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3.- CROMATOGRAFÍA DE AMINOÁCIDOS

3.- CROMATOGRAFÍA DE AMINOÁCIDOS

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En esta práctica se realizó una de las técnicas más sencillas para identificación de aminoácidos que fue la combinación de la cromatografía en capa fina con la reacción de la ninhidrina con la cual se peden identificar los aminoácidos por la tinción color morado o magenta que se presenta en ellos, excepto con la prolina la cual, da un tono amarillo al reaccionar con la ninhidrina debido a que no produce amonio al reaccionar con ella, lo que indica que los demás aminoácidos que si presentaron esta reacción.

Se investigaron teóricamente algunos métodos de identificación de los aminoácidos, pero principalmente por medio de cromatografías, a que esta es la técnica principal que se empleo para la técnica, así como algunas de las reacciones coloreadas principales para los aminoácidos.

Los objetivos principales de esta práctica fueron llevar a cabo la separación de aminoácidos por medio de las cromatoplacas utilizadas siendo así la fase móvil el eluyente que fue una mezcla de solventes y la fase móvil, el aminoácido utilizado en cada placa. Se utilizaron para esto 11 aminoácidos y una proteína que fue la caseína para compararlos con ella sin embargo no se observó un factor de rendimiento igual al de la caseína, no por que no tuviera esta ninguno de los aminoácidos que se utilizaron sino que para que se pudieran comparar sus aminoácidos e hubiera tenido que hidrolizar primero esta proteína para comparar sus residuos con los aminoácidos utilizados.

Se logro concluir que el factor de retención obtenido se debía dependiendo de las características de cada aminoácido ya que dependiendo de si estos eran o no polares o incluso neutros iban a tener mayor o menor factor de retención, esto debido a que un factor de retención alto indica una gran afinidad del compuesto por el disolvente y si el eluyente es polar va a jalar consigo a los compuestos polares por el contrario si no es polar, entonces jalara a los compuestos no polares.
En esta práctica se realizó una de las técnicas más sencillas para identificación de aminoácidos que fue la combinación de la cromatografía en capa fina con la reacción de la ninhidrina con la cual se peden identificar los aminoácidos por la tinción color morado o magenta que se presenta en ellos, excepto con la prolina la cual, da un tono amarillo al reaccionar con la ninhidrina debido a que no produce amonio al reaccionar con ella, lo que indica que los demás aminoácidos que si presentaron esta reacción.

Se investigaron teóricamente algunos métodos de identificación de los aminoácidos, pero principalmente por medio de cromatografías, a que esta es la técnica principal que se empleo para la técnica, así como algunas de las reacciones coloreadas principales para los aminoácidos.

Los objetivos principales de esta práctica fueron llevar a cabo la separación de aminoácidos por medio de las cromatoplacas utilizadas siendo así la fase móvil el eluyente que fue una mezcla de solventes y la fase móvil, el aminoácido utilizado en cada placa. Se utilizaron para esto 11 aminoácidos y una proteína que fue la caseína para compararlos con ella sin embargo no se observó un factor de rendimiento igual al de la caseína, no por que no tuviera esta ninguno de los aminoácidos que se utilizaron sino que para que se pudieran comparar sus aminoácidos e hubiera tenido que hidrolizar primero esta proteína para comparar sus residuos con los aminoácidos utilizados.

Se logro concluir que el factor de retención obtenido se debía dependiendo de las características de cada aminoácido ya que dependiendo de si estos eran o no polares o incluso neutros iban a tener mayor o menor factor de retención, esto debido a que un factor de retención alto indica una gran afinidad del compuesto por el disolvente y si el eluyente es polar va a jalar consigo a los compuestos polares por el contrario si no es polar, entonces jalara a los compuestos no polares.

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CROMATOGRAFÍA DE AMINOÁCIDOS

MANCILLA, C. G. E.; CASTREJÓN, C. R. ROSAS, T. M; BLANCO, E. Z.; y PÉREZ, S. L. J.;
Q.F.B.; V Semestre: Universidad del Valle de México, Campus Chapultepec
(Av. Constituyentes No. 151 Col. San Miguel Chapultepec. C.P. 11850 México, DF.)

