UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS,

TECNOLOGÍA E INGENIERÍA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

Introducción

El curso de Microbiología de los alimentos es de tipo metodológico (Teórico-Práctico) y por tanto implica el desarrollo de prácticas
de laboratorio cuyo objetivo principal es ofrecer al estudiante información y la oportunidad de aplicar lo tratado en la teoría en relación
al análisis microbiológico de los alimentos y los contaminantes biológicos de los alimentos.

Dentro de los temas tratados en estas guías de laboratorio se encuentran: la identificación de microorganismos, como bacterias y
hongos, presentes en diferentes superficies; las condiciones ideales de crecimiento de estos microorganismos; el conocimiento
sobre el metabolismo microbiano y la evaluación microbiológica de alimentos.

Cada una de las prácticas incluye: una serie de preguntas que le permiten al estudiante preparar el tema de la práctica con
anticipación, una breve explicación de los fundamentos teóricos necesarios para el logro de los objetivos propuestos, el desarrollo
de la práctica y un cuestionario que le brinda al estudiante la posibilidad de profundizar en el tema tratado.

Estas guías fueron adaptadas al área de alimentos basándose en las guías de Microbiología general elaboradas por la Dra. Angélica
Yara.

Recomendaciones Generales

A continuación encontraran una serie de materiales que son de carácter obligatorio para el ingreso al laboratorio:

 Bata blanca de manga larga

 Gorro
 Tapabocas
 Fósforos
 Hipoclorito de Sodio o clorox
  Papel absorbente
 Pañuelos desechables triple hoja
 Papel de arroz
 Cinta de enmascarar
 Marcador de vidrio
 Tijeras
 Frasco de boca ancha
 Láminas portaobjetos
 Láminas cubreobjetos
 Asas bacteriológicas: curva y recta
 Toalla para manos
 Jabón desinfectante para manos
 Jabón detergente en polvo
 Hisopos, aplicadores de madera
 Alcohol antiséptico
 Churrusco para tubos de ensayo
 Un alimento contaminado con hongos para la primera práctica

El gorro, la bata y el tapabocas son de uso individual e indispensable para el ingreso al laboratorio. El resto de materiales se utilizan
por grupos de, mínimo, 3 personas. Cada grupo debe tener todo el material.

Además se recomienda que tenga en cuenta las siguientes indicaciones:

 Recuerde que en algunas prácticas de laboratorio se trabaja con cepas bacterianas de alta patogenicidad por lo que debe
extremar sus cuidados.
 No debe salir con la bata fuera del laboratorio
 Debe tener especial cuidado con el mechero y el material de vidrio (evitar quemaduras y cortadas)
 Debe trabajar muy concentrado pues un pequeño error o descuido, puede dañar todo su trabajo en el laboratorio y tener el riesgo
de contaminarse con bacterias patógenas.
 Observe el material de vidrio y pida al Tutor y coordinador que le enseñe su adecuada manipulación (cajas de petri, pipetas
diferentes volúmenes, pipetas de pasteur).
 El material de vidrio en microbiología siempre debe ser utilizado estéril por lo que debe ser empacado con papel kraft antes de
ser sometido a un proceso de esterilización. Tenga especial cuidado con la manipulación del material ya que se puede contaminar
 con microorganismos provenientes de las manos.
 Identifique las asas bacteriológicas y reciba las indicaciones de uso por parte del Tutor o coordinador de laboratorio
 Una vez hecha la lectura de los medios de cultivo, quite la cinta de enmascarar .y entregue el material al grupo encargado de la
esterilización.
 Después del proceso de esterilización, espere a que el material este frío para proceder con el lavado de la siguiente manera:

1. Retire los restos de agar y cinta de enmascarar y deposítelos en una bolsa roja para basura. No deje residuos en los
vertederos !!!
2. Enjabone las cajas y demás material utilizado.
3. Enjuague bien, deje escurrir y seque el material.
4. Entregue todo el material al coordinador del laboratorio.

RECUERDE DEJAR EL LABORATORIO EN PERFECTO ESTADO DE LIMPIEZA.

 Práctica No. 1
Aislamiento de microorganismos en diferentes superficies

1. PRE – LABORATORIO

a. ¿Que es bioseguridad?
b. ¿Cuáles son las normas básicas de bioseguridad en el laboratorio de microbiología?
c. Mencione las clases de esterilización, cuales son los agentes de esterilización con más uso en el laboratorio, en que consiste
cada uno de ellos y para qué materiales se utilizan.

Material que se
Agente de Temperatura de
Equipo utilizado puede esterilizar
esterilización Uso (si se aplica)
por este método.
Esterilización con
calor seco

Esterilización con
calor húmedo

Radiaciones

Filtración

d. Establezca las diferencias entre esterilización y desinfección

e. ¿Qué es un medio de cultivo; de qué están compuestos principalmente; cómo se clasifican según su proporción de agar y
según su suministro de nutrientes?
 f. ¿Cuál es la utilidad de los medios de cultivo y qué diferencia un caldo de un medio sólido?
g. ¿Cuál es el fundamento de la coloración de Gram?
h. ¿Qué diferencias encuentra entre bacterias Gram positivas y Gram negativas?
i. ¿Cuáles son las principales características morfológicas y metabólicas de los hongos?
j.
2. OBJETIVOS

- Establecer normas y principios básicos de comportamiento en el laboratorio.

- Aprender y utilizar los métodos de esterilización disponibles en el laboratorio.
- Conocer los materiales y equipos utilizados en el laboratorio de microbiología.
- Aprender la preparación y manipulación de los medios de cultivo.
- Realizar el aislamiento de microorganismos de flora humana, ambiental y de superficies.
- Conocer y estudiar la morfología de bacterias, mohos y levaduras.
- Conocer y aplicar diferentes métodos de tinción para la identificación de los microorganismos.

