UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PANAMA

FACULTAD DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA

INGENIERÍA DE ALIMENTOS

MANUAL DE LABORATORIO
MICROBIOLOGÍA GENERAL

ELABORADA POR:

Elaborado en 2008
MSc. Damarys Cortés

Actualizado y editado en 2023 por

Eric Manzané-Pinzón Ph.D.

Dra. Damarys Cortés
 CONTENIDO

Normas Generales de Buenas Prácticas en el laboratorio de

Microbiología………………1
Identificación y usos del material y equipos del Laboratorio……………2

Uso y conservación del Microscopio……………………………….……3

El Método Científico…………………………………………….………4

Medios de Cultivo y Esterilidad…………………………………………4

Tinción Simple y Negativa………………………………………………5

Tinción de Gram…………………………………………………..……6

Cultivo, Aislamiento y Enumeración de Bacterias………………..……7

Técnicas Microbiológicas: Número más Probable (NMP)……………8

Observación y Cultivo de Hongos…………………………………….9

Control de Microorganismos por la Acción

de Agentes Bacteriostáticos……………………………………………10
 NORMAS GENERALES DE BUENAS PRÁCTICAS EN EL LABORATORIO
DE MICROBIOLOGIA

Leer esta sección ANTES de asistir al primer laboratorio

Objetivo General:

➢ Instruir al estudiante en los cuidados básicos que se deben mantener en el

laboratorio de microbiología.
➢ Informar a los estudiantes sobre los riesgos de contaminación a los que están
expuestos en el laboratorio de microbiología y como evitarlos.
INTRODUCCION
Todas las personas que trabajen con materiales que contengan agentes infecciosos
deben estar conscientes de los peligros potenciales asociados a estos agentes, además
deben estar entrenadas en las prácticas y técnicas requeridas para manejar estos
materiales de una manera segura. Es por ello por lo que antes de iniciar con las
actividades practicas, todas las personas involucradas (estudiantes y profesores)
tenemos la obligación de conocer cuales son las normas de seguridad a seguir en el
laboratorio de manera tal, que el trabajo se realice con un riesgo mínimo de exposición,
tanto para las personas que los ejecutan como para el medio ambiente.
La seguridad biológica o bioseguridad, es la aplicación del conocimiento, de las
técnicas y de los equipos necesarios para prevenir la exposición del personal, del área
del laboratorio y del medio ambiente a agentes potencialmente infecciosos o
biopeligrosos.
Los agentes biopeligrosos se define como todos aquellos agentes biológicos y
materiales que son potencialmente peligrosos para los seres humanos, los animales y las
plantas. Como, por ejemplo: bacterias, virus, hongos, parásitos, productos
recombinantes, alergenos, priones.
El Riesgo Microbiológico se encuentra presente cada vez que realicemos una actividad
práctica en el Laboratorio de Microbiología razón por la cual debemos llevarlas a cabo
con precaución, además de tener un ambiente de trabajo en el que seamos capaces de
reconocer y evitar los peligros involucrados con estas actividades, para así poder evitar
posibles accidentes. Hay que ejercer la prevención y el sentido común cuando se trabaja
con microorganismos.
NORMAS GENERALES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIA

1. El estudiante debe estar consciente de que algunos de los microorganismos

estudiados en este laboratorio son patógenos al hombre.
2. Trate todos los cultivos como potencialmente patógenos, es decir, limpie las
áreas con desinfectante si se derraman cultivos, lávese las manos después del contacto y
notifique a su instructor de inmediato.
3. La higiene y desinfección de manos es una medida a tomar antes y después de
cada práctica y antes de abandonar el laboratorio.
4. El estudiante debe utilizar su bata de laboratorio durante las pruebas a seguir
dentro del laboratorio. Dicha bata debe ser quitada inmediatamente antes de salir del
laboratorio.
5. Leer atentamente las instrucciones antes de comenzar un ejercicio. Además,
asegúrese de tener a mano todos los materiales necesarios para el ejercicio antes de
comenzar el experimento. Pídale al instructor que le aclare cualquier punto sobre el que
tengas dudas.
6. Mantener fuera del área de trabajo artículos personales (cosméticos u otros
similares) no indispensables para realizar las prácticas.
7. Llevar un calzado apropiado, preferiblemente cerrado y de suela antideslizante
8. No está permitido comer, beber, fumar o almacenar comidas dentro del
laboratorio.
9. Utilice guantes de látex cuando se trabaje con material biológico. Los mismos
deben ser cambiados toda vez que hayan sido contaminados, lávese las manos y
colóquese guantes limpios.
10. No toque los ojos, nariz, o piel con los guantes puestos. No camine fuera del
área de trabajo con las manos enguantadas.
11. Recoger el cabello largo
12. Las mesas de trabajo deben mantenerse ordenadas, limpias y desinfectadas,
antes, durante y al finalizar cada sesión.
13. Tener cuidado con el alcohol cuando este utilizando el mechero. Nunca debe
dejar este desatendido.
14. Incinere las asas y agujas bacteriológicas en un mechero o incinerador antes y
después de utilizarlas.
15. En ninguna circunstancia se pipeteará sustancia alguna con
la boca, para ello se usarán pipeteadores automáticos.
16. Colocar los materiales de vidrio para desechar en los
recipientes destinados para tal fin.
17. Regresar los reactivos y equipos empleados (microscopio, mechero, etc.),
limpios y de manera ordenada a su respectivo lugar una vez finalizada la actividad.
Reporte cualquier daño de estos al profesor.
18. No utilice ningún reactivo que no haya sido debidamente identificado, verificar
las etiquetas de estos y estar seguro de cómo emplearlos.
19. Recuerde rotular todo el material que vaya a ser colocado en refrigeración o en
la incubadora.
20. Realizar solo aquellas actividades indicadas por el profesor, no llevar a cabo
experimentos no autorizados.
21. No saque materiales patógenos del laboratorio sin haber obtenido instrucciones
específicas al respecto.
22. Si se derrama un cultivo o si se presenta alguna situación potencialmente
peligrosa, avise de inmediato a su instructor
23. Emplear técnicas asépticas para el manejo de microorganismos.
24. Deseche todos los materiales de desecho sólidos en una bolsa de riesgo
biológico y utilícelos en el autoclave antes de desecharlos en la basura normal
25. Sea sistemático y lógico. Mantenga un registro fiel de todos los experimentos y
observaciones Cuide y mantenga su manual de laboratorio en óptimas condiciones
 LABORATORIO No1
IDENTIFICACIÓN Y USOS DEL MATERIAL Y EQUIPOS DEL
LABORATORIO

INTRODUCCION
El conocimiento y uso adecuado de los materiales y equipos del laboratorio de
Microbiología es la base para acercarse a ese mundo diminuto que son los
microorganismos. Cada instrumento va a facilitar en diferentes experimentos observar
con mayor precisión los resultados de las pruebas y el crecimiento microbiano. Es
importante que el estudiante domine no sólo los nombres, sino la utilidad de estos equipos
para realizar los análisis con mayor eficiencia.

OBJETIVOS
➢ Conocer los materiales y equipos utilizados en el laboratorio.
➢ Aprender cual es la función de cada uno de los materiales y equipos de
laboratorio.

MATERIALES Y EQUIPOS USADOS ENEL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGÍA

Bata de laboratorio.
Es usada para cubrir y proteger la ropa de contaminaciones. Debe
usarse permanentemente en el laboratorio y estar abotonada

Mascarilla
Utilizada para protegerse de contaminaciones y evitar la
transmisión de enfermedades respiratorias
Redecilla
Utilizada para proteger el cabello de suciedad y a su vez
evitar que caída de cabello contamine las muestras
 Guantes resistentes al calor
Para protegerse de quemaduras, retirar productos o recipientes
calientes de la autoclave y de los baños calientes

Aguja bacteriológica
Se utiliza para tomar muestras de un cultivo y sembrarlo en otro medio
que se encuentre comúnmente en tubos de ensayo o en tubos muy
delgados.

Asa bacteriológica
Se utiliza para arrastrar o
transportarlos microorganismos de un
medio a otro para su adecuado
desarrollo, así como para hacer frotis.

Incinerador
Se utiliza para esterilizar tanto agujas como asas bacteriológicas.

Platos Petri o placas de Petri

Recipiente circular de vidrio o de plástico,
utilizado en microbiología para el cultivo
y aislamiento de colonias de bacterias,
utilizando el medio correspondiente.
 Membrana de filtración
Se utiliza para filtrar muestras de agua u otras
soluciones. Estas membranas se colocan luego en los
medios de cultivo respectivos para su incubación.

Petri film
Utilizados para verter en ellos los medios de cultivo en donde crecerán
después las colonias de microorganismos.

Portaobjetos
Lámina de vidrio rectangular
donde se coloca la muestra para
ser examinada al microscopio. Se
usa en conjunto con el cubreobjeto
para realizar observaciones
microscópicas

Cubreobjetos
Fina lámina de vidrio, utilizado para cubrir muestras que se han
colocado en el portaobjetos y luego verse al microscopio.

Microscopio
Se utiliza para observaciones de microorganismos en
diversos tipos de muestras. Permite identificar y contar
células y microorganismos presentes en las muestras.
Con la ayuda de las tinciones es posible, incluso,
clasificar bacterias en grupos básicos.
 Tubo de Ensayo:
es un instrumento de laboratorio que se utiliza
principalmente como contenedor de líquidos y sólidos a
los cuales se les va a someter a reacciones químicas u
otras pruebas. Posee una forma cilíndrica alargada
generalmente de vidrio. Su base tiene forma de “U”
redondeada. Tienen en su mayoría una boca acampanada
para ayudar a verter los líquidos.
Gradilla:
Una gradilla es un utensilio utilizado para dar soporte a
los tubos de ensayos o tubos de muestras. Normalmente es
utilizado para sostener y almacenar los tubos. Este se
encuentra hecho de madera, plástico o metal.

Vaso Químico o de Precipitado

Un vaso de precipitado tiene forma cilíndrica y
posee un fondo plano. Se encuentran en varias
capacidades.
Normalmente es utilizado para trasportar líquidos
a otros recipientes. También se puede utilizar para
calentar, disolver, o preparar reacciones químicas

Probeta o cilindro graduado

Cilindro de vidrio o plástico con diferentes graduaciones y volúmenes.
Se utiliza para medidas de poca precisión

Matraz Erlenmeyer:
Se utiliza para disolver sólidos en líquidos y calentarlos,
pueden venir en diferentes volúmenes.
 Matraz Kitasato
Utilizado juntamente con la bomba
de vacío, el embudo Büchner y el
sistema de filtración de membrana
para análisis microbiológico de
aguas y soluciones.