Resumen………………………………………………………………..….1 Introducción……………………………………………………………..…2 I.- Separación de moléculas por cromatografía…………….….…….……....2 II.-C cromatografía de reparto………………………………………….…….…3 III. Cromatografía en capa fina………………..…………………………………3 IV. Cromatografía de adsorción……………………..……………………….…..4 V. Cromatografía de intercambio iónico………………………………………..4 VI. Cromatografía de exclusión molecular………………………………………8 VII. Reacciones coloreadas de aminoácido………………………………………4 Objetivo………….………………………………………….……………..…..6 Hipótesis………...……………………………………………….……………6 Material………………...……………………………………….……………..6 Procedimiento………….………………………………………….…………..6 Resultados………………………………………………………………………7 Discusión de Resultados………………………………….………… ………..8 Conclusiones…………………………………………….…………………….9 Referencias……………………………………………….……………...……..9

RESUMEN: En esta práctica se realizó una de las técnicas más sencillas para identificación de aminoácidos que fue la combinación de la cromatografía en capa fina con la reacción de la ninhidrina con la cual se peden identificar los aminoácidos por la tinción color morado o magenta que se presenta en ellos, excepto con la prolina la cual, da un tono amarillo al reaccionar con la ninhidrina debido a que no produce amonio al reaccionar con ella, lo que indica que los demás aminoácidos que si presentaron esta reacción. Se investigaron teóricamente algunos métodos de identificación de los aminoácidos, pero principalmente por medio de cromatografías, a que esta es la técnica principal que se empleo para la técnica, así como algunas de las reacciones coloreadas principales para los aminoácidos. Los objetivos principales de esta práctica fueron llevar a cabo la separación de aminoácidos por medio de las cromatoplacas utilizadas siendo así la fase móvil el eluyente que fue una mezcla de solventes y la fase móvil, el aminoácido utilizado en cada placa. Se utilizaron para esto 11 aminoácidos y una proteína que fue la caseína para compararlos con ella sin embargo no se observó un factor de rendimiento igual al de la caseína, no por que no tuviera esta ninguno de los aminoácidos que se utilizaron sino que para que se pudieran comparar sus aminoácidos e hubiera tenido que hidrolizar primero esta proteína para comparar sus residuos con los aminoácidos utilizados. Se logro concluir que el factor de retención obtenido se debía dependiendo de las características de cada aminoácido ya que dependiendo de si estos eran o no polares o incluso neutros iban a tener mayor o menor factor de retención, esto debido a que un factor de retención alto indica una gran afinidad del compuesto por el disolvente y si el eluyente es polar va a jalar consigo a los compuestos polares por el contrario si no es polar, entonces jalara a los compuestos no polares.

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INTRODUCCIÓN A menudo se tienen mezclas de aminoácidos que se desean analizar. Antes de poder cuantificar estas mezclas es necesario separarlas. Tres métodos de separación han sido frecuentemente empleados en los laboratorios:

segundo sistema de solventes. Los fosfoaminoácidos pueden revelarse con un reactivo de ácido fosfomolíbdico para permitir su identificación. Los sistemas en los que las placas se desarrollan en ambas direcciones (en este caso se aplica sólo una muestra por placa) se conocen como TLC bidimensional.

Cromatografía de capa fina. Este método se basa en la separación de las moléculas adsorbidas a una capa muy delgada de gel de sílice, mediante el flujo de una columna de solvente que se deja ascender mediante capilaridad. La separación se realiza en base a la polaridad de las moléculas y la mezcla de solventes más empleada ha sido butanol: agua: ac. acético (4:1:1). La fase estacionaria es la celulosa del papel y la móvil una mezcla de disolventes orgánicos y agua. La celulosa retiene una cierta cantidad de agua entrelazada entre sus fibras y puede dar lugar a un mecanismo de reparto de los componentes de una muestra aplicados sobre ella cuando se hace fluir un disolvente de polaridad distinta de la del agua. Según la solubilidad que tengan los componentes de la muestra respecto de las dos fases así será su movilidad.[1, 2]

