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Tincion para Microscopio
Tincion para Microscopio
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AUTORAS
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BIOL. L. PATRICIA
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DRÍGUEZ PASC
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EDITORA
AS:
Q.B.P. MIR
RIAM JUÁREZ JUÁREZ
M. EN C. GLORIA
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EZ JIMÉNEZ
Manual para el Laboratorio de técnicas microbiológicas. UPIBI-IPN
AUTORAS:
Q.B.P. MIRIAM JUÁREZ JUÁREZ
Q.B.P. REFUGIA PÉREZ SÁNCHEZ
BIOL. L. PATRICIA RODRÍGUEZ PASCUAL
EDITORAS:
Q.B.P. MIRIAM JUÁREZ JUÁREZ
M. EN C. GLORIA LÓPEZ JIMÉNEZ
1. OBJETIVOS:
• El alumno aprenderá a enfocar correctamente una preparación para ser observada en el microscopio
compuesto, así como la forma correcta de utilizarlo
2.- INTRODUCCIÓN
El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño. Mediante un sistema de
lentes y fuentes de iluminación se puede hacer visible un objeto microscópico. Los microscopios pueden
aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamaño original. Los diversos elementos que existen en la
naturaleza, presentan tamaños, formas y composiciones distintas, la mayoría de ellas pueden verse, algunas a
simple vista, y otras mediante instrumentos.
Para poder observar a la célula es necesario recurrir a equipos como el microscopio, de este existen diversas
variedades, los cuales están diseñados a lo que pretendemos observar y como ejemplo tenemos a:
Microscopio óptico
Es un instrumento (de un lente o varios lentes), que amplifica una imagen y permite la observación de mayores
detalles de los posibles a simple vista. El microscopio más simple es una lente de aumento o un par de anteojos.
El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben
estar como mínimo a esa distancia. El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar la
información. La resolución depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor de la muestra, la
calidad de la fijación y la intensidad de la coloración. Teóricamente la máxima resolución que se puede alcanzar
es de 0,2 µm dada por una luz con longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible
por el ojo humano) y con objetos condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el
objetivo, pero no puede aumentar la resolución. Existen distintos microscopios ópticos generales y de
investigación que se diferencian en factores tales como la longitud de onda de la iluminación, la alteración física
de la luz que incide en la muestra y procesos analíticos que se aplican a la imagen final.
El microscopio compuesto esta formado por tres sistemas: 1. Sistema de iluminación; 2. Sistema óptico y 3.
Sistema mecánico.
El sistema de iluminación corresponde a la fuente de luz y sus aditamentos para iluminar eficazmente la
preparación y esta formado principalmente por la lámpara (6V), el diafragma de campo y el condensador (lente
frontal, diafragma de iris y lente auxiliar)
El sistema óptico esta formado por una serie de lentes de vidrio en los objetivos y oculares que permiten
agrandar la imagen y esta formado por los objetivos, tubo y el ocular.
El sistema mecánico esta formado por una serie de engranes y botones que permiten realizar el movimiento y
cambio de las lentes así como el enfoque de la preparación y esta formado por la base, estativo, tornillos
macrométrico y micrométrico, platina, revólver y portarevólver.
Revolver: Es un dispositivo giratorio en donde se atornillan las lentes de los objetivos de distinto aumento.
Tubo binocular. Cada uno de los tubos contiene en el interior un sistema de prismas y espejos que dividen el
haz de luz en dos haces, cada uno de los cuales se envía por separado a cada tubo, estos tubos se deslizan
hacia los lados para ajustar la distancia interpupilar ya que cada persona posee una diferente separación entre
sus ojos. Los microscopios binoculares tienen entre los tubos una escala grabada para poder ajustar la distancia
y cada persona debe memorizar su valor de apertura interpupilar; uno de los tubos tiene el ocular fijo y el otro
tiene un sistema mecánico que sube o baja. Para realizar el enfoque de cada ojo primero se enfoca con el
tornillo micrométrico el tubo que tiene el ocular fijo y después se enfoca el que tiene el ocular móvil, pero en este
caso sin mover el tornillo micrométrico, girando el ocular móvil hasta encontrar el foco.
Lámpara. Es la encargada de proporcionar los haces de luz y tiene las siguientes características: 6V, 5-15 W ó
12 V, 50-100 W
Diafragma de campo. Esta situada en la base del microscopio y su función es la de regular el diámetro de la
emisión de la luz a fin de que se ilumine solo el área de campo visual, es decir controla la cantidad de luz que
atraviesa la preparación.
Condensador. Es un sistema de tres lentes convergentes que concentran los rayos luminosos sobre el objeto a
observar, el condensador utilizado es capaz de agrupar todos los rayos que provienen del foco y permite
aprovechar toda la luz posible que inciden sobre él y los dirige hacia el plano focal del objeto.
c. Sistema óptico
Oculares
Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P. 3
Manual para el Laboratorio de técnicas microbiológicas. UPIBI-IPN
El ocular es la parte óptica final externa, situados en el tubo a través de los cuales se obtiene la imagen final, el
ocular tiene aumento propio (los aumentos son denominados con la letra X), en nuestro caso es de 10X. El
ocular consta de una lente cercana al ojo, collar, tubo del ocular y una lente cercana al objetivo.
Tubo
El tubo es la parte óptica – mecánica, situada en la parte superior del microscopio, este puede ser monocular o
binocular, además esta adaptada para poderle colocar una cámara fotográfica ó una cámara de televisión. El
tubo generalmente esta diseñado para trabajar a una distancia mecánica fija entre ellos y este valor puede ser
de 160 mm, el factor del tubo del microscopio a utilizar en el laboratorio es de 1,25X, dato que nos sirve para
calcular el aumento total.
Objetivos
Son lentes que captan la imagen a observar, están construidos de cristal o fluorita, poseen aumento propio,
apertura numérica y esta diseñada para trabajar con diferentes campos. Todos los objetivos tienen anillos de
colores y números grabados sobre el tubo metálico, que nos permite saber a detalle cuales son sus ventajas, la
disposición de estos caracteres es la siguiente:
1.- El anillo de color superior indica los aumentos (Tabla 1)
2.- El lado superior izquierdo indica el número de aumentos
3.- El lado superior derecho la apertura numérica.
4.- El lado inferior la distancia mecánica
5.- El lado inferior derecho el espesor del cubreobjetos
6.- El anillo de color inferior indica en qué medio se hace la inmersión del objetivo (Tabla 2)
En ocasiones el objetivo puede traer en lugar de 0.17, el número 1, el cual indica que:
Acepta cubreobjetos desde 0,17 a 0,22 mm de espesor,
10= No requiere cubreobjetos ó
0,11 – 0,27 = Es ajustable a diferentes espesores de los cubreobjetos, desde 0,11 mm hasta 0,27 mm.
Anillo superior
Los anillos de color cerca del anillo moleteado facilitan el reconocimiento del coeficiente de aumento:
Tabla 2. Colores para el anillo inferior que indican en qué medio se debe hacer la
inmersión del objetivo
Carácter Sustancia Índice de refracción Color del anillo
Oil Aceite 1,515 Negro
W Agua 1,333 Blanco
Glyz Glicerina 1,455 Anaranjado
Metileno Yoduro de metileno 1,740 Amarillo
Aumentos totales:
El número total de aumentos que se puede lograr en un microscopio se obtiene multiplicando el número de
aumentos que tiene el ocular por el número de aumentos que tiene el tubo y por el número de aumentos que
tiene el objetivo con el que se esta observando.
Distancia mecánica:
Se llama distancia mecánica a la distancia que recorre a luz por el interior del microscopio desde que penetra por
el objetivo, pasando por los tubos y espejos, hasta llegar al ocular, la distancia mecánica se mide desde la
superficie de la rosca del objetivo hasta la base del ocular, esta distancia en el caso de nuestro microscopio es
de 160 mm.
Poder de resolución:
El poder de resolución de una lente se define como la capacidad que tiene para discernir entre dos puntos muy
cercanos entre sí y que puedan verse separada.
El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm, el microscopio óptico de 0,2 µ y el microscopio electrónico
de 6 Ángstrom.
Apertura numérica:
Es una medida de la amplitud del cono luminoso que se forma por las lentes del microscopio, ya sea del
condensador o del objetivo.
Fig. Diafragma de iris de un microscopio de contraste de fases, microscopio auxiliar y filtro verde
3.2 REACTIVOS
• Aceite de inmersión
• Atomizador con benzal
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
4.1 Cuidado y limpieza del microscopio
Un proceso de limpieza debe considerar los siguientes aspectos:
a.- Para limpiar la parte óptica, se elimina primero las partículas de polvo, ya sea con un bulbo inyector de aire,
un pincel o soplando fuertemente sobre la lente.
b.- Algunos solventes como la acetona disuelven los revestimientos de barniz, la pintura y aún el cemento de las
molduras y los objetivos compuestos, por lo que no se deben usar.
c.- Las guías mecánicas deben mantenerse lubricadas.
Se enlistan algunos compuestos recomendados sólo para ciertas partes del microscopio.
a.- Espuma de jabón suave.- Solo para remover lo sucio de la superficie de instrumentos
b.- Agua destilada con algún detergente sin aditivos alcalinos.- para un prelimpiado de la óptica.
c.- Solución para limpiar la óptica.- etanol al 40 %, éter al 20 %, para limpiar superficies de la óptica o remover
residuos de aceite de inmersión.
5.4 En la siguiente tabla resume la función de cada una de las siguientes partes:
Parte del microscopio Función Sistema al que pertenece:
(mecánico, óptico, iluminación)
Condensador
Diafragma de campo
Diafragma de iris
Filtro azul
Lámpara
Objetivo
Ocular
Platina
Revólver
Tornillo macrométrico
Tornillo micrométrico
7.- CONCLUSIONES
Elabora tus conclusiones tomando en consideración los objetivos de la práctica, los resultados obtenidos y la
bibliografía consultada.
PRACTICA No. 2
PREPARACIONES FIJAS Y EN FRESCO
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general
El alumno realizará preparaciones en fresco y fijas para ser observadas en el microscopio óptico por medio de
tinciones.
I.2 Objetivo específicos
1.2.1 Realizar preparaciones en fresco y fijas de bacterias y mohos
1.2.2 Realizar tinciones simples, diferenciales y específicas.
1.2.3. Realizar esquemas coloridos de las observaciones a 40X y 100X
2. INTRODUCCIÓN
La gran mayoría de los microorganismos son invisibles para el ojo humano, por lo que el uso del microscopio
resulta indispensable para observar a estos seres vivos. Para lograr una buena observación microscópica es
necesario tomar en cuenta la preparación de la muestra, debido a que los objetos deben tener un cierto grado de
contraste con el medio circundante para poder ser percibidos a través del microscopio, además de que los
microorganismos carecen de una coloración natural, hay que teñirlos previamente para hacerlos resaltar de
manera artificial del fondo de la imagen. Una forma de conseguir este contraste consiste en realizar tinciones
simples con un colorante o tinción diferencial.
Tinción simple: En las tinciones simples se utiliza un solo colorante, que siempre es de tipo básico, se utiliza
solamente para incrementar el contraste de la célula que absorberá el colorante y quedará teñido del mismo
color.
Tinción diferencial: Se utilizan una combinación de colorantes para dar diversos complejos coloridos y como
ejemplo tenemos la tinción de Gram y la tinción de Ziehl-Neelsen.
Tinciones específicas: Incrementan el contraste en las células microbianas y revelan estructuras particulares,
entre las que se incluyen las endosporas, los flagelos y la cápsula. Estas técnicas se basan en la estructura que
se desea poner de manifiesto tiene un grado de afinidad por los colores utilizados mayor que el resto de la
célula.
Las bacterias no teñidas muestran pocos detalles morfológicos, el diagnóstico bacteriológico generalmente se
basa en las diferentes afinidades tintoriales de las bacterias para identificarlos más adecuadamente, Sin
embargo, también resultan útiles las preparaciones no teñidas en la determinación de la movilidad.
Las preparaciones fijas y teñidas son de uso casi universal, tanto a partir de especimenes recibidos como de
colonias cultivadas. En general una muestra del espécimen original puede ser colocada directamente sobre el
portaobjetos o bien ser recogida con una asa, recordando siempre tener una preparación delgada y homogénea.
Una colonia puede ser examinada haciendo con ella una suspensión tenue en una gota de solución salina, y
luego extendiéndola con una asa sobre un portaobjetos. Las películas secadas al aire son fijadas con calor
suave sobre la flama de un mechero y luego pasadas a través de ella. Debe tenerse cuidado para evitar el calor
excesivo, que puede alterar la forma bacteriana. El calor deseable es aquel en el que el portaobjetos sea apenas
caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.
Aunque cuando tenemos la necesidad de observar preparaciones en fresco podemos utilizar el microscopio de
contraste de fases, en donde la característica más importante de este tipo de microscopio es que nos permite ver
a los microorganismos sin la necesidad de teñirlos.
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Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P.
LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS. UPIBI-IPN
3.4 REACTIVOS
• Atomizador con benzal
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
4.1 Preparación de Frotis:
Método A
4.1.1 Limpiar el portaobjetos con una torunda de algodón y que contenga alcohol.
a.- Etiquetar la preparación, solo sobre la superficie superior del portaobjetos, la etiqueta será preferentemente
pegada a la izquierda de la preparación, si con una etiqueta no basta colocar otra del lado derecho, la etiqueta
llevará el nombre del microorganismos, el nombre de la tinción, el equipo, el grupo y la fecha.
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Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P.
LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS. UPIBI-IPN
b) En la gradilla se tiene un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 2 ml de agua, de ahí tomar con el asa una
pequeña gota de agua y colocarla en el centro de la superficie de un portaobjetos.
c) En el mechero, flamear el asa al rojo vivo y en un radio de 20 cm de la flama del mechero, abrir el tubo de
ensaye y flamearlo, tomar la muestra con el asa, volver a flamear la boca del tubo y taparlo. Dejar el tubo sobre
la gradilla y con la mano izquierda tomar el portaobjetos y con la mano derecha en la que tenemos el asa
extender el inoculo aproximadamente un cm2 para obtener una película delgada de microorganismos. Flamear el
asa para esterilizarla.
Nota: Procurar no tomar una gran cantidad del inóculo de lo contrario quedará un frotis grueso, la luz no pasará
y no observaremos; en caso de haber ocurrido esto entonces, observa en la periferia del frotis
Método B
a) Si se proporciona un tubo con una suspensión bacteriana, entonces encender el mechero.
b) En un radio de 20 cm abrir el tubo, flamearlo y con el asa tomar un inóculo de la suspensión.
c) Flamear la boca del tubo de ensaye, cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla
d) Colocar el inóculo en el centro de un portaobjetos limpio. Extender el inóculo por lo menos 1 cm2, y flamear el
asa. Dejar secar el frotis y fijarlo al calor.
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Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P.
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Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P.
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5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO
5.1 Realiza el esquema de la preparación en fresco del moho observado.
5.2 Realiza un esquema de lo observado en el microscopio en la siguiente tabla
100X
5.3 ¿Cuales son los inconvenientes al realizar un frotis con una gran carga microbiana?
5.4 ¿Cual es la finalidad de observar una muestra en fresco?
5.5 ¿Por qué se coloca un cubreobjetos sobre la muestra?
5.6 ¿Cuál es el propósito de fijar los frotis?
5.7 ¿Cómo afecta la edad del cultivo en la técnica de Gram?
5.8 ¿Por qué la tinción de Gram no se emplea para teñir mohos?
5.9 ¿Cuando es recomendable utilizar una tinción simple y que colorante utilizarías?
5.10 ¿Cuál es la finalidad de utilizar el barniz de uñas en las preparaciones en fresco?
7. CONCLUSIONES
7.1 Elaborar las conclusiones con base al análisis y discusión de las ventajas y desventajas en la realización de
preparaciones en fresco y fijas, el fundamento de las tinciones diferenciales, comparando con la bibliografía
consultada y los objetivos de la práctica.
8 BIBLIOGRAFÍA
8.1 Lymch, M.J.; S.S. Raphael: L. D. Mellor; D.D. Spare, M. J., Inwood. Métodos de Laboratorio. 2ª Edición.
Interamericana. México. 1140 pags.
