PRACTICA DE LABORATORIO

EXTRACCION DE ANTOCIANINAS E IDENTIFICACION DE ANTOCIANIDINAS

I. OBJETIVOS

 Extraer antocianinas, obtener e identificar antocianidinas.

II. FUNDAMENTO

Las antocianinas son un grupo de pigmentos solubles en agua ampliamente

difundidas en el reino vegetal; son responsables del color atractivo que presentan
muchos productos, como frutas, hortalizas, tubérculos, raíces y flores. El color de
las antocianinas varía desde el rosado hasta el azul oscuro. Su incorporación en
alimentos tiene la ventaja de no solo impartir color, sino también por sus
propiedades antioxidantes que poseen, se pueden considerar como alimentos
funcionales. Su estructura química se caracteriza por un esqueleto carbonatado
C6C3C6, posee dos anillos aromáticos, unidos por un puente de tres carbonos a
los cuales pueden estar unidos a uno o más grupos hidroxilos, siendo esta la
estructura básica de todo polifenol.

Cuando se hidroliza la mitad del azúcar de una antocianina, el aglicón (el producto
no azúcar de la hidrólisis) se conoce con el nombre de antocianidina. Se conocen
20 antocianidinas, pero solo 6 son importantes en los alimentos: cianidina,
peonidina, pelargonidina, malvidina, delfinina y petunidina.
 La utilización de estos compuestos como pigmentos se ha limitado por su
susceptibilidad, entre otros factores, al pH y a la temperatura. De acuerdo al valor
del pH, se presenta una variación del color que adquieren las antocianinas cuando
están en solución. Por consiguiente, es posible observar un color rojo o
anaranjado a pH acido de aproximadamente 2 ó menor, con un pH de 5 la
antocianina es incolora y cuando el pH se incrementa por arriba de 7, la
antocianina se degrada de forma irreversible.

El descubrimiento de antocianinas de tipo acilado, que son mas estables a

cambios de temperatura y pH que las no aciladas, ha venido a reactivar
nuevamente la búsqueda de fuentes naturales de estos compuestos para su uso
como pigmentos de los alimentos.

III. MATERIALES Y METODOS

3.1. MATERIALES

 Materia prima
 Fuente de antocianina.
 Sugerencia: Oca morada.

 Reactivos
 HCl 2N
 Metanol
 Etil Acetato
 Metanol acidificado: 0.01% (v/v) de HCl en metanol.
 Agua acidificada: 0.01% (v/v)
 Acetonitrilo grado HPLC
 Acido fórmico
 Agua extrapura (Agua MiliQ)
 Estándares de antocianidina

 Materiales
 Cartuchos C18 (con adsorbente C18 enlazado en silica: C18 Sep-Pack
Cartidhe (360 mg de adsorbente, Waters Chromatography: ODS-4
Octadecyl Silane (500 mg adsorbente) o equivalentes.
 Material de vidrio: Pipetas de 10 ml, beaker de 20,50ml, embudo buchner

 Equipos
 Balanza Analítica
 Rotavapor
 Sistema HPLC
 Filtros 0.45 m
3.2. METODOS

3.2.1. PROCESO DE EXTRACCIÓN DE ANTOCIANINAS

Este es el método clásico de extracción de antocianinas de los materiales

vegetales. Este procedimiento consiste en la maceración o empapado del material
vegetal en metanol que contiene una pequeña concentración de ácidos minerales
(por ejemplo, HCl). La extracción con metanol es un método fácil, rápido y
eficiente para la extracción de antocianinas. Sin embargo se obtiene un extracto
acuoso crudo con varios contaminantes y la evaporación del metanol puede
provocar una hidrólisis por ruptura de enlaces acilos lábiles lo cual podrìa
agravarse por la presencia de HCl. Si fuera el caso ensayar otros métodos de
extracción (por ejemplo extracción por el método de partición con acetona y
cloroformo)