Cromatografía líquida en columnas de intercambio aniónico. En este caso, los aminoácidos se hacen pasar por una columna de resina con un grupo catiónico. Los aminoácidos, según su carga se van a unir a la columna y luego, mediante un cambio gradual en el pH del solvente que se aplica a la columna, se va eluyendo cada aminoácido a un pH distinto (según su punto isoeléctrico). Como algunos aminoácidos son más dificiles de separar que otros, a menudo es necesario emplear una columna corta para separar un grupo de aminoácidos y una columna larga para separar los aminoácidos restantes. Cromatografía líquida de alta resolución en columnas de fase reversa. Este método consiste en aplicar los aminoácidos disueltos en una fase acuosa acidificada a una columna de sílice unida a una cadena hidrocarbonada. Los aminoácidos, según su polaridad se van a unir a la columna y entonces el eluyente se mezcla gradualmente con cantidades cada vez mayores de un solvente menos polar que el agua. Los aminoácidos van siendo lavados de la columna conforme la polaridad del solvente baja lo suficiente.[1]

Las mezclas de aminoácidos pueden separarse en placas de capa fina de gel de sílica, empleando como fase móvil butanol:agua:ácido acético (4:1:1). Las manchas de los aminoácidos pueden detectarse sobre la placa desarrollada, si después de secarla se asperja con una solución de ninhidrina. Los aminoácidos aparecen como manchas púrpura sobre un fondo ligeramente amarillento. Sin embargo, la prolina (que no produce amonio libre al reaccionar con ninhidrina) genera una mancha de color amarillo oscuro. Este método, aunque no es muy sensible, se empleó con frecuencia en los primeros estudios de la composición de las proteínas. En la actualidad ha sido desplazado por la cromatografía líquida de alta resolución, ya que esta última es más confiable para la cuantificación y tiene mayor sensibilidad si los aminoácidos se detectan por fluorescencia. Sin embargo, la cromatografía de capa fina se sigue empleando para determinar fosfoaminoácidos, ya que de esta manera es posible identificar si una determinada fosfoproteína, se encuentra fosforilada en serina, treonina o tirosina. Para ello, la proteína debe degradarse hasta liberar los aminoácidos que la componen y luego esto se separan en una placa de gel de sílica. La placa se gira 90o y se desarrolla con un

La cromatografía se engloba dentro de las llamadas técnicas de separación y permite el análisis de mezclas complejas de compuestos muy estrechamente relacionados químicamente. Son varias las modalidades usadas y se clasifican según la fase móvil (de gases, líquida) y por el tipo de soporte (columna, capa fina, papel) usados. La separación se lleva a cabo según la distinta interacción que presenta cada uno de los componentes de una muestra respecto a dos fases: una estacionaria y otra móvil que fluye sobre ella. Esta interacción puede ser de varios tipos que a su vez dan lugar a distintas subclases de cromatografía: de absorción, de reparto, de cambio iónico, de afinidad, etc. [2] Separación de moléculas por cromatografía El estudio y caracterización de las distintas biomoléculas (azúcares, lípidos, proteínas, ácidos nucleicos, etc.) requiere en numerosos casos su

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aislamiento y purificación a partir de mezclas complejas como son los preparados de cualquier material biológico. Una de las técnicas bioquímicas más clásicas y utilizadas para dicho fin es la cromatografía. La cromatografía incluye una amplia gama de técnicas, que se pueden clasificar atendiendo al fundamento físico-químico en el que se basa la separación (cromatografía de adsorción, de reparto, de cambio iónico, de filtración molecular, hidrofóbica y de afinidad), o al material sobre el que se lleva a cabo (cromatografía en papel, capa fina, en columna y de gases).[3] Cromatografía de reparto En la presente práctica llevaremos a cabo una cromatografía de reparto, en capa fina, para la separación de aminoácidos. En la cromatografía de reparto los componentes de una mezcla se separan en base a una distribución diferente entre la fase móvil y la fase estacionaria. El movimiento relativo de las moléculas a lo largo del sistema cromatográfico es el resultado de un equilibrio entre las fuerzas de transmisión o arrastre ejercido por la fase móvil en su desplazamiento sobre la fase estacionaria y las fuerzas que tienden a frenar dicho desplazamiento. Las fuerzas de frenado pueden ser tanto de reparto (basado en criterios de solubilidad) como de adsorción. [4] La teoría de la cromatografía de reparto se basa en que, en general, si dos fases inmiscibles se encuentran en contacto una con otra y si una de las dos fases contiene un soluto, éste se distribuirá entre ambas de acuerdo con sus solubilidades relativas. Dicho fenómeno se denomina reparto y viene determinado por el coeficiente de reparto, que es la relación entre las concentraciones del soluto, en el equilibrio, en las dos fases. En la cromatografía de reparto tenemos un soporte inerte al que está unida la fase estacionaria líquida. La mezcla a separar junto con la fase móvil se hace avanzar a lo largo de la fase estacionaria por capilaridad. En dicho avance, la fase móvil arrastrará consigo un porcentaje de moléculas de cada componente a separar de acuerdo con los respectivos coeficientes de reparto. La distancia recorrida por cada uno de los componentes de la muestra dependerá de la cantidad de solvente o eluyente que se haga pasar y de los coeficientes de reparto, de manera que si éstos son diferentes aquélla también lo será, siendo posible la separación si se utiliza el volumen de eluyente apropiado. En su desplazamiento, las moléculas de soluto se distribuirán no puntualmente, sino formando un área debido a que son parcialmente solubles en las dos fases y a otros fenómenos tales como la difusión. [5]

