TEMA 14

Métodos inmunológicos para la

identificación microbiana
Tema 14. Métodos inmunológicos para la identificación microbiana

1. Introducción
2. Detección de antígenos
2.1. Obtención de anticuerpos
2.2. Marcado de las inmunoglobulinas
2.3. Técnicas de detección
2.3.1. Aglutinación indirecta
2.3.2. Inmunofluorescencia
2.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA)
3. Detección de anticuerpos
3.1. Clases de antígenos
3.2. Muestras de suero
3.3. Pruebas serológicas
3.3.1. Aglutinación directa
3.3.2. Inmunofluorescencia
3.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA)
1. Introducción

Antígenos y anticuerpos son complementarios

• antígeno posible detectar anticuerpo específico (suero)

• anticuerpo posible detectar antígeno específico (muestra)

Pruebas para detección de anticuerpos: pruebas serológicas (suero)

Reacciones inmunológicas

• portaobjetos

• tubos convencionales (plástico

o vidrio) 12 x 100 mm

• placas de microtitulación
(micropocillos 8 mm ø y 12
mm alto)
2. Detección de antígenos

Algunas de estas técnicas son muy útiles para el diagnóstico

• rápidas (confirmadas por otras)

• técnicas de referencia (elevada eficacia)

Muy útiles para identificación de virus y clamidias (más rápidas, sencillas,

económicas y sensibles que el cultivo) (algunas automatizadas)

Se investiga un único microorganismo en cada prueba (caro y laborioso)

• establecer cuidadosa evaluación clínica del paciente

• solicitar la prueba para detectar microorganismo responsable (mayor

probabilidad)
2.1. Obtención de anticuerpos

Anticuerpos

• policlonales (animales inmunizados)

• monoclonales (producidos in vitro)

Todos los anticuerpos pueden fijarse a través de su fragmento Fc a:

• base de un pocillo de plástico Anticuerpo

Sitio de
unión
• superficie de una membrana
Antígeno
• partículas inertes (látex, gelatina, oro coloidal)

Fragmento o
región Fc
2.2. Marcado de las inmunoglobulinas

Inmunoglobulinas marcadas sirven para detectar antígenos y otros anticuerpos

Marcado del fragmento Fc con:

• Enzimas (β-galactosidasa, fosfatasa

alcalina, peroxidasa de rábano)

- actúan sobre sustrato

- transformación en producto coloreado (o diferente color)

• Sustancias fluorescentes (isotiocianato de fluoresceína, rodamina,

umbeliferona, lantánidos)

- producen luz cuando son excitadas por radiación incidente

• Sustancias lumínicas (luminol, isoluminol, ésteres de acridina, adamantil

dioxietano)

- producen luz (reacción química, oxidación, quimioluminiscencia)

2.3. Técnicas de detección

Si el microorganismo buscado no está en la muestra

• los anticuerpos no se unen a él

• no se produce señal

Si el microorganismo está presente en la muestra

• los anticuerpos se unen a él

• se producirá el efecto o la señal correspondiente

- aglutinación

- cambio de color del sustrato

- fluorescencia

- luz
2.3.1. Aglutinación indirecta

Anticuerpos adheridos por

región Fc a:

• partículas grandes de látex

(poliestireno, 1-5 µm)

• otras partículas inertes

Facilita la observación de la
aglutinación:

• formación de grumos (de

gran tamaño)

Permite detección de antígenos

solubles (polisacárido)

Realizable sobre portaobjetos

2.3.1. Aglutinación indirecta

Rápida (minutos)

Generalmente menos sensible que enzimoinmunoanálisis

Salvo excepciones no muy adecuada para detectar antígenos víricos (menor

cantidad que bacterianos)
2.3.2. Inmunofluorescencia

Directa (IFD)

Anticuerpos marcados con sustancias fluorescentes

• se fijan a los microorganismos

Microscopio de fluorescencia

• microorganismo brillante
sobre fondo oscuro

Virus

• no pueden ser observados

(pequeño tamaño)

