PRACTICA DE LABORATORIO

EXTRACCIÓN DE ADN BACTERIANO

Joan David Ayala Agudelo*, MVZ Est, Daniel Castrillon Pulgarin, MVZ
Est.
Universidad de Córdoba, Departamento de Ciencias Pecuarias, Facultad
Medicina Veterinaria y Zootecnia. Berastegui, Colombia, Curso Biologia
Molecular.
*Correspondencia: halo.3.joan@gmail.com

OBJETIVO GENERAL:
Obtener ADN genómico bacteriano de óptima calidad y cantidad para ser
utilizado en técnicas de biología molecular.

OBJETIVOS ESPECIFICOS:

 Adquirir habilidades y destrezas del manejo de los materiales

utilizados para la implementación de la técnica IN HOUSE para la
extracción de ADN bacteriano.
 Conocer las funciones específicas de cada uno de los reactivos
utilizados para esta técnica de extracción de ADN.
 Conocer los pasos primordiales para la extracción de ADN como son:
Lisis celular, desnaturalización de proteínas y precipitación de ADN.

INTRODUCCION

Todo estudio de biología molecular implica la disponibilidad de muestras

de ácidos nucleícos o proteínas. En la mayoría de los casos es el ADN.
Las cantidades necesarias de ADN para realizar estos estudios son lo
suficientemente pequeñas, tanto como cantidades en nanogramos.

Las técnicas de biología molecular para la extracción de ADN bacteriano

son relativamente sencillas. El ADN es estable y casi indestructible
dentro de la célula bacteriana, mostrando fragilidad tan solo fuera de la
célula a enzimas de restricción una vez que la célula es lisada.

La purificación de ADN consta de los siguientes pasos:

 Lisis de la pared bacteriana
 Desnaturalización de proteínas
 Precipitación y rehidratación del ADN
La lisis de la pared bacteriana se realiza por adición de proteínas
enzimáticas que hidrolizan los mucopolisacaridos y el peptidoglicano,
también, la lisis se puede ejecutar por el empleo de detergentes como
el dodecil sulfato de sodio (SDS), deoxicolato de sodio o por el uso de
altas temperaturas (ebullición). El uso de sales permiten quelar
proteínas y precipitarlas, o el uso de solventes orgánicos como el alcohol
isoamilico para separar las proteínas del ADN. Las proteínas pierden su
solubilidad y precipitan, permitiendo separar el sobrenadante que
contiene el ADN del precipitado que contiene las proteínas
desnaturalizadas. Finalmente el ADN es precipitado y purificado por el
uso de etanol e isopropanol, lo que permite que esté sea rehidratado por
la adición de agua ultrapura o bien por el uso de una solución buffer TE
(Tris 10mM, EDTA 10 mM pH 8,0).

El ADN purificado es conveniente para una variedad de aplicaciones,

incluyendo PCR, digestión con enzimas de restricción e hibridación.
MATERIALES Y METODOS

Aislamiento de ADN genómico de bacterias gram-negativas

(Salmonella)

Reactivo Cantidad en Cantidad en mililitros

microlitros
Buffer TEG 200 ul 0.20000 ml
Buffer Lissis 400 ul 0.40000 ml
Acetato de potacio 300 ul 0.30000 ml
Isopropanol 480 ul 0.48000 ml

1. Centrifugamos el cultivo por 10 minutos a una gravedad de

5.100 xG, a 4°C
 Se llevo el eppendorf que contenia las bacterias suspendidas en el
buffer TEG, a la centrifuga y se le aumenta 5.100 veces la
Gravedad, Sabiendo que la gravedad de la tierra es de 9.8 m/s2
por un tiempo de 10 minutos y dejamos enfriar a temperatura
ambiente. Logrando con esto que las bacterias se fijen a la pared
basal del eppendorf y en el sobrenadante (parte liquida) quedan
las sobras bacterianas que son desechadas al terminar de
centrifugar.