Embudo Büchner
El embudo Büchner es un tipo especial de embudo utilizado para
la filtración al vació o filtración a presión asistida. Se hace
tradicionalmente de porcelana, tiene una placa con agujeros que
dejan pasar el agua, sobre esta placa se coloca el papel filtro para
realizar la separación entre líquidos y solidos

Brochas para lavar

Utilizadas para lavar los utensilios de laboratorio

Mechero de Bunsen
Se utiliza para calentar utensilios y se emplean
fundamentalmente para calentar, evaporar o
esterilizar muestras o reactivos químicos y
disminuir la carga microbiana del ambiente
donde se realizan los análisis, además para
esterilizar asas y aguas bacteriológicas.
 Pipeta graduada
Las pipetas graduadas toman medidas exactas de
líquidos y tienen un material de cristal que se
encuentran calibrabas en pequeñas divisiones para
medir cantidades diferentes de líquido.
Es un tubo recto de cristal con un estrechamiento en
uno de sus extremos, conocido como punta cónica, y
en el otro extremo cuenta con una boquilla. Están
calibradas en pequeñas divisiones para medir
diferentes cantidades de líquido, entre 0,1 y 25 m

Propipeta
Se utiliza para facilitar el uso de las pipetas de succión sin utilizar
la boca, ya que se acopla a las pipetas. Permite una medida exacta
y segura de los líquidos del laboratorio.

Micropipeta
La micropipeta es un instrumento de laboratorio
empleado para absorber y transferir líquidos,
donde la diferencia fundamental es que el
volumen de líquidos que mide y transporta es
muy pequeños, usualmente en el rango de los
microlitros (μl), unidad que representa la
milésima parte de un mililitro (ml), o la
millonésima parte de un litro (l). Permite
transferir líquidos sin ensuciar la pipeta,
mediante el uso de puntas de plástico
desechables de diversos volúmenes.
 El plato caliente o plato agitador calefactor ha sido desarrollado
con el propósito de poder calentar y mezclar fluidos contenidos en
recipientes de laboratorio sin la necesidad de aplicar llama directa
como el Matraz de Erlenmeyer, Tubos de ensayo y tubos de
precipitado.
Un agitador magnético consiste en una pequeña barra magnética
(llamada barra de agitación) la cual está normalmente cubierta por
una capa de plástico (usualmente Teflón) y una placa debajo de la
cual se tiene un magneto rotatorio o una serie de electro magnetos
dispuestos en forma circular a fin de crear un campo magnético
rotatorio

Baño maría
Se utiliza para mantener en temperatura estable los medios
de cultivo, para proporcionar un ambiente estable para la
incubación de ciertos microorganismos. Además, muestras
de alimento pueden necesitar ser incubadas en baño maría
como pre-enriquecimiento. Pueden también tener un
mecanismo de agitación que permite mantener un medio en
estado homogéneo u homogenizar cualquier mezcla que se
este calentando en el mismo.

Incubadora
Una Incubadora de laboratorio es un dispositivo
utilizado para cultivar y mantener cultivos
microbiológicos o cultivos celulares. La incubadora
mantiene una temperatura y humedad optima
garantizando también otras condiciones tales como el
dióxido de carbono (CO2) y contenido de oxígeno
presente en la incubadora. Las incubadoras de
laboratorio son esenciales para una gran cantidad de
trabajos experimentales enfocados a la biología
celular, microbiología, y biología molecular.

Autoclave:
Una autoclave es un recipiente
metálico de paredes gruesas con un
cierre hermético que permite
trabajar a alta presión. La presión
elevada permite que el agua alcance
temperaturas superiores a su punto
de ebullición. Lo que permite una efectiva esterilización de los
utensilios y sustancias procesadas dentro de la misma.
Balanza:
Usada para pesar o medir cantidad de materia. Asegúrese
que la balanza este en cero y bien nivelada antes de realizar
cualquier medición. Si va a usar un recipiente para contener
la sustancia a medir recuerde poner la balanza a cero ANTES
de empezar a medir. También asegúrese que la balanza tenga
capacidad superior a la cantidad de sustancia que necesita
medir

Medidor de pH (pH-Metro)
Se utiliza para medir de manera precisa el valor del
pH de soluciones

Desionizador de Agua
Los desionizadores de agua, son equipos utilizados para
eliminar cationes y aniones del agua, mediante el proceso
de intercambio iónico. Son equipos de purificación de agua,
con conexión directa a la red y flujo continuo. El agua
desionizada se usa para elaborar soluciones y medios.
Cámara de flujo laminar
Existen diferentes niveles. Unas se utilizan para proteger la muestra de contaminaciones
externas. Otras protegen tanto la muestra como al Analista de laboratorio.

Experiencia 1.
Trabajando en grupos de 4 estudiantes pese 25 gramos de sal de mesa, NaCl, en una
balanza, primero trate de pesar sin nivelar la misma, luego nivélela y pese nuevamente
¿observa alguna diferencia en el peso?

Para nivelar la balanza asegúrese que la burbuja de balance esta en el medio del círculo
de nivel. La balanza tiene patas atornillables que se pueden mover para alcanzar el nivel
correcto
Ahora con la balanza bien nivelada proceda a pesar 25 gramos de sal, solo que esta vez
todos los miembros del grupo deben estar apoyados en la mesa donde esta la balanza y
moviendo levemente las manos. Como se comportan las mediciones en la balanza
Cada miembro del grupo debe medir los 25 gramos de sal usando papel y un plato Petri
y tomar y comparar cuanto tiempo demora en alcanzar el peso deseado. la destreza en
el uso de la balanza es una habilidad olvidada, pero muy importante en el laboratorio.
Experiencia 2
Trabajando con el mismo grupo anterior obtenga pipetas de diversos volúmenes,
usando una propipeta y un micropipeta, trate de obtener el menor volumen que cada
una es capaz de medir. Practique tomando diversos volúmenes. Recuerde: la
micropipeta NUNCA DEBE DESCANSAR de manera horizontal por que se puede
producir contaminación en el cuerpo de esta. Las micropipetas tienen un dial que
permite seleccionar la cantidad de liquido a ser medido
Por lo general el volumen se selecciona en este dial mientras el volumen se muestra en
una ventana lateral. El volumen se lee de arriba hacia abajo y la mayoría tiene hasta 4
dígitos. Según el fabricante, modelo o volumen nominal de la micropipeta, podemos
encontrar algunas diferencias en la presentación de estos valores

La punta desechable es la parte que realmente lleva el liquido a ser medido, por lo
tanto, es muy importante colocar una punta con un volumen acorde a la cantidad que se
va a medir, un error normal en los usuarios principiantes es colocar puntas de volumen
menor. Es importante eliminar la punta una vez se haya terminado la sesión de
medición
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

- Cabinas de Seguridad Biológica.

https://es.scribd.com/document/318938201/CABINA-DE-SEGURIDAD-
BIOLOGICA-pdf

- Manuales para el control de calidad de los alimentos 12. la garantía de la calidad

en el laboratorio microbiológico de control de los alimentos.
http://www.fao.org/3/a-t0451s.pdf
- Fuentes López, Ana. Fernández Segovia, Isabel. Fuentes López, Cristina.
Manual de Manejo de Micropipetas. Departamento de Tecnología de Alimentos,
Centro Universitat Politècnica de València

- Guía para la acreditación de laboratorios que realizan análisis microbiológicos.

www.fiocruz.br/biosseguranca/Bis/manuais/qualidade/GUIA%20PARA%20LA
%20ACREDITACIN%20DE%20LABORATORIOS%20QUE%20REALIZAN
%20ANLISIS%20MICROBIOLGICOS.pdf

- Landsborough, Lynne Mc. Food Microbiology Laboratory. CRC (Contemporary

Food Science.

- Garg Neelima, Garg, K.L, et. al. Laboratory Manual of Food Microbiology.
 LABORATORIO 2
USO Y CONSERVACION DEL MICROSCOPIO

INTRODUCCION
La microbiología se ocupa generalmente de organismos tan pequeños que el ojo humano
no los puede ver claramente a simple vista. La mayor parte de los conocimientos sobre
los microorganismos se han descubierto con microscopios. En los últimos tres siglos ha
permitido ampliar el campo de las investigaciones biológicas y se ha convertido en el
instrumento básico para abrir nuevas fronteras en la biología.
Antonie van Leeuwenhoek, Hans y Zacharias Jansen fueron tres holandeses que
contribuyeron significativamente al desarrollo de la microscopia a principios del siglo
XVII. Leeuwenhoek fue uno de los primeros en dejar constancia de sus observaciones,
describiendo con gran detalle, bacterias, protozoarios, glóbulos rojos y espermatozoides.
El instrumento básico para el estudio de células y tejidos vegetales es el microscopio de
luz, su poder resolutivo es la capacidad de hacer que aquellos objetos que están muy
juntos aparezcan separados; para que nos demos una idea el poder resolutivo del ojo
humano es de aproximadamente 0.1 mm, de modo que si dos líneas están separadas entre
sí por menos de 0.1 mm, dichas líneas aparecerán como una sola línea, no importa cuánto
se acerque el observador a ellas; para tener un ejemplo, la mayoría de las células tienen
un diámetro inferior a 0.1 mm es decir sin ayuda de lentes la vemos como una sola
estructura.
Los microscopios empleados en microscopia común son de tipo óptico o compuesto y el
estereoscópico o de disección; se disponen de una gran variedad de modelos en su
construcción; básicamente, los microscopios ópticos se caracterizan por tener un tubo
que lleva dos sistemas de lentes: el ocular en el extremo superior y el objetivo en el
extremo inferior; la imagen se forma por el objetivo y se magnifica por el ocular.
Los microscopios equipados con un solo ocular se llaman monoculares; aquellos con
dos oculares, binoculares; dependiendo de su tipo, un microscopio puede estar equipado
con varios objetivos intercambiables, los más comunes son lentes de: 2.5x, 10x, 40x y
100x, donde cada número indica las veces que se aumenta el espécimen observado.
Un accesorio indispensable en los microscopios es el condensador, el cual es un tercer
sistema de lentes que ayuda a regular el contraste de la imagen y la intensidad de la
iluminación; los condensadores no se encuentran en los microscopios de disección o
estereomicroscopios.
Con el microscopio óptico pueden lograrse aumentos de hasta 2000x. El aumento total
es el producto de poder de aumento del ocular multiplicado por el poder de aumento del
objetivo y por el poder de aumento del condensador. El poder resolutivo del microscopio
de luz, está limitado por la longitud de onda de la luz visible que utiliza, a esto se le
denomina campo brillante;
Usarás dos tipos diferentes de microscopio a lo largo de este semestre: estereoscopio
(del griego stereo, que significa "sólido" y scop, que significa "observar") es útil para
obtener una vista general tridimensional (estereoscópica) de un objeto opaco o
transparente muestra a bajo aumento. El microscopio compuesto es útil solo con
materiales muy delgados y transparentes (generalmente micro cortes de objetos
tridimensionales) para el estudio de finos detalles a gran aumento.
Cuando estudie especímenes bajo un microscopio, debe comenzar rutinariamente con el
aumento más bajo en el microscopio y progresar a los aumentos superiores sólo cuando
sea necesario. De esta manera, podrá relacionar pequeñas porciones y detalles con la
totalidad muestra.
El microscopio es un instrumento caro. En ninguna circunstancia debe quitar cualquier
parte del microscopio o intente repararlo. Si tiene alguna dificultad para operar su
microscopio, pida ayuda a su instructor. Si su microscopio está dañado o partes funcionan
mal, infórmeselo a su instructor de inmediato.

