PRÁCTICA E.

EXTRACCIÓN Y
ESTABILIDAD DE PIGMENTOS
GUÍA DE ALIMENTARIOS
Antocianinas y carotenoides

PRÁCTICA DE Ciencia de Alimentos [2019446]

LABORATORIO
 OBJETIVOS
 Preparar extractos de pigmentos naturales presentes en alimentos de origen vegetal,
con solventes domésticos, según la afinidad de estos con los compuestos pigmentarios.
 A partir de los extractos, preparar disoluciones con el fin de realizar pruebas de
estabilidad de los compuestos ante factores como variaciones de pH y/o exposición a
altas temperaturas o a radiación solar.
 A través del uso de una cámara fotográfica, adquirir imágenes de las diferentes
disoluciones preparadas en condiciones de iluminación lo más estándar posible, para
analizar el color obtenido de forma semi-cuantitativa en un espacio de color (RGB,
CIELAB), usando herramientas de análisis de imagen.
Aunque se emplearán materiales y sustancias comúnmente encontradas a nivel doméstico, se recomienda
consultar previamente todos los riesgos y medidas de seguridad asociados a los reactivos que se emplearán.

E1. EXTRACTOS DE ANTOCIANINAS: COLOR Y ESTABILIDAD.

MATERIALES (ver anexo para muestras de los materiales)

Material vegetal, reactivos y solventes:

 Arándanos (100 g) (en su defecto, se puede trabajar con mora o agraz)
 Solución de etanol en agua 70% v/v (alcohol 70°) o concentración mayor.
 Vinagre de frutas o de cualquier fuente (importante que sea incoloro).
 Bicarbonato de sodio.
 Agua potabilizada.

Materiales:
 Vasos o copas de vidrio transparentes (sin coloración, x 8 preferiblemente 5 de iguales
dimensiones).
 Vasos pequeños de plástico o vidrio (del tipo que se usa para aguardiente) x 7.
 Set de tapas medidoras o cucharas de distintos tamaños.
 Papel filtro de café No. 2., o toallas absorbentes reutilizables.
 Cauchitos para el cabello (x 4)
 Papel aluminio y película de PVC (tipo vinipel).

Equipos e instrumentación:
 Balanza casera (no es obligatoria, si no se tiene, se pueden emplear cantidades
aproximadas)
 Licuadora, procesadora de alimentos o similar
 Celular con cámara
 Computadora con acceso a internet
Aplicaciones en línea:

https://www.colorcodepicker.com/ (para determinar el color en coordenadas RGB)

http://colormine.org/convert/rgb-to-lab (para convertir de coordenadas RGB a L*a*b)
https://www.nixsensor.com/free-color-converter/ (para simular el color L*a*b)

1
 CONTEXTO

Antocianinas

Las antocianinas son compuestos químicos vacuolares, relativamente solubles en agua, que
corresponden a una subclase de los compuestos fenólicos llamados flavonoides. Son
responsables de la coloración roja, púrpura, azul o negra de muchos tipos de plantas
alimenticias como arándanos, grosellas, moras, arroz negro, soya negra, fresa, rábano, entre
muchas otras1. El interés en estos compuestos radica en sus propiedades como colorante
natural y además en su capacidad antioxidante2, la cual a su vez estaría relacionada con efectos
benéficos del consumo de alimentos ricos en ellas.

Estructuralmente las antocianinas son glucósidos de antocianidinas, conformadas por dos

anillos aromáticos y su color depende del número y orientación de grupos metoxilo e
hidroxilo, lo cual a su vez puede cambiar en función del pH y de la composición del medio en
que se encuentren disueltas, mostrando en general tonalidades azules cuando hay un aumento
en la hidroxilación y produciendo tonalidades rojizas con el incremento en las metoxilaciones3.

La estructura general de la molécula de antocianina y sus posibles sustituyentes son:

Figura 1. Estructura de las antocianinas

Tabla 1. Sustituyentes de las antocianinas, longitud de onda de máxima absorbancia en el

espectro de luz visible y matiz complementario que genera4.

1 Holton, T. A., & Cornish, E. C. (1995). Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis. The Plant Cell, 7(7), 1071.
2 Bernal, L. J., Melo, L. A., & Díaz Moreno, C. (2014). Evaluation of the antioxidant properties and aromatic profile during
maturation of the blackberry (Rubus glaucus Benth) and the bilberry (Vaccinium meridionale Swartz). Revista Facultad
Nacional de Agronomía Medellín, 67(1), 7209-7218.
3 Zapata, L., Carcel, J., & Clemente, G. (2014). Obtención de extracto de antocianinas a partir de arándanos para ser utilizado

como antioxidante y colorante en la industria alimentaria. Universidad Politécnica de Valencia.