2. Adición del buffer TEG (TRI EDTA GLUCOSA).

 Utilizando la pipeta exclusiva de clonación le agregamos 200 ul
del buffer TEG el cual tiene un pH de 7.5, se resuspende
nuevamente teniendo en cuenta que se debe hacer con mayor
fuerza debido a que las bacterias se encuentran fijadas por la
anterior centrifugación, posteriormente dejamos reposar a
temperatura ambiente por 5 minutos.

3. Adición del buffer lisis.

 Luego se le adicionó al eppendorf 400 ul de buffer lisis, el cual
contiene hidrixido de sodio, SDS y pH 8, despues se incubo a
4°C en una caja que contiene hielo por un tiempo de 5 minutos.
 Es importante la observación de la reacción que se presenta, la
cual describiremos posteriormente en el analisis de resultados.

4. Adición de acetato de potasio(KCH3CO2) 3molar.

 Le agregamos al eppendorf 300 ul de acetato de potasio el cual
tiene concentración 3 Molar
  Luego se incubo por 5 minutos a 4°C, posteriormente, se sometio
a la centrifuga por 10 minutos, infringiendole 15.355 xG a 25°C

5. Adición de isopropanol ((CH3)2CHOH) 96%

 Le agregamos 480 ul de isopropanol
 Cubrimos el eppendorf y posteriormente lo re-suspendemos, lo
cual nos permite observar una especie de un hilo transparente
 Luego se incuba por 10 minutos a 4°C
 Se lleva a la centrifuga por 10 minutos donde se le infringe 15.355
Gravedad a 4°C
 Descartamos el sobrenadante, donde se evapora el alcohol
 Le adicionamos 75 ul de buffer TE con un Ph de 8.8
 Observamos el ADN.
ANALISIS DE RESULTADOS

Utilizamos Bacterias Salmonella

Clasificación Cientifica
Dominio Bacteria
Filo Proteobaceria
Clase Proteobacteria
gamma
Orden Enterobacteriales
Familia Enterobacteriaceae
Genero Salmonella

1) En el primer prosedimiento se adecuo la bacteria para poder trabajar

con ella en el laboratorio, mediante los pasos mensionados
anteriormente.

2) En este procedimiento se observo que cuando se la agrega la

Bacteria al eppendorf, y despues de sacarla de la centrifuga, aparese en
el fondo un precipitado (bacterias). Esto sucede, ya que las Bacterias se
encuentran dispersas en un medio acuoso (TEG), y al momento de
infringirle una gravedad fuera de lo normal (5100G), hace que las
Bacterias dispersas se aglomeren en un solo sitio, ayudandonos así a
recoger las bacterias y tenerlas en un sitio especifico, para la utilizacion
de la sustancia de interes (bacterias), y luego desechar el sobrenadante
(resto del cultivo).

3) En este procedimiento se le agrega el buffer TEG debido a que

cumple diversas funciones con cada uno de sus componentes nesasarias
para continuar con el procedimiento de extracción del ADN bacteriano
como son: funciones de glucosa para mantener la presión osmótica,
mientras que el Tris amortigua las células a pH 8. O. El EDTA se une a
los cationes divalentes en la bi-capa lipídica, debilitando así la envoltura
celular, preparándola así posteriormente para la lisis y se deja en
reposo para asegurarse que el TEG sea asimilado en su totalidad por las
bacterias.

4) En este procedimiento se observo que cambia de color transparente,

a un color lila, al igual que cambio su consistensia, tornandose un poco
viscosa. Esto sucede, ya que adicionado el buffer TEG, el cual debilito la
envoltura celular, y posteriormente agregarle el Buffer Lisis, éste
rompe la envoltura celular débil al igual que la nuclear, lo que ocaciona
que todo el contenido intracelular salga al medio exterior donde está
disuelto, en este caso acuoso. Por esta razón, cambio su consistencia
liquida a viscosa, ademas como se trata de una bacteria gram -, por lo
que tiene una capa lipidica delgada, no se tiñe de color azul oscuro o
violeta, por lo que tiñe de rosado y como se habia sometido
previamente a diversos pasos, fue perdiendo su coloracion inicial, por lo
cual se torna un poco de color lila. Ademas se incuba a 5°C, porque a
esta temperatura este tipo de bacteria tiene las condiciones optimas
para un mayor crecimiento, ademas en el medio de cultivo, contaba con
aire, ya que estas bacterias son extrictamente aeorabias, es decir se
reproducen solamente en presencia de aire.