3. INTRODUCCIÓN

El organismo humano es considerado como un hospedero que puede albergar numerosos microorganismos, que solamente
desarrollarán un poder agresor si las condiciones normales de este hospedero se ven alteradas por situaciones adversas intrínsecas
o extrínsecas, favoreciendo así, la aparición de diferentes procesos infecciosos y de síntomas clínicos.

Esta población microbiana puede denominarse flora normal, microbiota o indígena, localizándose en numerosas áreas del cuerpo
humano y que pueden resumirse así:

Áreas del cuerpo hospederas de flora normal

TRACTO RESPIRATORIO SUSPERIOR

Cavidad Oral
Nasofaringe
Orofaringe
Amígdalas
TRACTO GASTROINTESTINAL BAJO

Ileón
Intestino Grueso

TRACTO GENITOURINARIO

Genitales Externos
Uretra Anterior
Vagina

OJOS

Conjuntiva

PIEL Y MUCOSAS

CONDUCTO AUDITIVO EXTERNO

Sánchez, 1984

Debe comprenderse muy bien el concepto de flora normal y hospedero normal:

Hospedero normal es aquel individuo que alberga un elevado número de microorganismos sin detrimento de su
salud.

Flora normal está constituida por todos aquellos microorganismos que pueden albergarse en un individuo sano, sin cambiar su
condición normal, pero cuando ocurre alguna alteración, ya sea por causas externas o internas, aquellos microorganismos varían
su comportamiento pasivo tornándose agresores activos y desarrollando procesos infecciosos.

Por otro lado, dentro de las normas de calidad, especialmente en el área de alimentos y farmacología, se enfatiza el control
microbiológico de las superficies de trabajo ya que debido a las condiciones de uso habituales o por una mala desinfección, estas
superficies pueden actuar como reservorios de agentes contaminantes, entre los que se incluyen microorganismos y agentes
químicos. Por consiguiente, se hace necesaria la valoración periódica de superficies y ambientes con el fin de mejorar las
condiciones de producción y obtener un producto inocuo y óptimo para su consumo.

La higiene de superficies, equipos y utensilios es uno de los pilares donde se asientan las buenas prácticas de manufactura,
considerado el primer escalón para alcanzar cualquier sistema de calidad que se quiera implantar en la empresa o industria.

4. MATERIALES

- 4 cajas petri con agar nutritivo (para crecimiento de bacterias)

- 2 cajas petri con agar Sabouraud (para crecimiento de mohos y levaduras)
- 1 caja petri con agar Baird Parker
- 1 caja petri con McKonkey /SS
- Frasco de boca ancha con agua y decol
- Tubos con agua destilada estéril
- Hisopos estériles con palo de madera
- Gradilla
- Cinta de enmascarar
- Mechero de bunsen
- Fósforos
- Incubadora
- Microscopio
- Cepas de microorganismos
- Azul de lactofenol
- Azul de metileno
- Colorantes para Gram : Cristal violeta, Lugol, Alcohol acetona, Fucsina.
- Soporte para tinción
- Solución salina fisiológica estéril
- Láminas portaobjetos
- Láminas cubreobjetos
- Cinta pegante
- Asas bacteriológicas
- Papel absorbente
- Frasco de boca ancha
- Cuentacolonias

5. PROCEDIMIENTO: I PARTE

a. Determinación de Flora Ambiental

 Marque una de las cajas de agar nutritivo y otra de agar Saboureaud con cinta de enmascarar (en la base de la caja), así: No.
de grupo, fecha, medio de cultivo y FLORA AMBIENTAL.
 Escoja un sitio seguro en el laboratorio o en la Universidad. Recuerde: No salir con la bata del laboratorio!!
 Retire la tapa de las cajas de Petri marcadas y exponga al aire por 15 a 30 minutos. Solo debe dejar que los medios de cultivo
se expongan al ambiente.
 Pasado el tiempo, cierre las cajas y déjelas en su sitio de trabajo.

b. Determinación de Flora de Superficie

En este caso deberá evaluar una superficie antes y después de utilizar un desinfectante.

Antes de limpiar

 Marque una de las cajas de agar nutritivo y otra de agar Saboureaud con cinta de enmascarar (en la base de la caja), así: No.
de grupo, fecha, medio de cultivo y SUPERFICIE ANTES DE LIMPIAR.
 Escoja una superficie en el laboratorio (mesones, pisos, pared, etc.)
 Delimite el sitio a muestrear (4x4 cm. aproximadamente)
 Encienda el mechero de bunsen.
 Abra el tubo tapa rosca con el agua destilada estéril, introduzca el hisopo para humedecer el algodón. Escurra el hisopo en las
paredes internas del tubo. Coloque el tubo en la gradilla.
 Pase el hisopo humedecido sobre toda la superficie delimitada
 Cerca del mechero, abra la caja de agar nutritivo marcada y pase suavemente el hisopo sobre el agar, haciendo un zig-zag en
la superficie. Cierre la caja.
 Cerca del mechero abra la caja de agar sabouraud marcada y realice el mismo procedimiento que con el agar nutritivo. Cierre
la caja.
 Descarte el hisopo en el frasco de vidrio con agua y clorox que trajo.
 Deje las cajas ya sembradas en su sitio de trabajo.

Procedimiento de Limpieza

Una vez hecho el procedimiento anterior, limpie la zona delimitada con agua y jabón. Enjuague, seque y luego desinfecte con
alcohol, agua mezclada con clorox o algún desinfectante de su interés. Deje secar.

Después de Limpiar

Efectúe el mismo procedimiento que realizó en Antes de limpiar pero recuerde marcar las cajas de petri (agar nutritivo y
Saboureaud) con SUPERFICIE DESPUES DE LIMPIAR.

c. Evaluación de Manipuladores Antes de lavado de manos

 Marque una de las cajas de agar nutritivo con cinta de enmascarar (en la base de la caja), así: No. de grupo, fecha, medio de
cultivo y FLORA HUMANA ANTES DE LAVADO DE MANOS.
 Abra el tubo tapa rosca con el agua destilada estéril, introduzca el hisopo para humedecer el algodón. Coloque el tubo en la
gradilla.
 Pase suavemente el hisopo humedecido sobre cada uno de los dedos y uñas del manipulador. (Escoja la mano dominante del
manipulador)
 Cerca del mechero abra la caja de agar Baird-Parker y de McKonkey/SS marcada y pase suavemente el hisopo sobre el agar,
haciendo un zig-zag en la superficie. Cierre la caja.
 Descarte el hisopo en el frasco de vidrio con agua y clorox que trajo.
 Deje las cajas ya sembradas en su sitio de trabajo.