4 Guerrero, D., & Moreno, N. (2011). Extracción y evaluación de un colorante natural a partir de la pepa de aguacate para el

teñido de las fibras de algodón y poliéster. Ténica de Ambato.

2
 En las frutas es común encontrar estos compuestos en la forma de glucósidos, es decir con un
carbohidrato unido covalentemente a través de un enlace, generalmente, de tipo éster. El tipo
de carbohidrato también influye sobre las propiedades pigmentarias y la solubilidad de las
antocianinas.

Extracción de antocianinas

Para su extracción a partir de las matrices vegetales ricas en estos compuestos, se emplean
solventes de polaridad alta como agua, alcoholes (etanol, metanol), acetona y sus mezclas.
Dado que las antocianinas son más estables a valores de pH más bajos, estos solventes en
ocasiones se acidifican por medio de un ácido orgánico.

Además del carácter polar del solvente, el carácter ácido del medio en el que se mantiene
estable (los cambios estructurales típicos se asocian con reacciones de los grupos hidroxilo,
metoxilo, glucósidos y especialmente grupos acilos), factores como la temperatura y la luz,
entre otros, de tal manera que se maximice la extracción de pigmentos, que minimicen la
presencia de contaminantes o subproductos provenientes del fruto y se limiten las alteraciones
que se puedan presentar en el estado fisicoquímico del extracto3,5.

En la literatura se pueden encontrar diferentes tipos de metodologías de extracción de

antocianinas, y de las cuales nos basaremos para plantear el proceso y los materiales a utilizar.
De acuerdo con Cacace y Mazza (2003)6 las antocianinas de grosella negra se extraen mejor
con etanol al 60% a temperaturas. En general mayores contenidos de solvente en relación al
fruto brindan mejores tasas de extracción, pero conllevan a extractos más diluídos. Zapata y
colaboradores (2014)3, encontraron que al usar etanol acidificado con ácido cítrico al 1% como
solvente, para extraer antocianinas de arándandos en agitación suave, los tiempos óptimos
fueron de 2 h a 36°C y relaciones fruta:solvente 1:3 m/m resultan óptimas como variables.

PRIMERA PARTE: PREPARACIÓN DEL EXTRACTO

Por facilidad de consecución y por las características de la práctica, emplearemos como matriz
fuente de antocianinas arándanos (Vaccimium sp.) u otra fruta rica en antocianinas como mora,
fresa, corozo o agraz, y como solvente una solución de etanol (alcohol etílico) en agua al 70%
v/v, que se comercializa comúnmente como antimicrobiano de uso doméstico de 70° (o de la
concentración de la que se disponga). NOTA: debido a esto, los extractos no serán
comestibles, dado que el alcohol antiséptico está desnaturalizado por adición de
compuestos de carácter tóxico al ser ingeridos. Si se desea, se puede utilizar un
destilado como vodka (40% v/v) o aguardiente (25% v/v): el rendimiento de extracción
será inferior pero funcionará para el experimento y además podrá emplearse como
bebida alcohólica para preparación de cócteles.

5 Garzón, G. A., Riedl, K. M., & Schwartz, S. J. (2009). Determination of Anthocyanins, Total Phenolic Content, and
Antioxidant Activity in Andes Berry (Rubus glaucus Benth). Journal of Food Science, 74(3), C227–C232.
6 Cacace, J. E., & Mazza, G. (2003). Optimization of extraction of anthocyanins from black currants with aqueous ethanol.

Journal of food science, 68(1), 240-248.

3
 La relación fruta:solvente será de aproximadamente 1:3 m/m, por lo tanto, para 100 g de
arándanos se emplearán 300 g de la solución de etanol, que equivalen aproximadamente a 345
ml (asumiendo una densidad de 0.87 g/ml).