En la cromatografía de reparto se suelen utilizar diversos materiales como soportes: almidón, celulosa, gel de sílice, óxido de aluminio, etc. Aunque en teoría se consideran inertes, pueden generar diferentes procesos de adsorción, por lo que la separación ocurrirá también, en parte, debido a la interacción entre las moléculas a separar con dicho soporte, la cual actuaría como fuerza de frenado. La fase estacionaria se forma suspendiendo o embebiendo el soporte con el solvente adecuado; éste recubre las partículas del soporte y es retenido por adsorción y/o capilaridad. El espacio entre las partículas del soporte será utilizado por la fase móvil para su desplazamiento.[6] Debemos de tener en cuenta que como fase móvil se suelen utilizar solventes hidrófobos cuando haya que separar compuestos no polares y solventes acuosos cuando haya que separar sustancias polares. Por su parte, la fase estacionaria, que debe ser al menos parcialmente inmiscible con la móvil, suele ser por lo general hidrofílica, aunque también pueden utilizarse compuestos hidrófobos.[7] Cromatografía en capa fina En la cromatografía en capa fina, CCF o TLC ("thinlayer chromatography, en la terminología inglesa) se puede utilizar como soporte cualquier sustancia que pueda dividirse en partículas finas y distribuirse uniformemente en forma de láminas. Esto incluye sustancias inorgánicas (gel de sílice, óxido de aluminio, tierra de diatomeas, silicato de magnesio, etc) y orgánicas (celulosa, poliamida, polietileno, etc). La utilización de soportes hidrófobos facilita la separación de compuestos no polares (lípidos, por ejemplo). En la CCF, la fase estacionaria es una lámina de 0,25-0,50 mm de espesor, extendida de forma uniforme sobre la superficie de una placa de vidrio o plástico. Aunque muchas casas comerciales suministran placas ya preparadas, éstas pueden hacerse en el laboratorio con aparatos especiales que permiten extender sobre la placa de vidrio o plástico la “papilla” formada por la suspensión del material en un disolvente adecuado (generalmente agua). La placa ha de dejarse secar antes de su utilización. [8] Para el desarrollo de la cromatografía, las muestras, en un disolvente adecuado, se aplican puntualmente con la ayuda de jeringas, micropipetas o capilares en un extremo de la placa. El volumen de muestra a aplicar es crítico, ya que va a afectar a la resolución (separación de los componentes de una mezcla compleja), y depende de la concentración del compuesto o compuestos de interés en la muestra. Para soluciones