Procedimiento de Limpieza

El manipulador debe lavarse las manos como rutinariamente lo hace.

Después de Lavado de manos

Efectúe el mismo procedimiento que realizó en Antes de Lavado de manos pero recuerde marcar las cajas de agar Baird-Parker
y de McKonkey/SS con FLORA HUMANA DESPUES DE LAVADO DE MANOS.

d. Identificación microscópica de hongos en alimento

 Coloque cerca al mechero el alimento con hongos y con ayuda de cinta pegante, recoja muestra de la superficie.
 Marque la lámina portaobjetos con cinta de enmascarar: número del grupo y coloración.
 Coloque en el centro de la lámina portaobjetos una pequeña gota de azul de Lactofenol, y luego pegue la cinta a la lámina.
Presione ligeramente para eliminar burbujas de aire.
 Observe en el microscopio en los objetivos de 10x y 40x.

II PARTE: FORMAS DE SIEMBRA

A.Siembra de medio sólido a medio líquido

 Marque correctamente los tubos con el número del grupo, sistema de siembra utilizado y la fecha.
 Encienda el mechero y trabaje siempre a lado de el.
 Caliente el asa recta al rojo y déjela enfriar.
 Con el asa tome un poco de colonia del cultivo, destape el tubo de caldo nutritivo estéril flameando la boca del tubo con el
mechero y deposite la porción de cultivo. Retire el asa, flamee la boca del tubo y tape.
 Caliente el asa al rojo. Esterilícela siempre antes de usarla y después de usarla.
 Incube los tubos a 37ºC por 24 horas.
 Observar el crecimiento obtenido.

B. Siembra de medio líquido a sólido

 Proceda en la misma forma que en la siembra anterior pero con el asa curva
 Si la siembra es e tubo recuerde hacer punción y estría. Si es en caja puede utilizar diferentes sistemas como estría,
agotamiento, rejilla con el fin de lograr un cultivo puro. Pregunte al Tutor o Coordinador de laboratorio en que consisten estos
sistemas de siembra.

C. Siembra de medio sólido a sólido

 Proceda de la misma forma que en la siembra anterior pero utilizando el asa recta.
 Si la siembra es e tubo recuerde hacer punción y estría. Si es en caja puede utilizar diferentes sistemas como estría,
agotamiento, rejilla con el fin de lograr un cultivo puro. Pregunte al Tutor o Coordinador de laboratorio en que consisten estos
sistemas de siembra.
D. Siembra en profundidad

 Marque la caja de petri estéril con el número de grupo, la fecha y Siembra en Profundidad.
 Abra ligeramente la caja cerca del mechero.
 Abra un tubo con cultivo de bacterias y con ayuda de una pipeta de Pasteur plástica, transfiera 1 ml de éste cultivo a la base
de la caja de petri estéril.
 Descarte la pipeta en el frasco de boca ancha con clorox.
 Vierta un poco de agar nutritivo en la caja de petri, tape la caja y luego realice movimientos suaves sobre el mesón, en el sentido
de las agujas del reloj, luego al contrario, en forma de L y L invertida, y por último en forma de 8. Esto garantiza una distribución
homogénea de las bacterias en todo el agar para facilitar su posterior recuento.

Procedimiento Final

 Reúna todas las cajas de agar nutritivo con la tapa hacia arriba y los tubos, envuélvalos con cinta de enmascarar y márquelos
con el número del grupo. Incubar a 37 ºc por 24 a 48 horas.

 Reúna todas las cajas de agar Saboureaud con la tapa hacia arriba, envuélvalas con cinta de enmascarar y márquelas con el
número del grupo. Incubar a temperatura ambiente por 3 a 5 días.

6. RESULTADOS

a. Flora Ambiental
De acuerdo al medio de cultivo utilizado identifique el número y las características macroscópicas y microscópicas de las colonias.
Para las características microscópicas deberá realizar la coloración de Gram (ver anexo al final de las prácticas).

Ambiente analizado

Agar Nutritivo/Agar Saboureaud

Cepa Número de colonias Características Macroscópicas

Características Microscópicas

b. Flora de Superficie: De acuerdo al medio de cultivo utilizado identifique el número y las características macro y
microscópicas de las colonias.

Superficie analizada

Indique la técnica y elementos utilizados en la limpieza de la superficie

Antes de Limpiar

Agar Nutritivo/Agar Saboureaud

Cepa Número de colonias Características Macroscópicas

Características Microscópicas
Después de limpiar

Agar Nutritivo/Agar Saboureaud

Cepa Número de colonias Características Macroscópicas

Características Microscópicas

c. Evaluación del Manipulador: Identifique el número y las características macro y microscópicas de las colonias.

Indique la técnica y elementos utilizados en el lavado de manos

Antes de Lavado de manos

Cepa Número de colonias Características Macroscópicas

Características Microscópicas
Después de Lavado de manos

Cepa Número de colonias Características Macroscópicas

Características Microscópicas

d. Hongos en alimento

Dibuje lo observado en el microscopio y señale las principales estructuras identificadas.