Procedimiento:

1. Pesar aproximadamente 100 g de arándanos. Si no se dispone de balanza, se puede

emplear como aproximación el peso declarado en el empaque o la medida casera (1
taza pequeña o pocillo de arándanos pesa aproximadamente 100 g).
2. Medir aproximadamente 350 ml del solvente (que pesan aproximadamente 300 g).
Si no se dispone de un medidor de volumen, se puede emplear como medida
aproximada tres veces el volumen de la taza pequeña o el pocillo usado para medir la
cantidad de arándanos.
3. Mezclar los arándanos y el solvente de extracción en un recipiente para procesar
alimentos (p.ej., homogeneizador, licuadora, etc.) y homogeneizar durante
aproximadamente 3 a 4 minutos en ciclos de menos de 1 minuto para mitigar el
aumento de la temperatura.
4. Filtrar la mezcla empleando doble filtro de celulosa para preparación de café y
recoger el filtrado (extracto rico en antocianinas) en un vaso o copa de vidrio. Si no se
dispone de estos filtros, se puede emplear doble papel absorbente reutilizable.
Recomendación: un cauchito para fijar el filtro en el vaso o copa. Es importante buscar
que el filtrado sea translúcido (que no contenga partículas).
5. Reservar el extracto rico en antocianinas de arándanos tapando cubriendo con
aluminio.

Muestra del procedimiento:

A continuación se muestra un ejemplo de cómo se pueden llevar a cabo los pasos anteriores (si
no se dispone de estos materiales e instrumentos, recuerde que la mayoría se pueden reemplazar).

Pasos 1 a 3: Se pesan los arándanos y se mezclan con el volumen deseado de solvente y se

homogeneizan (licúan, procesan) por aproximadamente 4 minutos en ciclos de 30 s:

4
 Pasos 4 a 5: Se filtra el extracto empleando el sistema de filtración (vaso con papel filtro, ver
anexo). El filtrado se reserva. Se produce una torta residual de aproximadamente 50 g (50% del
peso inicial de arándanos), lo cual indica que parte del filtrado es agua proveniente del jugo de
los arándanos. El color de la torta indica que parte de las antocianinas no fueron extraídas.

(torta residual)

(extracto translúcido)

Apariencia del extracto: se debe obtener un filtrado translúcido (sin partículas sólidas
visibles), lo cual indica que el proceso de filtración es adecuado para remover los compuestos
no solubles en el disolvente de extracción.

Separación de pigmentos en el papel filtro: un aspecto interesante es que el papel filtro

adquiere una pigmentación de distintas tonalidades:

(recortes del papel filtro donde se observa la

separación de varios pigmentos)

Los distintos colores corresponden a distintos compuestos químicos (probablemente

antocianinas y posiblemente clorofila). Este fenómeno se debe a que el etanol “arrastra” los
compuestos a través del papel y de acuerdo con su afinidad por el material del filtro, que en
este caso es celulosa, estos se van separando. Esto demuestra que hay más de un
pigmento; este es el principio de la cromatografía de papel, y en general de las técnicas de
análisis cromatográfico.

5
 SEGUNDA PARTE: EFECTO DE DISTINTAS CONDICIONES DE ACIDEZ
SOBRE EL COLOR DE LAS ANTOCIANINAS

Debido a la presencia de ácidos orgánicos en la fruta, el extracto tendrá probablemente un pH

ácido (el pH del jugo de arándanos por ejemplo es de 2,3-2,5). Empleando soluciones
acidificantes, se puede disminuir aún más el pH, y por otra parte, empleando soluciones
alcalinizantes, se puede aumentar el pH.

En función del medio en el que se encuentren, en particular del pH y de la naturaleza del

solvente, los grupos funcionales que dan propiedades cromóforas a la antocianinas (es decir,
que le permiten absorber una parte de la luz visible) pueden sufrir diferentes tipos de
disociaciones, lo cual a su vez altera el tipo de luz visible que absorben y, por ende, el matiz
complementario (la luz visible que transmiten) y, en últimas, el color percibido.

En esta parte de la práctica se observará el efecto que tienen distintos niveles de acidez sobre
las propiedades colorantes de las antocianinas y se realizará una medida semi-cuantitiva de los
cambios observados.