 Tomar 50 – 60 g de muestra
 Homogenizar el material con dos volúmenes de metanol acidificado (p/v)
proteger en todo momento de la luz. Dejar la muestra una hora con agitación
continua de lo contrario 24 horas bajo refrigeración.
 Filtrar en un embudo buchner con papel Whatman No. 1. Reextraer en el
residuo con suficiente solución de metanol acidificado hasta agotar el residuo.
 Combinar y concentrar el filtrado bajo vacio a 40 ºC en un rotavapor. Deberá
evitarse tiempos prolongados en esta etapa para minimizar la degradación
del pigmento.
 Redisolver el residuo remanente con una solución acuosa de HCL al 0.01%.
Si la muestra no es analizada de forma inmediata se recomienda almacenar a
–18°C.

3.2.2. PURIFICACIÓN DE ANTOCIANINAS

Esta operación es necesaria antes de la identificación debido a que los solventes

usados en la extracción no son específicos para las antocianinas. Considerables
cantidades de materiales acompañantes pueden ser también extraidos y
concentrados con los extractos coloreados, los cuales pueden influir en la
estabilidad y/o análisis de estos pigmentos (Jackman y Smith, 1996). La
purificación de antocianinas usando la metodología de extracción en fase sólida
permite la remoción de varios componentes de interferencia en el extracto crudo.
Mini columnas conteniendo cadenas C-18 enlazadas en silica retienen
componentes orgánicos hidrofóbicos (antocianinas, fenólicos), permitiendo el
paso de interferentes como azúcares y ácidos. El lavado posterior de los
pigmentos retenidos con acetato de etilo permite la remoción de otros compuestos
fenólicos diferentes a la antocianina. Este proceso de purificación puede
observarse esquemáticamente en la Figura 1.
 Figura 2. Purificación de antocianinas.

 Activar el cartucho pasando dos volúmenes de columna de metanol y tres

volúmenes de agua desionizada acidificada
 Inyectar el extracto acuoso de antocianina. El volumen de la muestra aplicada
dependerá principalmente de la cantidad de muestra, el contenido de
antocianina y la cantidad de absorbente empacado en el cartucho.
Usualmente un volumen de muestra de 5 a 10 ml es usado para cartuchos de
extracción fase sólida conteniendo 360 mg de absorbente. Sin embargo esto
deberá ajustarse para cada caso en particular.
 Lavar el cartucho con dos volúmenes de agua acidificada para remover los
componentes no adsorbidos (azúcar, acidos y otros solubles)
 Seguidamente pasar por el cartucho dos volúmenes de acetato de etilo para
remover componentes polifenólicos tales como ácidos fenólicos y favonoles.
 Extraer las antocianinas adsorbidas en el cartucho con solución de metanol
acidificado y colectar en un balón de vidrio.
 Remover el metanol en un rotavapor a 40°C bajo vacio.
 Redisolver el pigmento en agua acidulada.
 Almacenar el extracto purificado a 4 °C si será analizado en las próximas 24
horas, para periodos más prolongados almacenar bajo congelación a –15°C o
mas bajas temperaturas.

IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES

Analizar los espectros de absorción y discutir todos los resultados obtenidos en

base a otras investigaciones revisadas.

V. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

VI. BIBLIOGRAFÍA
1. Cevallos – Casals, B. y Cisneros – Zevallos, L. (2003). Stoichiometric and
Kinetic Studies of Phenolic Antioxidants from Andean Purple Corn and Red-
Fleshed Sweet potato. J. Agric. Food Chem. Vol. 51. pp. 3313 – 3319.
2. Giusti MM and Wolrstad RE., (2001). Anthocyanins. Characterization and
measurement with UV-Visible Spectroscopy. In Current protocols in Food
Analytical Chemistry; Wrolstad, R.E., Ed.; John Wiley & Sons: New York.
3. Jakman, R.L. y Smith. J.l. 1996. Anthocyanins and betalains. In Natural Food
Colorant, 2nd ed. (G.A.F. Hendry and J.D. Houghton, eds) pp. 244-309.
Blackie and Son.Ltd.,London.