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Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P.
LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS.UPIBI-IPN
PRACTICA No. 3
ESTERILIZACIÓN
2. INTRODUCCIÓN
La esterilización es un proceso que destruye o elimina los microorganismos. La esterilización se puede realizar a
través de métodos físicos y químicos. Para seleccionar el más adecuado es necesario conocer la naturaleza del
material, aunque algunos pueden tener varias formas de esterilización.
Métodos físicos
Calor húmedo:
La aplicación de calor es el método más simple para esterilizar un material, a condición de que no sufra daño en
sí mismo. Una temperatura de 100 °C matará a todas las formas vegetativas de Eubacterias, pero no las
esporas ni a las Arqueobacterias extremófilas, para matar a estas es necesario una temperatura de 121 °C, 15
minutos y 15 libras de presión. La muerte microbiana se produce por la desnaturalización de las proteínas,
generalmente se utiliza vapor, tanto porque las bacterias se mueren más rápidamente cuando se encuentran
húmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas las partes del
recipiente.
Calor seco:
Para esterilizar materiales que deben permanecer secos se dispone de hornos eléctricos por los que circula aire
caliente, en vista de que el calor es menos eficaz en materiales secos, se aplica una temperatura de 160 –170
°C durante una h.
Para ambos tipos de calor aplicadas en los tiempos ya mencionados el calor actúa desnaturalizando las
proteínas y los ácidos nucleicos de la célula y fragmentando las membranas celulares.
Incineración:
La llama es un agente esterilizador eficaz, y el más simple de todos. Es frecuentemente utilizado para esterilizar
el asa bacteriológica para sembrar o resembrar un cultivo. Al flamear el asa, debe evitarse de ser posible, que
dicha asa lleve grandes cantidades de material biológico, pues éste podría “saltar” diseminándose partículas
infectantes.
A veces para instrumentos como tijeras, hojas de bisturí o pinzas, se puede esterilizar el material mojándolo con
alcohol y encendiéndolo éste. Se debe repetir varias veces para lograr una esterilización completa. El método es
rápido pero produce carbonización y pérdida del filo.
Jeringas y portamembranas
Métodos químicos
Gases (oxido de etileno) y líquidos (formaldehído y β propiolactona)
Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógeno lábiles como los que tiene grupos carboxilos,
amino, sulfhidrilos e hidroxilos. Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la industria
farmacéutica, sirve para esterilizar material termosensible como el plástico, equipos electrónicos, bombas
cardiorrespiratorias. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo y además cancerigeno, por lo que
se suministra normalmente con una concentración entre el 10 y el 20 % de CO2. La concentración de óxido de
etileno, la humedad y la temperatura influyen sobre la velocidad de esterilización. Un objeto limpio puede
esterilizarse si se trata de 5 a 8 h a 38 °C o de 3 a 4 h a 54°C, cuando la humedad relativa se mantiene entre el
40 y el 50 % y la concentración de óxido de etileno es de 700 mg/L. Una vez esterilizado el material es necesario
airear para eliminar el óxido de etileno residual porque es muy tóxico.
La β-propiolactona se emplea para esterilizar vacunas y suero, se degrada hasta una forma inactiva después de
varias h y, por ello, no es tan difícil de eliminar. Destruye a los microorganismos más rápidamente que el óxido
de etileno, pero no penetra tan bien en los materiales y puede ser cancerígena.
NOTAS:
-Los tubos o frascos con tapa de baquelita, nunca deben cerrarse completamente.
-Si existe material que ha estado en contacto con cultivo de microorganismos, éste debe ser esterilizado en
autoclave a 121 oC, 1,05 atm de presión durante 15 minutos
- Recolectar los desechos del material esterilizado en recipientes adecuados para darle una disposición final
ambientalmente responsable.
3.2 MATERIAL
• Papel aluminio • Un mechero Fisher
• Papel Kraft • Un vaso de precipitados de 100 ml
• Algodón • 8 tiras de papel filtro
• 2 cajas de Petri • Ligas
• 2 matraces de 125 ml • Un sistema Millex–HA
• 3 pipetas de 2, 5 y 10 mL • Un portamembranas de filtración
• Una pinza de disección • Membranas de 0.45 micrones de porosidad
• Una tijera • Escobillones de diferentes tamaños
• Una gradilla • Una esponja
• Un cilindro pipetero • Un tubo de ensaye 13 X 100 estéril con caldo
• Un cilindro para cajas de Petri nutritivo
•
3.3 MEDIOS DE CULTIVO
• 4 tubos de 16 x 150 mm con 3 ml de caldo nutritivo
• 2 matraces con 20 ml de caldo nutritivo estéril
• 2 tubos de 113 X 100 con 3 ml de caldo nutritivo sin esterilizar
3.5 REACTIVOS
• Agua destilada
• Caldo nutritivo
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN
4.1 Lavado de material de vidrio e instrumental
a).Utilizando escobillones para pipetas, tubos y matraces y una fibra suave para las cajas de Petri, el material
plano y el instrumental metálico lavar el material que se va a esterilizar, utilizando detergentes aniónicos que no
dejan residuos
b) Enjuagar suficientemente con agua de la llave
c) Enjuagar con agua destilada, escurrir y secar en el horno o dejarlos secar a temperatura ambiente.
4.2.3 PIPETAS
a) Colocar en la boquilla de cada una de las pipetas un tapón de algodón cuidando que no quede muy
compactado, utilizar para ello una aguja de disección o un clip
b) Flamear en la flama del mechero las boquillas de las pipetas a fin de eliminar el exceso de algodón
c) Envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft, fijar el extremo con
masking-tape y anotar sobre el papel la capacidad de la pipeta, la fecha, el grupo y el número de equipo de
laboratorio. Con una fecha indicar el sentido de la punta de la pipeta.
4.2.4 MATRACES
a) Colocar en la boca de cada matraz un tapón compacto de algodón, envuelto con gasa, siguiendo las
instrucciones del profesor.
b) Con papel Kraft, elaborar un gorro ligeramente más grande que el tapón de algodón.
c) En una tira de Masking-tape anotar la fecha, grupo y equipo, adherir el Masking-tape al matraz. No anotar los
datos sobre el gorro de papel.
4.3.3 PIPETAS
a) Poner en la boquilla de cada una de las pipetas un tapón de algodón cuidando que no quede muy
compactado.
b) Flamear las boquillas en la flama del mechero a fin de eliminar el exceso de algodón, antes colocar en el
interior un poco de papel aluminio para evitar que las pipetas se despunten en el momento de introducirlas.
c) Colocar en el interior de un cilindro pipetero, las pipetas preparadas.
d) Anotar en una tira de papel Kraft la cantidad de pipetas, su capacidad, fecha, grupo y equipo. Fijar la tira entre
la tapa del cilindro pipetero.
4.3.4 MATRACES
a) Colocar en la boca de un matraz de 125 ml una tapa de papel aluminio.
b) En una tira de papel Kraft anotar fecha, grupo y equipo. Fijar la tira al cuello del matraz sujetándolo con
masking-tape o etiquetar con un marcador indeleble.
4.3.5 PINZAS Y TIJERAS
a) Envolver en papel aluminio una pinza o una tijera.
b) En una tira de masking-tape, anotar fecha, grupo y equipo. Fijar el masking-tape a la envoltura.
NOTAS:-El bioindicador utilizado en los procesos por filtración a través de membrana es Pseudomonas diminuta,
para membranas con un diámetro de poro de 0,22 µm
5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO
5.1 Completa el siguiente cuadro indicando presencia o ausencia de turbidez.
Método Reducción de la carga Calor seco Calor húmedo Filtración a través
microbiana (110°C/10/´10lb) 170°C/2 h 121°C/15´/15lb de membrana
Testigo -
Testigo +
Resultado
7. CONCLUSIONES
7.1 Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de estos, así como a la
bibliografía consultada y los objetivos de la práctica.
8. BIBLIOGRAFÍA
PRACTICA No.4
NUTRICIÓN Y CULTIVO MICROBIANO
1.- OBJETIVOS
1.1 Objetivo General.
• El alumno cultivará microorganismos en los diferentes medios de cultivo, previa preparación y clasificación
con base a sus componentes, uso y consistencia.
Objetivos específicos
• Determinar las especificaciones mínimas que deben tener los medios de cultivo para microorganismos en
general de acuerdo a la NOM-065-SSA1-1993
• Preparar y clasificar diversos medios de cultivo en base a sus componentes, complejidad, uso y
consistencia.
• Cultivar bacterias y hongos en placa y tubo e identificar los requerimientos nutricionales de estos
microorganismos.
2.- INTRODUCCIÓN
Las células están formadas por grandes cantidades de pequeñas moléculas como agua, iones inorgánicos,
carbohidratos y aminoácidos y contienen un número todavía más pequeño de moléculas grandes, los polímeros de
las células, siendo los más importantes las proteínas y los ácidos nucleicos. La célula puede obtener la mayoría de
las moléculas pequeñas de su medio ambiente de manera preformada, mientras que las grandes moléculas son
sintetizadas dentro de ellas. Existen complejas interrelaciones entre los compuestos incorporados por la célula y los
que son sintetizados.
Nutrición.
A las sustancias en el medio ambiente utilizadas por los organismos para el catabolismo y el anabolismo se les llama
nutrientes, y pueden dividirse en dos clases:
(1) nutrientes necesarios, sin los cuales la célula no podría crecer, y
(2) nutrientes útiles pero no indispensables, que se emplean si están presentes pero no son esenciales.
Algunos nutrientes son los “ladrillos” a partir de los cuales las células forman las macromoléculas y otras estructuras,
mientras que otros nutrientes sirven solo para la obtención de energía sin ser incorporados directamente en las
sustancias celulares, aunque en ocasiones un nutriente puede desempeñar ambas funciones. Las sustancias
pueden dividirse en dos grupos: macronutrientes y micronutrientes, dependiendo de si son necesarios en cantidades
grandes o pequeñas respectivamente y factores de crecimiento como compuestos orgánicos, vitaminas, ácidos
orgánicos etc. Es fácil detectar cuando se requiere un macronutriente, simplemente porque se necesita en gran
proporción. Frecuentemente los micronutrientes son necesarios en cantidades tan pequeñas que es imposible
determinar cuánto se requiere; muchas veces ni siquiera se sospecha que un micronutriente esté presente en el
medio en que un microorganismo está creciendo, debido a que los componentes del medio pueden contener tales
micronutrientes en pequeña cantidad como contaminantes.
Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P.
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LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS. UPIBI-IPN
Los microorganismos se desarrollan a partir de sustancias nutritivas que se obtienen del medio que las rodea. En el
laboratorio los microorganismos se desarrollan en medios de cultivo que contienen los nutrimentos adecuados para
cada uno y requeridos para la síntesis de sus constituyentes celulares, además estos medios proporcionan las
condiciones de pH, osmolaridad y humedad que le permiten un buen crecimiento.
Existe una gran diversidad de sustancias que pueden utilizarse en la preparación de medios de cultivo, formulado
con un fin específico, y el cual deberá contener:
• Fuente de carbono
• Fuente de nitrógeno
• Fuente de azufre
• Factores de crecimiento (que actúan como cofactores, oligoelementos como aminoácidos o vitaminas que
no pueden sintetizar)
• Fuente de enriquecimiento para microorganismos exigentes (huevo, sangre, suero etc).
• Inhibidores de crecimiento microbiano como los colorantes, sales biliares, detergentes, antibióticos o
metales pesados.
• Indicadores de potencial oxido-reducción.
• Agar como el agente gelificante o soporte.
Medios de cultivo: Según la NOM-065-SSA-1993. Que establece las especificaciones sanitarias de los medios
de cultivo.Generalidades.
Medios selectivos.
Son medios que contienen sustancias que impiden el desarrollo de algunos microorganismos, pero en una flora
mixta permiten el aislamiento y recuperación del germen o grupo de gérmenes de interés.
Medios selectivos de enriquecimiento.
Son medios líquidos que estimulan la multiplicación de algún germen determinado e impiden o inhiben la
reproducción de otros.
Medios diferenciales.
Son aquellos que contienen indicadores de ácido base, redox o sustancias que detectan cambios en el medio o en
las características típicas de las colonias.
Medios para cultivar gérmenes anaeróbicos.
Son medios de cultivo para aquellos gérmenes que requieran condiciones de anaerobiosis o de microaerofilia.
Medios de transporte.
Sirven para transportar los especímenes que contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del producto
hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio.
Estos medios impiden que se altere la proporción original de la flora microbiana en los especímenes.
Medios para filtración a través de membrana.
Pueden ser líquidos o sólidos. En el primer caso, se preparan a la concentración usual y permiten el crecimiento de
microorganismos presentes en la membrana.
Los medios sólidos tienen un contenido mínimo de agar para favorecer la difusión de nutrientes del medio de la
membrana.
Medios especiales para cultivo de hongos y levaduras.
En el caso de los hongos, el medio de cultivo descrito por Sabouraud es el que más se utiliza, ya que tiene un pH de
5.6 lo que inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias. Este medio puede ser más selectivo al adicionarle
ciertos antibióticos tales como: cloranfenicol, eritromicina o gentamicina; para eliminar los hongos filamentosos de
rápido crecimiento se adiciona cicloheximida (este medio se llama mycosel o micobiótico). Se emplea también el
medio de agar papa y dextrosa para promover la esporulación de hongos filamentos y para recuento, se acidifica con
Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P.
26
LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS. UPIBI-IPN
ácido tartárico al 0.1 M hasta un pH de 4.5 El agar rosa de bengala se emplea para inhibir el crecimiento radial de
hongos con micelio cenocítico.
Otros medios de cultivo que pueden ser utilizados son los siguientes:
Medios especiales para cultivo de protozoarios.
Medios de cultivo para medir la potencia de los antibióticos.
En la formulación de un medio de cultivo deben considerarse, no sólo el tipo de microorganismo, sino también el tipo
de muestra que se va a analizar, y el objetivo final que se persiga: aislamiento, recuento o identificación.
Por otro lado, es de suma importancia los cuidados que deben observarse en la preparación de los medios de cultivo
como son:
a. La calidad del agua utilizada (que se prefiere libre de sales)
b. Los materiales y utensilios que deben encontrase en condiciones de limpieza (libres de otras sustancias o
reactivos que interfieran en la formulación original)
c. Si se debe añadir calor y cuánto para no incurrir en problemas de homogeneidad, desnaturalización,
caramelización o pérdida de actividad nutricional.
d) pH final del medio que deberá ajustarse según indicaciones del fabricante o fórmula estandarizada.
e) Esterilidad del medio de cultivo de acuerdo a indicaciones del fabricante si es una formulación comercial,
o en otras condiciones si los componentes lo requieren.
Cultivo microbiano.
Los microorganismos obtenidos a partir de suelo, aire, alimentos, etcétera se encuentran asociados, y en raras
ocasiones se encontrará un solo tipo de microorganismo. A partir del cultivo inicial de una muestra, se encontrará
una variedad de tipos de colonias y posteriormente se pretenderá lograr un cultivo puro. Un cultivo puro es aquel que
está constituido por microorganismos de la misma especie. El cultivo de microorganismos se puede realizar en
medio sólido, en medio semisólido y en medio líquido.
Se conoce como cultivo en medio sólido al que se hace en una caja Petri con el medio de cultivo gelificado (agar).
Las variantes del cultivo en caja son diversas pero todas se centran en la formación de estrías sobre la superficie
del medio de cultivo con el asa en el caso de bacterias y por punto si se trata de hongos filamentosos.
Las siembras en tubos con medio sólido, por lo general se emplean para la conservación de un cultivo proveniente
de una placa.
Existen dos variedades de cultivo en tubo:
a) Por estrías: se utilizan los medios de cultivo inclinados, se toma una muestra de alguna colonia
inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se arrastra el asa en forma zigzagueante en el medio por la superficie
inclinada del agar.
b) Por picadura: se utilizan los medios de cultivo en un tubo solidificado ó semisólido en forma inclinada y
en forma recta, se toma la colonia y se introduce en el medio picándolo longitudinalmente.