OBJETIVOS
➢ Identificar las partes en que se compone el microscopio de luz.
➢ Conocer la función de cada una de las partes del microscopio y su importancia.
➢ Indicar los pasos a seguir para obtener un buen enfoque en el microscopio de luz.
➢ Hacer montaje húmedo y observación de placas temporales.
➢ Reconocer la diferencia en la posición y movimiento de los objetos observados
bajo el microscopio.
➢ Determinar el tamaño del campo visual del microscopio.
➢ Dar a conocer las unidades de medida de mayor uso en micrometría
➢ Adquirir destreza para calcular las medidas de estructuras celulares, células y
organismos.
➢ Reconocer la importancia del microscopio en el desarrollo de las ciencias
biológicas.
➢ Comprender los cuidados que se deben tener al usar el microscopio.
MATERIALES
Microscopio compuesto de luz
Portaobjetos
Cubreobjetos
Papel de lente
Papel milimétrico
Papel delgado con letras impresas
Goteros

PROCEDIMIENTO
Partes del Microscopio:
Identifique cada una de las partes del microscopio.
Base: Parte inferior del microscopio que hace contacto con la mesa. Es el punto de apoyo
del microscopio.
Columna o Brazo: Estructura rígida situada en la parte posterior del microscopio,
sostiene el tubo binocular y la platina, y sirve para transportarlo.
Tubo: Pieza vertical que sostiene el revolver y el lente ocular.
Revolver: sistema giratorio localizado en la parte inferior del tubo, al cual se incorporan
los lentes objetivos.
Tornillo macrométrico: Se encuentra en la parte inferior del microscopio, cerca de la
base. Sirve para acercar el tubo y la platina, produce un movimiento arriba-abajo del
cuerpo del tubo, por medio del cual se obtiene la imagen de la muestra (enfoque o ajuste
grueso).
Tornillo micrométrico: Generalmente se encuentra incorporado al tornillo
macrométrico. Sirve para dar claridad a la imagen, se logra el ajuste fino. Se usa después
del enfoque inicial con el ajuste grueso.
Platina: Plataforma con un orificio central en donde se coloca la muestra que se desea
observar.
Carro mecánico: Sistema de pinzas colocado encima de la platina. Sirve para desplazar
el portaobjeto hacia delante y hacia atrás, y de derecha a izquierda.
Oculares: Lentes convergentes situados en la parte superior del tubo. Aumenta la imagen
formada por los objetivos en el cuerpo tubular. La mayoría de los oculares son 10 X.
Objetivos: Lentes convergentes incorporados en la parte inferior del revolver. Aumentan
la imagen del objeto observado. Se conocen 4 lentes: 4X (objetivo examinador), 10X
(objetivo de bajo poder), 40X (objetivo de alto poder seco), 100X (objetivo de inmersión
y para su uso es indispensable el uso de aceite de inmersión).
Condensador: Está localizado debajo de la platina y contiene un sistema de lentes
convergentes encargados de concentrar los rayos de luz en el centro del orificio de la
platina. Sirve para enfocar la luz hacia el objeto que se va a examinar.
Diafragma o Iris: Esta situado debajo de la platina e inmediatamente debajo del
condensador. Sirve para regular la cantidad de luz que viene a través del condensador
desde el iluminador en la base y se acciona mediante una palanca. Usualmente se empieza
con el diafragma completamente abierto y luego se reduce la luz poco a poco hasta
obtener una imagen satisfactoria.
Iluminación (lámpara): Algunos microscopios están equipados con una lámpara
eléctrica interna. En algunos microscopios la intensidad de la iluminación puede ajustarse
con un tornillo colocado en la parte superior de la base.
Cuidado del Microscopio:
El microscopio es un aparato delicado y costoso por lo que, su buen funcionamiento va
a depender tanto del mantenimiento adecuado como de su uso correcto. Para una buena
microscopia es conveniente que tengamos en cuenta las siguientes recomendaciones:
Transporte: El microscopio ha de transportarse firmemente sujeto por su brazo y
sosteniéndolo por la base, manteniéndolo en posición vertical para prevenir que se caigan
los oculares
Iluminación: Si su microscopio presenta un sistema de iluminación incorporado no hay
que realizar ajuste alguno en cuanto a la posición de la fuente de luz. Este es el caso de
su microscopio.
PRECAUCION:
− Limpie las lentes oculares y objetivos antes y después de usar el microscopio y
cuando utilice el aceite de inmersión.
− Una vez que haya colocado aceite sobre la lámina, cuide de que los objetivos
“secos” no entren en contacto con el aceite, pues los puede dañar.
− Las perillas de ajuste macro y micrométrico deben ser giradas suavemente.
− Bajo ningún concepto intercambie piezas entre microscopios. Si encuentra
resistencia para mover alguna de las partes del aparato, no lo fuerce, trate de establecer
la causa.
− Antes de guardar el microscopio coloque el objetivo de bajo poder y baje el tubo
cerca de la platina.
− Al concluir, apague la luz de la lámpara.
Uso del Microscopio:
Busque su microscopio en el armario y cárguelo con dos manos, una bajo el
mismo y la otra sostenga el asa de los objetivos
Coloque una mano debajo de la base y sostenga el brazo del microscopio con la
otra mano. Colóquelo sólidamente en su mesa de laboratorio.
Desdoble el cable, enchúfelo y encienda la luz para asegurarse de que la bombilla
funcione. Encienda y apágue lo menos posible para aumentar la vida útil de la bombilla.
No permita que nada más que papel para lentes toque la lente del microscopio.
Las partículas duras pueden rayar permanentemente la lente. Puede usar papel regular
para limpiar portaobjetos sucios, pero NUNCA ¡use toallas de papel en las lentes del
microscopio! Incluso el agua puede dañar el mismo entrando en la carcasa de la lente a
través de la acción capilar. Nunca permita que su objetivo toque agua, ya que esto puede
causar daños importantes y requerir reparaciones costosas.
NUNCA FUERCE UNA PIEZA MECÁNICA. Si tiene problemas para operar
su alcance, llame al su instructor de laboratorio.
A nadie que use mucho maquillaje en los ojos se le permitirá usar un microscopio
(¿Por qué?)
Cuando haya terminado de usar el microscopio al final del laboratorio:
A. Apague la lámpara y DEJE QUE SE ENFRIE. Mover una lámpara caliente
puede hacer que la bombilla filamento se rompa
B. Retire la placade la platina.
C. Gire la boquilla hasta que el objetivo de baja potencia esté sobre el
condensador.
microscopio
D. Limpie cualquier líquido o suciedad del escenario o cuerpo. Si una lente está
sucia, límpiela cuidadosamente con papel de lente
 E. Desenchufe el cable y dóblelo cuidadosamente, siguiendo su "zig-zag" natural.
Mételo debajo de la platina del microscopio, entre el brazo y la fuente de luz. NO
ENVOLVER EL CABLE ALREDEDOR DE LA BASE, YA QUE ESTO
PROVOCA FATIGA DEL ALAMBRE.
F. Coloque con cuidado el microscopio en su gabinete (¡Use ambas manos!) y
coloque el cubre polvo. Tire de la cubierta contra el polvo completamente sobre
la base.

Familiarícese con las partes del microscopio usando la imagen siguiente y discuta
con su compañero que partes faltan o están demás al comparar esta imagen con el
microscopio que usted está usando
 Enfoque: Mantenga ambos ojos abiertos aun cuando su microscopio sea
monocular. Acerque el objetivo de bajo poder (10X) a medio centímetro del portaobjetos,
baje el condensador para lograr iluminación uniforme del campo y, observando por el
ocular, lentamente aumente o disminuya la distancia girando el tornillo macrométrico
hasta lograr la nitidez deseada. Si desea mayor aumento utilice el objetivo requerido
girando el revolver, afine el enfoque con el tornillo micrométrico y ajuste la iluminación
como ya se indicó. Si el objetivo a emplear es el de inmersión (100X) colocará una gota
de aceite sobre la preparación inmediatamente antes de girar el revolver con el objetivo
de 100X y proceda a enfocar. Al enfocar la muestra los ajustes para mayor nitidez deben
hacerse con el tornillo micrométrico.
Determinación del poder de aumento: El poder de aumento del microscopio se
calcula multiplicando el aumento del ocular por el aumento del objetivo utilizado.
Calcule el poder de aumento de cada uno de los siguientes objetivos y anote sus
resultados

Fórmula para encontrar el aumento total de un microscopio

Aumento ocular x Aumento objetivo= aumento total

4X: __________ 10X: ___________

40X: _________ 100X: __________
Observaciones con el Microscopio:
Cálculo del Campo de Visión
1. Coloque una regla métrica transparente debajo del objetivo de baja potencia (4x) de
un microscopio.
2. Enfoque el microscopio en la escala de la regla y mida el diámetro del campo de
visión en milímetros (mm). Registre este número.
3. Convierta esta medida a micrómetros (µm) (¿cómo se hace eso?) resultado_____
4. Calcular el diámetro en µm del campo de visión a alta potencia (AP) utilizando la
fórmula siguiente:
𝑑𝑖𝑎𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 (𝐵𝑃)𝑥 𝑚𝑎𝑔 𝑑𝑒𝑙 𝑜𝑏𝑗𝑒𝑡𝑖𝑣𝑜 𝐵𝑃
𝑑𝑖𝑎𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑒𝑛 𝜇𝑚(𝐴𝑃) =
𝑚𝑎𝑔 𝑜𝑏𝑗𝑒𝑡𝑖𝑣𝑜 𝐴𝑃

diámetro del campo de visión BP (mm) = ___________________________

diámetro del campo de visión BP (µm) = ___________________________
diámetro del campo de visión AP (µm) = ___________________________
Primera observación: La letra “e”
Primero aprendamos como realizar un montaje húmedo:
• Para realizar un montaje húmedo se necesita un porta y cubre objetos que
deberá estar limpio y libre de polvo y otras partículas finas.
 • En el centro del portaobjetos se ubica la muestra y sobre este se pone una gota
de agua limpia; posteriormente se coloca el cubreobjetos sobre la muestra,
formando un ángulo de 45 grados y procurando que los bordes de éste coincidan
con los del portaobjetos sin presionarlo y evitando la formación de burbujas.
• Se deja caer el resto del cubreobjeto sobre la muestra y se sacan las burbujas, el
exceso de agua se puede eliminar colocando un esquina de papel toalla en la
esquina del cubre objeto Cuando la muestra esta lista, se ubica en la platina del
microscopio y se observa.