Procedimiento:

1. Solución alcalinizante. Como solución alcalinizante se empleará una solución

saturada de bicarbonato de sodio (pH 8,3). La solubilidad del NaHCO3 es de
aproximadamente 8,3 g/100 ml. Para prepararla se pesarán 20 g de bicarbonato (2
cucharadas) y se medirán 200 ml de agua (1 vaso pequeño). Se deja decantar por al
menos 10 minutos y se filtra, como en el paso 4 de la parte anterior, para obtener una
solución sin turbidez.
2. Solución acidificante. Como solución acidificante se empleará vinagre blanco,
vinagre destilado de frutas o cualquier tipo de vinagre sin coloración y sin turbidez.
Normalmente estos vinagres corresponden a soluciones aproximadamente de 3 a 5%
ácido acético y tienen valores de pH entre 2,5 y 3,3, por lo que su uso solamente
resultará en un descenso significativo de pH si se trabaja con frutas como la fresa; en el
caso de los arándanos o la mora, no habrá un efecto de acidificación dado que el pH
del extracto será muy similar.
3. Preparación de soluciones con diferente acidez (de igual volumen):
a. Solución 1 (mayor acidez): Servir 1 cucharadita colma del extracto de
antocianinas a una copa. Adicionar 120 ml (3 vasos de tipo usado para servir
aguardiente) de vinagre. Adicionar 1 cucharada de vinagre.
b. Solución 2 (acidez intermedia): Servir 1 cucharadita colma del extracto de
antocianinas a una copa. Adicionar 120 ml (3 vasos de tipo usado para servir
aguardiente) de agua. Adicionar 1 cucharada de vinagre.
c. Solución 3 (dilución en agua): Servir 1 cucharadita colma del extracto de
antocianinas a una copa. Adicionar 120 ml o (3 vasos de tipo usado para
servir aguardiente) de agua. Adicionar 1 cucharada de agua.

6
 d. Solución 4 (ligeramente alcalinizada): Servir 1 cucharadita colma del
extracto de antocianinas a una copa. Adicionar 120 ml o (3 vasos de tipo
usado para servir aguardiente) de agua. Adicionar 1 cucharada de
solución de bicarbonato.
e. Solución 5 (alcalinizada): Servir 1 cucharadita colma del extracto de
antocianinas a una copa. Adicionar 120 ml o (3 vasos de tipo usado para
servir aguardiente) de solución de bicarbonato. Adicionar 1 cucharada de
solución de bicarbonato.
f. Solución 6 (dilución en etanol): Servir 1 cucharadita colma del extracto de
antocianinas a una copa. Adicionar 120 ml o (3 vasos de tipo usado para
servir aguardiente) del alcohol. Adicionar 1 cucharada del alcohol.
4. Comparación del color. En este momento debe tener 6 vasos o copas distintas. Para
comparar el color, sirva las soluciones, al mismo volumen, en vasos de tipo aguardiente
y posiciónelos uno al lado del otro, sabiendo cuál es cuál, empleando un fondo blanco
(por ejemplo en hojas de papel) tratando de que todos los vasos tengan la misma
iluminación. Haga una fotografía de los vasos sin usar el flash.
5. Realice un recorte de la fotografía de manera que se observen las seis soluciones y
guárdela con un nombre en formato .jpeg o .tiff.
6. Suba la fotografía al sitio https://www.colorcodepicker.com/ y para cada vaso,
posicionando el cursor en al menos 5 distintos pixeles (puntos) determine el color en
coordenadas RGB; calcule el promedio de las coordenadas R, G y B de cada vaso,
empleando una hoja de cálculo de Excel o una herramienta de cálculo.
7. En la página web: http://colormine.org/convert/rgb-to-lab introduzca los valores
R, G y B de cada solución y convierta el color a coordenadas CIELAB
(coordenadas L, a y b).
8. En la página web: https://www.nixsensor.com/free-color-converter/ introduzca
los valores L, a y b, y simule el color “promedio” de cada solución. Con la
herramienta de recortes de su sistema operativo (ej., snipping tool en Windows),
seleccione el cuadrado del color.
9. Organice los resultados en un cuadro comparativo.

A través de sus observaciones y de una revisión bibliográfica intente responder las siguientes
preguntas de forma objetiva:

 ¿Cuál de las soluciones es más luminosa o más tendiente al blanco (valores mayores de
“L”) y cuál más oscura o más tendiente al negro (valores menores de “L”)?
 ¿Cuál de las soluciones es más tendiente al rojo (valores más positivos de “a”) y cuál
más tendiente al verde (valores más negativos de “a”)?
 ¿Cuál de las soluciones es más tendiente al amarillo (valores más positivos de “b”) y
cuál más tendiente al azul (valores más negativos de “b”)?
 ¿Cuáles son las antocianinas predominantes en la fruta empleada?
 ¿Qué cambios químicos en la estructura de las antocianinas predominantes explican los
cambios observados a mayores valores de acidez y mayores valores de alcalinidad?
Descríbalo a través de reacciones químicas con las estructuras moleculares
involucradas.