La siembra en tubos de cultivo en medio líquido se realiza tomado el inóculo con el asa y se introduce en el medio
líquido agitando suavemente el asa.
a) Desarrollo en medio sólido inclinado. Se siembran los microorganismos por estría en tubos con agar
inclinado
b) Desarrollo en medio líquido. Las características que se observan en el cultivo son:
turbidez, un sedimento, una película superficial, o combinados.
c) Desarrollo en medio semisólido por picadura hasta ¾ partes del tubo
Cabe señalar que la identificación de microorganismos por el estudio de sus características de cultivo es solo parcial
ya que se requiere otras pruebas bioquímicas, fiosiológicas e inmunológicas.
Mediante la evaluación de las características de las colonias descritas y la acción en el medio, se puede hacer una
identificación preliminar de los diferentes microorganismos aislados en un cultivo primario. Estas características son
útiles para seleccionar otros medios y pruebas diferenciales apropiadas para completar la identificación de los
microorganismos.
Sesión II
♦ Incubadora a 28° C
♦ Incubadora a 37° C
3.3 REACTIVOS
150 mL de caldo glucosa sales (NH4) 2SO4
● 100 mL de agar nutritivo ● K2HPO4
● 75 mL de agar EMB ● MgSO4 7H2O
● 25 mL de PDA ● MnSO4 4H2O
● 25 mL de medio SIM ● 6 g de agar bacteriológico
● Glucosa ● Agua destilada
3.4 CEPAS
Escherichia coli Penicillum sp.
Bacillus sp. Aspergillus sp.
• Si se requiere preparar tubos con agar una vez que se haya disuelto el agar agregar 3 mL a cada uno de los
tubos, agregar el agar rápidamente antes de que solidifique, una vez agregado el agar tapar los tubos con
tapo de algodón y colocarlos en un bote de lámina para su esterilización.
• Para el caso de matraz tapar el matraz con un tapón de algodón- gasa y gorro de papel Kraft. Etiquetar el
matraz.
• Esterilizar los tubos, el matraz con caldo glucosa y el matraz de agar glucosa en autoclave a 121° C
durante 15 minutos a 15 libras de presión.
• Una vez que se ha llevado a cabo la esterilización dejar a temperatura ambiente los matraces y tubos
durante 24 horas como prueba de esterilidad.
• En condiciones de esterilidad transferir de 15 a 20 mL de cada medio a las cajas de Petri estériles y dejar
que se solidifiquen a temperatura ambiente.
• Tomar una muestra representativa de las cajas y dejarlas a temperatura ambiente colocándolas en posición
invertida durante 24 horas para prueba de esterilidad.
SESIÓN II
4.7 CULTIVO EN MEDIO SÓLIDO EN PLACA
Se utilizarán cajas con agar nutritivo ó EMB.
• Tomar el asa de platino ó acero y quemarla al rojo vivo en la flama del mechero para esterilizarla.
• Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la boca del tubo por la flama del mechero.
• Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar con ella el inóculo.
• Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del mechero y colocarle el tapón.
• Destapar la caja Petri con agar nutritivo o EMB y sembrar al microorganismo por estría cruzada como se
indica en el esquema 1
• Quemar el asa cada vez que se realiza una estría.
• Una vez sembrado el microorganismo incubar la caja sembrada a 37° C, durante 24 horas.
• Observar el crecimiento a las 24 horas y anotar las características del crecimiento en el medio cultivo ya sea
agar nutritivo o EMB
• Sembrar por picadura, sumergiendo el asa hasta ¾ partes del medio SIM sin tocar el fondo y sacar el asa
verticalmente. (El crecimiento debe de darse en la línea de trazo en el caso de que la bacteria sea no móvil,
cuando es móvil el crecimiento se difunde a través del medio).
• Quemar el asa una vez realizada la siembra.
• Incubar los tubos a 37° C durante 24 horas.
• Observar los cultivos a las 24 horas y anotar las características del cultivo.
Medio de cultivo Condiciones de Aspecto final del Clasificación por su Clasificación por su
esterilización medio consistencia composición
Caldo Glucosa
sales
Agar Glucosa sales
Agar Nutritivo
EMB
PDA
5.2 ¿Qué precauciones deben tomarse en cuenta para la preparación de medios de cultivo?
5.3 ¿Qué cuidados deben tenerse al preparar un medio de cultivo sólido en caja de petri?
5.4- Clasificar los siguientes medios de acuerdo a su composición, selectividad y complejidad. Mencionar que
componentes les confieren la capacidad diferencial o selectiva y qué tipos de microorganismos crecen en ellos.
a) Agar Nutritivo
b) Agar Rosa de Bengala
c) Agar Papa Dextrosa
d) Agar Soya y Tripticaseína
5.5 ¿Cuál es la función de los colorantes e indicadores en los medios de cultivo?
5.6 ¿Cuál es la fuente de carbono de cada uno de los medios utilizados?
5.7 ¿Por qué es recomendable llenar los tubos con medio líquido y luego esterilizarlos. ¿Por qué en las cajas de
Petri, primero se esteriliza el medio y posteriormente se transfiere a cajas de Petri estériles?
Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P.
33
LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS. UPIBI-IPN
5.8 De los medios utilizados indica cuáles son específicos para hongos y cuáles para bacterias y ¿por qué?
5.9 ¿Los medios de cultivo tienen fecha de caducidad? ¿Qué pasa si la fecha esta vencida?
5.10 Cuando se siembran hongos filamentosos (mohos) en medio líquido, describa cómo es el crecimiento con y sin
agitación.
5.11 ¿En qué casos se siembra en medio semisólido y cuáles son las precauciones que se deben tomar?
5.12 Realiza un esquema indicando la forma correcta de sembrar a bacterias y mohos en medio sólido inclinado.
7.- CONCLUSIONES
Elabora tus conclusiones utilizando los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, la bibliografía
consultada y al objetivo de la práctica.
8.- BIBLIOGRAFÍA
Enlistar la bibliografía que utilizaste para el informe de esta práctica.
9.-BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA
8.1 Manual de medios de cultivo Bioxón
8.2 Norma Oficial Mexicana Nom-065-SSA1-1993, Bienes y Servicios.
PRACTICA No 5
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
1. OBJETIVO GENERAL:
El alumno aplicará las técnicas de aislamiento y cuantificación de microorganismos.
2. INTRODUCCIÓN
Se entiende por aislamiento, al proceso que permite separar uno o más microorganismos presentes en una muestra.
No todos los microorganismos pueden cultivarse en medios de cultivo, es el caso de los organismos biotróficos
(parásitos obligados), sólo se desarrollan sobre tejido vivo de su hospedante (viroides, virus, rickettsias, hongos).
*Cultivo puro: es aquel que contiene una sola especie o tipo de microorganismo y que presumiblemente se ha
obtenido a partir de una sola célula (clona). En un cultivo puro, no necesariamente todas las células que lo
componen tienen que ser exactamente iguales, ya que es factible que algunas de ellas sufran mutaciones y se
diferencien de las restantes. Cada uno de los cultivos puros que componen una especie se denominan cepas.
Diluciones
La dilución primaria tiene por objeto obtener una distribución lo más uniforme posible de los microorganismos
contenidos en la muestra destinada para el análisis.
La preparación de diluciones decimales adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el número de
microorganismos por unidad de volumen, para permitir, después de la incubación, la observación de la prueba en el
caso de tubos o matraces y la cuenta de colonias en el caso de placas.
Dilución primaria, es la solución, suspensión o emulsión obtenida después de pesar o medir una cantidad del
producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporción de diluyente.
Diluciones decimales adicionales, las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un determinado volumen de la
dilución primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que por repetición de esta operación con cada
dilución así preparada, se obtiene la serie de diluciones decimales adecuadas para la inoculación de medios de
cultivo.
Vaciado en placa:
El fundamento de la técnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio de elección después de
un cierto tiempo y temperatura de incubación, presuponiendo que cada colonia proviene de un microorganismo de la
muestra bajo estudio. El método admite numerosas fuentes de variación, algunas de ellas controlables, pero sujetas
a la influencia de varios factores.
Después de inocular las diluciones de las muestras en las cajas Petri estériles y vacías, agregar de 12 a 15 ml del
medio preparado que esta a una temperatura aproximada de 45°C, mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a
izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una
superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no
moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar.
Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) durante el tiempo y la temperatura que se requieran,
según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate.
En la lectura seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250 UFC, para disminuir el error en la cuenta y
en la interpretación. Si hay mas colonias que las indicadas, en la última dilución realizada, hacer más diluciones
hasta que se tenga este rango del número de colonias.
Unidades Formadoras de Colonias (UFC), término que debe utilizarse para reportar la cuenta de colonias en placa,
las cuales pueden surgir de una célula o de un cúmulo de células.
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
• Realizar diluciones de la muestra como lo indique el profesor ( figura 1)
4.1Diluciones
A partir de muestras líquidas:
a) Para muestras líquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la distribución de microorganismos
es homogénea o fácilmente homogeneizable por medios mecánicos (agitación, etc.).
b) Para muestras congeladas de un alimento originalmente líquido o licuable, fundir por completo en baño de agua
de 40 a 45°C un tiempo máximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente.
c) Para la parte líquida de una muestra heterogénea la cual sea considerada suficientemente representativa de la
muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales).
d) Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm efectuados en un
tiempo de 7 segundos. Tomar 1 mL de la muestra si es muestra líquida y /o 1 g si es muestra sólida y diluir con 9 mL
del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el
diluyente (todo en condiciones asépticas). (Ver figura 1).
e) Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas que se hayan seleccionado. El
volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la pipeta.
1g o 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
9 mL de diluyente
sol. Salina al
0.85% o
agua peptonada
al 0.1%
10 –1 10-2 10 -3 10-4
Figura 1
f) La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, dependen del número
esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de análisis previos y de la información que
se obtenga del personal de inspección que la haya colectado. En ausencia total de información, trabajar con las
diluciones de la primera a la sexta.
Figura 2
d) Incluir una caja sin inóculo por cada lote del medio preparado como testigo de esterilidad.
e) El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se
adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.
f) Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se requieran, según
el tipo de alimento y microorganismo de que se trate.
g) Para mohos 27°C por 48 a 72 horas para bacterias y levaduras 37°C 24 a 48 horas.
h) Contar todas las colonias en aquellas cajas que tengan entre 25 y 250 colonias
i) Si se cuenta la última dilución y no tiene entre 25 y 250 sino más, se sigue lo siguiente:
j) Entre 250 y 450 colonias contar la mitad de la caja
k) Entre 451 y 750 colonias contar un cuarto de la caja
l) Si es mayor de 750 colonias, contar 9 cuadros al azar, hacer un promedio y multiplicar por 65, cuando se utilizan
cajas que en su base mide 91 mm de diámetro, si se usan cajas con diámetro diferente, obtener el área para saber el
factor por multiplicar.
b) Marcar las cajas en sus tapas con los datos pertinentes previamente a su inoculación y correr por duplicado.
c) Se inocula 0.1 mL de las dos ultimas diluciones de las muestras preparadas sobre la superficie del medio de
cultivo a utilizar.
d) Humedecer una varilla de vidrio en forma de L con alcohol y pasarla por la flama del mechero.
e) Enfriar la varilla, una vez fría extender el inoculo por toda la superficie del medio de cultivo Agar nutritivo. (Fig. 3).
f) Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad.
g) El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se
adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.
h) Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se requieran, según
el tipo de alimento y microorganismo de que se trate.
i) Para bacterias 37°C 24 a 48 horas.
j) Se procede a contar el número de bacterias haciendo los cálculos como en la técnica de vaciado en placa.
Varilla en
0.1 mL forma de L
Figura 3
Figura 4
5. RESULTADOS
5.1 Informe de resultados de la técnica de Vaciado en placa:
5.1.1 Reportar como: Unidades formadoras de colonias, ___________UFC/g o mL de bacterias aerobias en placa en
agar cuenta estándar, incubadas: ______________horas a _______________°C
5.2 Informe de resultados de la técnica de Extensión en placa:
5.2.1 Reportar como: Unidades formadoras de colonias, ___________UFC/g o mL de bacterias aerobias en placa en
agar cuenta estandar, incubadas: ______________horas a _______________°C.
6 CUESTIONARIO:
6.1 ¿En que casos aplicarías la técnica de estría cruzada?
6.2 ¿La técnica de estría cruzada permite contar el número de colonias?
6.3 ¿Cuál es el fundamento de la técnica de vaciado en placa?
6.4 ¿Cuál es el fundamento de la técnica de extensión en placa?
6.5 Escribe 3 ventajas y 3 desventajas de la técnica de vaciado en placa y de la técnica de extensión en placa
6.6 ¿En que casos aplicarías utilizar diluciones?
6.7 De los medios utilizados clasifícalos de acuerdo a su uso y composición
8. CONCLUSIONES
8.1 Elabora tus conclusiones tomando en consideración si se cumplieron los objetivos de la práctica y los resultados
obtenidos.
9. BIBLIOGRAFÍA
-NOM-092-SSA-1994 Bienes y Servicios. Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa.
-Mac Faddin, Pruebas Bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica, Edit. Medica
Panamericana, 2002.
-Koneman, Diagnóstico Microbiológico 3ra. Edición, Edit. Panamericana 2003
PRÁCTICA No 6
CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS
2.- INTRODUCCIÓN
Los microorganismos que son seleccionados por producir algún metabolito importante industrialmente no deben de
sufrir cambios metabólicos, por lo que es importante conservarlos, el método elegido debe ser el adecuado para que
no varíen sus características genéticas.
Existen varios métodos para la conservación de microorganismos donde la elección del método estará encaminada
a retener las características de la cepa, estas técnicas se mencionan a continuación así como algunas diferencias
entre ellas. (Cada uno de estos métodos presenta dos o más variaciones):
Durante un programa de aislamiento y selección han demostrado tener y mantener las características requeridas por
la industria, se deben someter a un estudio estricto acerca de los cambios que pueden sufrir cuando se someten a
algún procedimiento de conservación; así pues, el método de conservación elegido juega un papel importante en la
industria de fermentación.
Resiembra en serie en tubos inclinados y en medio líquido en refrigeración con una duración de 15 a 20 días de
almacenamiento. Tapa de aceite mineral, tapa de cera, con una duración de 12 a 36 meses de almacenamiento.
a) Cultivos profundos en agar – extracto de suelo, este es un método adecuado para el mantenimiento de
microorganismos anaerobios los cuales han sido aislados de suelo.
b) Mantenimiento de cultivos en tubos inclinados de agar y en medios líquidos. Este es un método de
conservación muy empleado en cultivos que se emplean continuamente (cultivos de trabajo).
Por otro lado las resiembras sucesivas y continuas aunadas a los cambios que sufre el medio propiciarán
cambios genéticos indeseables en los cultivos, lo cual se reflejará en los rendimientos de la cepa. Aunque este
método es el mas usado y normalmente se aplica a hongos, bacterias, levaduras actinomyces y algas.
c) Cultivos en tubos inclinados con agar adicionado de aceite mineral. A los cultivos preservados por el
método anterior, se les puede adicionar un aceite mineral como Amerol o Nugol, con esto se disminuyen las
posibilidades de contaminación, de tal forma que los cultivos pueden mantenerse por más tiempo, aunque
no se elimina el problema de los cambios genéticos que pueden sufrir la cepa. Los cultivos mantenidos en
agar inclinado ya sea con o sin aceite mineral deben ser protegidos con capuchón métalico o de papel
parafina.
• Liofilización coloca al microorganismo en un soporte leche descremada, carbonatos, lactosa, para darle
protección por los cambios del proceso. Este proceso puede durar de 15 a 20 años ó más de
almacenamiento.
• Tierra fértil estéril: el microorganismo esta con sustrato, el microorganismo se coloca en un recipiente al
vacío, esto es perfecto para el microorganismo que esporula.
• Criogenia: sumergir en gases líquidos como N2 liquido a 80 ° C, se requiere un equipo muy grande,
instalaciones especiales, es muy utilizado para microorganismos que no esporulan.
• Otros gases O2, He - 220 ° C, Argón, se usa un soporte Ej. Polvo de cal.
• Virus se conserva en tejido o se inserta a un hospedero) o en estado atenuado en cultivo de células
anímales, embriones de pollo.
