Cátedra de Farmacognosia y Productos Naturales. Departamento de Química Orgánica. Facultad de Química.

Práctico 2: EXTRACCIÓN DE GLICÓSIDOS CARDIOTÓNICOS DE

NERIUM OLEANDER L. Y PURIFICACIÓN DE OLEANDRINA

1. Objetivo y campo de aplicación

Esta práctica tiene por objetivo la extracción de los glicósidos cardiotónicos de las hojas
de Nerium oleander L. (laurel de jardín), así como la detección de los mismos por medio
de ensayos de coloración y cromatografía en capa fina.
El Nerium oleander L. pertenece a la familia de las Apocináceas. Es un arbusto
perennifolio, de hasta 4 m de altura. Tiene flores olorosas, grandes, de color rosa, blanco
o naranjo-amarillentas. Es una planta muy tóxica (hojas y flores), destacándose entre sus
componentes principios activos con propiedades cardiotónicas y diuréticas.
El principal cardiotónico que se encuentra en la hoja de Nerium oleander es la
oleandrina, la cual es un monósido de oleandrigenina (16-acetilgitoxigenina) y L-
oleandrosa. En menor porcentaje se hayan presentes otros cardiotónicos, dentro de los
cuales cabe destacar la digitalina, el cual está formado por 2 azúcares (glucosa +
digitalosa) unidos a gitoxigenina.

2. Conocimientos previos necesarios

Previo a la realización de esta práctica, el estudiante debe manejar fluidamente los

siguientes conceptos:
1. Conceptos generales sobre esteroides: definición de cardiotónicos, propiedades
fisicoquímicas, distribución en la naturaleza, drogas que los contienen. Principales
cardiotónicos utilizados por el ser humano.
2. Métodos generales de extracción de productos naturales y en particular de
glicósidos cardiotónicos.
3. Métodos generales para detección y caracterización de cardiotónicos.
4. Cromatografía, conceptos generales: TLC en fase normal y fase reversa.

3. Definiciones
Glicósidos: Son un grupo de compuestos formados por la unión acetálica de un azúcar y
un componente no glicídico (genina o aglicona). La unión es entre el grupo reductor de un
azúcar y un átomo de O, C, N o S de la genina. Desde el punto de vista de la terapéutica,
las sustancias de mayor interés son los glicósidos cardiotónicos.
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Glicósidos cardiotónicos: Son compuestos esteroidales que se caracterizan por ejercer

acción específica y muy potente sobre el músculo cardíaco, aumentando la eficiencia
mecánica del corazón y restaurando la función cardíaca.
Desde el punto de vista químico su estructura puede dividirse en 3 partes:
⮚ núcleo esteroidal (configuración de los anillos cis-trans-cis, con presencia de OH
en C3 y en C14)
⮚ en C17 presencia de un sustituyente tipo lactona insaturada conjugada al carbonilo
-lactona de 5 miembros monoinsaturada (cardenólidos)
-lactona de 6 miembros biinsaturada (bufadienólidos)
⮚ cadena de azúcares ligada al C3 del núcleo esteroide (O-glicósido), constituida por
1 a 5 monosacáridos. En el caso de los cardiotónicos de uso clínico (digitálicos)
poseen 3 o 4 moléculas de azúcar, entre los que se encuentra D-glucosa, L-ramnosa
y otros desoxiazúcares como D-fucosa y 2,6-dideoxiazúcares como la D-digitoxosa,
etc. Muchos de estos azúcares (digitoxosa, digitalosa, oleandrosa) solo se
encuentran en la naturaleza formando parte de los glicósidos cardiotónicos.

La eficacia farmacológica de los glicósidos cardiotónicos depende tanto de la presencia

de la genina como de la cadena de azúcares.
La actividad farmacológica depende exclusivamente de la genina mientras que los
sustituyentes hidrofílicos y la cadena de azúcares aumenta la biodisponibilidad de la
droga.
Es importante para la actividad la estructura cis-trans-cis, OH en C3 (β) libre o
glicosilado, lactona insaturada en C17 (β) y OH en C14 (β).