7
 Muestra del procedimiento:

Paso 1: para preparar la solución que será usada como alcalinizante se pesan 20 g de
bicarbonato de sodio y se adicionan 200 ml de agua tibia. Para evitar la presencia de cristales
(dado que es una solución sobresaturada) se puede filtrar usando el mismo sistema de filtrado
anterior.

Se usan entonces, para la preparación de las soluciones: agua potabilizada (pH 7,0-7,5),
solución saturada de bicarbonato de sodio (pH 8,3), vinagre blanco (pH 2,5-3,3) y alcohol (pH
7,0-7,2).

Pasos 3 y 4. Empleando las medidas descritas anteriormente, se preparan las soluciones en

copas o vasos y se sirven en vasos de tipo aguardiente al mismo volumen. Con la ayuda de un
papel blanco, se posicionan las distintas soluciones para ser fotografiadas en condiciones de
iluminación similar:

8
 Paso 5. Realizar un recorte tratando de que las soluciones queden en una única imagen con la
iluminación lo más homogénea posible; este archivo se guarda como .jpeg. Por ejemplo:

Paso 6 a 8. Subir la imagen “.jpeg” al sitio https://www.colorcodepicker.com/ En esta página,

una vez cargada la imagen, al posicionar el cursor sobre un pixel (cruz amarilla), un programa
da el valor de las cooordenadas RGB del pixel:

En este caso las coordenadas R, G y B fueron 180, 46 y 51, respectivamente. Para

transformar RGB a CIELAB (sistema más comúnmente empleado en alimentos), se puede
usar la app del sitio web: http://colormine.org/convert/rgb-to-lab:

En este ejemplo, las coordenadas RGB (180, 46, 51) corresponden a L=41,1; a=53,4 y
b=30,0.

9
 Finalmente, para simular el color, se puede usar el sitio web:
https://www.nixsensor.com/free-color-converter/:

Observar la similitud entre el color simulado y el color seleccionado con el cursor en la

página web colorcodepicker.com.

Para obtener resultados confiables, es importante seleccionar muchos pixeles (al menos 5) y
calcular el promedio de las coordenadas RGB, dado que las imágenes tienen brillo,
sombras y reflejos, ya que las fotos no fueron realizadas en condiciones óptimas.

Paso 9. Finalmente, se puede organizar la información en una tabla así:

Solución Descripción Coordenada Coordenada Coordenada Color simulado

L a b
1 Mayor acidez X ± SD X ± SD X ± SD

2 Acidez X ± SD X ± SD X ± SD
intermedia
3 Dilución en X ± SD X ± SD X ± SD
agua
4 Ligeramente X ± SD X ± SD X ± SD
alcalinizada
5 Alcalinizada X ± SD X ± SD X ± SD

6 Dilución en X ± SD X ± SD X ± SD
alcohol
X corresponde al promedio, SD corresponde a la desviación estándar, las cuales
pueden calcularse fácilmente en Excel o cualquier software estadístico.

10
 TERCERA PARTE: ESTABILIDAD DE LAS ANTOCIANINAS A LA
EXPOSICIÓN RADIACIÓN SOLAR

El sol o ciertos iluminantes artificiales pueden fotodegradar los componentes antociánico

ocasionando una decoloración parcial o total7. Esta degradación puede verse acelerada por
aumentos en la temperatura debido a reacciones de foto-isomerización, foto-reducción y foto-
oxidación, siendo el tiempo de exposición el factor crítico para que lleguen a producirse dichas
reacciones fotodegradativas8.

En esta parte del experimento, el extracto rico en antocianinas será sometido a dos condiciones
de almacenamiento (con y sin exposición solar) con el fin de comparar el efecto de este factor
sobre el color.