En algunas ocasiones la industria fermentativa tiene frecuentes pérdidas por degeneración de las cepas de trabajo;
las causas primordiales que cusan estas pérdidas de los cultivos que se mantienen bajo determinadas condiciones
se mencionan a continuación:
a) Contaminación por otros microorganismos
b) Contaminación por fagos
c) Problemas de mutación y selección natural.
d) Personal mal entrenado.
El objetivo fundamental de mantener la viabilidad en los microorganismos es: conservar todas las funciones
metabólicas, reproducible y que transmitan todas sus características a sus descendientes, con replicaciones bajas,
capaces de reproducirse.
Para la reactivación del microorganismo se pueden utilizar solución salina, agua peptonada en general medio de
cultivo líquido; esto para cuidar la osmolaridad.
La reactivación también depende del medio que se utiliza par realizar la conservación, el H2O no se utiliza porque
deben de ser soluciones con concentraciones osmóticas y el H2O no cumple pero para esporas si se puede utilizar.
Cuidar que no haya mucho estrés y que se reactive en condiciones iguales a donde se conserva:
1. Medio de cultivo.
2. Temperatura
3. Componentes de nutrición.
Los pasos a seguir para la recuperación del microorganismo son:
• Reactivar
• Rehidratar
• Inocular en medio del cultivo.
• Vaciado en placa el más común.
• Extensión con varilla.
• Resuspender en líquido se retendrá una alícuota y sirve como fuente de propagación del microorganismo.
Evaluación
∗ Siempre se utiliza un cultivo sumergido (medio líquido).
∗ Realizar cinética.
∗ Se realiza de una forma que se pueda comparar antes y después.
∗ En la industria se le deben de hacer todas las pruebas necesarias porque influirán en una nueva producción.
Los datos que debe de tener el microorganismo que va a ser reactivado son:
En el laboratorio se trabaja con dos cultivos del mismo microorganismo a los cuales se les, llama “Cultivos Stock”, a
éstos se les divide en “Cultivos Stock Primario” y “Cultivos Stock de Trabajo”, los primeros se usan como cultivos de
referencia y de reserva, los cultivos de trabajo son usados para la preparación del inóculo que se usará en el
proceso de fermentación.
3.1. MATERIAL
• Mechero Fisher
• 6 tubos de ensaye de 16 X 150 mm
• 2 tubos de 16x 150 mm con 9 mL de solución salina fisiológica (0.85%)
• 1 gradilla metálica
• 1 Pipetero con pipetas estériles de 1 mL
• 1 puente de coloración
• 4 pipetas de 1 mL
• 1 caja de Petri con varilla en forma de “ V ”, con un porta y un cubreobjetos
• 1 asa micológica y bacteriológica
• 1 bisturí
• Algodón
• Gasa
Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P 44
LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS- UPIBI-IPN
• Papel Kraft
• Colorantes para la tinción de Gram
• Azul de metileno
3.2. EQUIPO
• 1 autoclave
• 1 incubadora 28° C
• 1 incubadora 35 ± 2 ° C
• 1 microscopio
• 1 horno a 170°C
• 1 balanza digital
3.4 REACTIVOS
• Aceite mineral
• Arena estéril
• Solución salina fisiológica
4.1.2 Previamente se deberá realizar una tinción de Gram para bacterias y una preparación en fresco para mohos y
tinción simple para levaduras.
4.1.3 Si el cultivo es puro, se deben preparar tubos con medio para conservarlo.
4.1.4 Preparar tubos inclinados con 5 mL de medio agar soya tripticaseína, para bacterias y actinomicetos, agar papa
dextrosa para mohos y levaduras, también se pueden usar los medios de cultivo en los que se haya aislado o bien el
que recomiende la bibliografía que se haya consultado.
• Lugar y fuente de donde se aisló (aislado en el laboratorio o proporcionado por alguna institución)
• Requerimientos especiales (Medio de mantenimiento, temperatura óptima de crecimiento, y de producción,
pH óptimo, nutrientes específicos etc.)
• Nombre del metabolito (si lo produce).
4.2.2 Se siembra por triplicado cada uno de los microorganismos que se van a conservar.
4.2.3 Incubar los tubos a 35 ± 2°C durante 24 horas si se trata de bacterias y levaduras y a 28°C durante 48 horas
si se trata de mohos durante cinco días.
4.2.4 Se verifica el crecimiento adecuado y se conservan los tubos en refrigeración a una temperatura aproximada
de 4°C
4.3.2 Se colocan 100 mL de aceite mineral en un matraz Erlenmeyer y se esteriliza por calor seco a 170°C durante
una hora.
4.3.3. Al tubo inclinado que se sembró en el punto 4.2 se le adiciona el aceite mineral hasta que cubra el agar, sellar
con papel parafilm y guardar el tubo en el cuarto frió a una temperatura aproximada a 4ºC (figura 1).
ACEITE MINERAL
MEDIO DE CULTIVO SOLIDO
FIGURA 1.
4.4 MANTENIMIENTO DE CULTIVOS EN ARENA ESTÉRIL.
4.4.1 Este método se recomienda para conservar mohos y microorganismos esporulados.
4.4.2 Se esterilizan 3 tubos de ensaye con tapón de rosca que contienen arena y se esterilizan por calor seco 170°C
durante 1 hora.
4.4.3 El tubo que tiene el moho que se va a conservar se le adicionan 5 mL de solución salina estéril, se homogeniza
hasta que se vea una suspensión y se adiciona lentamente al tubo que contiene el suelo de tal manera que la arena
solo se humedezca.
4.4.4 Se sella el tubo con papel parafilm y se conserva en refrigeración.
5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO
1. ¿Qué les pasa a los tubos con agar inclinado si se mantienen en refrigeración por más de 6 meses?
2. ¿Menciona otros métodos de conservación de microorganismos?
3. ¿Cuánto tiempo pueden durar vivos los microorganismos por el método de suelo estéril?
4. ¿Cuánto tiempo pueden durar vivos los microorganismos por el método de tubos inclinados?
5. ¿Cuánto tiempo pueden durar vivos los microorganismos por el método con aceite mineral?
6. ¿Cuánto tiempo pueden durar vivos los microorganismos por el método de congelación?
7. ¿Cuánto tiempo pueden durar vivos los microorganismos por el método de liofilización?
8. ¿Tendrán variación genética transferencias masivas?
9. ¿A que se le llama cultivo patrón?
10. ¿A que se le llama cultivo probado?
11. ¿Se considera la edad fisiológica del microorganismo para conservarlo?
12. ¿En que fase del crecimiento se siembra un microorganismo?
7.- CONCLUSIONES
7.1 Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, a la bibliografía
consultada y a los objetivos de la práctica.
8.- BIBLIOGRAFÍA
Enumerar la bibliografía consultada para la elaboración del reporte de la práctica
-Koneman, E.W. & Morrison; Micología, diagnóstico de laboratorio; Ed. Médico Panamericana: 1991.
-Tortora J. Gerard; Introducción a la microbiología; Ed. Acribia; 1993.
PRACTICA No.7
CRECIMIENTO MICROBIANO
1. OBJETIVO GENERAL
El alumno aplicará las técnicas más utilizadas para el recuento de microorganismos y explicará qué ocurre en cada
una de las fases de crecimiento celular.
1.2 Objetivos Específicos
• Realizar un cultivo sumergido con agitación (fermentación) a nivel matraz de Escherichia coli por 24 horas.
• Cuantificar el número de microorganismos viables como unidades formadoras de colonias (UFC), a través
de la técnica por vaciado en placa
• Estimar el crecimiento microbiano por la técnica de turbidimetría y comparación con el nefelómetro de
McFarland.
• Cuantificar el número de microorganismos por cuenta directa con la técnica de conteo en cámara de
Neubauer.
2. INTRODUCCIÓN
Al hablar de crecimiento microbiano nos referimos al número de células, las células que crecen, están aumentando
de número y forman cúmulos de cientos de microorganismos, colonias de cientos de microorganismos o poblaciones
de miles de millones.
Al conocer las condiciones para el crecimiento microbiano, podemos predecir la rapidez con que crecerán estos en
distintas situaciones y determinan la forma de controlar su crecimiento, estos requerimientos pueden ser físicos y
químicos. Los aspectos físicos incluyen la temperatura, el pH y la presión osmótica y entre los requerimientos
químicos están el agua, las fuentes de carbono y nitrógeno, las sustancias minerales, el oxigeno y los factores
orgánicos de crecimiento.
Las bacterias se reproducen generalmente por fisión binaria, una división celular da lugar a dos células, la división de
estas células produce cuatro y así sucesivamente.
El tiempo necesario para que una célula se divida y por consiguiente para que su población se duplique, es lo que se
llama tiempo de generación o tiempo de duplicación, puesto que, para los organismos unicelulares; cada
duplicación constituye una nueva generación, varía considerablemente entre los diferentes microorganismos. La
mayoría de las bacterias tienen un tiempo de generación de una a tres horas.
Hay una serie de métodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos métodos miden el número de células, otros
la masa total de la población. Las medidas de población se refieren normalmente al número de células que hay en un
mililitro de líquido o en gramo de material sólido.
Los métodos de cuantificación están basados en mediciones directas o indirectas de muestras muy pequeñas,
después se determina mediante cálculos el tamaño de la población total.
Los métodos recomendados para medir la población son:
• Recuento en placa
• Diluciones seriadas.
Existen numerosos modelos de cámaras de para contar células, adaptadas a su uso en microscopía. En la imagen
puedes observar una cámara de Neubauer doble, como las que usas en el laboratorio de prácticas.
Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes métodos. El más común es el de tinción con azul tripán.
El azul tripán es un coloide que se introduce en el interior de las células que presentan roturas en la membrana. Así
pues las células que aparecen en la imagen, claramente de color azul, son consideradas no viables. Asimilar células
blancas, por exclusión, a células viables es un error pues por este método se sobrevalora la viabilidad de las células
en la suspensión, determinando como inviables sólo aquellas con la membrana rota. Existen otros métodos de
determinación de la viabilidad celular como el más preciso de la tinción con ioduro de propidio.
Es importante diferenciar entre el crecimiento de las células individuales y el crecimiento de poblaciones de células
(proliferación). El crecimiento de una célula es el aumento en su tamaño y peso y generalmente es la antesala de la
división celular. Por otra parte, la proliferación es el aumento del número de células a consecuencia del crecimiento y
la división celulares.
Una vez que se proveen de nutrientes necesarios al microorganismo, la célula empiezan a crecer y/o a producir
algunos metabolitos.
Fase del crecimiento
En un cultivo microbiano todas las partes están sujetas a las mismas condiciones de temperatura, pH, concentración
de nutrientes, en la figura siguiente se indican diferentes fases que ocurren en un cultivo, en donde se refleja los
cambios en la biomasa y en el medio ambiente.
3.3.- EQUIPO
• Espectrofotómetro
• Autoclave
• Horno
• Incubadora a 37° C
• Contador de colonias
• Cámaras de Neubauer
3.4.- CEPAS:
Cepa de Escherichia coli
Cepa de Saccharomyces cerevisiae
4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL
4.1 PREPARACIÓN DE MATRAZ SEMILLA
4.1.1 Inocular en condiciones de esterilidad un matraz nefelométrico conteniendo 50 mL de caldo nutritivo estéril con
2.5 mL de una suspensión de Escherichia coli ó Saccharomyces cerevisiae ajustado al tubo 3 del nefelómetro de
6
Mac Farland (aproximadamente 3x10 de células de E. coli).
4.1.2 Incubar a 35° C por 24 horas en agitación aproximadamente a 120 rpm. Éste será el matraz semilla.
NOTAS
A.- El día de la cinética tomar en condiciones de esterilidad 4 ml y medir la turbidez en el espectrofotómetro.
B.- De lo que quede en la pipeta realizar una tinción de Gram para verificar la pureza de nuestro matraz semilla.
C.- Enjuagar una celda espectrofotométrica con benzal y luego en condiciones de esterilidad enjuagarla con alcohol,
ahora con una pipeta estéril tomar 4 ml de caldo nutritivo del matraz de cinética y colocarlo en la celda
espectrofotomérica y colocarle papel parafilm (este es el blanco para ajustar el espectro y poder leer cada lectura).
4.2 INOCULACIÓN DE MATRAZ DE CINÉTICA
4.2.1 Homogeneizar la suspensión microbiana del matraz semilla y tomar una muestra de 2.5 mL de esta suspensión
en condiciones de esterilidad e inocular el matraz con caldo nutritivo para la cinética (de 250 mL) y homogeneizarlos.
4.2.2 Con una pipeta de 5 ml tomar inmediatamente la primera muestra de 4 mL en condiciones estériles, esta será
la muestra de tiempo cero (t0), 3 mL se ocupan para la técnica de turbidimetría, 1 mL para hacer las diluciones, y un
par de gotas para llenar la cámara de Neubauer. Después coloca el matraz en agitación aproximadamente a 120
rpm.
4.2.3. Cada hora, o según los tiempos establecidos, en condiciones de esterilidad se toma una muestra de 4 mL para
determinar el crecimiento por los tres métodos señalados. Recuerda que inmediatamente después de tomar la
muestra debes regresar el matraz a la agitadora.
4.3 DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO POR TURBIDIMETRIA
4.3.1 Prender el espectrofotómetro con el paso de luz bloqueado y ajustar a 100% de transmitancia y cero de
absorbancia con la celda que contiene el caldo nutritivo (blanco) a una longitud de onda de 540 nanómetros (seguir
indicaciones y recomendaciones de uso de los profesores).
4.3.2 Tomar 3 mL de muestra de cada una de los matraces desde el tiempo cero hasta el tiempo final en condiciones
de esterilidad y colocarla en la celda espectrofotométrica. Tapar la celda con papel parafilm, y leer en el
espectrofotómetro para registrar la absorbancia; esta lectura corresponde a la turbidimetría adquirida por aparición
de células a lo largo de la cinética.
4.3.3 Después de obtener la lectura desecha el contenido en benzal, y enjuaga la celda con benzal, para
posteriormente enjuagarlo con agua, junto al espectro tenemos los frascos de desecho.
La cámara de Neubauer es una cámara de conteo adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de
fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda
de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm., con una separación
entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L corresponde a 1 milímetro
cuadrado. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando
se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la
superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.
4.4.3 Enfocar con objetivo seco fuerte (nunca uses el objetivo de inmersión) y contabilizar las células que se
observan en toda la cuadrícula central (marcada con la letra M), la cual a su vez se encuentra subdividida en 25
cuadros, cada uno dividido en 16 cuadros. Si el número de células es muy grande, selecciona al menos cinco de los
25 cuadros y cuenta las células, y obtén un promedio. Este promedio multiplícalo por 25 que es el número total de
cuadros.
4.4.4 Calcular el número de células totales por mililitro de cultivo, siguiendo la siguiente fórmula.
Concentración en la suspensión (células/ mL) = # de células contadas X 10,000
4.4.5 Retira el cubreobjetos con una torunda de algodón impregnada con alcohol y con una pinza que contenga
también una torunda impregnada con alcohol, limpia la cámara con mucho cuidado procurando no frotar demasiado
para evitar rayar la cámara y la torunda utilizada colócala en un frasco que contenga benzal.
5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO
5.1 Turbidimetría: anota los resultados obtenidos de lecturas de absorbancia en los tiempos correspondientes.
5.2 Cuenta viable por vaciado en placa: Anota el número de colonias que se desarrollaron en las cajas petri con
agar cuenta estándar.
Microorganismo:
MUESTRA TIEMPO (min) DILUCIÓN No. de UFC/mL
T0
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
T10
5.3.1 Anota el número de células totales que se contabilizaron en cada uno de los tiempos de la cinética.
5.3.2 ¿Cuál es el fundamento del número total de células?
5.3.3 ¿Es posible diferenciar células muertas de las vivas?
5.4. Con los resultados obtenidos del método de cuenta viable determina el número de unidades formadoras de
colonias en los 25 mL del medio de cultivo.
5.5. Menciona el fundamento de la técnica de cuenta viable.
5.6. Construye una gráfica del número de UFC/mL vs Tiempo, señalando en la curva las diferentes zonas de
crecimiento.