3. Generalidades y breve fundamento teórico

⮚ Obtención del extracto orgánico

La extracción de los glicósidos cardiotónicos se basa en la solubilidad de los

mismos en solventes de diferente polaridad. La polaridad de la molécula depende
de la presencia o ausencia de hidroxilos suplementarios (a los presentes en 3 y 14)
y a la presencia, tipo y número de unidades glucídicas presentes, que determinan el
grado de lipofilia.
En el caso de los glicósidos de Nerium, y debido a la presencia de sólo uno o dos
unidades de azúcar y a las características de estos, presentan mayor solubilidad en
una mezcla EtOH:CH2Cl2.
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⮚ Obtención del extracto concentrado en glicósidos cardiotónicos y

reacciones de reconocimiento.

Los métodos de detección se basan en:

● detección de la parte glucídica: Es de interés la detección de los
desoxiazúcares ya que son característicos de los glicósidos cardiotónicos. Esto se
realiza mediante la reacción de Keller Killiani (no se realizará en la
práctica).identificación del núcleo esteroide: Estas reacciones no son específicas.
● identificación de la lactona: Se hará en la práctica la reacción de Kedde
que identifica la γ lactona α, β insaturada específica de cardenólidos.
Las reacciones de detección no son suficientes para identificar una droga; tampoco
proveen información sobre la composición de mezclas. Para estudiar la
composición de mezclas de productos naturales se usan corrientemente métodos
cromatográficos (TLC, GC, HPLC).

⮚ Purificación de la oleandrina.

Se realiza mediante la utilización de tubos de extracción de fase sólida (SPE)

conteniendo fase reversa. En esta cromatografía de fase reversa los compuestos
más hidrofóbicos interaccionan más con la fase sólida (fase estacionaria) y por lo
tanto los compuestos polares son los primeros en ser eluidos.

4. Reactivos y Materiales
Muestras problemas:

El estudiante recibirá extracto orgánico, resultado de la maceración del material

vegetal fresco finamente dividido en CH2Cl2-EtOH 50:50 (24 hs) con CaCO3 sólido.

Soluciones, solventes y reactivos:

-Acetato de etilo, MeOH, agua: para la fase móvil de la TLC.

-Hexano: para el desgrasado.
-Solución buffer fosfato pH 7.4 0,1 M
-Solución de Kedde: Se mezclan volúmenes iguales de ácido 3,5 dinitrobenzoico 5% en
EtOH con NaOH 2M (debe prepararse en el momento).

Materiales:

-placas de sílica gel.

-material de vidrio adecuado (matraces, tubos de ensayo, pipetas, bola de decantación,
cámara para TLC, capilares para sembrar TLC).
-tubos de extracción en fase sólida (SPE) con la fase reversa: Supelclean LC-18

5. Aparatos y/o instrumentos

-Rotaevaporador para destilar solventes a presión reducida.
-Balanza analítica.
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6. Procedimientos

Primera parte: Obtención del extracto concentrado en glicósidos cardiotónicos

i) Rotaevaporar a sequedad 30 mL del extracto orgánico recibido

previamente filtrado por algodón.

ii) Retomar en 25 mL de MeOH, sonicar por 5 minutos, filtrar con papel de

filtro y extraer en bola de decantación 3 veces con 25 mL de hexano.

iii) Rotaevaporar la fase metanólica a sequedad.

iv) Retomar en 4,5 mL de buffer fosfato de potasio monobásico pH 7.4.

Sonicar 10 minutos en baño de agua tibia.