Características Microscópicas
7. CUESTIONARIO

a. Indique la importancia del conocimiento del laboratorio de microbiología, en el área de alimentos

b. ¿Por que no se utiliza medio Saboureaud en la determinación de flora humana?
c. ¿A que se debe la diferencia de incubación entre bacterias y hongos?
d. Indique 5 puntos que debe tener en cuenta el manipulador de alimentos al momento de manejar los alimentos
e. Indique cual es la principal flora normal encontrada en humanos y como se relaciona con las ETA´s
 Práctica No. 2
Condiciones de crecimiento y Metabolismo Bacteriano
1. PRE – LABORATORIO

a. ¿Qué factores intrínsecos y extrínsecos afectan el crecimiento de los microorganismos?

b. Defina los diferentes sistemas de siembra: Punción y estría, agotamiento, rejilla y profundidad.
c. Qué se entiende por metabolismo Bacteriano

2. OBJETIVOS

- Reconocer las principales pruebas metabólicas utilizadas en la identificación de microorganismos Gram negativos.
- Identificar los factores ambientales que afectan el crecimiento en bacterias
- Conocer las diferentes técnicas de siembra y aislamiento de microorganismos a partir de cultivos puros.
- Adquirir destreza en la manipulación de medios de cultivo y cepas microbianas.

3. INTRODUCCIÓN

Prácticamente todos los microorganismos, pero en particular las bacterias, pueden cultivarse sobre substratos nutritivos (medios de
cultivo) para el estudio de sus propiedades y lograr identificarlas. El crecimiento de las bacterias es el resultado de la intervención
de diferentes sustancias alimenticias y principios activos, y donde intervienen factores físicos como la temperatura, pH, tensión de
oxígeno, potencial redox, etc. Para su crecimiento los microorganismos necesitan agua, además de estar presentes en forma
utilizable el carbono, el oxígeno, el hidrógeno, el nitrógeno, el azufre, el fósforo, el potasio, el calcio, el magnesio y el hierro.

Para la selección y diferenciación de los microorganismos se añaden sustancias al medio de cultivo, entre las que se encuentran:
las sustancias selectivas que ofrecen buenas condiciones de crecimiento solamente a determinados organismos, mientras que otros
no pueden proliferar, o solo lentamente. Los aditivos, del medio de cultivo, pueden reaccionar con los productos del metabolismo
bacteriano que son formados sólo por determinados organismos. Esto lleva a modificaciones en el medio (cambio de color, formación
de gas, etc) o influir en el aspecto de las colonias respectivas (ej. Por acumulación de colorante).

Igualmente, en el medio de cultivo se pueden encontrar colorantes, como indicadores, cuyo cambio de color es característico para
un determinado intervalo de pH y obviamente de microorganismos. Algunas sustancias selectivas se emplean como
colorantes: cristal violeta, verde brillante, que inhiben los organismos gram positivos por lo que solamente crecerán los gram
negativos.
Por consiguiente, de acuerdo a la habilidad que tienen los microorganismos para crecer sobre medios de cultivo específicos, así
como la formación de colonias características y una morfología especial, se pueden clasificar en 4 importantes grupos:

a. Microorganismos Gram-positivos : Cocos (Staphylococcus y Streptococcus) y

Bacilos (Corynebacterium y Listeria)
b. Microorganismos Gram-Negativos (crecimiento exigente): Cocos (Neisserias patógenas), Bacilos y Cocobacilos
(Haemophilus), Formas espirales (Campylobacter).
c. Microorganismos Gram-Negativos (crecimiento no exigente): Bacilos
(Enterobacterias y Pseudomonas).
d. Anaerobios estrictos

De otra parte, el paso de una muestra microbiana a un medio de cultivo, ya sea líquido o sólido, se denomina siembra o inoculación.
El paso de una muestra microbiana de un medio de cultivo a otro se denomina resiembra. Estos procedimientos se pueden realizar
de diferentes formas y dependerá de las características de la muestra, del medio en el que se van a sembrar o resembrar, del tipo
de material que se utilice, etc. Entre los métodos más importantes de siembra están: estrías, agotamiento, rejilla y profundidad.

4. MATERIALES

- Tubos con caldo nutritivo estéril

- Tubo con Tioglicolato
- Un tubo con caldo nutritivo pH 3.0
- Un tubo con caldo nutritivo pH 7.0
- Un tubo con caldo nutritivo pH 11.0
- Tubo con Cepa bacteriana
- Tubos con los siguientes medios de cultivo inclinados estériles
 Lisina Hierro Agar (LIA)
 Triple azúcar hierro (TSI)
 Citrato (CIT)
 Sulfuro Indol Motilidad (SIM)
Tubos con los siguientes medios líquidos estériles
 Caldo lactosado BRILLA con campana de Durham
  Caldo nutritivo (CN)
Cajas de petri con los siguientes medios estériles
 Agar nutritivo (AN)
 Eosina azul de metileno agar (EMB)
 S.S. agar (SS)
 Mc Conkey (McCk)
- Hisopos estériles
- Sensidiscos
- Pinzas estériles
- Hipoclorito de sodio al 5%
- Aceite mineral estéril
- Asas bacteriológicas
- Pipeta estéril
- Gradilla
- Incubadora
- Nevera

5. PROCEDIMIENTO

5.1. FACTORES EXTRÍNSECOS E INTRÍNSECOS

a. Influencia de la temperatura

 Marque 3 tubos de caldo nutritivo con los siguientes datos: Tubo 1: No. de grupo, fecha, no. de bacteria
y 4ºC
Tubo 2: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y 37ºC
Tubo 3: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y 55ºC
 Esterilice el asa recta o curva y déjela enfriar
 Recoja con el asa estéril la bacteria indicada y siembre en los tubos marcados.
 Esterilice el asa.
 b. Influencia del pH

 Marque 3 tubos de caldo nutritivo con los siguientes datos: Tubo 1 pH 3.0: No. de grupo, fecha, no. de
bacteria y pH 3.0 Tubo 2 pH 7.0: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y pH 7.0 Tubo 3 pH 11.0: No. de grupo,
fecha, no. de bacteria y pH 11.0
 Esterilice el asa recta o curva y déjela enfriar
 Recoja con el asa estéril la bacteria indicada y siembre en los tubos marcados.
 Esterilice el asa.
c. Influencia de la Tensión de oxígeno

 Marque los tubos de la siguiente manera

Tubo de tioglicolato: No. del grupo, fecha, no. de bacteria y TIOGLICOLATO. Tubo de Caldo Nutritivo: No. del grupo,
fecha, no. de bacteria y AEROBIO. Tubo de Caldo Nutritivo: No. del grupo, fecha, no. de bacteria y ANAEROBIO.
 Esterilice el asa recta o curva y déjela enfriar
 Recoja con el asa estéril la bacteria indicada y siembre en los tubos marcados.
 Esterilice el asa.
 Adicione 2 ml de aceite mineral estéril a los tubos de tioglicolato y al tubo para anaerobios.
Una vez realizados los tres procedimientos anteriores (a, b, y c) separe el tubo marcado con 4 ºC y 55 ºC, y entréguelos al
coordinador del laboratorio para que los lleve a incubar a las temperaturas correspondientes.