Recortar la letra “e” minúscula de un periódico o cualquier publicación, realice un

montaje húmedo con la misma:
• Coloque una gota de agua en un portaobjeto limpio
• Coloque la letra en la gota de agua con unas pinzas.
• La letra debe colocarse de manera que pueda leerse sin girar el
portaobjeto
• Vea la letra debajo del microscopio en bajo poder primero, después en
medio poder y contesta las siguientes preguntas:
1. Dibuja la letra “e” tal como aparece bajo el microscopio.
 2. Describe la posición de la “e”.

3. ¿Qué le sucede a la “e” cuando mueves el deslizador hacia la derecha?

4. ¿Qué pasa si la mueves lejos de ti?

5. Aproximadamente, ¿cuántas veces aumentó la ampliación cuando cambió de

baja potencia a media potencia?

9. ¿Cómo cambia esto el área de la placa incluida en el campo de alta potencia?

Segunda observación: Células animales

Células de la mejilla
1. Para ver las células de la mejilla, raspe suavemente el revestimiento interior de la
mejilla con un palillo de dientes. ¡NO SE RASQUE EL INTERIOR DE SU MEJILLA!
2. Haga rodar suavemente y frote el palillo sobre la parte superior de un portaobjetos de
vidrio en un área que será visible a través del microscopio.
3. Prepare un montaje húmedo de estas células.
4. Preparar un segundo montaje húmedo de las células, pero en éste añadir una gota de
azul de metileno (específico para animales) y cubrir con un cubreobjetos.
5. Observe las células de la mejilla tanto con un aumento alto como bajo de su
microscopio. Dibuja un diagrama de una célula de la mejilla y rotula las partes. (Debe
observar al menos la membrana celular, el núcleo y el citoplasma)

CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la función de cada parte del microscopio?
2. ¿Cuál es el objetivo de tener orden, cuidado y limpieza del microscopio?
3. Explica cuál es la utilidad de tener un correcto ajuste en el microscopio.
4. Discute a que se puede deber que se obtenga poca resolución y mal contraste de
la imagen.
5. Explica cómo se obtiene el aumento al que se están haciendo las observaciones.
6. Discute por que dos personas diferentes pueden no ver con la misma nitidez la
misma imagen.
7. Investiga sobre la historia y descubrimiento del microscopio.
8. Investiga a que se puede deber que los ojos del observador se cansan con largos
ratos de observación al microscopio.
BIBLIOGRAFIA
Gray, P. (1964). Handbook of Basic Microtechnique. Mc Graw Hill Nook Co. New
York. 302 pp.
Krempels, Dana, (2018) Manual de Laboratorio de Biología General, Universidad de
Miami
(2001). Instrucciones de manejo. Axiostar plus. Microscopio de luz transmitida y Fl.
(2002). Stereomicoscopes. Stemi DV4. Operatin Manual. Carl Zeiss Ligth Microscopy.
Gottingen, Germany
 LABORATORIO 3
El Método Científico

Para resolver cualquier tipo de problema en el mundo de las STEM es necesario

dominar el método científico, una serie de pasos ordenados diseñados para dar una
respuesta científica replicable y comprobable a un problema determinado. Cada uno de
nosotros usa el método científico de manera inadvertida cada día para resolver los
problemas cotidianos (que tan pesado estará el tranque, que habrá de almuerzo en la
cafetería, etc). El dominar el método científico nos ayudar a responder de manera
efectiva problemas que no se pueden dejar al ensayo y error, con el consiguiente gasto
y desperdicio que esto conlleva

Usted es un ingeniero que trabaja en una planta de papel que utiliza pulpa vegetal para
crear diversos productos, y ahora la compañía ha decidido lanzar una línea de papel
higiénico. Como una de las pocas personas con entrenamiento en ciencias, los
ejecutivos le solicitan que evalúen la calidad de los 4 primeros prototipos de papel
higiénico para determinar cual tiene la mayor resistencia cuando está mojado y por
tanto la mayor calidad y posible aceptación de parte de los consumidores. De la
efectividad de su trabajo depende que sea ascendido a jefe del departamento de R&D o
que sea despedido de la empresa
PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN:
¿Qué marca de papel higiénico tendrá la mayor cantidad de centavos cuando esté
mojada?
MATERIALES:
1. Trabaje en grupo de 4 estudiantes.
2. 4 marcas diferentes de papel higiénico
3. 1 vaso químico
 4. 1 banda elástica
5. 100 centavos
6. 1 gotero
7. Agua

OBSERVACIONES: Examine cada marca de tejido. Piense en cosas como el grosor,

la textura o los diseños de los papeles (áspero, liso, áspero), etc. ¡Haga observaciones
usando los 5 sentidos!
Marca A:
_________________________________________________________________
Marca B:
_________________________________________________________________
Marca C:
_________________________________________________________________
Marca D:
_________________________________________________________________
Discutan y establezcan cuáles de estas observaciones pueden ser más importantes a la
hora de determinar la resistencia de cada marca de papel higiénico:

HIPÓTESIS:
Establezca las hipótesis alterna y nula para su experimento, puntos extra si puede usar
hipótesis direccionales
Ha;
______________________________________________________________________
Ho:
______________________________________________________________________
Antes de empezar su experimento identifique las variables en el experimento:
Variable(s) independiente(s):
_________________________________________________
Variable(s) dependiente(s):
___________________________________________________
Variable(s) control:
_________________________________________________________
Recuerde también de establecer su grupo control y su grupo experimental y establecer
qué condiciones lo hacen diferente a cada uno
Grupo
experimental_______________________________________________________
Grupo Control:
___________________________________________________________
PROCEDIMIENTO
Describa su procedimiento, establezca claramente la metodología a seguir para probar
su hipótesis:
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_______________________________________________________________
DATOS Y RESULTADOD
Tabla 1: Número de centavos aplicados antes de romperse
Replica Marca 1 Marca 2 Marca 3 Marca 4
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Promedio
Otras observaciones (datos
cualitativos)
PRESENTACION DE RESULTADOS:
Abra el programa PAST introduzca los datos, haga un análisis de normalidad (menú:
univariate>normality test), un análisis de ANOVA (menú: univariate>ANOVA), para
determinar si existe diferencia significativa en la resistencia de las marcas de papel,
Elabore y presente una gráfica en PAST(menú:plot>barchart) mostrando si existen o no
diferencias significativas
Describa sus resultados usando la terminología correspondiente, ver el documento en
anexos sobre como reportar resultados de ANOVA
CONCLUSIÓN:
1. Resuma sus resultados: ¿qué papel higiénico fue el más fuerte?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_______________
2. ¿Qué información (evidencia) te convenció de que este papel higiénico era el más
fuerte?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
____________

3. Haga una inferencia: ¿por qué cree que el papel higiénico que era el más fuerte
superó a los demás?
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_______________
4. Evalué sus hipótesis, fue correcta su hipótesis alterna, en caso de no serlo elaboré
una nueva de acuerdo con la nueva información recibida
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_______________
BIBLIOGRAFIA
Manual de Prácticas de Laboratorio Biología I.
Para los alumnos del Colegio de Bachilleres del Estado de Baja California Sur.
Edición 2019.
Dalton State General Biology Laboratory Manual, last revision 02/2023:
https://libguides.daltonstate.edu/PrinciplesofBiology/labmanual
 LABORATORIO 4
TINCIÓN SIMPLE Y NEGATIVA