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concentradas bastará una cantidad muy pequeña (rango de μl) para aplicar suficiente cantidad de los solutos a separar sin llegar a saturar la capacidad de resolución de la placa cromatográfica. Para soluciones muy diluidas, deberá aplicarse un volumen suficiente (de hasta varios ml) para asegurar una cantidad detectable de soluto o solutos de interés. En este caso conviene hacer la aplicación en pequeños volúmenes fraccionarios, no procediéndose a una nueva adición hasta haberse secado totalmente la precedente (de lo contrario la superficie de aplicación se haría muy grande, distando mucho de la situación ideal de concentración de la muestra en un solo punto de aplicación). Una vez aplicada y seca la muestra, la placa se introduce en un recipiente cerrado (tanque cromatográfico) y uno de los extremos (el más próximo a la línea de aplicación) se sumerge en un disolvente apropiado (fase móvil), cuyo nivel en el fondo del tanque debe quedar por debajo de la línea de aplicación. El solvente se desplaza a través del soporte por capilaridad provocando un reparto de los solutos entre él y la fase estacionaria de acuerdo con sus solubilidades relativas (coeficientes de reparto). Una vez que el solvente haya alcanzado un punto próximo al otro extremo de la placa, ésta se saca del tanque y se seca. [9] Las manchas correspondientes a cada compuesto, si no son visibles, se pueden revelar mediante técnicas analíticas concretas. Se determina la posición de cada mancha relativa al frente alcanzado por el solvente, calculándose el correspondiente valor de Rf. La detección de los compuestos una vez realizada la cromatografía se puede llevar a cabo en base a sus propiedades espectroscópicas, fluorimétricas, haciéndolos reaccionar con reactivos específicos, radioisotópicamente, etc. La identificación de tales compuestos se suele realizar comparando sus Rf con los de compuestos de referencia (patrones) de naturaleza química conocida. Alternativamente, los diferentes compuestos, una vez localizada su posición por un método no destructivo, pueden eluirse de la placa raspando las zonas correspondientes y extrayendo el polvo obtenido con un solvente adecuado. [10] Uno de los factores más críticos en este tipo de cromatografías es la elección de la fase móvil, que, básicamente, suele estar formada por una mezcla de un solvente orgánico con agua y algunas sustancias adicionales tales cómo ácidos, bases, agentes acomplejantes, etc., cuya finalidad es aumentar o disminuir la solubilidad de algunos compuestos. Además de en una sola dirección, la CCF puede también realizarse bidimensionalmente. En este caso sólo se aplica una única muestra, que se dispone en uno

de los vértices de la placa y se eluye dos veces, normalmente con solventes diferentes, y en direcciones perpendiculares.[11] La CCF presenta una serie de ventajas respecto a cromatografías alternativas, como es la de papel, tales como las siguientes: i) Una mayor resolución, obteniéndose por lo general manchas más pequeñas. ii) Una mayor velocidad de separación. iii) Pueden utilizarse un gran número de materiales como soportes y disolventes. iv) Los compuestos pueden ser detectados con facilidad y su recuperación es muy simple. La mayor resolución obtenida por CCF se debe a que pueden formarse partículas muy finas del soporte, por lo que la relación superficie/volumen es muy elevada, proporcionando una gran área superficial por unidad de longitud. Esto se traduce en que la cantidad de muestra que se puede aplicar es mayor y la difusión es mucho menor. La ventaja respecto a la cromatografía en papel es que éste tiene una estructura fibrosa y la capilaridad asociada a las fibras tiende a aumentar la difusión de las moléculas.[12] Cromatografía de Adsorción: Está basada en la diferente adsorción y posterior desorción de sustancias contenidas en un disolvente móvil (líquido o gas) sobre un sólido estacionario. No se debe confundir la adsorción que es un fenómeno de superficie que se manifiesta por el aumento de concentración de la interfase que rodea al medio estacionario, con la absorción que consiste en la penetración de una sustancia en el seno de otra. Ejemplos de cromatografía de adsorción son la cromatografía en columna de alúmina y de carbón activado, la placa de sílica gel.[13] Cromatografía de Intercambio Iónico: La fase estacionaria es una matriz polimérica porosa que posee grupos iónicos unidos covalentemente y contraiones móviles que pueden ser intercambiados por iones arrastrados por la fase móvil (líquido).[14] Cromatografía de Exclusión Molecular: Las moléculas pueden ser separadas también sobre la base de sus diferentes tamaños al pasar a través de una columna que contiene partículas hidratadas de geles porosos. Se encuentra en el mercado un buen número de materiales para estos fines, cuya composición y

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porosidad son controladas cuidadosamente, de modo que moléculas de tamaño relativamente parecido puedan ser separadas mediante la adecuada selección del tamaño del poro gel (tabla 1). El Sephadex consta de partículas pequeñas de dextrano formadas por una red tridimensional de cadenas de polisacáridos ramificados. Es altamente polar debido a su alto contenido de grupos hidroxilos, por ello se hincha considerablemente cuando se coloca en agua. La mezcla de moléculas grandes y pequeñas se colocan sobre la superficie libre superior del gel. A medida que la muestra desciende por la columna, las moléculas pequeñas difunden dentro del gel teniendo que recorrer un camino más largo, mientras que las moléculas grandes pueden ser completamente excluidas de los poros del gel. Eventualmente se obtiene una separación completa en la que las moléculas grandes salen primero de la columna y por último las más pequeñas. El resultado de la columna cromatográfica se expresa en la forma de un diagrama de elución que muestra la variación de la concentración del soluto en el eluyente versus el volumen del eluyente que ha pasado por la columna. De este diagrama se obtiene el volumen de elución. El volumen de elución (Ve) no es un criterio para definir el comportamiento de un compuesto, ya que varía con el volumen total de la columna (Vt) y la forma como la columna ha sido empaquetada. Para ello se utiliza la constante Kav