Los otros tubos envuélvalos en cinta de enmascarar, márquelos con el número del grupo y entréguelos al coordinador para
incubarlos a 37ºC.

5.2. METABOLISMO MICROBIANO

 Para iniciar el proceso de identificación de cultivo que le correspondió, realice una tinción de gram.
 Marque muy bien todos los medios con el No. de la cepa, No. del grupo y nombre del medio de cultivo. Esterilice el asa, déjela
enfriar para luego tomar una cepa de bacterias. Inocule los medios diferenciales de la siguiente manera:

- Tubos con agar inclinado (TSI, LIA, CIT): Realice una punción en el fondo del tubo y una estría en la superficie.
- Tubo con medio semisólido (SIM): Realice una sola punción hasta el fondo del tubo.
- Tubos con medio líquido (BRILLA, CN): Suspenda la cepa bacteriana en el medio líquido y gire varias veces el asa.
- Cajas de agar (AN, EMB, SS, McCk): Utilice el sistema de siembra de rejilla para obtener unidades formadoras y colonias
individuales.

Finalmente envuelva los tubos y cajas con cinta de enmascarar, márquelos con el número del grupo y llévelas a incubar a 37 ºC
durante 24 a 48 horas.

5.3. PRUEBA DE ESTERILIDAD EN ALIMENTOS

- Para esta prueba el estudiante debe traer un alimento envasado en cualquier tipo de presentación (bolsas, enlatados o tetra-
pack), herméticamente cerrados.
- Inicialmente debe hacerse una inspección previa de los envases donde se visualicen las marcas de identificación y manchas o
corrosión que se observen en los envases o cualquier anomalía que indique defectos del producto.

- En el caso de los enlatados se deben detectar abolladuras, depresiones del borde, picos, pliegues, pestañas salientes y defectos
de solapados.

Procedimiento

- Se toman dos envases y se envuelven en papel absorbente. Luego uno de los envases se lleva a 37 ºC y el otro a 55 ºC durante
8 días.
- Se deben examinar los envases por lo menos 2 veces en la semana para determinar si el papel absorbente está manchado de
producto, lo que indicaría fugas. También se debe observar si aparece abombamiento que indicaría la presencia de gas.
- En cualquiera de los dos casos se debe inmediatamente abrir el producto y examinar el contenido de los envases.
- Una vez terminado el período de incubación se desinfecta externamente el producto con alcohol al 70% y se toma la muestra así:

* Si es un producto líquido se abre el envase y se toma 1 mL de muestra, con pipeta estéril, que se siembra en caldo BHI (1 tubo en
aerobiosis y 1 tubo en anaerobiosis), para un total de 2 mL de muestra.

* Si es un producto sólido se abre el envase y se toma aproximadamente de 1 a 2 gr de producto con pinzas estériles, que se siembra
en caldo BHI (1 tubo en aerobiosis y 1 tubo en anaerobiosis), para un total de 2 g de muestra.
- Este procedimiento se realiza para los dos envases que se encuentran a 37 ºC y a 55
ºC.
- Luego se incuban los tubos sembrados a las respectivas temperaturas (37 ºC y 55 ºC)
-Debe realizarse la tinción de Gram directamente del producto después de la incubación.

6. RESULTADOS

6.1. FACTORES EXTRÍNSECOS E INTRÍNSECOS

De acuerdo a la lectura de los medios de cultivo incubados complete las siguientes tablas:
1.1. Influencia de la temperatura

Temperatura (To) Crecimiento(Positivo/Negativo)

4º C
37º C
55º C

Tipo de microorganismo según la temperatura de crecimiento

1.2. Influencia del pH

pH Crecimiento(Positivo/Negativo)
3.0
7.0
11

Tipo de microorganismo según el pH de crecimiento

1.3. Influencia de la tensión de oxígeno

Tensión de O2 Crecimiento
(Positivo/Negativo)
Aerobio
Anaerobio
 Microaerófilo

Tipo de microorganismo según las necesidades de oxígeno de crecimiento

6.2. METABOLISMO MICROBIANO

Realice la lectura de la reacción metabólica de cada uno de los tubos y cajas inoculadas con anterioridad. Interprete y analice las
reacciones obtenidas con los fundamentos de los medios de cultivo que investigó y complete la siguiente tabla:

Reacción que se evalúa en Color de las colonias o medio

MEDIO el medio de cultivo según reacción de cultivo

Agar MacConkey
Agar EMB
Agar XLD
TSI
LIA
Simmons Citrato
Agar
SIM
BRILLA
Klinger Agar

6.3. PRUEBA DE ESTERILIDAD EN ALIMENTOS Lectura

- Hacer frotis de cada tubo sembrado y colorearlo por el método de gram para determinar el tipo de gérmenes presentes.