5.7. Construye una gráfica del número de UFC/mL vs Tiempo (horas).
5.8. Construye una gráfica del log del número de UFC/mL vs Abosrbancia.
5.9. Determina la velocidad específica de crecimiento máxima.
5.10. Calcula el tiempo de generación de la cepa estudiada.
5.11. Define el término crecimiento microbiano
5.12. Define el término Velocidad Específica de Crecimiento
5.13. Menciona los factores de que depende la fase de muerte
5.14. Explica fisiológicamente qué sucede en la fase lag.
5.15. ¿Por qué es importante la cinética microbiana?
7. CONCLUSIONES
Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P 56
LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS- UPIBI-IPN
Elabora las conclusiones sobre la base de los resultados obtenidos, al análisis y discusión de estos, a la bibliografía
consultada y a los objetivos de la práctica.
8. BIBLIOGRAFÍA
Enlistar la bibliografía consultada para el reporte de esta practica.
PRÁCTICA No. 8
1. OBJETIVOS GENERAL
El alumno realizará la producción de un metabolito de importancia industrial de origen microbiano
I.2 Objetivos específicos
Determinar cuantitativamente el metabolito producido.
Establecer la correlación entre el crecimiento microbiano y la producción de un metabolito primario.
2. INTRODUCCIÓN
Por biotecnología se entiende “Toda aplicación tecnológica que utilice sistemas biológicos y organismos vivos o sus
derivados para la creación o modificación de productos o procesos para usos específicos”, según la definición de la
ONU. Desde los inicios de la civilización, la humanidad ha hecho uso de los microorganismos para obtener productos
específicos como pan, cerveza, vino, yogurt, etc., en lo que se conoce como biotecnología tradicional o de primera
generación. En la década de los 40´s, se emplearon las herramientas de la bioquímica y la microbiología en el uso y
manipulación de organismos para la obtención de metabolitos (aminoácidos, antibióticos, enzimas), como
biotecnología de segunda generación. Actualmente, la biotecnología de tercera generación hace uso de las
herramientas de la biología molecular y la ingeniería genética para la producción de compuestos, enzimas, vacunas,
anticuerpos, etc.
Uno de estos metabolitos de origen microbiano es el ácido láctico, obtenido generalmente a partir de bacterias
lácticas homofermentativas. Fue el primer ácido orgánico producido mediante fermentación microbiana industrial en
1880. Se emplea en medicina para estabilización hemodinámica, en cosmética como queratinolítico, para curtir
pieles en peletería, y como acaricida en el ganado. El ácido láctico tiene múltiples aplicaciones en la industria
alimentaria como aditivo y conservante en productos cárnicos y lácteos, en industria derivada de cereales y en
numerosas industrias de bebidas. De hecho el yogurt se produce por la fermentación de la lactosa de la leche hasta
ácido láctico, cuya acidez genera la precipitación de la caseína, dando el aspecto grumoso del yogurt. Se producen
otros alimentos a partir de fuentes de carbono diversas, en donde se genera acido láctico, tales como la leche
búlgara, el yakult, el jocoque, etc. En la producción de saeukrut (col fermentada), la primera fase del proceso incluye
la fermentación láctica. La producción sólo del ácido es de 20,000 toneladas anuales.
El ácido láctico se produce a través de la degradación de lactosa ó glucosa por la ruta de Embden –Meyerhoff –
Parnas o glicólisis, hasta producir piruvato, el cuál es reducido por la Lacato deshidrogenada (LDH) a L – (+) Lactato.
El lactato es un ácido carboxílico, y la acidez que genera, la cuál llega a ser de pH 4.5, detiene el crecimiento de los
microorganismos, lo que da fin al proceso fermentativo, y permite conservar los productos, pues la acidez evita la
contaminación por otros microorganismos
Las cepas utilizadas desde hace tiempo en la producción de lactato (sal sódica del ácido láctico, y que es la forma
como se comercializa) son principalmente las del grupo I de lactobacilos (homofermentativos), como son
Lactobacillus delbruckii sub. delbrueckii, sub. bulgaricus y sub. lactis, y L. helveticus. Estos microorganismos son
anaerobios aerotolerantes, por lo que la fermentación se puede llevar a cabo en condiciones parcialmente
anaerobias, y no es necesaria la anaerobiosis absoluta. Otros lactobacilos son heterofermentativos (grupo III), y
además de producir lactato, producen acético, etanol u otros productos, por lo que no son útiles para la producción.
L. delbruckii sub. delbrueckii fermenta la glucosa y la fructosa, pero no la lactosa; L. delbruckii sub. bulgaricus y
lactis si pueden fermentar la lactosa. Actualmente la mitad del lactato que se genera se produce por fermentación, y
el resto por síntesis química.
Los fabricantes ponen especial interés en la selección de las condiciones adecuadas de cultivo para lograr altas
tazas de producción del ácido. En la producción se puede emplear glucosa o lactosa como fuentes de carbono, pero
se prefiere la glucosa por el precio. Además de la glucosa y de la fuente de nitrógeno, generalmente fosfato de
amonio, estas bacterias requieren vitaminas del grupo B para su crecimiento, las cuales se pueden adicionar puras,
o adicionar una fuente rica en ellas, como el extracto de levadura. En los procesos continuos, se adiciona CaCO3
para mantener el pH alto y evitar que la fermentación se detenga. La fermentación típica dura 72 horas y debe
mantenerse una temperatura entre 30 -35° C. En los últimos tiempos, se han desarrollado procesos para la
obtención a partir del suero lácteo desproteineizado que es un subproducto de queserías, con lo cuál se disminuyen
costos, además de evitar contaminación por su desecho. Este suero contiene un 5% aprox. de lactosa que funciona
como fuente de carbono. También se emplea la melaza del azúcar, dando un uso alternativo de la caña de azúcar.
Un proceso típico de fermentación “batch”, consiste en la preparación del inóculo, la inoculación del fermentador
semilla, la fermentación en el tanque de producción y la etapa de purificación del metabolito. El estudio cinético de un
proceso fermentativo para la obtención de un metabolito consiste en la determinación y análisis de los componentes
del sistema que nos permitan establecer las mejores condiciones de producción y tener control sobre ellas, como
son: determinación del crecimiento del microorganismo como biomasa producida (x), el consumo de carbohidratos o
de la fuente de carbono empleada, es decir el sustrato (s) y la cantidad de metabolito producido (P).
La determinación de biomasa microbiana se puede hacer por peso seco o peso húmedo, ó por cuenta directa. La
determinación del consumo de la fuente de carbono o sustrato depende de la naturaleza de éste, y y existen varias
técnicas espectrofotométricas para ello. La técnica elegida para la determinación del metabolito producido, también
depende de la naturaleza de este. Dado que el ácido es un metabolito asociado al crecimiento, la medición de la
biomasa producida, puede ser indicativa de la producción de láctico en un cultivo “batch”. En este caso la
determinación de la acidez del medio nos permitirá determinar su producción.
3. MATERIAL Y REACTIVOS
• Medios de cultivo:
Medio Suero
Medio Glucosa
Glucosa 9.0 g
Extracto de levadura 2.0 g
Fosfato de amonio 1.5 g
Agua cbp 100.0 mL
Ajustar pH a 6.0 con NH4OH. Esterilizar a 121ºC / 15 minutos
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
PRIMERA SESIÓN
A PREPARACIÓN DEL INÓCULO Y MATRAZ SEMILLA.
4.1 Tomar un tubo con medio inclinado con un cultivo de Lactobacillus lactis y adicionarle 2 mL de solución
salina isotónica.
4.2 Homogeneizar perfectamente para formar la suspensión celular.
4.3 Inocular un matraz conteniendo 25 mL de medio de cultivo con 2.0 mL de la suspensión celular (el
profesor indicará cuál le toca a cada equipo). A fin de verificar la pureza de éste matraz semilla, se
realizará una tinción de Gram (ver apartado C) y se revisará en el microscopio, antes de inocular el matraz
de producción.
4.4 Incubar a 40 oC durante 48 horas sin agitación.
5.2 Anotar en la tabla 5.2 sus resultados de número de células producidas (que es un indicativo de la biomasa
producida). Los resultados obtenidos serán utilizados para elaborar la gráfica de la cinética de producción de
lactato.
24
48
72
5.3 Anotar en la tabla 5.3 los resultados del valor de pH determinado con tira reactiva, a los diferentes tiempos.
Tabla 5.3
Tiempo Valor de pH
(horas)
0
24
48
72
5.4 Ahora anotar el gasto en mL de NaOH con la muestra de tiempo 72 horas, y con ello calcular los moles de ácido
láctico producido. Para ello primero se calculan los moles de sosa consumidos en la titulación, con la siguiente
fórmula:
5.5 ¿Cuántos moles de lactato se produjo en el matraz que se corrió? Comparar la cantidad de lactato producido en
los matraces con suero de leche y con glucosa, e indicar cuál es más conveniente para la producción de lactato.
5.6 Con los resultados anteriores de pH, y número de células, elaborar una gráfica, de tiempo contra crecimiento y
pH a los diferentes tiempos. Con esto tendremos una gráfica donde se muestre como se comporta el cultivo con
respecto al pH. Recuerda que es una so0la gráfica para pH y número de células.
5.7 Escribir la vía metabólica utilizada en la fermentación para la producción de ácido láctico.
5.8 Explicar porque se eligió esta cepa para la producción de lactato.
5.9 Mencionar dos usos del ácido láctico.
5.10 Elaborar el diagrama de flujo (en bloques) de la producción de lactato.
5.11 DISCUTIR LOS RESULTADOS OBTENIDOS en función del medio empleado y la cantidad de lactato producido
en cada medio. Explicar las ventajas de producir lactato en cada uno de los medios.
6. BIBLIOGRAFIA
6.1 Crueger,D y Crueger, A. Biotecnología: Un texto de microbiología industrial. 2da. Edición. Ed. Omega.
Barcelona. 1994.
6.2 Jakymec, M.; Moran, H.; Páez, G.; Ferrer, J.; Mármol, Z.; Ramones, E. 2001. “Cinética de la producción de
ácido láctico por fermentación sumergida con lactosuero como sustrato”. Rev. Cient., FCV-LUZ. XI(1): 53-
59.
6.3 Rodríguez Pascual, L. y Martínez Zúñiga R.1999. Manual de Prácticas de Laboratorio de Bioquímica
Microbiana. UPIBI-IPN. México.
6.4 Río de Janeiro. Convenio de Diversidad Biológica. Secretariat of the Convention on Biological Diversity.
UNEP. 1992. Disponible en WEB como [ref. marzo de 2007]
http://www.biodiv.org/convention/convention.shtml
PRÁCTICA No. 9
CUANTIFICACIÓN DE BACTERIAS POR LA TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)
1.-OBJETIVOS GENERAL
• El alumno utilizará la técnica del Número Más Probable.para cuantificar bacterias coliformes
•
1.1 Objetivos específicos:
• Aplicar la Técnica del Número Más Probable para cuantificar organismos coliformes totales en muestras
de agua y alimentos.
• Aplicar la Técnica de Número Más Probable para cuantificar de organismos coliformes fecales en
muestras de agua y alimentos.
2.- INTRODUCCIÓN
Esta técnica está basada en la estadística, matemática inobjetable, para expresar cuantitativamente la densidad
de microorganismos en una muestra. Se basa en la presunción de que las bacterias se hallan normalmente
distribuidas en un medio líquido, esto es, en las muestras repetidas del mismo tamaño de un mismo producto,
debe esperarse contengan el mismo número de microorganismos como promedio; naturalmente, algunas de las
muestras pueden contener algunos gérmenes mas o menos. La cifra media es el número más probable (Numero
Más Probable o MPN).
La Norma Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994 Bienes y Servicios Determinación de bacterias coliformes
Técnica del Número Más Probable. Secretaria de Salud. México, establece el método microbiológico para
estimar el número de coliformes presentes en productos alimenticios, por medio del cálculo del número más
probable (NMP).
Este procedimiento puede aplicarse a agua potable, agua purificada, hielo y alimentos procesados térmicamente,
así como a muestras destinadas a evaluar la eficiencia de prácticas sanitarias en la industria alimentaría. Este
procedimiento debe seleccionarse cuando la densidad esperada es como mínimo de una bacteria en 10 mL de
producto líquido o una bacteria por gramo de alimento sólido.
Cuando la densidad bacteriana sea menor que la aquí citada y si la naturaleza del alimento lo permite, utilizar el
método de filtrado en membrana. Si la densidad microbiana se espera sea mayor a 100 por mililitro o gramo de
muestra, ampliar el intervalo de diluciones o utilizar el método en placa.
El método se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a 35 ± 1°C durante 24 a 48
horas, resultando una producción de ácidos y gas el cual se manifiesta en las campanas de fermentación.
La técnica NMP requiere de mucho más material que la utilizada en los recuentos en placa y se considera en
general, que posee una menor exactitud y precisión; es sin embargo, incomparablemente más sensible ya que
estima la presencia de unos cuantos microorganismos o uno solo, en un gran volumen de muestra (teóricamente
litros). Por esta razón encuentra aplicación en el análisis de agua, por ejemplo, en donde la presencia de 2
organismos coliformes en 100 mL, ya reclama atención especial en un sistema de abastecimiento. Para este
propósito deberá usarse también un recuento por vaciado en placa.
Con frecuencia en la aplicación de la técnica de NMP de un grupo particular de microorganismos, el ensayo se
extiende a dos o más estadios, en el primero, que constituye la prueba presuntiva, los tubos positivos pueden ser
el resultado de la actividad del microorganismos en cuestión, o también de otros con comportamiento similar e
incluso, de asociaciones de diferentes microorganismos. La que viene a ser la prueba presuntiva en la
investigación de organismos coliformes, consiste en inocular alícuotas de la muestra en tubos de fermentación
64
Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P.
Laboratorio De Técnicas Microbiológicas-UPIBI.IPN
con caldo lactosado. En ellos, estos microorganismos proliferan fácilmente fermentando la lactosa y liberando
anhídrido carbónico que en gran cantidad se acumula en la campana o tubo de Durham. Un efecto semejante
puede ocurrir en ausencia de organismos coliformes como resultado de la acción sinérgica de dos tipos de
bacterias; una capaz de fermentar la lactosa hasta ácido láctico y pirúvico; y otra que metaboliza estos ácidos
generando el gas aldehído y ácidos menores. Algunas bacterias Gram positivas también pueden, aunque en
menor grado producir gas a partir de la lactosa. se hace por ello indispensable efectuar un segundo ensayo,
llamado prueba confirmatoria en la cual los organismos coliformes, en caso de existir, proliferan activamente en
tanto que los falsos positivos serán inhibidos por la presencia de sustancias selectivas antibacterianas
adicionadas al medio de confirmación.
Otras pruebas para determinar la presencia de bacterias coliformes:
Las bacterias coliformes son bacilos cortos, Gram negativos, que fermentan la lactosa y forman ácido y gas. Son
anaerobios facultativos y se multiplican a mayor rapidez a temperaturas entre 30 y 37 ºC.
Las bacterias coliformes incluyen la Escherichia coli y otras bacterias que se asemejan morfológica y
fisiológicamente. Estos microorganismos con frecuencia difieren entre sí en características pequeñas; se
diferenciaron docenas de especies, pero en la actualidad solamente se reconocen cuatro géneros que son: E.
coli, Klebsiella, Citrobacter y Enterobacter.
3.2 MATERIAL
1 pipetero metálico
4 pipetas de 2 mL
4 pipetas de 10 mL
3.3 REACTIVOS
Benzal
3.4 EQUIPO
1 autoclave.
1 balanza granataria.
1 incubadora a 35°C.
1 horno a 180°C.
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Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P.
Laboratorio De Técnicas Microbiológicas-UPIBI.IPN
4.- PROCEDIMIENTO
Prueba presuntiva
• Inocular 1 mL de la dilución 10 -1, de la muestra a cada uno de los 3 tubos con 10 mL de caldo
lactosado concentración sencilla (0.1 g)
• Inocular otra serie de tres tubos con caldo lactosado de concentración sencilla con 0.1 ml de la dilución
10-1. (0.01g)
• Inocular otra serie de tres tubos con caldo lactosado de concentración sencilla con 0.1 ml de la dilución
10-2 (0.001g)
• Incubar los tubos a 35°C durante 48 horas.