Procedimiento:

1. Servir partes iguales del extracto en dos vasos o copas de vidrio transparentes
incoloros. Marcar con un lápiz o marcador el nivel de volumen ocupado por el
extracto.
2. Cubrir uno de los dos vasos completamente con papel aluminio y película
autoadherente. Almacenar en un lugar oscuro. Esta será la muestra no sometida a
radiación solar.
3. Cubrir el otro vaso con paper aluminio y película autoadherente de manera que
quede visible el extracto, pero se evite la evaporación del solvente. Almacenar en un
lugar donde esté expuesto a la radiación del sol por al menos 48 horas. Esta será la
muestra sometida a radiación solar.
4. Pasadas aproximadamente 48 horas o más verificar que no haya habido pérdida
por evaporación. Si la hubo, lleve al volumen demarcado empleando el solvente de
extracción.
5. Para observar más fácilmente el efecto, preparar disoluciones del mismo volumen a
partir de las dos muestras de extracto adicionando 1 cucharada de cada extracto
y 60 ml de etanol.
6. Sirva las disoluciones en vasos de tipo aguardiente y repita los pasos 4 a 9 de la sección
anterior.

A través de sus observaciones y de una revisión bibliográfica intente responder las siguientes
preguntas de forma objetiva:

 ¿Existen diferencias entre el color de los extractos debidas a la exposición a la radiación

solar? ¿En qué coordenadas del color es verificable esta diferencia?
 ¿Cuál de las soluciones es más luminosa o más tendiente al blanco (valores mayores de
“L”) y cuál más oscura o más tendiente al negro (valores menores de “L”)?

7 Carocho, M., Barreiro, M. F., Morales, P., & Ferreira, I. C. F. R. (2014). Adding Molecules to Food, Pros and Cons: A
Review on Synthetic and Natural Food Additives. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 13(4), 377–399
8 Bernal, L., Melo, L., & Díaz, C. (2014). Evaluation of the Antioxidant Properties and Aromatic Profile During Maturation of

The Blackberry (Rubus glaucus Benth) and The Bilberry (Vaccinium meridionale Swartz). Revista Facultad Nacional de
Agronomía, 67(1), 7209–7218. https://doi.org/10.15446/rfnam.v67n1.42649

11
  ¿Qué cambios químicos en la estructura de las antocianinas predominantes explican los
cambios observados a mayores valores de acidez y mayores valores de alcalinidad?
Descríbalo a través de reacciones químicas con las estructuras moleculares
involucradas.
Muestra del procedimiento:

Paso 1. Se separa el extracto en dos vasos al mismo volumen. Es importante rotular el nivel del
extracto en el vaso, en caso de que haya que compensar pérdidas por evaporación.

Pasos 2 y 3. Uno de los vasos es cubierto totalmente con papel aluminio y guardado en total
oscuridad. El otro es almacenado en exposición a la luz:

Pasos 4 a 6. Una vez pasadas al menos 48 horas, se revisa que los extractos no hayan sufrido
pérdidas por evaporación (en este periodo no debe suceder si están bien sellados, sin embargo,
si lo hicieron, es importante adicionar etanol hasta recuperar el nivel inicial, de lo contrario las
muestras no son comparables).

12
 Dado que los extractos son muy concentrados, puede difícil notar a simple vista las diferencias
causadas por la radiación. Con el fin de observar más fácilmente se preparan diluciones (1
cucharada de extracto + 60 ml (o 1 vaso de aguardiente colmo) de alcohol). En la siguiente
fotografía se observan al fondo los extractos y en primer plano copas con las diluciones, en las
cuales el cambio de coloración es visible.

De la misma forma que en la parte anterior, se hace una fotografía y con la ayuda de las
aplicaciones en línea, se calcula el valor promedio de color CIELAB para las dos soluciones,
con el fin de observar si hay diferencias cualitativas y semi-cuantitativas.

Solución Descripción Coordenada Coordenada Coordenada Color simulado

L a b
1 48 horas, con X ± SD X ± SD X ± SD
radiación
solar
2 48 horas, sin X ± SD X ± SD X ± SD
radiación
solar
X corresponde al promedio, SD corresponde a la desviación estándar, las cuales
pueden calcularse fácilmente en Excel o cualquier software estadístico.

13
 E2. EXTRACTOS DE CAROTENOIDES: COLOR Y ESTABILIDAD.
MATERIALES (ver anexo para muestras de los materiales)

Material vegetal y solventes

 Ahuyama o zapayo pequeño (700-1200 g) (también se puede trabajar con 100 g de
polen apícola en cuyo caso no es necesario hacer la deshidratación)
 Aceite de girasol o aceite vegetal refinado incoloro.