7. CUESTIONARIO

a. De acuerdo a los resultados obtenidos indique las características metabólicas del microorganismo que le correspondió y
señale la importancia de conocer estas características.
b. Cuál es la importancia de la prueba de esterilidad en alimentos.
c. Describa en su alimento analizado (esterilidad de alimentos): método de envasado y condiciones de almacenamiento e
indique como estos dos factores pueden afectar el tipo de microorganismo que crece en el alimento.
d. Indique en el proceso de la elaboración del pan que factores físicos, químicos o biológicos pueden afectar este producto.
e. De acuerdo a los resultados de los factores extrínsecos indique en que tipo de alimento se puede encontrar este
microorganismo.
 Practica No. 3
Análisis microbiológico de alimentos
1. PRE-LABORATORIO

a. ¿Qué son microorganismos indicadores y que revela su presencia en un análisis microbiológico?

b. ¿Cómo se expresan los resultados de un recuento?
c. ¿En que consiste el método del número más probable?

2. OBJETIVOS

a. Conocer los métodos de análisis microbiológico de alimentos y materias primas en general.

b. Conocer como se presentan y evalúan los resultados microbiológicos.
c. Reconocer la importancia de la identificación de microorganismos indicadores en un alimento o materia prima.

3. INTRODUCCIÓN

En la elaboración de los alimentos intervienen muchas variables, como por ejemplo: materias primas, superficies de trabajo,
equipos e instrumentos, envases, manipuladores, etc. lo que lleva a que el producto final tenga una carga microbiana normal y
que debe estar acorde con los rangos legales permitidos. Por consiguiente, los niveles microbianos de un alimento son
indicadores del proceso o elaboración del alimento, señalando si hay buenas o malas prácticas de manufactura. Es importante
destacar que la implantación de buenas prácticas de manufactura en la industria alimenticia, permite elaborar productos idóneos
e inocuos para el consumidor.

4. MATERIALES

- Alimento o materia prima a analizar 11 g o ml

- Cubiertos plásticos estériles
- Balanza
- Mechero de Bunsen
- Agar Standard Plate Count fundido (SPC)
- Agar Sabouraud (SAB)
- Agar TSN fundido
- 1 caja con agar Baird Parker
- 9 tubos con caldo lactosado verde brillante (BRIILA) con campana de Dirham
- Frasco con agua peptonada 0.1 % estéril (90 mL)
- 3 tubos con agua peptonada 0.1 % estéril
- 1 pipeta estéril de 10 ml
- 3 cajas de petri estériles desocupadas
- Tubos tapa rosca estériles
- Gradilla
- Incubadora

5. PROCEDIMIENTO

 Ubique la balanza digital en el laboratorio

 Coloque el frasco de agua peptonada (90 mL) sobre la balanza y tare a cero.
 Corte pequeñas porciones de la muestra dentro del frasco hasta que lleve a 11 g. de muestra.
 Cierre el frasco y agite suavemente durante 15 minutos, con el fin de homogenizar adecuadamente la muestra.
 Proceda a marcar el resto del material así:

Frasco de agua peptonada: 10ˉ¹,

Tubos de agua peptonada 0.1 %: 10ˉ², 10ˉ³
Tubos de caldo lactosado bilis verde brillante: 3 → 10ˉ¹
3 → 10ˉ²
3 → 10ˉ³

3 cajas de petri estériles con los siguientes datos en la base: Mesófilos, SPC. Grupo, Fecha, 10ˉ¹
Mesófilos, SPC. Grupo, Fecha, 10ˉ²
Mesófilos, SPC. Grupo, Fecha, 10ˉ³

3 cajas de petri estériles con los siguientes datos en la base:

Hongos y levaduras, SAB. Grupo, Fecha, 10ˉ¹ Hongos y levaduras, SAB. Grupo, Fecha,
10ˉ² Hongos y levaduras, SAB. Grupo, Fecha, 10ˉ³

1 caja con Agar Baird Parker con los siguientes datos en la base:

Estatafilococo. BP. Grupo, Fecha, 10ˉ¹

3 Tubos tapa rosca estériles con los siguientes datos:

TSN. Esporas Clostridium. Grupo, Fecha, 10ˉ¹ TSN. Esporas Clostridium. Grupo, Fecha,
10ˉ² TSN. Esporas Clostridium. Grupo, Fecha, 10ˉ³
Pipetas estériles

10ˉ¹
10ˉ²
10ˉ³

 Con la pipeta marcada 10ˉ¹ tome 1 ml del frasco inicial (90 ml de agua peptonada) y adiciónelo a todo el material marcado 10ˉ¹:
1 caja de mesófilos, 1 hongos y levaduras, 1 tubo de TSN, 3 tubos de BRILLA y un mililitro al tubo de agua peptonada 10ˉ².
 Con la pipeta marcada 10ˉ² tome 1 ml del tubo de agua peptonada 10ˉ² y adiciónelo a todo el material marcado 10ˉ²: 1 caja de
mesófilos, 1 hongos y levaduras, 1 tubo de TSN, 3 tubos de BRILLA y un mililitro al tubo de agua peptonada 10ˉ³.
 Con la pipeta marcada 10ˉ³ tome 1 ml del tubo de agua peptonada 10ˉ³ y adiciónelo a todo el material marcado 10ˉ³: 1 caja de
mesófilos, 1 hongos y levaduras, 1 tubo de TSN, 3 tubos de BRILLA.
 Descarte las pipetas en el frasco de boca ancha con decol.
 Lleve los tubos de TSN a ebullición durante 15 minutos.
 Tome las 3 cajas de petri desocupadas, vierta el medio de cultivo SPC y mezcle el medio sobre la superficie del mesón
(siembra en profundidad).
 Deje solidificar el agar
 Agregue una segunda capa de agar a los tubos de TSN, deje solidificar.
 Separe las cajas según el agar que contienen.

Lleve a incubar todo el material marcado, recuerde que las cajas de hongos y levaduras son a temperatura ambiente.
Lave y entregue el material de la primera práctica, recuerde las recomendaciones de lavado y descarte de material contaminado.

6. RESULTADOS

 Solicite las cajas correspondientes a la siembra de su grupo.

 Realice los recuentos respectivos utilizando el cuenta colonias.
 Realice los cálculos e informe los resultados.