• se pueden detectar proteínas víricas (producidas durante multiplicación)

- anticuerpos específicos para esas proteínas

2.3.2. Inmunofluorescencia

Indirecta (IFI)

Utiliza dos anticuerpos:

- Primero

• no marcado

• se une al antígeno

- Segundo

• dirigido contra el primero

(anti-anticuerpo)

• está marcado

• permite revelar diferentes

anticuerpos específicos no marcados
2.3.2. Inmunofluorescencia
2.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA)

ELISA: enzyme linked immunosorbent assay

Método directo

Anticuerpos fijados en base de pocillo de placa de microtitulación o membrana de

nitrocelulosa (específicos del antígeno buscado).

Se añade muestra al pocillo: antígeno presente reacción Ag - Ac

Se añade segundo anticuerpo

• dirigido contra el antígeno

• marcado con enzima

2.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA)
Técnica en pocillos

Técnica sobre nitrocelulosa

2.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA)

Método indirecto (“sandwich”)

Anticuerpos (generalmente monoclonales) fijados en base de pocillo de placa de

microtitulación o membrana de nitrocelulosa (específicos del antígeno buscado).
Anticuerpo anti-Ig
unido a enzima
Se añade muestra al pocillo
Sustrato
incoloro
• antígeno presente reacción Ag - Ac

Se añade un segundo anticuerpo Anticuerpo

de detección Producto
coloreado
• generalmente policlonal
Antígeno diana
• dirigido contra el antígeno

Se añade un tercer anticuerpo

• dirigido contra el segundo anticuerpo Anticuerpo de fijación

(o de captura)

• marcado con enzima

2.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA)

Se añade sustrato (incoloro) Enzima

Sustrato
sin color
Actúa enzima sobre sustrato
Segundo
Producto
anticuerpo
Aparece color (o tercero)
coloreado

• se puede medir intensidad

(colorímetro)

Si no existe antígeno buscado

• no es retenido en el pocillo

• es eliminado mediante lavado

• al añadir sustrato no se
produce color
3. Detección de anticuerpos

Método de diagnóstico indirecto

Detectan anticuerpos formados frente al microorganismo (en suero del paciente)

Técnicas semejantes a las descritas para la detección de antígenos

La mayoría permiten cuantificar los anticuerpos del suero

3.1. Clases de antígenos

Naturales

• microorganismos íntegros

• extractos antigénicos (más o menos purificados) obtenidos de ellos

Recombinantes

• se obtienen por ingeniería genética

3.2. Muestras de suero
Extraer sangre (5-10 mL)

Dejarla coagular (temperatura ambiente, 20 minutos)

Centrifugar 1.000-1.200 g, 10 minutos (separar el suero)

Guardar suero 4-6ºC (una semana; -20ºC (años, si se evita descongelar y congelar
repetidamente)

3.3. Pruebas serológicas

Todos los resultados se refieren a anticuerpos totales

Aglutinación directa, inmunofluorescencia y enzimoinmunoanálisis (más

utilizadas)

3.3.1. Aglutinación directa

Portaobjetos, tubos de ensayo o placas de microtitulación

Antígeno (suspensión del microorganismo); si hay anticuerpos en

el suero, se produce aglutinación
3.3.1. Aglutinación directa

Patrón característico

• Tubo
- sobrenadante transparente
- formación de muchos
grumos (al resuspender
el sedimento)

• Pocillos
- sedimento amplio y granulado
(reacción positiva)
- botón puntiforme central (reacción
negativa)

Permite la cuantificación de anticuerpos

mediante el cálculo del título de anticuerpos
3.3.2. Inmunofluorescencia
3.3.3. Enzimoinmunoanálisis (ELISA)

Anticuerpo secundario
Antígeno anti-anticuerpo del paciente
Enzima

Sustrato sin color

Anticuerpo primario del paciente producido Producto coloreado

Pocillo o membrana contra el antígeno (microorganismo)