INTRODUCCION
Entre las principales características de las bacterias figuran su tamaño, su forma, su
estructura y su tipo de agrupación, las que en conjunto constituyen la morfología de la
célula. Según su especie, las bacterias son: oval o esféricas, cilíndricas o en forma de
bastón; en espiral o helicoidal. Cuando las bacterias tienen la forma esférica u oval, se
denominan cocos, estos a su vez manifiestan modelos de agrupación, que son útiles para
su identificación.
Agrupaciones características de los cocos
➢ Diplococos: se disponen en forma de parejas
➢ Estreptococos: los podemos encontrar formando cadenas.
➢ Tétradas: forman grupos característicos de cuatro células
➢ Estafilococos: forman “racimos” de cocos
➢ Sarcinas: forman agrupaciones cuboidales.
Por el contrario, las bacterias cilíndricas o en forma de bastón, llamadas bacilos no se
agrupan por sí mismas en diversos modelos de agrupación característicos de los cocos.
En las bacterias en espiral, los espirilos predominan las células individuales aisladas.
Para poder observar con mayor claridad estas características morfológicas se hace
necesario fijar y teñir a las bacterias utilizando diferentes tipos de tinción. La tinción
bacteriana tiene sus inicios en el siglo XIX cuando Robert Koch crea el método de tinción
de las bacterias causantes de la tuberculosis. Utilizó la tinción en tejidos como base para
aislar el Micobacterium tuberculosis, donde usó azul de metileno entre otros tintes.
Los pasos esenciales en la preparación de un frotis fijo y teñido son:
a) hacer el frotis,
b) la fijación y
c) la aplicación de una o más soluciones colorantes.
La fijación es el proceso por el cual se conservan y fijan en su posición las estructuras
internas y externas de las células de los microorganismos. Inactiva enzimas que podrían
alterar la morfología celular y endurece las estructuras celulares, de manera que no
cambien durante la tinción ni la observación. Normalmente, durante la fijación se
destruye al microorganismo y se fija firmemente al portaobjetos. Existen dos clases de
fijación fundamentalmente diferentes: fijación con calor y la fijación química. En la
fijación con calor se conserva adecuadamente la morfología general, no así las estructuras
internas de las células y la fijación química protege la subestructura fina y la morfología
de microorganismos delicados de mayor tamaño.
Los colorantes son compuesto químicos utilizados para aumentar el contraste y facilitar
la observación de las muestras. Los numerosos tipos de colorantes empleados para teñir
microorganismos poseen dos características en común: todos poseen grupos cromóforos
(le dan el color al colorante); pueden unirse a las células mediante enlaces iónicos,
covalentes o hidrófobos. Por ejemplo, un colorante cargado positivamente se une a
estructuras de la célula cargadas negativamente.
Los colorantes ionizables se pueden dividir en dos clases a saber: colorantes básicos
(azul de metileno, fucsina básica, violeta cristal, safranina, verde malaquita); y
colorantes ácidos, se utilizan para teñir tejidos animales infectados con microorganismos
(eosina y fucsina ácida, rojo congo). Un colorante básico (o catiónico) es aquél donde la
carga llevada por el ión colorante es positiva. Un colorante ácido (o aniónico) es aquél
donde la balanza de la carga sobre el ión colorante es negativa. En general, los colorantes
ácidos tiñen a los componentes celulares básicos y los colorantes básicos a los
componentes celulares ácidos
Existen tres tipos de técnicas de tinción: simples, diferenciales y especificas (especiales)
Los microorganismos se pueden teñir satisfactoriamente con tinción simple, es decir,
utilizando un solo colorante, que siempre es de tipo básico; todas las células absorberán
el colorante y quedarán teñidas del mismo color. La ventaja de esta tinción es su
simplicidad, rapidez y facilidad de empleo. Las tinciones diferenciales se utilizan para
distinguir entre grupos de microorganismo. Las tinciones específicas incrementan el
contraste en las células microbianas y revelan estructuras particulares, entre las que se
incluyen las endosporas, los flagelos y las capsulas.
Una técnica por la cual las células sin teñir se hacen visibles en una película oscura es la
llamada tinción negativa. Esta técnica revela la presencia de capsulas difusas alrededor
de muchas bacterias. Como resultado de dicha tinción las bacterias aparecen como
cuerpos más claros en medio de un fondo oscuro. La ventaja de este procedimiento para
el estudio de la morfología es que las células no reciben una agresión física o química
violenta.
OBJETIVOS
➢ Distinguir entre tinción simple y tinción negativa
➢ Aplicar los pasos esenciales en la preparación de un frotis fijo y teñido.
➢ Aplicar el método para teñir un frotis con un solo colorante.
➢ Conocer las distintas formas y agrupaciones que se pueden presentar en los
microorganismos.
MATERIALES Y REACTIVOS
Porta y cubre objeto
Pinzas de madera
Mechero
Asas bacteriológicas
Yogurt natural
Plato caliente
Botella lavadora
Colorantes (Safranina, azul de metileno, violeta cristal, tinta china),
Material bacteriológico
Cultivo de 24 horas de E. Coli, Estafilococos aureus, Estretococos sp.

PROCEDIMIENTO:
A. Preparación de un Frotis Bacteriano
1. Con la ayuda del asa o un gotero coloque una gota de agua sobre un portaobjeto
seco y limpio.
2. Con el asa previamente estéril y enfriada tome una pequeña porción del material
bacteriológico proporcionado y colóquelo sobre la gota de agua. Extienda la muestra
suavemente dando movimientos circulares con la ayuda del asa (fig.1). Nota: Si el
cultivo proviene de un medio líquido no es necesario colocar agua en el portaobjeto, en
este caso se toma el material bacteriológico directamente con el asa estéril y se procede
como se indica en el punto anterior.
3. Déjelo secar a temperatura ambiente (fig.1).
4. Utilizando el mechero fije la muestra con calor pasando el portaobjeto por la
flama pero sin dejarlo sobre esta (fig.1).
5. Enfríe la muestra.
B. TINCIÓN SIMPLE
1. Para la tinción simple coloque unas gotas del colorante (safranina, azul de
metileno o violeta cristal) y déjelo por espacio de un minuto.
2. Enjuague el portaobjeto con la ayuda de una botella lavadora.
3. Deje secar la muestra.
4. Observe bajo el microscopio con el objetivo de inmersión (100X). Recuerde que
al utilizar el objetivo de inmersión (100X) es necesario colocar una gota de aceite de
inmersión sobre la muestra a observar.
5. Haga un diagrama de lo observado y preséntelo en su informe.
C. TINCIÓN NEGATIVA:
1. Coloque una gota de nigrosina o tinta china en el extremo de un portaobjeto
limpio y seco; luego, con el asa estéril y enfriada previamente tome una pequeña porción
del material bacteriológico y mézclelo con el tinte.
2. Con la ayuda de otro portaobjeto extienda la muestra hasta cubrir todo el
portaobjeto como se muestra en la figura 2. Déjela secar a temperatura ambiente.
3. Observe bajo el microscopio con el objetivo de inmersión (100X).
4. Repita los pasos 1, 2 y 3 pero esta vez utilizando yogurt.
5. Haga un diagrama de lo observado y preséntelo en su informe.
Figura 1: Preparación y tinción de un frotis
Fijación de las bacterias al calor

Extensión de una fina capa de la muestra

(cultivo sobre el porta objetos)

Secado al aire

Fijación por flameado del porta objetos

Dar inicio al proceso de tinción

Paso 1: Preparación de un frotis Paso 2: fijación del frotis al calor

Paso 3: Tinción del frotis Paso 4: Lavar con agua destilada o

corriente

Figura 2: tinción negativa

Extensión de la muestra
 LABORATORIO 5
TINCION DE GRAM
OBJETIVOS
➢ Conocer los principios y la importancia de la tinción diferencial en la microbiología
➢ Diferenciar entre bacterias Gram positivas y Gram negativas.

INTRODUCCION
Los procedimientos de tinción que ponen de manifiesto diferencias entre las células
bacterianas o en partes de una célula bacteriana se conocen como técnicas de tinción
diferencial. En 1884 el patólogo danés Christian Gram establece una tinción de contraste
la “tinción de Gram” que permite distinguir dos grupos bacterianos en función de su
reacción diferencial. Actualmente es el método de tinción más ampliamente utilizado en
microbiología. Las bacterias sometidas al método de Gram pertenecen a dos grupos:
bacterias Grampositivas, que retienen el cristal violeta y aparecen color violeta
profundo; las bacterias Gramnegativas, que pierden el cristal violeta y por el contraste
de la safranina aparecen rojas.

El distinto comportamiento frente a los colorantes de las bacterias grampositivas y

gramnegativas se debe a las diferencias existentes en sus superficies externas. Las células
gramnegativas poseen una pared de peptidoglicano delgada y una membrana externa;
mientras que las bacterias grampositivas poseen una pared gruesa de peptidoglicano y
carecen de membrana externa. En el cuadro 1 y la figura 1 se presentan algunas
diferencias entre las bacterias grampositivas y gramnegativas.
La tinción de Gram tiene su mayor aplicación en la caracterización de las bacterias; ya
que por medio de esta podemos averiguar si un organismo es Gram positivo o
Gramnegativo, su morfología celular y su agrupación típica y así poder determinar con
que tipo de bacteria estamos trabajando.
Materiales y Reactivos
Asas bacteriológicas
Porta y cubre objetos
Mecheros
Horquillas de madera
Goteros
Plato caliente
Colorantes para la tinción de Gram
botellas lavadoras
Material bacteriológico:
Cultivo de 24 horas de Escherichia coli
Cultivo en caldo de 24 horas de Estafilococos aureus y Estreptococos sp.

Cuadro 1. Diferencias entre bacterias Gram negativas y Gram positivas.

Figura 1. Diferencia en la pared celular entre las bacterias Gram – y Gram +. (tomado
de Freeman Biología 2009)
PROCEDIMIENTO:
A. Preparación del frotis y fijación
1. Prepare un frotis de la misma forma que lo hizo en su experiencia anterior. Tome
un portaobjeto limpio y con el asa extienda una fina capa del cultivo. Seque al aire libre.
Fije la muestra.
B. Tinción
1. Realice la tinción de Gram añadiendo cada uno de los colorantes de la siguiente
manera:
➢ Añada primero el violeta cristal (procure cubrir todo el frotis con el
colorante), deje transcurrir un minuto y enjuague con agua. Durante este
proceso todas las células se tiñen de azul púrpura (Gram +). Continúe con el
Yodo Gram, después de transcurrido un minuto enjuague con agua. Decolore
con Alcohol-Acetona y lave rápidamente con agua. Las células (Gram +)
retienen el violeta cristal; mientras que las Gram- se decoloran. Por ultimo
agregue safranina deje que transcurra un minuto y enjuague con agua. Las
células decoloradas en el paso anterior se teñirán de rosado. Nota: Recuerde
llevar el tiempo adecuado para cada colorante, esto influirá en sus resultados.
2. Deje secar al aire y observe al microscopio.
ESQUEMA DE LA TINCION DE GRAM
REACTIVOS TIEMPO
Violeta Cristal 1 minuto
Yodo Gram (mordente) 1 minuto
Alcohol-Acetona (decolorante) -
Safranina 1 minuto
 LABORATORIO 6
MEDIOS DE CULTIVO Y CONTROL DE ESTERILIDAD

OBJETIVOS
➢ Conocer los diferentes medios de cultivos utilizados en la industria de los
alimentos.
➢ Conocer y aplicar los métodos de esterilización utilizados en la preparación de
medios de cultivo.
➢ Conocer la importancia del control de esterilidad