• Observar si hay producción de gas en los tubos a las 24 horas, si no la hay, seguir incubando hasta las
48 horas, si en este tiempo no hay formación de gas la prueba se considera negativa.
No olvidar que cada vez que se quita el tapón, la boca del tubo se debe flamear, en cada transferencia se debe
de emplear una pipeta estéril.
Prueba confirmativa
• Ordenar los tubos de acuerdo a la dilución.
• Agitar suavemente los tubos de caldo lactosado que resultaron positivos en la prueba presuntiva.
• Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo a caldo lactosa bilis verde brillante.
• Incubar a 35°C durante 48 horas.
• Considerar la prueba positiva si hay formación de gas en cualquier cantidad.
• Determinar el número de organismos coliformes totales de acuerdo con la tabla correspondiente
tomando como base el número de tubos en que se observe producción de gas.
• Informar: Número más probable de coliformes por gramo de muestra NMP.
• Comparar con el límite microbiano de cada muestra de acuerdo a la Norma Oficial mexicana que le
corresponda.
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Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P.
Laboratorio De Técnicas Microbiológicas-UPIBI.IPN
1 mL
Caldo lactosado Caldo bilis verde brillante
1 mL
Caldo lactosado Caldo bilis verde brillante
67
Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P.
Laboratorio De Técnicas Microbiológicas-UPIBI.IPN
• Inocular 10 mL de la muestra directa a cada uno de los 5 tubos con 10 mL de caldo lactosado doble
concentración
• Inocular otra serie de cinco tubos con caldo lactosado de concentración sencilla con 1 ml de la muestra
directa
• Inocular otra serie de cinco tubos con 0.1 mL de la muestra directa.
• Incubar los tubos a 35°C durante 48 horas.
• Observar si hay producción de gas en los tubos a las 24 horas, si no la hay, seguir incubando hasta las
48 horas, si en este tiempo no hay formación de gas la prueba se considera negativa.
No olvidar que cada vez que se quita el tapón, la boca del tubo se debe flamear, en cada transferencia se debe
de emplear una pipeta estéril.
Prueba confirmativa
• Agitar suavemente los tubos de caldo lactosado que resultaron positivos en la prueba presuntiva.
• Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo a caldo lactosa bilis verde brillante.
• Incubar a 35°C durante 48 horas.
• Considerar la prueba positiva si hay formación de gas en cualquier cantidad.
• Determinar el número de organismos coliformes totales de acuerdo con la tabla correspondiente
tomando como base el número de tubos en que se observe producción de gas.
• Informar: Número más probable de organismos coliformes totales por 100 mL de muestra NMP
• Comparar con el límite microbiano de cada muestra de acuerdo a la Norma Oficial mexicana que le
corresponda.
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Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P.
Laboratorio De Técnicas Microbiológicas-UPIBI.IPN
10 mL c/tubo
0.1 mL
10 mL de Caldo Lactosado 10 mL de Caldo bilis
de concentración sencilla verde brillante
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Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P.
Laboratorio De Técnicas Microbiológicas-UPIBI.IPN
Prueba presuntiva
• Inocular 1 mL de la dilución 10 -1, de la muestra a cada uno de los 3 tubos con 10 mL de caldo Lauril
triptosa sulfat (CLTS) (0.1 g)
• Inocular otra serie de tres tubos con caldo lauril triptosa sulfato con 0.1 ml de la dilución 10-1. (0.01g)
• Inocular otra serie de tres tubos con caldo llauril triptosa sulfato con 0.1 ml de la dilución 10-2 (0.001g)
• Incubar los tubos a 35°C durante 48 horas.
• Observar si hay producción de gas en los tubos a las 24 horas, si no la hay, seguir incubando hasta las
48 horas, si en este tiempo no hay formación de gas la prueba se considera negativa.
No olvidar que cada vez que se quita el tapón, la boca del tubo se debe flamear, en cada transferencia se debe
de emplear una pipeta estéril.
Prueba confirmativa
• Ordenar los tubos de acuerdo a la dilución.
• Agitar suavemente los tubos de caldo lauril triptosa sulfato que resultaron positivos en la prueba
presuntiva.
• Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo a caldo EC.
• Incubar a 44.5°C durante 48 horas.
• Considerar la prueba positiva si hay formación de gas en cualquier cantidad.
• Determinar el número de organismos coliformes fecales de acuerdo con la tabla correspondiente
tomando como base el número de tubos en que se observe producción de gas.
• Informar: Número más probable de organismos coliformes fecales por gramo de muestra NMP.
• Comparar con el límite microbiano de cada muestra de acuerdo a la Norma Oficial mexicana que le
corresponda.
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Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P.
Laboratorio De Técnicas Microbiológicas-UPIBI.IPN
Prueba presuntiva
• Inocular 10 mL de la muestra directa a cada uno de los 5 tubos con 10 mL de caldo lauril sulfato doble
concentración
• Inocular otra serie de cinco tubos con caldo lauril triptosa sulfato de concentración sencilla con 1 ml de
la muestra directa
• Inocular otra serie de cinco tubos con 0.1 mL de la muestra directa.
• Incubar los tubos a 35°C durante 48 horas.
• Observar si hay producción de gas en los tubos a las 24 horas, si no la hay, seguir incubando hasta las
48 horas, si en este tiempo no hay formación de gas la prueba se considera negativa.
No olvidar que cada vez que se quita el tapón, la boca del tubo se debe flamear, en cada transferencia se debe
de emplear una pipeta estéril.
Prueba confirmativa
• Agitar suavemente los tubos de caldo lauril triptosa sulfato que resultaron positivos en la prueba
presuntiva.
• Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo a caldo lactosa bilis verde brillante.
• Incubar a 44.5°C durante 48 horas.
• Considerar la prueba positiva si hay formación de gas en cualquier cantidad.
• Determinar el número de organismos coliformes fecales de acuerdo con la tabla correspondiente
tomando como base el número de tubos en que se observe producción de gas.
• Informar: Número más probable de organismos coliformes fecales por 100 mL de muestra
• Comparar con el límite microbiano de cada muestra de acuerdo a la Norma Oficial mexicana que le
corresponda.
71
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Laboratorio De Técnicas Microbiológicas-UPIBI.IPN
3.-Anota todos los componentes del caldo lactosado y menciona la función de cada uno de ellos.
4.- ¿Por que se usa caldo lactosado de doble concentración para análisis de agua?
5.-Anota todos los componentes del caldo lactosa bilis verde brillante y menciona la función de cada uno de
ellos.
6.-Anota todos los componentes del caldo lauiril sulfato triptosa y del caldo EC, menciona la función de cada uno
de ellos.
7.-Anota todos los componentes del caldo lactosado y menciona la función de cada uno de ellos.
9.- ¿Cuál es la diferencia de usar la técnica para coliformes fecales y coniformes totales?
10.- ¿Por qué se les llama indicadores sanitarios a los microorganismos coliformes?
11.- A que se debe la presencia de organismos coliformes fecales en muestras de agua y alimentos.
13.- ¿Cuáles son las principales géneros que conforman el grupo coliforme?
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Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P.
Laboratorio De Técnicas Microbiológicas-UPIBI.IPN
Analice la Técnica del Número Más Probable, presencia o ausencia de organismos coliformes totales y
coliformes fecales en muestras de agua, así como el uso de las tablas.
7.- CONCLUSIONES
Elabora las conclusiones con base a los resultados obtenidos y a los objetivos de la práctica.
8.- BIBLIOGRAFÍA
-American Public Health association 1998. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of
Foods. Ed. Marvin L. Speck. E.U.A.
-Fernández Escartín E. 1981. Microbiología Sanitaria Agua y Alimentos. Vol 1. Universidad de Guadalajara.
ANUIES-SEP. México.
-NOM-112-SSA1-1994 Bienes y Servicios Determinación de bacterias coliformes Técnica del Número Más
Probable. Secretaria de Salud. México.
-IPN. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. Departamento de Microbiología. 2004 Manual de Laboratorio de
Microbiología Sanitaria. 3ª Edición.
73
Autoras: Juárez Juárez M., Pérez Sánchez R., Rodríguez Pascual P.
LABORATORIO DE TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS- UPIBI.IPN
PRÁCTICA No 10
IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS
1.-OBJETIVOS
1.1 Objetivo general
El alumno utilizará las pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias.
2.- INTRODUCCIÓN
El término metabolismo se utiliza cuando nos referimos a todos los procesos químicos que tienen lugar dentro de
una célula. Los elementos químicos básicos que utiliza una célula provienen del medio ambiente y estos elementos
químicos son transformados por la célula en los constituyentes característicos que componen dicha célula. Estos
compuestos químicos se llaman nutrientes y el proceso por el cual una célula transforma estos nutrientes en sus
componentes celulares se denomina anabolismo o biosíntesis. La biosíntesis es un proceso que requiere energía.
Las células pueden utilizar 3 tipos distintos de fuente de energía: luz, compuestos orgánicos y compuestos
inorgánicos. Aunque algunos organismos obtienen su energía de la luz, la mayor parte lo hacen a través de
compuestos químicos. Cuando estos compuestos químicos se rompen originando compuestos más simples se libera
energía. Este proceso se denomina catabolismo. Las células también necesitan energía para otras funciones
celulares como es la movilidad celular y transporte de nutrientes.
Los microorganismos son capaces de efectuar reacciones bioquímicas para degradar nutrientes cuyos productos
finales permiten su identificación, a este grupo de reacciones se les denomina pruebas bioquímicas, las cuales se
han clasificado según el sustrato que emplean:
Existen distintas clases de fermentación producidas por las bacterias y cada una depende de los productos finales
característicos formados. Según la mayoría de los autores los grupos más importantes de bacterias muestran uno de
los cinco tipos principales de formas de fermentación.
1.Fermentación alcohólica.
2.Fermentación del ácido láctico.
3.Fermentación del ácido propiónico.
4.Fermentación del ácido mixta.
5.Fermentación del alcohol butílico.
d) Por el tipo de respiración que efectúan (aerobios estrictos, microaerofílicos,, anaerobios facultativos y
anaerobios estrictos).
La identificación bacteriana preliminar pueden efectuarse observando las características de las colonias y la
morfología microscópica, pero la caracterización final de un aislamiento bacteriano desconocido en género y especie
se logra mediante la detección de ciertos sistemas enzimáticos exclusivos de cada especie.
En el laboratorio estos sistemas se detectan inoculando una pequeña porción de la colonia bien aislada a una serie
de medios de cultivo que contienen substratos específicos, e indicadores químicos que detectan los cambios de pH
o la presencia de un subproducto.
Para poder realizar una identificación bacteriana es necesario primero sembrar por estría a los microorganismos, ya
que generalmente tendremos un cultivo mixto, de esta manera lograremos tenerlos aislados y podemos conocer su
morfología colonial (una vez teniendo el cultivo puro lo pasamos a un medio de cultivo en la cual se desarrolle, para
poder lograr estos pasos es necesario saber la temperatura de crecimiento, cuando tenemos el cultivo puro
procederemos a realizar la tinción de Gram para saber a que grupo pertenece G+ ó G-
Además en la morfología microscópica podemos conocer la forma del microorganismo ( bacilo, coco, coma, etc).
La mayoría de las pruebas utilizadas para evaluar la actividad bioquímica o metabólica de las bacterias, por medio
de las cuales podemos identificarlas hasta especie, es realizando un subcultivo de la colonia pura, aunque es posible
efectuar observaciones preliminares utilizando ciertos medios de aislamiento primario, selectivo o diferencial. Se
recomienda que de una sola colonia hacer una suspensión bacteriana en 1 mL de solución salina fisiológica 0.85 p/v
para que de ahí se tome la muestra e inocular todo el juego de pruebas bioquímicas.
Fermentación de carbohidratos ( glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, sorbitol,
rafinosa, ramnosa, xilosa, etc.)
TSI (fermentación de la glucosa, producción de ácido sulfhídrico, producción de gas)
LIA ( descarboxilación de la lisisna)
MIO (movilidad, descarboxilación de la ornitina y la producción de indol)
SIM (movilidad, producción de ácido sulfhídrico)
Rojo de metilo
Produción de urea
Reacción de Voges Proskauer
Utilización deMalonato
Utilización del citrato
Licuefacción de la gelatina
Crecimiento en caldo CN
Utilización de la esculina
Utilización del gluconato
Requerimientos de oxígeno
Catalasa
Oxidasa
Reducción de nitratos
Fermentación O/F
Prueba de la fosfatas
Prueba de la DNAsa
Incubación a 10 y 45 ª C
Reducción con azul de metileno
Hidrólisis del hipurato
Formación de cápsula
Hidrólisis del almidón
HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN
Fundamento: Determinar la capacidad de un microorganismos para secretar la enzima amilasa para la degradación
de almidón en moléculas mas pequeñas para ser utilizadas en su metabolismo.
Detección de fermentadores de glucosa y lactosa en agar de hierro de Kligler (KIA) o agar triple azúcar hierro (TSI).
Fundamento: Este medio sirve para determinar la fermentación de glucosa, sacarosa y lactosa además de la
producción de gas a partir de glucosa y la producción de ácido sulfhídrico que precipita como sulfuro férrico al
reaccionar con el hierro, la liberación del ácido sulfhídrico se libera por acción enzimática, de los aminoácidos que
contienen azufre produciendo una reacción visible de color negro.
PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER
Fundamento: La reacción de Voges – Proskauer se basa en la conversión del acetilmetilcarbinol (acetoína) en
diacetilo por acción del KOH al 40 % y el oxígeno atmosférico, la acetoína se convierte en diacetilo α - naftol actúa
como catalizador para revelar un complejo de color rojo.
Fundamento: Determinar la capacidad de un organismo de utilizar malonato de sodio como única fuente de carbono,
con la consiguiente alcalinidad.
El malonato es un inhibidor enzimático ya que interfiere en la oxidación del ácido succínico en ácido fumárico,
inhibiendo la acción catalítica de ka enzima succínico deshidrogenasa, mediante un proceso de inhibición
competitiva. El ácido malonico ( malonato) se une a la enzima encerrando los sitios activos de manera que la enzima
no puede combinarse con su sustrato normal, el ácido succínico. Esto ocasiona un cloqueo en la oxidación del ácido
succínico. El medio se inocula por asada y se incuba a 35 ° C durante 24.
HIDRÓLISIS DE UREA
Fundamento: La urea es una diamida del ácido carbónico y esta es fácilmente hidrolizada con la liberación de
amoníaco y dióxido de carbono. La enzima ureasa que posee un microorganismo pueden hidrolizar a la urea que
esta presente en el medio de cultivo de acuerdo con la siguiente reacción: el amoníaco reaccionan en solución para
formar carbonato de amonio, produciéndose una alcalinización y un aumento del pH del medio.
Fundamento: Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas proteo líticas que, a su vez son
detectadas por la digestión o licuefacción de la gelatina presente . Estas enzima que son capaces de gelatinólisis, se
denominan gelatinazas. Las proteínas que se producen son demasiado grandes para entrar en la célula por lo tanto
para ser metabolizadas deben ser hidrolizadas a componentes más pequeños, las enzimas exocelulares de tipo
proteolítico, gelatinazas son secretadas por ciertas bacterias para desdoblar a las proteínas y esta capacidad ayuda
a la identificación bacteriana.
La prueba de movilidad nos sirve para determinar si un microorganismo es móvil por la presencia de flagelos o
inmóvil .
La prueba de Indol nos sirve para determinar si un organismo es capaz de desdoblar el indol de la molécula de
triptófano.
Este aminoácido puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos indólicos principales: indol,
escatol e indolacético. El proceso es efectuada por varias enzimas que en conjunto se denomina “ triptofanasa ” .
La prueba de la descarboxilación de la ornitina sirve para determinar la capacidad enzimática de un microorganismo
de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La descarboxilación es un proceso
por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas específicas son capaces de atacar a los grupos
carboxilo del aminoácido dando una amina o una diamina y anhídrido carbónico, la enzima que efectúa esta reacción
se llama ornitina descarboxilasa , la cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son
cultivadas en un medio ácido en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilación provocan un cambio
de pH hacia la alcalinidad.. Además la descomposición del aminoácido se produce anaerobicamente y el proceso es
irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima común, el fosfato de piridoxal.