Segunda parte: Purificación de la oleandrina y reacciones de reconocimiento

v) Filtrar por papel de filtro (previamente humedecido con buffer fosfato) a un

tubo de ensayo.
Al extracto concentrado en glicósidos cardiotónicos se le realiza una
extracción en fase sólida usando tubos SPE (solid phase extraction).

vi) Extracción en fase sólida:

PASO 1: Activación de la fase reversa

Pasar 2 ml MeOH seguido de 2 mL de buffer fosfato de potasio monobásico
pH 7.4. Un delgado film del buffer deberá permanecer sobre el packing (esto
provoca mejor contacto entre la muestra acuosa y la fase sólida hidrófoba).

PASO 2: Sembrado de la muestra

Pasar lentamente 1 mL del filtrado obtenido en el punto vi).

PASO 3: Lavado
Lavar con 2 mL de una solución buffer-MeOH (8:2), rotaevaporar a cerca de
medio mL.

PASO 4: Elución de los compuestos de interés.

Pasar 2 mL de acetato de etilo, rotaevaporar a cerca de medio mL.

PASO 5: Lavado de la fase para su reuso.

Pasar 4 mL de metanol seguidos de 4 mL de agua.

vii) Preparar una cámara cromatográfica con la siguiente fase móvil: AcOEt-
MeOH-H2O (81:11:8).

viii) Tomar una placa fina y sembrar (en bandas de 1 cm cada una):
1) filtrado obtenido en el punto vi).
2) lavado del SPE con buffer-MeOH (del paso 3)
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3) elución del SPE con acetato de etilo (del paso 4).

4) Cosiembra de la solución de digitalina y solución de oleandrina.

ix) Revelar la placa con solución de Kedde recientemente preparado.

x) Reacciones de reconocimiento de glicósidos cardiotónicos. Se realiza

sobre:
1) filtrado obtenido en el punto vi).
2) lavado del SPE con buffer-MeOH.
3) elución del SPE con acetato de etilo.

Kedde
Tomar 1 mL de la solución a estudiar y agregarle 2 mL de reactivo Kedde
recientemente preparado. Si la prueba es positiva en uno o dos minutos aparece
un color violeta.
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MATERIAL VEGETAL

MARCO VEGETAL EXTRACTO ORGÁNICO

Rotaevaporar
Retomar en MeOH
Extraer 3 veces con Hexano

FASE METANÓLICA FASE HEXANO

HIHIDROMETANÓLI
Rotaevaporar
CAEXANO
Retomar en Buffer fosfato pH 7.4
Filtrar

EXTRACTO CONCENTRADO EN
GLICÓSIDOS CARDIOTÓNICOS

REACCIONES DE
RECONOCIMIENTO

PURIFICACIÓN CON TUBOS SPE

TLC
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7. Bibliografía

▪ Bruneton J. (1995) “Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants”

Intercept Ltd., Andover, England UK.
▪ Evans W.C. (1989) “Trease & Evans, Farmacognosia”, Interamericana-Mc Graw
Hill, México DF.
▪ Domínguez, X (1973) “Métodos de Investigación fitoquimica ”, Ed.Limusa.
▪ Wagner H. & Bladt S. (1996) “Plant Drug Analysis”, Springer-Verlag, Berlin,
Germany.
▪ Newman, R, Cisneros, A, Lin, Y. (2001),Journal of Herbal Pharmacotherapy
vol.1 n 3.
▪ Sharapin, N(2000) “Fundamentos de Tecnología de Productos Fitoterapicos”,
Editor Pinzon.
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INFORME
EXTRACCIÓN DE GLICÓSIDOS CARDIOTÓNICOS DE
Nerium oleander L.

NOMBRES: GRUPO:
FECHA:

RESULTADOS
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

Rf Digitalina =
Rf Oleandrina =

Esquema a escala del cromatograma obtenido por TLC sobre placas de sílica gel, fase móvil
AcOEt- MeOH- H2O (81:11:8).

ENSAYOS DE RECONOCIMIENTO
Fracción Reactivo de Kedde
Extracto filtrado
Lavado con buffer
Eluído con AcOEt

DISCUSIÓN DE RESULTADOS Y CONCLUSIONES

(Continúe al dorso de la hoja si es necesario)