INTRODUCCION
Gran parte de la microbiología depende de la capacidad de cultivar y mantener
microorganismos en un laboratorio, y esto solo es posible si se dispone de los medios de
cultivo adecuados. Para lograr esto es preciso conocer cuales son los nutrientes y las
condiciones físicas que requieren. Los medios de cultivo son las soluciones nutritivas
que se usan en el laboratorio para el cultivo de los microorganismos. Robert Koch fue el
primero que cultivó bacterias en medios de cultivo sólidos. Inicialmente, Koch empleó
gelatina como agente solidificante de los diversos nutrientes líquidos que usaba para
cultivar bacterias patógenas y desarrolló un método para preparar láminas horizontales
de medio sólido que mantenía libre de contaminantes cubriéndolas con una campana o
tapadera de cristal. Sin embargo, el uso de los caldos nutritivos con gelatina presentaba
varios inconvenientes, y el más importante era que la gelatina no se mantenía sólida a la
temperatura del cuerpo humano (370C), que es la temperatura óptima para el crecimiento
de la mayoría de los microorganismos patógenos humanos. Se requería de un agente
solidificante y éste resultó ser el agar. El agar es un polisacárido derivado de las algas
rojas del género Gelidium y otros, y se le emplea en bacteriología como agente
solidificante. Cuando se funde en agua hirviendo, puede enfriarse y mantenerse estable a
una temperatura de 40 a 420C, sin endurecerse, y no fundirá de nuevo hasta que alcance
una temperatura de 80 a 900C.
Un medio se utiliza frecuentemente para seleccionar y cultivar microorganismos
específicos o para facilitar la identificación de una especie en particular. En
microbiología se usan dos grandes grupos de medios de cultivo: los químicamente
definidos o sintéticos y los indefinidos (complejos). Los medios químicamente definidos
son aquellos en que se conocen todos los componentes, éstos se preparan añadiendo a un
volumen de agua destilada, cantidades precisas de compuestos orgánicos o inorgánicos
altamente purificados. En algunos casos el conocimiento de la composición química no
es crítico. Los medios indefinidos contienen algunos ingredientes cuya composición
química se desconoce. En los medios complejos podemos encontrar componentes como
peptonas, extracto de carne y de lavadura. Además, se necesitan muchos medios de
cultivo elaborados para propósitos especiales que facilitan la identificación, aislamiento
y cuantificación de ciertos tipos de bacterias; evaluar la sensibilidad a los antibióticos,
analizar aguas y alimentos, en microbiología industrial y otras actividades.
De acuerdo con su función o aplicación, se pueden clasificar de la siguiente manera:
Medios enriquecidos: Son medios utilizados para fines generales ya que mantienen el
crecimiento de muchos microorganismos. La adición de sangre y otros nutrientes
especiales permite el crecimiento de microorganismos exigentes. Estos medios
especiales (por ejemplo, agar sangre) se denominan medios enriquecidos
Medios selectivos: Favorecen el crecimiento de microorganismos particulares. Por
ejemplo, la presencia de sales biliares o colorantes como la fucsina básica y el cristal
violeta favorecen el crecimiento de bacterias gramnegativas, mientras que inhiben el
crecimiento de las grampositivas sin afectar a las primeras.
Medios diferenciales: Son medios que diferencian entre grupos distintos de bacterias e
incluso permiten una identificación tentativa de los microorganismos, según sus
características biológicas.
Teniendo en cuenta su estado físico los medios de cultivo pueden ser:
Sólidos: Contienen agar como agente solidificante, normalmente al 1.5%
Semisólidos: Contienen pequeñas cantidades de agar (0.5% o menos)
Líquidos: No contiene agar como agente solidificante. Sin embargo se puede obtener un
medio sólido o semisólido mediante la adición de agar al medio líquido.
Debido a que los microorganismos son omnipresentes, los medios de cultivos deben ser
esterilizados antes de usarse.
La esterilización implica la muerte o destrucción de todos los organismos viables de un
medio de cultivo. Existen distintos métodos de esterilización los cuales varían en cuanto
a su forma de actuación y son empleados para impedir el crecimiento microbiano,
descontaminar áreas o materiales contaminados con microorganismos.
Esterilización por calor: La aplicación de calor quizás sea el método mas generalizado
para el control del crecimiento microbiano. Los procedimientos en los que se emplea
calor se dividen en dos categorías: calor seco (incineración, esterilización con aire
caliente) y calor húmedo (vapor a presión). La mayoría de los medios de cultivo, son
esterilizados habitualmente mediante calor húmedo en un gran recipiente llamado
autoclave que permite la entrada de vapor de agua bajo presión. Por lo general, aunque
no siempre el autoclave se opera a una presión de 15 lb/pulg2, lo que permite alcanzar
una temperatura de 1210C, el tiempo de esterilización suele ser de 10 a 15 minutos, pero
puede variar dependiendo de la naturaleza del material, el tipo de recipiente y el volumen.
Esterilización por radiación: La utilización de radiaciones electromagnéticas como un
método de esterilización o para reducir la carga microbiana en casi cualquier sustancia
es sumamente eficaz. Las microondas, las radiaciones UV, los rayos X, radiaciones
gamma y los electrones, son tipos de radiaciones electromagnéticas que pueden controlar
potencialmente el crecimiento microbiano Sin embargo, hay que tener en cuenta que cada
tipo de radiación actúa con un mecanismo especifico.
Esterilización por filtración: Algunos medios de cultivo y materiales, como por ejemplo:
líquidos biológicos (suero) o soluciones de sustancias como las enzimas y algunas
vitaminas o antibióticos, son termolábiles, o sea, se destruyen por el calor. Un filtro es
un dispositivo con poros muy pequeños que no permiten el paso de los microorganismos,
pero suficientemente grandes para permitir el paso de un líquido o un gas. El tipo de filtro
más común para la esterilización en microbiología es el filtro de membrana.
Materiales y Reactivos
Platos petri
Medios de cultivo
Matraz erlenmeyer
Plato caliente y agitador
Parafilm
Balanzas
Recipientes para pesar
Espátula
Policial o agitadores magnéticos
Mechero
Guantes resistentes al calor
Alcohol al 70%
Agua destilada
Papel de aluminio
PROCEDIMIENTO:
Preparación de un medio de cultivo
1. Siga las instrucciones del medio de cultivo pese la cantidad adecuada del medio
que se va a preparar.
2. Coloque en un matraz erlenmeyer un volumen apropiado de agua destilada, y
disuelva el medio de cultivo.
3. Determine el pH del medio con un potenciómetro y ajuste de ser necesario (ver
el recomendado en el envase).
4. Si el medio que va a preparar es sólido caliente hasta ebullición en una plancha
caliente y agite constantemente hasta disolver por completo el agar del medio.
Asegúrese que todo el agar se haya disuelto, un error común es dejar medio sin
disolver. Si el medio es líquido no es necesario calentar hasta ebullición.
5. Distribuir el medio en los recipientes adecuados para su posterior
esterilización.
6. Esterilizar en la autoclave por 15 minutos a 121oC. Para este paso siga
cuidadosamente las instrucciones del Profesor de laboratorio.
7. Retirar de la autoclave y colocar en baño maría a una temperatura de 45- 50
o
C.
8. Vierta el medio de cultivo en platos petri, y deje solidificar. Para evitar
contaminaciones siga las siguientes recomendaciones: Limpie su área de
trabajo antes de servir los platos, trabaje siempre cerca del mechero. No hable
cuando este sirviendo el medio
9. Es importante dejar enfriar el líquido antes de cubrir las placas petri para
prevenir condensación en las tapas y así reducir el riesgo de moho.
10. El líquido debe tornarse en gelatina al enfriarse. Si esto no ocurre, hierva de
nuevo el líquido con un poco más de agar.
11. Deje solidificar y enfriar , cubra el borde con Parafilm para evitar
contaminaciones y guarde en la neverapara el próximo laboratorio
 Vertido en Placa Vertido en Placa

Sí No

No se debe verter el medio de cultivo desde arriba y se debe

mantener la tapa del plato petri lo más cerca posible tratando de
proteger tanto el medio como la base del plato
La Técnica aséptica previene las contaminaciones
 LABORATORIO 7
AISLAMIENTO POR SIEMBRA EN ESTRÍAS Y OBTENCIÓN DE UN
CULTIVO PURO.
Para empezar cualquier estudio microbiológico es siempre importante saber aislar
organismos en colonias de manera que se puedan identificar y categorizar. El proceso
de aislamiento consiste en disponer de la descendencia de un individuo (célula)
inmovilizada sobre la superficie de un medio sólido y separada del resto de individuos
presentes en el cultivo mixto. Esta célula, en las condiciones de crecimiento adecuadas
dará lugar a una descendencia (clon) que resultará macroscópicamente visible y que se
llama colonia. Cada colonia contiene millones o miles de millones de células idénticas
y con el mismo origen y propiedades. Se puede demostrar que prácticamente cada
colonia procede de una sola célula o de un grupo de células del mismo tipo si el
microorganismo forma agregados. Por ello lo más correcto es hablar de unidades
formadoras de colonias (UFC) al referirnos al origen de una colonia. El cultivo
descendiente de una misma colonia es un cultivo puro.
La siembra por estría es un método cualitativo de aislamiento de microorganismos por
agotamiento en placa a partir de una muestra natural o de un cultivo de laboratorio. Este
método está basado en arrastrar, mediante un asa de siembra, un número cada vez más
pequeño de individuos. Es un método rápido y simple de agotamiento progresivo y
continuo del inóculo sobre un medio sólido contenido en una placa de Petri. El objetivo
es obtener, a partir de un elevado número de bacterias, un número reducido de ellas
distribuidas individualmente sobre la superficie de la placa.
Al incubar la placa, y dejar crecer las bacterias distribuidas sobre ella, cada una de las
bacterias originará una colonia. Haciendo fácil su posterior crecimiento en platos
individuales
Material necesario
TSA (Agar de triptona y soja).
Mezcla de dos o más bacterias en solución salina o agua de peptona.
Cultivos puros de bacterias.
Asas bacteriológicas,
Pinzas
Marcadores
Platos Petri con medios previamente preparados
Siembra en estrías
Seleccionar un cultivo en un plato Petri con agar de TSA que no tenga agua de
condensación.
Marcar las placas Petri que contienen el medio de cultivo para aislamiento. Los rótulos
deben ser hechos en aquella parte de la placa que lleva el medio.
Utilizar platos sin agua de condensación (ni en la tapadera ni en el medio)
Colocar siempre las placas en posición invertida (con el medio de cultivo arriba).
Se evitan las contaminaciones y que el agua de condensación caiga sobre el medio.
En condiciones de esterilidad, tomar una gota de la mezcla bacteriana con ayuda de un
asa estéril. Si se trata de un cultivo puro (en tubos de TSA inclinados), tomar la menor
cantidad de masa bacteriana posible
Los métodos de siembra son variados. Lo importante es avanzar el asa sobre la
superficie del medio con estrías muy juntas, nunca superpuestas.
Incubar las placas, el tiempo y temperatura de incubación adecuados para cada bacteria
(si no se indica lo contrario, 37 C, 24 horas).
Observar las colonias y describir los diferentes tipos encontrados.
El alumno puede ayudarse de una lupa, pero no es imprescindible
 LABORATORIO 8
CULTIVO, AISLAMIENTO Y ENUMERACION DE BACTERIAS

OBJETIVOS
➢ Conocer las técnicas de cultivo, aislamiento y enumeración de bacterias y su
importancia en la industria de los alimentos