El aminoácido L-ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina – descarboxilasa para dar la diamina putrescina y
anhídrido carbónico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si recubrimos la superficie del
medio con parafina o vaselina .
En este medio se determina la descarboxilación de la lisina que se lleva a cabo en anaerobiosis y la desaminación
de la lisina que se lleva acabo en aerobiosis.
Fundamento: La capacidad de un organismo para reducir nitratos a nitritos es una característica importante utilizada
para la identificación y diferenciación de muchas especies. Los organismos que reducen nitratos tienen la capacidad
de obtener oxígeno de los nitratos para formar nitritos y otros productos de reducción. La presencia de nitritos en el
medio se detecta añadiendo α - naftilamina y ácido sulfanílico, con la formación de un color rojo de diazonio, p –
sulfobenceno – azo - α - naftilamina. El color en caso de ser positiva aparecerá a los 30 segundos de añadir los
reactivos.
La prueba OF presenta limitaciones, ya que los bacilos fermentadores de desarrollo más lento pueden no
producir cambios de color durante varios días, y las especies que son esencialmente proteolíticas pueden con el
tiempo producir reversiones de las reacciones débiles, confundiendo así la interpretación final.
Fundamento: Los citocromos son hemoproteínas que contienen fierro y actúan como el último eslabón de la
cadena respiratoria, transfiriendo electrones ( hidrógeno) al oxígeno, con formación de agua. El sistema citocromo
oxidasa se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la prueba de oxidasa es
importante para identificar a aquellos organismos que carecen de la enzima o son anaerobios obligados. La prueba
es muy útil para el conocimiento de las colonias sospechosas de ser enterobacterias (todas negativas ) y para la
identificación de colonias que se presume sean especies de Pseudomonas o Neisseria (positivas)
Esta prueba ocupa el diclororhidrato de p-fenilendiamina, que actua como aceptor final de electrones, sustituyendo al
oxígeno, la p-fenilendiamina es incolora en estado reducido, pero en presencia de citicromo oxidasa y oxígeno
atmosférico se oxida formando azul de indofenol.
PRODUCCIÓN DE LA CATALASA
Fundamento: Determinar la presencia de la enzima catalasa, que se encuentra en la mayoría de las bacterias
aerobias y anaerobias facultativas que contiene citocromo.
La catalasa es una enzima que se descompone en peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua, químicamente la
catalasa es una hemoproteína de estructura similar a la de la hemoglobina.
El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aeróbico de los
hidratos de carbono. Si se deja acumular el peróxido de hidrógeno es letal para la célula bacteriana. La catalasa
transforma al peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno en agua.
3.-MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS
3.1.- EQUIPO
• 1 incubadora a 35°C
• 1 microscopio
• 1 refrigerador
• 1 autoclave
• 1 horno
3.2.- MATERIAL
• 1 Mechero Fisher
• 2 cajas de Petri
• portaobjetos
• 65 tubos de ensaye de 13 x 100 mm
• 1 gradilla metálica
• 1 pipetero con pipetas estériles de 1 mL
• 1 frasco con alcohol
• 8 campanas de Durham
• Algodón
• Gasa
• Papel Kraft
• Asas bacteriológicas
• cilindro de acero inoxidable para cajas Petri
3.4 .-REACTIVOS:
• Solución de rojo de metilo
• Solución de α naftol
• Solución de KOH
• Reactivo de Kovac’s o Erlich
• Solución de ácido sulfanilico
• Solución de α naftilamina
• Aceite mineral
• Solución de peroxido de hidrogeno al 1 %
• Reactivo N,N,N,N-tetrametil-p-feniléndiamina
• Reactivos para tinción de Gram
• Reactivos para tinción de esporas
• Benzal
3.5.-BACTERIAS:
• Bacterias Gram + y Gram – cultivadas en la práctica de Aislamiento o bacterias control
disponibles en el laboratorio
4.1 Anotar el nombre del medio de cultivo en el que describiste la morfología colonial de la cepa aislada de la
práctica de aislamiento, así como la morfología microscópica y el resultados de la tinción de Gram.
4.2 Realizar una suspensión de la cepa pura en un tubo que contenga 5 mL de solución salina estéril.
Prueba bioquímica
Medio de cultivo Forma de inocular
Utilización de carbohidratos
Hidrólisis de almidón Agar almidón Por estría simple
Utilización de citrato de sodio Citrato de Simmmons Por estría
Fermentación de carbohidratos Caldo rojo fenol con lactosa Por asada
Fermentación de carbohidratos Caldo rojo fenol con manitol Por asada
Prueba de rojo de metilo Rojo de metilo Por asada
Prueba de Voges-Proskauer Voges Proskauer Por asada
Utilización de sales orgánicas
Utilización de malonato de sodio Caldo malonato por asada
Hidrólisis de urea Caldo urea por asada
4.4 Incubar las pruebas a 35° C durante 24 horas e incubar una serie de pruebas bioquímicas sin inocular para
observar las reacciones por cambios de coloración.
5.2 Con los resultados obtenidos consulta las tablas que serán proporcionadas por el profesor, para la identificación
de su microorganismo.
5.5 ¿Por qué siempre que se identifica una bacteria se pone una serie de pruebas bioquímicas sin inocular?
5.6.Explicar el significado de la presencia o ausencia de un halo claro, al agregar el lugol, en las pruebas de hidrólisis
del almidón
5.8 Explicar porqué en las pruebas de fermentación de azúcares en tubos con campana de Durham se emplea un
indicador de pH, cual es el indicador y cual es su rango de sensibilidad.
5. 10 ¿Qué significa TSI y que es lo que podemos observar con esta prueba?
5. 11 ¿Cuál es el fundamento de las pruebas de utilización de citrato y malonato y cual es el indicador de pH que se
emplea en estas pruebas bioquímicas?
5.13 Explicar cual es la utilidad de detectar la capacidad de hidrólisis de proteínas que tienen ciertos
microorganismos. ¿De qué manera se detectan estas enzimas proteolíticas de los microorganismos?
6.3 Analizar la importancia de las pruebas bioquímicas en cuanto a fermentación de azúcares, utilización de sales
inorgánicas, hidrólisis de proteínas y aminoácidos, metabolismo oxidativo – fermentativo realizadas para la
identificación de microorganismos.
6.5 Discutir la importancia del buen uso de las tablas para identificar a los microorganismos.
7.- CONCLUSIONES
7.1 Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, a la bibliografía
consultada y a los objetivos de la práctica.
7.2 Concluir el género del microorganismo analizado de acuerdo a las pruebas bioquímicas.
8.- BIBLIOGRAFÍA
-Koneman. E: W Allen, S.D., Dowell, VR., Sommers, H.M. Diagnóstico Microbiológico. Traducción: Wasserman. A. V.
Editorial Médica Panamericana. México. 1984.
- Mac Faddin. J.F., Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. Traducción
Lorenzo, I., Editorial Médica Panamericana, México. 1984.
PRACTICA No. 11
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS
1. OBJETIVOS:
1.1 Objetivo general:
1.1.1 El alumno identificará y cuantificará mohos filamentosos y levaduras en productos de interés biotecnológico.
1.2 Objetivos específicos:
1.2.1 El alumno aislará de una muestra de interés un moho filamentoso y una levadura por la técnica de vaciado en
placa.
1.2.2 El alumno cuantificará mohos filamentosos y levaduras aislados.
1.2.3 El alumno describirá la morfología microscópica de los mohos filamentosos y levaduras aislados.
1.2.4 El alumno describirá la morfología macroscópica de los mohos filamentosos y levaduras aislados.
1.2.5 El alumno identificará un moho filamentoso por medio de la técnica Ridell (Microcultivo).
2. INTRODUCCIÓN
Existen aproximadamente 100,000 especies de mohos microscópicos, y la mayoría viven en el suelo como
saprofitos sobre materia orgánica en descomposición, manteniendo así la fertilidad de los suelos.
Alrededor de 50 especies producen enfermedades en los animales, y aproximadamente 8,000 especies causan
enfermedades en las plantas, por las que se producen pérdidas económicas en la agricultura. En el área de la
industria farmacéutica algunos mohos son utilizados para obtener antibióticos, como la penicilina a partir del género
Penicillium .
En el campo de la elaboración de alimentos y la biotecnología, los mohos microscópicos se utilizan para elaboración
de cerveza, vino, pan, maduración de quesos, producción de diversos ácidos orgánicos, etc.
Los mohos también se pueden usar, por ejemplo, en la degradación de hidrocarburos en el caso de
derrames de petróleo en el mar. Los mohos pueden crecer tanto en agua dulce como el agua marina. También es
relevante el hecho de que algunos mohos forman sustancias tóxicas al crecer en alimentos.
colonias de mohos es de tipo aterciopelado, algodonoso o polvoso, con muy diversas coloraciones que abarcan toda
la gama de color. Los mohos poseen hifas multinucleadas y estas pueden tener septos o carecer de ellos con base
en esta característica, se clasifican en:
1) Mohos con micelio cenocítico : son los que carecen de septos o tabicaciones
2) Mohos con micelio septado: son los que presentan septos o tabicaciones entre las células.
Cada hifa puede tener un grosor uniforme o puede terminar en porciones mas delgadas o anchas. El diámetro va
desde 0.5 hasta 100 micras, y su longitud puede ser desde unas cuantas micras hasta varios metros. En algunas
formas superiores de mohos, las hifas están pegadas juntas para formar cuerpos fructiferos grandes, de estructura
compleja, formado los llamados mohos carnosos o macroscópicos. Pero aun cuando alcancen tales dimensiones,
todos los mohos siguen siendo microorganismos “primitivos”, debido a su especialización en tejido es reversible.
En cuanto a su función, las hifas y micelios se clasifican en 2 tipos:
1) Hifa o micelio vegetativo: son las que penetran al sustrato para absorber las sustancias nutritivas.
2) Hifa o micelio aéreo o reproductivo: son las que se proyectan sobre el sustrato y producen estructuras de
reproducción.
Muchos mohos patógenos presentan dimorfismo, desarrollándose como formas de aspecto de levadura o como
micelios. Por ejemplo, cuando cierto moho crece a temperatura de 37ºC en el cuerpo humano, se pueden presentar
como levaduras, pero cuando crece en un medio de cultivo para mohos a 25ºC presenta forma de moho con micelio
y esporas asexuales.
REPRODUCCIÓN
Los mohos se reproducen principalmente por medio de esporas, que son estructuras especializadas para la
propagación del moho y están capacitados para soportar condiciones adversas del medio ambiente, sin embargo
son más sensibles, en general que las endosporas bacterianas. Las esporas fúngicas pueden formarse
asexualmente o pueden ser el resultado de un proceso sexual. A continuación se muestran la clasificación de estas
esporas:
Artrosporas
Talosporas Blastosporas
Clamidosporas
Reproducción
Microconidias
Asexual Conidiosporas Macroconidias
Esporangiosporas
Zigosporas
Reproducción Ascosporas
Sexual Basidiosporas
Oosporas
Esporas asexuales:
I.- Talosporas:
a) Artrosporas. Son esporas que se forman por fragmentación de hifas generalmente son rectangulares con doble
pared gruesa.
b) Blastosporas. Se forman en las levaduras por gemación a partir de una célula preexistente; una vez que la yema
ha alcanzado su máximo desarrollo se separa de la célula madre y en este estado o todavía unida, produce un nuevo
brote, pudiéndose formar un pseudomicelio.
c) Clamidosporas. Se forman cuando las condiciones del medio se tornan adversas, las células aumentan de tamaño
y se hinchan. Estas esporas son redondeadas y poseen doble pared gruesa que les confiere gran resistencia.
II.- Conidiosporas.
Son esporas producidas libremente, por segmentación de las puntas de unas hifas especializadas, llamadas
conidioforos.
a) Microconidias. Son esporas unicelulares que se presentan en una variedad de tamaños, formas y colores.
Son producidas por los conidióforos, mediante el estrangulamiento sucesivo en el punto de unión.
b) Macroconidias. Son esporas multicelulares, las hay de diversas formas. Las macroconidias pueden dividirse
en dos o más células por tabiques transversales y pueden adoptar forma de huso o de clava. La forma de
estas estructuras varía, según el género.
III.- Esporangiosporas.
Son esporas producidas en estructuras especializadas llamadas esporangios, que son sacos redondos unidos al
micelio vegetativo por una estructura especial llamada esporangióforo.
Esporas sexuales
I.- Cigosporas o Zigosporas:
Esta espora surge cuando las puntas de dos hifas cercanas se unen y fusionan sus contenidos genéticos,
desarrollándose así grandes cuerpos de paredes gruesas. Las dos hifas que se unen pueden ser homotálicas (ambas
provenientes de la misma colonia o talo), o heterotálicas (provenientes de dos talos distintos).
II.- Ascosporas.
De la fusión de los gametos masculino y femenino surge una estructura llamada asco o asca. Las ascosporas se
desarrollan en el interior del asca, que es un saco que contiene generalmente ocho ascosporas.
III.- Basidiosporas
De la fusión de los gamento masculino y femenino surge una basidia, en cuyo interior están las basidiosporas; se
desarrollan en grupo de cuatro como carácter atípico a partir de los extremos de estructuras en forma de maza, que
debido a su forma reciben el nombre de basidios.
IV.- Oosporas
Esporas que surgen de la unión de dos estructuras llamadas anteridio (gameto masculino) y oogonio (gameto
femenino), y que van a producir una sola oospora.
Respecto a sus requerimientos nutricionales, los mohos son heterótrofos. Al faltarles la clorofila lógicamente
no llevan a cabo fotosíntesis, y comparándolos con las bacterias, los mohos en general tienen requerimientos
nutritivos extraordinariamente simples y sus procesos metabólicos y de biosíntesis los llevan acabo por las vías mas
comunes. Por lo tanto pueden vivir en condiciones más severas que otros microorganismos, casi en cualquier
sustrato. Por ejemplo: cuero, madera, alimentos, mermelada, frutas, plantas, el cuerpo humano, animales, etc.
El pH óptimo en el cual se desarrollan es de 3 a 5. Pueden crecer en humedad pero también resisten la falta de agua.
Son aerobios estrictos y carecen en un rango de temperatura óptimo de 22 a 30ºC. Algunos mohos son capaces de
desarrollarse en condiciones extremas, como deteriorqando carne a 0ºC (mohos psicrófilos), o crecimiento a 62 ºC
(mohos termófilos).
Las fuentes de carbono que pueden utilizar los mohos son: glucosa, sacarosa, maltosa, almidón o celulosa. Las
fuentes de nitrógeno que pueden utilizar los mohos son: nitrógeno orgánico, nitrógeno inorgánico y nitratos. Algunos
iones que requieren son: Zn, Cu, Mn, Fe y Mo.
De acuerdo al color de las hifas estas pueden ser hialinas cuando no están pigmentadas o dematiáceas
cuando poseen con color café oscuro
3.1 MATERIAL
• Pipetas de 1 mL
• Bisturi
• Caja de Petri con varilla en forma de “V”
• con un porta y cubreobjetos
• Asa micológica
3.2 EQUIPO
• Autoclave
• Incubadora a 28°C
• Incubadora a 35°C
• Mechero
• Horno a 170°C
• Maltosa al 10%
• Sacarosa al 10%
• Rafinosa al 10%
• Matraces con Agar Dextrosa sabouraud para 4 placas por equipo
• Ácido tartárico al 10%
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
4.4.2 Colocar el cuadro de PDA en un portaobjetos que esta sobre una varilla de vidrio doblada en forma de “V” en
una caja de Petri (todo esto previamente esterilizado).
Tomar con el asa el inoculo del moho al cual se quiere identificar.
4.4.3 Inocular por picadura cada uno de los 4 lados del cuadro de agar.
4.4.4 Colocar sobre el cuadro de agar un cubreobjetos y presionar ligeramente para que se adhiera este al medio.
4.4.5 Adicionar a la caja 5 mL de glicerol al 10%.
4.4.6 Cerrar la caja Petri e incubarla a 28°C durante 48 horas.
4.4.7 Realizar observaciones mínimo cada 12 horas para identificar los cuerpos fructíferos
4.4.8 Si se observa que el moho ya se ha desarrollado y se puede identificar, quitar el glicerol con una pipeta pasteur.
4.4.9 Adicionar 5 mL de formaldehido para inactivar el moho, esto es durante 15 minutos.
4.4.10 Desprender con cuidado el cubreobjetos que se encuentra sobre el cuadro de agar y colocarlo sobre un
portaobjetos que contenga una gota de azul de algodón, sellar la preparación con barniz de uñas transparente.