Mesófilos (SPC)

Dilución Lectura
10-1
10-2
10-3
Hongos y Levaduras (SABOUREAUD)

Dilución Lectura
10-1
10-2
10-3

Estafilococo (BAIRD-PARKER)

Dilución Lectura
10-1
10-2
10-3

Clostridium Sulfito Reductor (TSN)

Dilución Lectura
10-1
10-2
10-3

Coliformes Totales (BRILLA)

Dilución Lectura
10-1
10-2
10-3

7. CUESTIONARIO

a. De acuerdo al informe de los resultados de los análisis microbiológicos de la muestra analizada. ¿Qué recomendaciones
haría usted para mejorar la calidad del producto o mantenerla dentro de los límites microbiológicos establecidos?
b. Explique en un diagrama de flujo la elaboración del producto analizado y sus posibles puntos de contaminación.
c. Indique por que se han utilizado 5 medios de cultivo diferentes en esta práctica.
d. Explique en un diagrama de flujo la elaboración del producto que analizó en la práctica y describa método de envasado
y condiciones de almacenamiento e indique como estos dos factores pueden afectar el tipo de microorganismo que
crece en el alimento.
e. Explique dos formas de control microbiológico para el área de alimentos.
 ANEXOS

A. FROTIS BACTERIANO

Para realizar la coloración de Gram se debe hacer el frotis bacteriano de la siguiente manera:

 Encienda el mechero y esterilice el asa, (curva para el cultivo líquido y recta para el cultivo sólido) como indicó el tutor. Déjela
enfriar cerca del mechero.
 Recoja con el asa estéril una muestra de colonia bacteriana, al lado del mechero.
 En una lámina portaobjetos limpia, desengrasada y marcada, coloque una pequeña gota de solución salina estéril y realice una
suspensión homogénea del cultivo (si el cultivo es sólido). Si el cultivo bacteriano es líquido coloque una pequeña gota de éste
en la lámina portaobjetos y extiéndala.
 Dejé que el frotis se seque a temperatura ambiente. Luego pase la lámina portaobjetos por el mechero 3 veces (con el frotis en
la parte de arriba) con el fin de fijar el extendido.
 Coloque la lámina en el soporte de coloración para realizar la coloración de Gram.

Para hongos y levaduras

 Coloque cerca al mechero el alimento con hongos y con ayuda de cinta pegante, recoja muestra de la superficie.
 Marque la lámina con cinta de enmascarar: número del grupo y coloración.
 Coloque en el centro de la lámina portaobjetos una pequeña gota de azul de Lactofenol, y luego pegue la cinta a la lámina.
Presione ligeramente para eliminar burbujas de aire.
 Observe en el microscopio en los objetivos de 10x y 40x. Realice una posible identificación del hongo con los diagramas que
encuentra en el laboratorio.
 Dibuje sus observaciones.

B. COLORACION DE GRAM

 Coloque sobre el frotis una pequeña cantidad de Cristal Violeta durante 1 minuto (Debe cubrir el frotis)
 Vierta suavemente, sobre la lámina portaobjetos, agua de la llave, con el frasco de boca ancha y escurra el exceso de agua.
 Aplique la solución de Lugol por 1 minuto (Debe cubrir el frotis).
 Lave con el frasco de boca ancha y escurra el exceso de agua.
 Decolore aplicando Alcohol acetona durante 30 segundos (Debe cubrir el frotis).
 Lave con el frasco de boca ancha y escurra el exceso de agua.
 Aplique el colorante de contraste Fucsina durante 1 minuto (Debe cubrir el frotis).
 Por último lave con agua y deje escurrir sobre papel absorbente a temperatura ambiente.
 Observe al microscopio con objetivo de 10x, luego de 40x y finalmente con el Objetivo 100 x (de inmersión) colocando una gota
de aceite de inmersión sobre el frotis.
 Dibuje sus observaciones.

Una vez terminada ésta actividad, coloque las láminas portaobjetos usadas dentro del frasco de boca ancha con agua y clorox.
Deseche en la basura los alimentos analizados. Desconecte el microscopio, limpie sus lentes con Xilol y pañuelos desechables triple
hoja (únicamente), las demás superficies del microscopio puede limpiarlas con los paños absorbentes y alcohol antiséptico. Por
último realice la entrega del microscopio al coordinador del laboratorio.

C. CARACTERÍSTICAS MACROSCOPICAS DE LAS COLONIAS BACTERIANAS

A cada tipo de colonia que se observa, se le debe hacer el estudio macroscópico teniendo en cuenta las siguientes
características:

Tamaño: puntiforme, pequeña, mediana, grande, extendida

Forma: Redonda, ovalada, irregular, filamentosa, rizoide
Elevación: Plana, elevada, convexa, monticular, umbeliforme, umbilicada
Borde: Entero, ondulado, lobulado, aserrado, filamentoso, rizado.
Superficie: Brillante o mate.
Consistencia: dura, blanda
Aspecto: húmedo, seco, cremoso, mucoso, granuloso, algodonoso.
Color: blanco, crema, gris, transparente. Crecimiento: Abundante, moderado, escaso
Características especiales: pigmentos, hemólisis.

BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA

KONEMAN, Elmer W. Diagnóstico Microbiológico. Ed. Panamericana. PUMAROLA, A. Microbiología y Parasitología. Ed. Salvat.
MARTINEZ, María Mercedes. UNAD. Microbiología. Facultad de Ciencias Básicas e Ingeniería. MERCK. MANUAL DE MEDIOS DE CULTIVO.
 DIAGRAMA DE FLUJO PRÁCTICA No. 1 FLORA AMBIENTAL

Agar nutritivo Agar saboureaud

Abrir en ambiente
escogido por 15 min. y
cerrar.

