época relativamente reciente, ha sido posible observar fosforescencia a temperatura ambiente cuando la
muestra se incorpora a una matriz sólida.
Claudio González Pérez 7
.
.
CH 2
fluoreno bifenilo
– –
COO COO
fluoresceína fenolftaleína
Métodos luminiscentes 8
(el primer estado singulete excitado) posee un carácter ácido diferente del estado
fundamental. Algo parecido sucede con los estados triplete, si bien, en menor medida.
Influencia del oxígeno disuelto. El efecto del oxígeno disuelto es uno de los
problemas más molestos de la fluorimetría, ya que a menudo reduce la intensidad de
emisión de una disolución fluorescente. Normalmente, el oxígeno presente en
concentración 10–3 M reduce la emisión fluorescente del orden del 20%. Por ello, es
necesario desairear las disoluciones antes de llevar a cabo la medida.
P –ε bC
T= = 10
Po
P –ε bC
1– = 1 – 10
Po
Po – P = Po (1 – 10–εbC)
If = k φf (Po–P)
2 3
–ε bC 2.3ε bC 2.3ε bC
1 – 10 = 1 – 1 – 2.3ε bC + – +… =
2! 3!
2 3
2.3ε bC 2.3ε bC
= 2.3ε bC – + –…
2! 3!
de donde,
2 3
2.3ε bC 2.3ε bC
If = k φ f Po 2.3ε bC – + –… [I ]
2! 3!
If = k φf Po 2.3 ε b C
If = K C
K Po
If
fluorescencia
no uniforme
fluorescencia
uniforme
C
Figura 4.4. Relación entre la intensidad de fluorescencia y la concentración.
INSTRUMENTACION
Muestra
Fuente de monocromador
radiación (o filtro)
de excitación
.
Medidor monocromador
Detector (o filtro)
o registro de emisión
.
Figura 4.4. Componentes básicos de un fluorímetro.
Por lo que respecta a las redes, ofrecen las ventajas de presentar resolución
uniforme y dispersión lineal a todas las longitudes de onda. El mayor inconveniente es
que pasan varios órdenes espectrales, lo cual puede evitarse usando filtros en el
camino óptico.
Métodos luminiscentes 16
Las cubetas utilizadas para contener la muestra suelen ser de cuarzo, para
permitir el paso de la radiación ultravioleta. Las más típicas son de 1 cm de espesor,
como las utilizadas para medidas de absorción, excepto que todas las caras son
transparentes a la radiación (están pulidas), ya que generalmente las medidas de
fluorescencia se realizan en un ángulo de 90º respecto a la radiación incidente; a otros
ángulos, la dispersión por la disolución y las propias paredes de la cubeta puede
originar mayor ruido de fondo.
Excitación - absorción
Fluorescencia
* Estas bandas, ordinariamente llamadas "transiciones 0–0" se producen como consecuencia de transiciones
entre niveles vibracionales cero de los estados fundamentales y primer estado singulete excitado.
Métodos luminiscentes 18
APLICACIONES
Sustancias inorgánicas
transición poseen una gran cantidad de niveles energéticos poco espaciados, lo cual
aumenta la probabilidad de desactivación por conversión interna.
Tabla 4.1.
Determinación fluorimétrica de especies inorgánicas
Quelatos fluorescentes
Especie Reactivo Sensibilidad
( g/mL)
Ag+ Butilrodamina S 0.01
Al3+ Morina 0.05
Al3+ Rojo de alizarina R 0.007
Cu2+ Luminocupferrón 0.1
Li+ 8-hidroxiquinoleína 0.2
Sn4+ Flavonol 0.1
Determinaciones indirectas
Especie Reactivo Sensibilidad
( g/mL)
Cl– Nitrato de uranilo 1.0
F– Al–morina 0.2
PO43– Al–morina 0.05
– 2–
2 + 4 CN 2 + Pd(CN) 4
N N
O O–
Pd/2
SO 3K 2+
Mg
N
O
Mg/2
fluorescente
Claudio González Pérez 21
Sustancias orgánicas
Tabla 4.2.
Determinación fluorimétrica de vitaminas
CH3
Vitamina A
Dentro del grupo de vitaminas B, las hay que presentan fluorescencia nativa,
como la B2 (riboflavina) y la B12 (cianocobalamina), mientras que otras, como la B1
(tiamina) y la B6 (piridoxina) necesitan una transformación previa, lo cual se consigue
por oxidación con ferricianuro y permanganato rspectivamente.
O O– O
OH
. OH N=
O .
O O
[I] [II]
O O
O Zn O
H2 O Cl H2 O
[III]
Tabla 4.3.
Determinación fluorimétrica de fármacos y drogas
NH 2
NCO NHCNHCH 2
+ 2
.
NCO
NHCNHCH 2
FOSFORESCENCIA
Las medidas de fosforescencia se llevan a cabo de forma análoga a las de
fluorescencia, excepto en lo siguiente: la muestra normalmente se mide a la
temperatura del nitrógeno líquido (77ºK) para minimizar la desactivación por
colisiones, y la excitación debe ser interrumpida un cierto tiempo para observar la
emisión de fosforescencia en ausencia de la emisión fluorescente. Para ello se utilizan
dispositivos como el representado en la figura 4.6.
.
Figura 4.6. Medida de fosforescencia.
QUIMIOLUMINISCENCIA
La quicio-luminiscencia se origina cuando se produce una especie excitada como
consecuencia de una reacción química.
A + B —> X*
X* —> X + hν
NH 2 NH 2
O –
COO
NH –
. + OH + O 2 + N 2 + 2 H2 O + hν
NH –
COO
O
Claudio González Pérez 29
Tabla 4.4.
Determinación quimioluminiscente de metales
La respuesta es lineal entre 1 ppb y 10000 ppm. Esta reacción se utiliza también
para la determinación de NO2 en muestras de interés ambiental. En este caso, es
necesaria una reducción previa de NO2 a NO, lo cual se lleva a cabo operando a 800 º
en presencia de radiación ultravioleta.
UV
NO 2 NO
800º
+O 3 NO 2 *+ O 2
NO 2 + h ν