INTRODUCCION
Las bacterias u otros microorganismos que se desarrollan en medios de laboratorio, se
llaman cultivos. Estos cultivos pueden contener diferentes especies de bacterias que se
desarrollan en la misma clase de medios de cultivo y que pueden tener aspectos muy
diferentes. El conocimiento de la apariencia, o de las características de cultivo de las
especies nos ayuda a identificar y caracterizar ciertos tipos de bacterias.
En los hábitats naturales, los microorganismos crecen en poblaciones mixtas y complejas,
es decir, que contienen varias especies. Esto representa un problema ya que no se puede
estudiar adecuadamente un único tipo de microorganismo en un medio mixto; por lo tanto
se hace necesario la obtención de cultivos puros que nos permitan determinar las
características de cultivo o cualquier otra propiedad de las especies. Un cultivo puro esta
formado de poblaciones de células derivadas de una única célula. Existen diferentes
técnicas, por medio de las cuales las diferentes especies en una muestra natural pueden
ser aisladas y desarrollarse como cultivo puro. El aislamiento de bacterias es una técnica
que se basa en la obtención de cultivos puros, es decir, que parten de colonias bacterianas
crecidas en un medio de cultivo conocido, y cuyas propiedades físicas (color de la
colonia, forma, dimensiones, características propias) indican que se trata de un solo tipo
de microorganismo.
La técnica de siembra por estría en placa: Consiste en pasar una pequeña porción de la
muestra con un asa bacteriológica a la superficie de un medio de cultivo hecho a base de
agar y a continuación se siembra en el medio y se extiende formando estrías sobre la
superficie como se muestra en la figura 1. Cuando se raya adecuadamente el agar con el
asa de siembra se logra que las células bacterianas queden lo suficientemente separadas,
de esta manera podemos suponer que cada colonia aislada es la descendencia de una sola
célula y por tanto, un cultivo puro.
Técnica de difusión y vertido en placa: En ambas técnicas el cultivo es previamente
diluido en tubos antes de su siembra en placa. En la técnica de difusión en placa se
transfiere un volumen del cultivo ya diluido, que no suele ser superior a 0.1 ml, y se
extiende uniformemente sobre la superficie del agar con la ayuda de una varilla de vidrio
estéril, doblada en forma de “L” (asa de Digralsky) como se muestra en la figura 2. Las
placas son incubadas de manera que las células así dispersas desarrollan colonias
aisladas. Técnica de vertido en placa, se pipetea un volumen conocido (por lo general
0.1-1.0 ml) de cultivo en una placa Petri estéril sobre la cual se agrega el medio con agar
fundido y se mezcla dando suaves movimientos a la placa sobre la superficie de la mesa
antes que se solidifique el agar; ambos tipo de siembra permiten contar una población
microbiana. Sin embargo, con este método el organismo que se cuenta debe ser capaz de
resistir la temperatura del agar fundido a 450C.

MATERIALES Y REACTIVOS
Platos de agar
Asas bacteriológicas
Pipetas de 1 ml estériles
Varillas de vidrio en forma de L
Muestras de alimentos
Muestra de alimento
Tubos con 9 ml de agua peptonada
Material bacteriológico
• Caldo con cultivo mixto de bacterias
PROCEDIMIENTO:
A. Técnica de estriado en plato
1. Incinere y enfríe el asa, luego tome una porción del cultivo y estríe en un plato de
agar tal como en el laboratorio anterior
2. Incube el plato de manera invertida a 37oC por 24 horas.
1. Técnica de difusión en plato
La técnica de difusión en plato se utiliza para la separación de una población mezclada y
diluida de microorganismos de modo que se puedan aislar colonias individuales.
En esta técnica, un pequeño volumen de mezcla microbiana diluida se transfiere al
centro de una placa de agar y se distribuye uniformemente sobre la superficie con una
varilla de vidrio doblada en forma de L estéril, mientras se hace girar la placa de Petri;
en algún momento, se obtendrán células individuales. depositado con la varilla de
vidrio doblada sobre la superficie de agar. Incubar la placa de agar a 37ºC durante 24
horas, en posición invertida. Las células dispersas se desarrollarán en colonias aisladas.
Debido a que la cantidad de colonias será igual a la cantidad de organismos viables en
la muestra, se pueden usar placas para contar la población microbiana.

B. Técnica de vaciado en plato

Con la ayuda de una pipeta estéril tome 1 ml de la muestra de alimento y viértala en el

centro de un plato petri sin agar
Inmediatamente agregue el agar, el mismo debe tener una temperatura de 45oC a 50oC.
Sin levantar el plato, girar suavemente en forma de 8.
Dejar solidificar e incubar por 24 horas a 36oC.
Leer y enumerar en la siguiente clase.
 LABORATORIO 9
OBSERVACION Y CULTIVO DE HONGOS
OBJETIVOS
Analizar la morfología macroscópica y microscópica de hongos de diversos tipos de
hongos en dos sesiones prácticas.
Observar, describir y analizar la morfología macroscópica de colonias fúngicas.
Generar preparaciones para la observación de la morfología microscópica de hongos
levaduriformes y filamentosos.
Crecer un hongo de interés en un medio de cultivo líquido y un medio de cultivo sólido
para comparar su morfología.
Determinar la velocidad de crecimiento del hongo seleccionado
INTRODUCCION
Los hongos son organismos eucariontes, heterótrofos. Obtienen sus nutrientes por
digestión extracelular (mediada por actividad de enzimas secretadas) seguido de la
absorción de productos solubles. En su estado vegetativo, crecen en o sobre un sustrato,
formando hifas y/o micelios (septados o cenocíticos); la mayoría de los hongos carecen
de estructuras móviles, su pared celular está compuesta principalmente de glucanos y
quitina. Los hongos pueden ser uninucleados o multinucleados, homotálicos o
heterotálicos, haploides o diploides. Sus mecanismos de reproducción incluyen la sexual,
asexual y parasexual, lo que genera propágulos microscópicos (esporas). Se caracterizan
por ser de distribución cosmopolita, teniendo una importancia ecológica como saprófitos,
simbiontes mutualistas o parásitos. Una de las características fundamentales que
permiten la identificación de los hongos es el análisis de las características macroscópicas
y microscópicas de sus colonias
MATERIALES Y REACTIVOS
• Aguja de disección
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Azul de metileno
• Agar Papa Dextrosa
• Acido Tartárico al 10%
• Platos petri
• Balanza
 • Mechero
• Plato caliente y agitador
• Agitadores magnéticos
• Pinzas de madera
• Espátula
• Recipientes para pesar
• Alcohol al 70%
• Muestra de alimentos

PROCEDIMIENTO:
A. Observación de hongos en muestras de alimentos
1. Utilizando una aguja de disección tomar una muestra del alimento en que se
observe crecimiento de hongo.
2. Coloque la muestra en un portaobjetos y seguidamente agregue unas gotas de azul
de metileno de manera que se tiña la muestra.
3. Coloque un cubreobjetos sobre la preparación, teniendo especial cuidado de que
no se formen burbujas al colocar el cubreobjetos.
4. Observe al microscopio con el objetivo de 40X

B. Preparación de un medio para el cultivo de hongos.

1. Prepare el agar Papa Dextrosa siguiendo las indicaciones del envase y según lo
aprendido en prácticas anteriores. Una variante en la preparación de este agar es la
adición de ácido tartárico al 10 %. Este se agrega con cuidado de no contaminar el agar
ya esterilizado, siguiendo las proporciones recomendadas en el envase del agar.
2. Tome los platos de agar Papa Dextrosa ya preparados y rotúlelo con lo siguiente:
a) Control de esterilidad, b) Control ambiental por 15 minutos c) Control ambiental por
30 minutos d) Finger print o control de higiene de manos
3. Coloque los platos de control ambiental en puntos específicos del laboratorio
4. Incubar a temperatura ambiente (22oC a 28oC) de 3 a 5 días. En esta ocasión los
platos no se invierten y se incuban con la tapa hacia arriba.
5. Se debe observar a los 3 días, 5 días y hasta los 7 días si no tiene altos recuentos
En la siguiente sesión de laboratorio:
1. Enumerar las colonias.
2. Observar al microscopio y tomar nota de la morfología y estructuras

BIBLIOGRAFIA
Webster J, Weber R (2007) Introduction to Fungi (3 ed). UK: Cambridge University
Press.
Bonifaz-Trijullo J.A (2012) Micología Médica Básica (4 ed). Mc. Graw-Hill.
 LABORATORIO 10
CONTROL DE MICROORGANISMOS POR LA ACCION DE AGENTES
BACTERIOSTATICOS

OBJETIVOS
➢ Conocer los métodos y procedimientos utilizados para el control microbiano
➢ Demostrar que existen componentes naturales capaces de inhibir el crecimiento de
los microorganismos.
INTRODUCCION
En general, puede ejercerse el control limitando el crecimiento microbiano, por medio de
agentes físicos, procedimientos físicos o agentes químicos que inhiban, eliminen o
maten, los microorganismos. Los procedimientos físicos y agentes químicos empleados
en la lucha contra los microorganismos reciben los siguientes nombres: esterilización,
desinfectante, antiséptico, saneamiento, germicida (microbicida), bactericida,
bacteriostasis y agentes antimicrobianos ¿Por qué es necesario controlar el crecimiento
microbiano? Se ha calculado que una sola célula de Escherichia coli, bajo condiciones
óptimas de crecimiento, produciría en menos de 48 horas, una masa de microorganismos
mucho mayor que la masa de la tierra; sin embargo, esto es sólo teóricamente, pues el
crecimiento de un microorganismo está limitado por el agotamiento de los nutrientes. Por
razones prácticas, el control del crecimiento microbiano es con frecuencia necesario para
limitar la destrucción de una valiosa “fuente de nutrientes”. Ejemplo en la industria
alimenticia, el deterioro de los alimentos causa grandes pérdidas económicas.
Los agentes bacteriostáticos inhiben el crecimiento microbiano y, hoy en día se extrae el
principio activo de estos productos, como el caso del eugenol del clavito de olor para ser
usados en la preservación de alimentos, disminuyendo cantidades excesivas de aditivos
químicos que tienen efectos secundarios.
Muchos alimentos contienen sustancias antimicrobianas naturales, como inhibidores
químicos complejos y enzimas. Las curaminas presentes en las frutas y hortalizas
presentan actividad antimicrobiana. La leche de vaca y los huevos también contienen
sustancias antimicrobianas. Los huevos tienen un alto contenido en la enzima lisozima,
capaz de lisar las paredes celulares (el peptidoglucano) de las bacterias gram positivas
contaminantes.
Las hierbas y las especias a menudo poseen importantes sustancias antimicrobianas;
Ejemplo de estos tenemos: La salvia y el romero son dos de las especias con mayor
poder antimicrobiano. En la canela, la mostaza y el orégano se encuentran compuestos
aldehídicos y fenólicos, que inhiben el crecimiento microbiano. Otros inhibidores
importantes son el ajo, que contiene alicina, y el clavo que contiene Eugenol; la
pimienta, la sábila, el jengibre, el culantro, el limón y otros. Es por esto que con
frecuencia son recomendados para tratar ciertos malestares estomacales, en especial la
sábila, el culantro; sin embargo, se deben tomar en cuenta los efectos colaterales que
pudieran causar la pimienta y el jengibre por ser irritantes.
En general, los hongos son más sensibles que la mayoría de las bacterias. No obstante las
especias también pueden contener microorganismos patógenos. En la mayoría de las
especias se han detectado bacterias coliformes, Bacillus cereus, Clostridium perfringens
y especies de Salmonella.
Las variedades de té verde y negro no fermentados también tienen propiedades
antimicrobianas bien establecidas debido a su contenido en polifenoles, que
aparentemente disminuyen al fermentar el té estos tipos de té son activos frente a
bacterias, virus y hongos, y es posible que tengan propiedades contra el cáncer.
Si se siembra un microorganismo conocido en un medio de cultivo, y se coloca una
pequeña porción del agente bacteriostático, se forma un halo inhibitorio alrededor del
producto, lo que indica que las bacterias fueron afectadas y no se pueden multiplicar
cerca del agente bacteriostático, por causar distintas reacciones a nivel de su capacidad
reproductiva.
MATERIALES Y REACTIVOS
Discos de papel filtro
Platos con agar
Pinzas de metal
Mortero y pistilo
Espátulas
Mecheros
Alcohol 95%
Especias (clavito de olor, salvia, romero, ajo, mostaza, etc.)