presente. Para cada prueba se utilizará un control negativo, también denominado blanco de la reacción, en el que el reactivo se añadirá a agua destilada (o solvente adecuado). Aunque en la presente práctica se llevará a cabo la determinación cualitativa de aminoácidos (ausencia o presencia de dichos compuestos), las reacciones coloreadas pueden también ser utilizadas para la determinación cuantitativa de dichas biomoléculas. Hay una amplia gama de métodos colorimétricos que permiten la determinación cuali- y cuantitativa de aminoácidos. Aunque son métodos muy generales, algunos de ellos permiten discriminar entre diferentes tipos de estos compuestos. Así, hay métodos de determinación de aminoácidos con el grupo amino libre (método de la ninhidrina), de aminoácidos con núcleos aromáticos (reacción xantoproteica), de los que poseen un grupo indólico (triptofano; reacción con el ácido glioxílico), un anillo fenólico (tirosina; reacción de Millon), de aminoácidos azufrados (cisteína; reacción con nitroprusiato sódico). En todos los métodos, el aminoácido reacciona con otro compuesto formando derivados coloreados que se pueden determinar cuantitativamente por espectroscopia visible. De todos los métodos reseñados, el más general y utilizado es el de la reacción con la ninhidrina. La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminoácidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formación de amoniaco y anhídrido carbónico, con reducción del reactivo (ninhidrina) a hidrindantina. La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y otra molécula de ninhidrina para dar un compuesto de adición doble que presenta una coloración azulpúrpura, con la excepción de la prolina que da una coloración amarillenta (recordar que en la prolina el grupo amino está sustituido). El derivado coloreado presenta máximo de absorción en torno a 570 nm. La reacción se lleva a cabo en caliente y a valores de pH comprendidos entre 4 y 8. Las aminas primarias (R-CH2 –NH2) dan también positiva la prueba de la ninhidrina, aunque en este caso no se libera CO2 La técnica es muy sensible, por lo que es ideal para detectar concentraciones bajas de aminoácidos, utilizándose para revelar su presencia en cromatogramas y fracciones procedentes de otras técnicas de separación. La presencia de aldehídos resultantes de la degradación de la ninhidrina por reacción con los aminoácidos modifica, bajo ciertas condiciones, el color formado, lo que sirve para identificar el tipo de aminoácido.[17]

K av =

v −v v −v
e t

0 0

En cromatografía de exclusión el volumen de la fase móvil se llama volumen intersticial (V0). El valor de V0 se determina haciendo pasar por la columna una molécula grande e inerte de peso molecular superior al límite de exclusión del gel. El azul de dextrano 2000, un colorante con peso molecular de 2*106, se utiliza generalmente con este propósito. Cuando no se dispone de la información adecuada para este cálculo, el Vo se puede estimar como el 35% del volumen total de la columna (Vt). El volumen total de la columna se calcula a partir de las dimensiones de la columna (Vt = π · r2 · h ).[15] Reacciones coloreadas de aminoácidos Los métodos colorimétricos de determinación de aminoácidos se basan en la reacción específica de éstos con determinados compuestos, dando derivados coloreados. La formación de color se toma como resultado positivo e indica su presencia, mientras que el no desarrollo de color es indicativo de que no está

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Reacción de aminoácidos con la ninhidrina.[6]

          

valina fenilalanina isoleucina caseína leucina triptofano Agua destilada Ninhidrina N-butanol Ácido acético Acetona