5). En este procedimiento despues de agregarles isopropanol

observamos ADN un color purpura mas oscuro y al fondo las proteinas,
esto se da porque La precipitación de los ácidos nucleicos permite su
purificación y concentración. Se basa en la simultánea neutralización de
las cargas negativas (mediante el añadido de sales), y deshidratación de
la molécula (mediada por el agregado de alcoholes, típicamente etanol o
isopropanol), lo cual lleva a su precipitación.
Luego se lleva a la centrifuga, infringiéndole gravedad (15355G), con el
fin de que el ADN, se adhiera al tubo, para que no se pierda al momento
de desechar el medio acuoso y evaporar el alcohol.

6) Adición del buffer TE

En este procedimiento, luego de que el alcohol se evaporara, el ADN

quedo adherido al tubo que los contenía, el ADN queda adherido al tubo
por la gravedad que se le infringe previamente, luego se le agrega
buffer TE (tris-Edta), que su función es de conservar al ADN y evitar su
degradación.
INFORME DE LABORATORIO (POR GRUPO DE TRABAJO)

PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS.

1. ¿Qué son las endonucleasas?

Las endonucleasas o enzimas de restricción son enzimas de

restricción tienen como función principal ser catalizadores de
proteína, utilizadas por las bacterias para destruir los virus
invasores. Las enzimas de restricción cortan el ADN en sitios muy
específicos, en las secciones del ADN que consisten en cadenas
de cortas bases de ADN, estas son conocidas como secuencias de
reconocimiento.

2. ¿Cómo previene usted la contaminación con endonucleasas en la

extracción de ADN?

Las altas concentraciones de (5M) de NaCL se pueden usan para

prevenir la contaminación de la muestra con polisacáridos que
afectan la pureza del ADN pudiendo inhibir la acción de enzimas
como polimerasas, ligasas, y endonucleasas.

Tambien una forma fácil para evitar la contaminación de

endonucleasas, es que al utilizar una micropipeta siempre utilizar
una punta diferente para cada procedimiento es decir utilizara una
específica para las enzimas de restricción

3. ¿Qué función cumple la lisozima, el fenol cloroformo, el SDS, el

isopropanol, en la extracción de ADN?

La lisozima cumple la función de suavizar las membranas de las

células reduciendo notablemente su integridad, combinación de
fenol y cloroformo a menudo se utilizan como disolventes para
eliminar los contaminantes de los ácidos nucleicos con objeto de
eliminar las proteínas. El SDS (sodio dedecil sulfato), solubiliza
proteínas, tejidos y membranas evitando que una cantidad
significativa de ADN quede atrapada en los desechos o restos
celulares. Para concentrar los ácidos nucleicos suele realizarse una
precipitación con isopropanol.
4. ¿Un ADN de buena calidad cómo se observa en un gel de agarosa?

Se observa la separación de fragmentos de ADN

DISCUSION

Con la realización de este laboratorio de Biología Molecular obtuvimos

importantes conocimientos, habilidades y destrezas para la extracción
de ADN, En este caso de la Bacteria Salmonella, Mediante el
procedimiento IN HOUSE utilizado pudimos seguir de manera secuencial
todos los cambios que va teniendo la bacteria, logrando romper las
membranas que protegen la informacion genetica, fijarlas y concervarlas
para su posterior estudio.

Aunque existen muchos procedimientos para la extracción del ADN,

logramos tener una idea clara acerca de cómo se puede obtener la
información genetica y asi entender, como es posible que aunque
podamos llegar a paracernos mucho a un familiar siempre hay algo que
nos diferencia y esa información que hace posible tal diferencia se
encuentra precisamente en el ADN.

Para nosotros como futuros Medicos Veterinarios Zootecnistas es muy

importante profundizar en cualquir fenomeno biologico y explicar la
naturaleza intima de los procesos que determinan una propiedad o una
funcion de los seres vivos como es el caso de las caracteristicas fisicas,
geneticas entre otras que posee cada animal y que los hace unicos.