Marcar y llevar a
incubar según
corresponda
 FLORA DE SUPERFICIE

ANTES DE LIMPIAR
Escoger superficie a
evaluar y delimitar

Abra tubo tapa rosca e

introduzca el hisopo
para humedecerlo

Pase el hisopo
humedecido sobre la
superficie a evaluar

Sembrar en

Agar nutritivo Agar saboureaud

Marcar y llevar a
incubar según
corresponda
DESPÚES DE LIMPIAR

Una vez limpia la zona escogida

Abra tubo tapa rosca e

introduzca el hisopo
para humedecerlo

Pase el hisopo
humedecido sobre la
superficie a evaluar

Sembrar en

Agar nutritivo Agar saboureaud

Marcar y llevar a
incubar según
corresponda
 PRÁCTICA No. 2

FACTORES EXTRÍNSECOS E INTRÍNSECOS

A. INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA

Cepa asignada

Sembrar en 3 tubos de ensayo

4ºC 37ºC 55ºC

Marcar y llevar a
incubar según
corresponda
B. INFLUENCIA DEL pH

Cepa asignada

Sembrar en 3 tubos de ensayo

pH :3.0 pH :7.0 pH :11

Marcar y llevar a
incubar según
corresponda
C. INFLUENCIA DE LA TENSIÓN DE OXÍGENO

Cepa asignada

Sembrar en 3 tubos de ensayo

Tioglicolato Aerobio Anaerobio

Marcar y llevar a
incubar según
corresponda
 METABOLISMO MICROBIANO

MEDIOS LÍQUIDOS

Cepa asignada

Sembrar en
TSI CIT SIM BRILLA KLINGER
LIA
Marcar y llevar a
incubar según
corresponda
MEDIOS SÓLIDOS

Cepa asignada

Sembrar en
Agar Agar Agar
MacConkey EMB XLD
Marcar y llevar a
incubar según
corresponda
 PRUEBA DE ESTERILIDAD

Alimento envasado en envase o

bolsa o enlatado,
herméticamente cerrado

Revisar el envase para detectar alguna anomalía

Incubar a 37 ºC /8 días Incubar a 55 ºC/8 días

 Para cada envase sembrar en Caldo BHI

Aerobiosis Anaerobiosis
 PRÁCTICA No. 3

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS

Alimento homogenizado: 11g en 90 mL agua peptonada

Dilución 1:10

Diluciones

1 mL

1 mL
Dilución Dilución
1:100 1:1000
 Sembrar 1 mL de cada dilución en

SPC: Mesófilos Levaduras BP: Estafilococo BRILLA: Coliformes TSN: Esporas

SAB: Hongos y
Clostridium

.
.
.
.
.
.
.
.
.
..
.
 UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA
NOMBRE DEL CURSO: BIOTECNOLOGÍA ALIMENTARIA
RÚBRICA DE EVALUACIÓN INTERMEDIA
Criterios de desempeño de la actividad colaborativa
Aspectos
Valoración alta Valoración media Valoración baja Puntaje
evaluados
El estudiante asiste al El estudiante asiste El estudiante asiste
componente al componente al componente
Asistencia al practico presencial practico presencial y practico presencial
laboratorio y realiza proceso realiza proceso y realiza proceso 20
acorde a la guía acorde a la guía acorde a la guía

(Hasta 20 puntos) (Hasta 10 puntos) (Hasta 0 puntos)

El estudiante tuvo un El estudiante no El estudiante no
buen desempeño tuvo un desempeño tuvo un buen
en las prácticas regular en las desempeño en las
Desempeño
presenciales y prácticas prácticas
en el
validación de lo presenciales y presenciales y 20
Laboratorio
aprendido en el validación de lo validación de lo
informe aprendido en el aprendido en el
informe informe
(Hasta 20 puntos) (Hasta 10 puntos) (Hasta 0 puntos)
Los documentos Aunque los El estudiante no tuvo
presentan un documentos en cuenta las
excelente entregados normas básicas
estructura con los presentan una para la
Estructura
requerimientos estructura base, la construcción del 20
del informe
solicitados misma carece de trabajo
algunos elementos
del cuerpo solicitado
(Hasta 20 puntos) (Hasta 10 puntos) (Hasta 0 puntos)
 UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA
NOMBRE DEL CURSO: BIOTECNOLOGÍA ALIMENTARIA
RÚBRICA DE EVALUACIÓN INTERMEDIA
Criterios de desempeño de la actividad colaborativa
Aspectos
Valoración alta Valoración media Valoración baja Puntaje
evaluados
El informe de El informe de No se desarrolla el
laboratorio laboratorio objetivo de los
desarrolla el desarrolla el objetivo laboratorios y el
objetivo del del mismo; sin informe
mismo; se embargo, en algunos presentado carece
Fines del
evidencia a partes no se de coherencia 10
trabajo
coherencia científica evidencia coherencia científica
entre los diferentes científica
acápites del
informe
(Hasta 10 puntos) (Hasta 5 puntos) (Hasta 0 puntos)
Los análisis poseen un
Existe un criterio No existe en el
criterio científico y
científico en los informe análisis
estos son producto
análisis, pero estos con criterio
directo de losno se relacionan de científico basado
Análisis de
resultados forma directa con los en la bibliografía, 20
resultados
obtenidos en el resultados de la ni hay relación
laboratorio práctica coherente con los
resultados
(Hasta 20 puntos) (Hasta 10 puntos) (Hasta 0 puntos)
Quiz o El informe de El informe de No se desarrolla el
estrategia de laboratorio laboratorio objetivo de los
evaluación desarrolla el desarrolla el objetivo laboratorios y el 10
de la tutora objetivo del del mismo; sin informe presentado
que evalúa el mismo; se embargo, en algunos carece de
 UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA
NOMBRE DEL CURSO: BIOTECNOLOGÍA ALIMENTARIA
RÚBRICA DE EVALUACIÓN INTERMEDIA
Criterios de desempeño de la actividad colaborativa
Aspectos
Valoración alta Valoración media Valoración baja Puntaje
evaluados
componente evidencia a partes no se coherencia
práctico coherencia científica evidencia coherencia científica
entre los diferentes científica
acápites del informe
(Hasta 10 puntos) (Hasta 5 puntos) (Hasta 0 puntos)
Calificación final 100