OBJETIVOS

EQUIPO

 Se llevará a cabo la separación de mezclas de  Balanza analítica aminoácidos mediante cromatografía en papel. Se  estufa revelará la presencia de los mismos en el papel mediante reacción con ninhidrina y se identificarán PROCEDIMIENTO en el cromatograma por comparación con la posición de los correspondientes patrones 1.- Preparar: preparados al efecto.  25ml de lisina al 0.4%  25ml de arginina 0.4% HIPÓTESIS  25ml de acido aspártico al 0.4%  25ml de glicina al 0.4% Si se preparan soluciones de aminoácidos a las cuáles  25ml de prolina al 0.4% se les separa por medio de cromatografía de capa fina,  25ml de valina al 0.4% se podrán estudiar estas de acuerdo al rendimiento que  25ml de fenilalanina al 0.4% nos proporcionen además de aprender una técnica de  25ml de isoleucina al 0.4% cromatografía con ninhidrina, la cual les da una  25ml de leucina al 0.4% coloración para revelarlas.  25ml de histidina al 0.4% MATERIAL  25ml de triptofano al 0.4% 2.- Tomar 5ml de cada aminoácido por equipo 3.- Poner en una cromatoplaca una muestra de cada aa.  Gradillas con tubos de ensayo. y una muestra de caseína al 0.1%  Juego de pipetas (0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 ml). Nota: las cromatoplacas miden 3x5 cm.  Probetas (100 y 250 ml). 4.- utilizar como eluyente una muestra de n-butanol,  Vasos de precipitado (100 y 150 ml). acido acético y agua en relación (4:1:5)  Piseta 5.- Cuando se eluyan las muestras dejar secar las  Papel de filtro. cromatoplacas y rociarlas con nihidrina al 0.5% en  Capilares para aplicar muestras. acetona.  Papel de parafilm. Preparar para todo el grupo 100ml de solución de  Rotulador de vidrio. nihidrina al 0.5% en acetona y ponerla en un frasco  Pipetas Pasteur atomizador  Cromatoplacas  Vidrio de reloj SUSTANCIAS      lisina arginina acido aspártico glicina prolina

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¡Cuidado la acetona disuelve el frasco atomizador, así que hay que ponerla en un frasco con tapón esmerilado, mientras se espera para utilizarla! ¡Precaución utilizar guantes de látex para prepararla y para aplicarla, pues mancha la piel, ya que se une a las proteínas de la piel! 6.- revelar las cromatoplacas por calentamiento en una estufa a 90ºC por 10 minutos. Colocar las placas en un vidrio de reloj

Elución de las cromatoplacas 7.- Marcar con un lápiz el frente de disolvente y las manchas 8.- calcular el Rf de cada a.a e identificarlos a.a de la caseína.

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RESULTADOS:

Revelado de las cromatoplacas

7

Rf = Rf =

1.9 = 0.5588 3.4 0.5 = 0.1471 3.4

12. - Histidina

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

 Se utilizó la técnica de cromatografía en capa fina,
la cual se basa en la separación de las moléculas absorbidas a la capa de gel de sílice de la cromatoplaca mediante el flujo de la columna de la mezcla de solventes de agua, butanol y ácido acético. La fase estacionaria es la celulosa y la móvil los disolventes. Según la solubilidad que tienen los aminoácidos de la muestra respecto de las dos fases así fue su movilidad Las manchas de los aminoácidos se observaron sobre la placa desarrollada, por la una solución de ninhidrina rociada y al después ponerla en la estufa.  Los aminoácidos aparecieron como manchas púrpura sobre un fondo ligeramente amarillento. Sin embargo, la prolina (que no produce amonio libre al reaccionar con ninhidrina) genera una mancha de color amarillo oscuro.  Se utilizó la ninhidrina debido a que sirve para la determinación de aminoácidos con el grupo amino libre .La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminoácidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formación de amoniaco y anhídrido carbónico, con reducción del reactivo (ninhidrina) a hidrindantina. La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y otra molécula de ninhidrina para dar un compuesto de adición doble que presenta una coloración azulpúrpura. La ninhidrina reacciona con los aminoácidos formando aductos coloreados según la reacción:

Cálculo del factor de retención 1.- Prolina:

Rf =

1.7 = 0.5213 3.2 1.1 = 0.2895 3.8 1.1 = 0.3548 3.1 0.6 = 0.1935 3.1 0.7 = 0.2188 3.2 0.5 = 0.1613 3.1 0.9 = 0.2647 3.4 0.9 = 0.25 3.6