4.4.11 Desprender con cuidado el cuadro de agar y colocar una gota de azul de algodón ahora colocar un
cubreobjetos y sellar nuevamente la preparación con barniz de uñas trasparente.
4.4.12 Realizar las observaciones de las preparaciones en el microscopio con el objetivo de 10X y 40X.
4.4.13 Dibujar las estructuras observadas y con ayuda de la bibliografía comparar las estructuras reproductivas e
identificar el moho.
4.6 Zimograma
Se utiliza para identificar diversos géneros y especies fúngicas, principalmente levaduras y algunas bacterias
pertenecientes a los Actinomycetes, con base en su capacidad de fermentar azúcares.
4.6.1 Tomar una colonia de levadura aislada e inocular cada tubo que contiene diferentes azúcares con las levaduras
a estudiar, una concentración aproximada a la del tubo número 1 de la escala de Mc Farland, incubar 72 horas y
observar la fermentación de carbohidratos y comparar con la tabla.
C. zeylanoides +* - - - - -
5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO.
5.1 Anotar el número de UFC/mL o g de mohos y levaduras de las diluciones correspondientes en la siguiente tabla.
5.4 Anotar en la siguiente tabla las características de la morfología colonial del moho.
5.5 Anotar en la siguiente tabla las características de la morfología colonial de la levadura en el medio PDA.
Tamaño
Aspecto
Color
Consistencia
5.6 Anota la composición y utilidad de los medios de cultivo: Sabouraud, agar Papa Dextrosa y Agar Rosa de
Bengala.
5.7 Describe la técnica de microcultivo.
5.8 ¿Por que se inocula con esporas y micelio un medio de cultivo?
5.9 ¿Por que se utiliza la técnica de punto para sembrar mohos?
5.10 ¿Porque es necesario realizar la técnica de microcultivo para identificar mohos?
5.11 ¿Cuál es la función del glicerol y el formaldehido en un microcultivo?
5.12 ¿Como identificarías un moho contaminante de un producto biológico?
5.13 ¿ Que otras técnicas se utilizan para la identificación de levaduras?
7. CONCLUSIONES
7.1 Elabora tus conclusiones tomando en consideración los objetivos de la practica, los resultados obtenidos y la
bibliografía consultada.
8. BIBLIOGRAFIA
8.1 Enumera la bibliografía consultada para la elaboración del reporte.
9. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
-Koneman, E:W:& Morrison; Micología, Diagnóstico de Laboratorio, Edito.. Médico Panamericana 1991.
-Tortora, J. Gerard; Introducción a la microbiología, Editorial Acribia, 1993
Saccharomyces cerevisiae
Penicillium
PRÁCTICA No. 12
FACTORES AMBIENTALES
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general
1.1.1 El alumno determinará la influencia de algunos factores ambientales que modifican el crecimiento de los
microorganismos que identificó en prácticas anteriores.
1.2.1 El alumno determinará la temperatura óptima, el punto térmico mortal (PTM) y el tiempo térmico mortal
(TTM) de algunos microorganismos.
1.2.2 El alumno determinará el efecto de la presión osmótica y del pH sobre el crecimiento de los
microorganismos.
1.2.3 El alumno determinará el efecto de algunos metales pesados y halógenos sobre el crecimiento de los
microorganismos.
1.2.4 El alumno determinará la sensibilidad de algunas bacterias ante el efecto de los antibióticos.
1.2.5 El alumno realizará una pasteurización como una aplicación de un proceso térmico.
1.2.6 El alumno evaluará la resistencia bacteriana ante un antibiótico.
2.-INTRODUCCIÓN
La temperatura es el factor ambiental que ejerce una variada influencia sobre el crecimiento microbiano, el
crecimiento microbiano se ve afectado de manera importante por la temperatura por lo que se clasifican en
psicrofílicos: (0°C a 20ºC), los mesofílicos crecen entre 20 y 40ºC y los termofílicos: crecen entre 40 y 80ºC.
La forma mas común de determinar la sensibilidad a calor de un organismo es por medio de su Punto Térmico
Mortal (PTM), que es la temperatura mínima necesaria para que todos los organismos de una población
mueran en 10 minutos y el Tiempo Térmico Mortal (TTM), es el tiempo mínimo en el cual muere una población a
una temperatura dada.
La elevada concentración de solutos en la célula genera una presión interna que recibe el nombre de presión
osmótica; las bacterias poseen paredes celulares rígidas y por lo general no presentan cambios muy
pronunciados de forma y tamaño cuando experimentan plasmolisis o plasmoptisis.
Existen microorganismos que crecen en medios con alta concentración de solutos y reciben el nombre de
osmofilicos, como son los halofílicos, que crecen en altas concentraciones de sal y los sacarofílicos, que crecen
en altas concentraciones de azúcar.
Los metales pesados presentan actividad antimicrobiana, actúan generalmente por medio de la precipitación de
enzimas o de otras proteínas esenciales para la célula o interfieren con algunas funciones celulares, el
mercurio, la plata, el arsénico, el zinc y el cobre son los más utilizados, se utilizan en bajas concentraciones ya
que tienen buena actividad antimicrobiana.
Compuestos halogenados como el yodo, cloro, el hipoclorito, actúan como oxidantes de los constituyentes
celulares, como las proteínas.
Los antibióticos se definen como substancias producidas por un microorganismo, la cual a bajas
concentraciones inhibe el crecimiento de los microorganismos, por su modo de acción, los antibióticos se pueden
clasificar como bactericidas, bacteriostáticos, macrólidos, polipéptidos y grupo misceláneo.
3.1.- MATERIAL
• Pipetas de 1,2,5 y 10mL estériles.
• Tubos de 13x 100mm con 5 mL de caldo nutritivo
• Tubos de 13x 100mm con 5 mL de caldo nutritivo Placas con agar nutritivo
• 20 mL de leche de establo
• Tubos con 9 rnL de agua peptonada al 0. 1%
• Matraz de 1 50 mL con Agar bilis rojo violeta
• Cajas Petri con Agar cuenta estándar
• Caja con agar Luria
• Caja con agar Luria + ampicilina (50 g/mL)
• Tubo con 5 mL de caldo Luria inoculado con una cepa de Esccherichia coli, con crecimiento de 24
horas.
• Tubos de 13x 100 mm con 3 mL de caldo nutritivos pH 3. 5
• Tubos de 13x 100 mm con 3 mL de caldo nutritivos pH 5
• Tubos de 13x l00 mm con 3 mL de caldo nutritivo a pH 7.0
• Tubos de 13x 100 mm con 3 mL de caldo nutritivo a pH 9.0
• Tubos de 13x 100 mm con 3 mL de caldo nutritivo con 1% de cloruro de sodio
• Tubos de 13x100 mm con 3 mL de caldo nutritivo con 3% de cloruro de sodio
• Tubos de 13x 100 mm con 3 mL de caldo nutritivo con 5% de cloruro de sodio
• Discos de papel filtro de 1 cm de diámetro
• Cajas de Petri estériles
• Pinzas de disección
• Discos de papel filtro impregnados con hipoclorito de sodio
3.1 EQUIP0
• 1 termómetro
• 1 refrigerador a 4°C
• 1 incubadora a 25°C
• 1 incubadora a 35°C
• 1 baño María a 50°C
• 1 baño María a 60°C
• 1 baño María a 70°C
• 1 baño María a 80°C
• 1 baño María a 92°C
• 1 autoclave
• Probetas
• Horno
• Bacillus sp.
• Saccharomyces cerevisiae
• Pseudomonas sp.
• Escherichia coli
• Aspergillus niger
• Micrococcus luteus
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
4.1.1 Hacer una suspensión del microorganismo, cada equipo utilizará el mismo microorganismo en todos sus
experimentos.
4.1.2 Etiquetar 4 tubos con 3 mL de caldo nutritivo con: nombre del microorganismo, fecha, equipo, grupo y con
las siguientes temperaturas, 5°C, 28°C, 35°C y 55°C.
4.1.3 Inocular cada uno de los tubos con 0.1 mL de la suspensión microbiana, dejar un tubo sin inocular que
servirá como testigo.
4.1.5 Después de este tiempo observar si hay crecimiento haciendo anotaciones con un signo (+) dependiendo
de cuanta turbidez se observe y si no hay crecimiento con un signo (-).
4.2.1 Etiquetar una serie de 7 tubos conteniendo cada uno 3 mL de caldo nutritivo, con las siguientes
temperaturas: 35°, 50°, 60°, 70°, 80° y 92° C y un tubo que se mantendrá a temperatura ambiente,
4.2.3 Calentar los tubos a las temperaturas correspondientes durante 10 minutos a baño María.
4.2.4 Dividir una caja Petri con agar nutritivo en 6 partes y marcar con 35°, 50°, 60°, 70°, 80°, 92°C y el testigo.
4.2.6 Incubar la placa durante 48 horas a 25°C si se sembró a mohos y a 35°C, 24 horas si se trata de bacterias
y levaduras.
4.3.1 Etiquetar una serie de 7 tubos conteniendo cada uno 3 mL de caldo nutritivo, con los siguientes tiempos 5,
l0, 15, 20, 25 y 30 minutos y un testigo a temperatura ambiente.
4.3.3 Calentar los tubos a 70ºC en un baño María durante los tiempos indicados
4.3.4 Dividir una caja Petri con agar nutritivo en 7 partes y marcar con 5, l0, 15, 20, 25 y 30 minutos y un
testigo a temperatura ambiente.
4.2.6 Incubar la placa durante 48 horas a 25° C si se sembró a mohos y a 35°C, 24 horas si se trata de bacterias
y levaduras.
5’ 10’ 35 50
0’ Tºamb
15’ 60
20’ 70
Te
4.4.-PASTEURIZACIÓN Te
30’ 92
25’ 80
Leche sin pasteurizar: determinar organismos mesofílicos aerobios (OMA) y organismos coliformes
(OC).
4.4.3 Sembrar por duplicado utilizando agar bilis rojo violeta, homogenizar, dejar solidificar y agregar una capa
de agar, solidificar e incubar a 35°C durante 24 horas.
4.4.4 Contar las colonias típicas de coliformes que son de color rosa o roja con un halo de precipitación.
4.4.5 Sembrar por duplicado la dilución 10-2 utilizando agar cuenta estándar o agar nutritivo.
4.4.8 Pasteurizar la leche pasteurizada: adicionar 10 mL de leche bronca en un tubo estéril, en un baño María a
70° C durante 30 minutos, enfriar rápidamente en baño de hielo y determinar organismos mesofílicos y
organismos coliformes.
4.5 Leche pasteurizada: determinar organismos mesofílicos aerobios (OMA) y organismos coliformes
(OC).
4.5.1 Etiquetar 2 cajas vacías y estériles con los siguientes datos: leche pasteurizada, equipo, grupo.
4.5.2 Sembrar por duplicado la leche, adicionar agar bilis rojo violeta, homogenizar, dejar solidificar, agregar una
capa de agar, dejar solidificar e incubar a 35°C durante 24 horas.
4.4.3 Contar las colonias típicas de coliformes que son de color rosa o roja con un halo de precipitación.
4.4.4 Etiquetar 2 cajas vacías y estériles con los siguientes datos: leche pasteurizada, equipo, grupo y OMA.
4.4.5 Adicionar 1 mL de leche a cada caja, adicionar agar cuenta estándar, homogenizar, dejar solidificar e
incubar a 35°C durante 24 horas.
4.4.6 Contar las colonias típicas de coliformes que son de color rosa o roja con un halo de precipitación.
10 mL
Leche de establo sin Pasteurizar
4.5.1 Marcar los 4 tubos de caldo nutritivo con los diferentes pH con: el nombre de la cepa, grupo, equipo.
4.5.3 Incubar los tubos a 35°C para bacterias y levaduras durante 24 horas y a 25°C durante 48 horas para
mohos.
4.5.4 Después de este tiempo observar presencia o ausencia de crecimiento observando la turbidez para los
diferentes pH.
4.6.1 Etiquetar los tubos que contienen 3 mL de caldo nutritivo con diferentes concentraciones de cloruro de
sodio (1%, 3% y 5%.) con nombre de la cepa, grupo y equipo.
4.6.3 Incubar los tubos a 35°C para bacterias y levaduras durante 24 horas y a 25°C durante 48 horas para
mohos.
4.6.4 Después de este tiempo observar presencia o ausencia de crecimiento observando la turbidez para los
diferentes pH.
4.7.1 Impregnar discos de papel filtro con los siguientes compuestos. AgNO3, CuSO4
4.7.2 Marcar una caja Petri con agar nutritivo con: nombre de la cepa, grupo, equipo, nombre del metal.
4.7.3 Sembrar por estría masiva la caja y colocar los discos sobre la placa.
4.7.4 Incubar la placa a 35 ° C para bacterias y levaduras durante 24 horas y a 25°C durante 48 horas para
mohos.
4.7.5 Observar el crecimiento del microorganismo y medir el halo de inhibición de c/u de los agentes utilizados.
AgNO3 CuSO4
AgNO3 CuSO4
4.8.1 Impregnar discos de papel filtro con los siguientes compuestos: hipoclorito de sodio y de yodo.
4.8.2 Marcar una caja Petri con agar nutritivo con: nombre de la cepa, grupo, equipo, nombre del metal.
4.8.3 Sembrar por estría masiva la caja y colocar los discos sobre la placa.
4.8.4 Incubar la placa a 35°C para bacterias y levaduras durante 24 horas y a 25°C durante 48 horas para
mohos.
4.8.5 Observar el crecimiento del microorganismo y medir el halo de inhibición de c/u de los agentes utilizados.
4.9.1 Marcar una placa con agar nutritivo con el nombre de la cepa, grupo, equipo.
4.9.3 Colocar un multidisco o discos individuales sobre las placas sembradas con las cepas.
4.9.4 Presionar ligeramente cada disco sobre el cultivo con ayuda de pinzas de disección para poner en contacto
el antibiótico con la cepa
4.9.6 Después del tiempo de incubación medir el diámetro del los halos de inhibición del crecimiento producido y
anotar los resultados.
4.9.1.1 Tomar 1 mL del cultivo de Escherichia coli e inocularlo en cada una de las cajas con agar luria y agar
luria + ampicilina (50 g/mL). Incubar a 35°C durante 24 horas, marcar correctamente las cajas.
4.9.1.3 Guardar la placa con colonias desarrolladas en presencia del antibiótico en el refrigerador para la práctica
siguiente.
4.9.1.4 Calcular la frecuencia de bacterias resistentes al antibiótico, como UFC en presencia de antibiótico/UFC
sin antibiótico (número de bacterias resistentes / cuenta total).
5. RESULTADOS
CRECIMIENTO UFC/mL
5.4 PASTEURIZACIÓN
LECHE SIN
LECHE PASTEURIZADA
PASTEURIZADA
UFC/mL UFC/mL
ORGANISMOS
MESOFILOS
AEROBIOS
ORGANISMOS
COLIFORMES
CONCENTRACIÓN DE NaCl 1% 3% 5%
CRECIMIENTO
CUESTIONARIO
5.6.¿Cómo actúan los antibióticos utilizados sobre el microorganismo con el que trabajaste?
5.10 ¿Explica la diferencia como actúan los diferentes metales pesados utilizados en el laboratorio.
5.11 Explica la relación que existe entre la concentración del agente químico y el tiempo de exposición
6.1 Basándose en los resultados anteriores y a la bibliografía consultada, analizar y discutir los resultados
obtenidos en esta práctica, haciendo énfasis en el efecto causado a nivel molecular de los factores estudiados y
la importancia práctica que tiene el conocer el efecto de estos mismos sobre los microorganismos.
7.-CONCLUSIONES.
7.1 Elaborar las conclusiones basándose en los resultados, al análisis y discusión que se hicieron de estos, a la
bibliografía consultada y a los objetivos de la practica.
8.-BIBLIOGRAFÍA