PROCEDIMIENTO
1. Seleccione el producto que va a utilizar (culantro, pimienta, sábila, etc.)
2. Seleccione cinco platos Petri sin condensación.
3. Con la ayuda de un mortero y un pistilo triture el producto y agregue alcohol al
95%
4. Utilizando una pinza de metal estéril tome los discos de papel filtro e imprégnelo
en cada uno de los extractos.
5. Utilizando el método de difusión en placa proceda a inocular el plato con el
microorganismo.
6. Sobre el agar inoculado y con la ayuda de una pinza de metal estéril coloque cada
uno de los discos impregnado con los extractos debidamente identificados.
7. Incube los platos por 24 a 48 horas a 370C
8. Usando una regla graduada en milímetros mida el halo de inhibición de cada uno
de los compuestos
 LABORATORIO 11
ESTUDIO DEL CRECIMIENTO BACTERIANO
1.- CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO
INTRODUCCIÓN
La siguiente figura muestra una curva típica de crecimiento de una población bacteriana
en un sistema de crecimiento cerrado (sin aporte continuo de nutrientes) y con un
medio de cultivo que aporta todos los nutrientes necesarios. Esta curva se divide en
varias partes: fase de latencia, fase de crecimiento exponencial, fase estacionaria y fase
de muerte.

Fase de latencia: es el tiempo que tarda una bacteria determinada en adaptarse al

medio de cultivo y las nuevas condiciones ambientales.
Fase exponencial: la población crece al ritmo máximo de forma que cada célula se
divide originando dos células, estas dos darán cuatro, y así sucesivamente,
duplicándose la población en cada período divisional o tiempo de generación (o tiempo
de duplicación), típico de cada cepa bacteriana para unas condiciones de cultivo dadas.
Al representar el logaritmo del número de células viables respecto al tiempo, se obtiene
una línea recta.
Fase estacionaria: en un cultivo donde no hay renovación del medio de cultivo, los
nutrientes se agotan y se acumulan productos metabólicos tóxicos, con lo que el
crecimiento de la población se ralentiza e incluso se detiene.
Fase de muerte: si se prolonga el cultivo, se llega a una situación en que las células
mueren, disminuyendo el número de células viables.
EXPRESIÓN MATEMÁTICA DEL CRECIMIENTO
Cuando el crecimiento es exponencial, se puede definir matemáticamente como una
reacción de primer orden, donde el incremento del número de bacterias respecto al
tiempo es proporcional al número de células presentes en aquel momento.
Por tanto,
dN/dt = μN (1)
dN/N = μdt (2)
donde μ= tasa de crecimiento (constante de la velocidad de crecimiento específico)
N= concentración de células por unidad de volumen
t= tiempo
Integrando (2),
lnN - ln N0= μ(t-t0)
μ= (lnN - lnN0) / (t-t0) (3)
Haciendo la conversión a logaritmos decimales (ln10= 2.3), a partir de (3) se obtiene la
expresión matemática de la tasa de crecimiento:
μ= 2.3 (logN - logN0) / (t-t0) (4)
Expresando (4) en forma de recta (y= ax + b)
logN= μ(t-t0) / 2.3 + logN0 (5)
donde a= μ/2.3; b= logN0
Esto representa que la pendiente de la recta es proporcional a la tasa de crecimiento
(μ/2.3), y que la ordenada en el origen corresponde al inóculo.
Operando y haciendo el antilogaritmo de (5)
logN/N0= μ(t-t0) / 2.3
N/N0= 10 μ(t-t0) / 2.3
N= N0 10 μ(t-t0) / 2.3 (6)
Así, las poblaciones bacterianas que crecen en un medio de cultivo cerrado y sin
limitación de nutrientes siguen un crecimiento exponencial.
El tiempo de generación (g) se define como el tiempo necesario para que una bacteria
se divida, o lo que es lo mismo, el tiempo necesario para que se duplique el número de
células de un cultivo (si este está en crecimiento exponencial).
Por tanto, g= t-t0 cuando N=2N0 , y sustituyendo en (6)
2N0= N0 10 μg / 2.3
 2= 10 μg / 2.3
log2= μg/2.3
g= 2.3 log2/ μ
g= ln2/μ (7)
Otro parámetro es el número de generaciones (n) que han existido en un cultivo
determinado:
n= t/g ; g=t/n
sustituyendo en (7)
t/n= ln2/μ
μ= n ln2/t

ACTIVIDAD
Medida del crecimiento bacteriano
Los métodos más utilizados son dos: la determinación de la masa celular y el número
de células viables del cultivo.
Masa celular: se mide la turbidez del cultivo (causada por la dispersión de luz por
parte de las bacterias). En la práctica se utiliza un espectrofotómetro, midiéndose la
Absorbancia del cultivo a lo largo del tiempo utilizándolo como medida de Densidad
Óptica, D. O.
Número de células viables: se basa en la capacidad de una célula bacteriana de crecer
sobre medio de cultivo sólido produciendo una colonia. La técnica consiste en diluir el
cultivo bacteriano mediante un banco de diluciones, sembrar un volumen conocido de
las diluciones sobre una placa de medio con agar, incubar las placas a la temperatura
adecuada, y realizar el recuento de colonias.
MATERIALES:
1 matraz de 1000 ml con 100 ml LB por grupo de 4 personas
(total 4 matraces, dos con aspas de aireación y dos sin)
Espectrofotómetro
10 placas de LB-agar por grupo.
10 tubos Eppendorf con 1ml Ringer 1/4
Cultivo bacteriano aislado de Escherichia coli
PROCEDIMIENTO:
1.- Inocular el matraz con 4 ml (4%) (v/v) de cultivo "overnight" (o.n.) de la bacteria.
E. coli a 37ºC con elevada y baja aireación
E. coli a 30ºC con elevada y baja aireación
2.- Dejar crecer durante 8h, e ir tomando muestras para las siguientes determinaciones:
a) Medida de D. O.:
Determinar D.O. 600nm utilizando un espectrofotómetro; tomar muestra cada media
hora hasta alcanzar D.O= 0.8, y después cada hora hasta estabilizarse la D.O.
NOTA: Cuando el cultivo llegue a D.O= 1, diluir el cultivo y medir D.O.
b) Recuento de células viables:
Cuando la D.O esté en 0.2, 0.5 y 0.8, tomar alícuota del cultivo, realizar un banco de
diluciones en tubos Eppendorf con Ringer 1/4, y plaquear de la siguiente forma:
cuando D.O= 0.2, plaquear 100μl de diluciones 10-3, 10-4, 10-5.
cuando D.O= 0.5, plaquear 100μl de diluciones 10-4, 10-5, 10-6.
cuando D.O= 0.8, plaquear 100μl de diluciones 10-5, 10-6, 10-7.
3.- Incubar las placas a 37ºC o/n.
4. Recuento de células viables: recuento de colonias, y calcular el número de células
viables/ml de cultivo (UFC/ml). Aplicar las fórmulas anteriores para calcular μ (tasa de
crecimiento) y g (tiempo de duplicación).
 LABORATORIO 12
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE LA LECHE
Prueba de azul de metileno reductasa
Principio
Esta prueba de reductasa se basa en las actividades de oxidación-reducción de las
bacterias presentes en la muestra de leche. El indicador utilizado en la reacción es el
azul de metileno, que es sensible a la concentración de oxígeno en la muestra. El
indicador es azul en estado oxidado y leuco o blanco en estado reducido. La velocidad
de desaparición del color del azul de metileno es proporcional a la carga microbiana en
la muestra de leche. Cuantas más bacterias presentes, más rápida será la reducción.
La clasificación de la leche según la prueba de azul de metileno reductasa es la
siguiente.
1. Grado A- Excelente, no se decolora en 8 horas (<500 bacterias/ml), leche de
consumo humano directo
2. Grado B-Bueno, decolorado en menos de 8 horas pero no menos de 6 horas (>500
bacterias/ml)
3. Grado C-Regular, decolorado en menos de 6 horas pero no menos de 2 horas
(>40,00,000 bacterias/ml)
4. Clase D, esta categoría no existe para Panamá- Pobre, decolorado en menos de 2
horas. (> 2,00,00,000 bacterias/ml)
Materiales necesarios
Muestras de leches,
Solución de azul de metileno,
Frascos Mc Cartney o cualquier frasco o vial con tapa rosca hermética,
Pipetas,
Baño María a 37oC,
Agua destilada,
Mechero Bunsen.
Nota
Todos los artículos de vidrio deben esterilizados antes de su uso.
Procedimiento
1. La solución de azul de metileno se prepara disolviendo asépticamente 1 mg de
polvo de azul de metileno en 25 ml de agua destilada.
2. Realizar toda la operación en un ambiente aséptico.
3. Transferir10 ml de muestra de leche a una botella estéril usando pipetas
estériles.
4. Se agrega 1 ml de solución de azul de metileno a la muestra de leche usando
una pipeta estéril separada.
5. Se cerrar la botella con el tapón.
6. El contenido del tubo se mezcla invirtiéndolo suavemente 2-3 veces.
7. Incube la botella de Mc Cartney en un baño de agua a 37oC durante 6 horas.
8. También se incuban tubos controlados que contenían 10 ml de leche hervida y 1
ml de azul de metileno.
9. Registrado el tiempo de decoloración.
10. Realizar un cultivo de cada una de las muestras y comparar los resultados de las
colonias con la velocidad de decoloraciom