2.- Glicina

Rf = Rf = Rf = Rf = Rf = Rf =

3.- Isoleucina

4.- Caseína

5. - Lisina

6. - Arginina

7.-ácido Aspártico

8. - Valina

Rf = Rf =

9. - Leucina

1.2 = 0.3529 3.4 1.8 = 0.5 3.6

10. - Fenilalanina

Rf =

11. - Triptofano

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 El reparto de los aminoácidos en el papel se debe a su naturaleza química. Las fórmulas de los compuestos usados como patrón son:

por lo cual es importante esta técnica ya que de esta manera se nos facilitaran saber las características del aminoácido que se este utilizando. REFERENCIAS [1]http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/estructura/EPa mm2.html [2] Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL (2003) Estructura y función de las proteínas. En: “Bioquímica”, 5ª ed. Editorial Reverté (Barcelona, España), pp. 41-76. [3] Luisot P (1982). “Bioquímica Estructural”, 2ª Ed. Editorial AC. [4] Smith I, Feinberg JG (1965) “Paper & Thin Layer Chromatography and Electrophoresis”. Shandon Scientific Company Ltd. Desarrollo histórico de la técnica y aplicaciones. [5] Bermúdez A, Bernal J, Espinosa E, Cornejo W, Briceño I, Prieto JC, Arrieta L [6]http://med.javeriana.edu.co/publi/vniversitas/serial/v 44n3/0023%20propuesta.pdf [7] Lehninger, A.L., Nelson, D.L. y Cox, M.M (1995) Principios de Bioquímica. 2ª Ed. Ediciones Omega. [8] Mathews, C.K. y van Holde, K.E. (1998) BIOQUÍMICA. Editorial Mc-Graw Hill. Interamericana. [9] Voet, D. y Voet, J.G. (1992) BIOQUÍMICA. Ediciones Omega. [10] Iborra, J.L., Lozano, P., Manjón, A., Monserrat, F., Cánovas, M, Obón, J.M. y Castellar, M.R. (1997) Guía de Bioquímica y Biología Molecular para estudiantes de Ciencias e Ingeniería. Editorial DM. [11] Azcon-Bieto, J. y Talón M. (1993) Fisiología y Bioquímica Vegetal. Ed. Interamericana-McGraw Hill. [12] Rawn, J.D. (1989) Bioquímica. Vols. I y II. Ed. Interamericana-McGraw Hill. [13] Stryer, L. (1995) Bioquímica. Vols. I y II. Ed. Reverté. [14]http://www.cursos.ucv.cl/qui34302/XLaboratorios/Laboratorio2REVGuia03.doc [15] Robert Bohinski, 1991. Bioquímica, 5ª Edición, Addison-Wesley, Iberoamericana. [16] Donald Voet and Judith G. Voet, 1998. Biochemistry. John Wiley & Sons. [17] A.L. Lehninger, D.L. Nelson and M.M. Cox, 1993. Principles of Biochemistry (Second Edn.) Worth Publishers. [18] http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimi ca-biol[19]mol/pdfs/11%20CROMATOGRAF%C3%8DA%2 0DE%20CAPA%20FINA%20DE%20AAs.pdf

 El reparto que se obtiene es el siguiente: los aminoácidos apolares son los que mejor interaccionan con el solvente y son arrastrados por él; la lisina presenta la menor movilidad debido a que al pH del solvente, este aminoácido presenta sus dos grupos amino cargados positivamente por lo que interacciona mal con el solvente, mayoritariamente apolar (n-butanol). Los demás aminoácidos se separan entre los aminoácidos apolares y el básico.  Al determinar los factores de retención se puede observar que el triptofano es el que mayor factor de retención obtuvo, esto debido a que es el que tiene mayor afinidad por el disolvente y el de menor factor de retención fue la histidina, es decir, tuvo menor afinidad por el disolvente. CONCLUSIONES Esta técnica de separación cromatográfica es de las más simples, además de que nos permitió estudiar esta técnica y cualitativamente observar la reacción producida por medio de la ninhidrina que permite identificar aminoácidos ya que la reacción de los aminoácidos con ninhidrina se debe a la presencia del grupo α–NH2 en los mismos observándose así una coloración morada o magenta. La prolina no tiene dicho grupo libre, sino –NH- ya que forma parte del anillo de pirrolidina, y al reaccionar con ninhidrina se forma un color amarillo…. El factor de retención depende de la afinidad de los aminoácidos con el disolvente o eluyente utilizado y esto mismo depende del tipo de aminoácido que se utilice, es decir si son polares, apolares, neutros, etc.,

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