Materiales:
 Vasos o copas de vidrio transparentes (sin coloración, x 4 preferiblemente de iguales
dimensiones).
 Vasos pequeños de vidrio 1,5 onzas (del tipo que se usa para aguardiente) x 7.
 Vasos pequeños de plástico 1,5 onzas (del tipo que se usa para aguardiente) x 7.
 Set de tapas medidoras o cucharas de distintos tamaños.
 Toallas absorbentes reutilizables.
 Cauchitos para el cabello (x 4)
 Papel aluminio y película de PVC (tipo vinipel).
 Cuchillo de cocina. Nota: se debe tener mucho cuidado para evitar cortes y otros
accidentes.

Equipos e instrumentación:
 Horno que opere a temperaturas por debajo de 80°C (se usará la menor temperatura
posible del horno).
 Balanza casera (no es obligatoria, si no se tiene, se pueden emplear cantidades
aproximadas).
 Licuadora, procesadora de alimentos o similar. Si no se dispone de este elemento, se
deberá usar un cuchillo para cortar la ahuyama seca lo más finamente posible.
 Celular con cámara.
 Computadora con acceso a internet.

Aplicaciones en línea:

https://www.colorcodepicker.com/ (para determinar el color en coordenadas RGB)

http://colormine.org/convert/rgb-to-lab (para convertir de coordenadas RGB a L*a*b)
https://www.nixsensor.com/free-color-converter/ (para simular el color L*a*b)

14
 CONTEXTO

Carotenoides

Los carotenoides son una familia numerosa de compuestos que participan en la recolección de
luz y juegan un papel esencial en la función de fotoprotección de los organismos fotosintéticos,
mientras que, en tejidos y organismos no fotosintéticos, actúan como pigmentos, aportando
tonalidades en el rango del amarillo al rojo9. Los carotenoides son los responsables del color de
muchas frutas y vegetales, como el amarillo del maíz, el anaranjado de las zanahorias, la
ahuyama y las naranjas, y el rojo del tomate y la sandía, entre muchos otros10.

Los carotenoides son hidrocarburos isoprenoides constituidos por una cadena principal de
polieno que contiene un número variable de dobles enlaces conjugados, lo cual les confiere la
posibilidad de absorber luz visible, lo que resulta en su coloración característica en tonalidades
amarillo a rojo. Los carotenoides se dividen en dos grupos principales: aquellos constituidos
únicamente por carbono e hidrógeno, denominados carotenos y aquellos con grupos
oxigenados, denominados xantófilas.

Figura 1. Estructura de algunos carotenos

9 Rodriguez-Concepcion, M., et al. (2018). A global perspective on carotenoids: Metabolism, biotechnology, and benefits for
nutrition and health. Progress in Lipid Research, 70, 62–93.
10 Khoo, H.-E., Prasad, K. N., Kong, K.-W., Jiang, Y., & Ismail, A. (2011). Carotenoids and their isomers: color pigments in

fruits and vegetables. Molecules, 16(2), 1710–1738.

15
 Figura 2. Estructura de algunas xantófilas

El color de los carotenoides depende principalmente de su estructura química, de la

composición de la matriz en la que se encuentren, en particular de los demás compuestos
pigmentarios que hagan parte de esta y, naturalmente de la fuente de iluminación bajo la cual el
color es percibido.

Tabla 2. Tonalidad caracterísitica de algunos carotenoides11

Carotenoide Color característico
Licopeno Rojo
α-Caroteno Amarillo
β-Caroteno Anaranjado
γ-Caroteno Rojo-anaranjado
Luteína Amarillo
Violaxantina Amarillo
β-Criptoxantina Anaranjado
Zeaxantina Amarillo-anaranjado
Astaxantina Rojo

Estabilidad de carotenoides

Las reacciones de degradación de los carotenoides durante el almacenamiento se aceleran a

altas temperaturas, presencia de oxígeno y exposición a la luz y tienen una influencia en la
coloración y el olor del producto. La cadena de polieno conjugado es rica en electrones y por
ende es más susceptible a reacciones con reactivos electrofílicos. La oxidación es la principal
causa de pérdida de los carotenoides durante el almacenamiento y procesamiento y se ocasiona

11 Carotenoids and food preparation. Washington, D.C., 1997

16
 por exposición a la luz y al calor, influyendo en la estabilidad a través oxidación de radicales
libres, que también conlleva a la isomerización de los carotenoides trans a conformación cis12.

Extracción de carotenoides

Dentro de los aspectos críticos en la extracción de carotenoides se considera que la selección

del solvente es el factor más importante por la solubilidad requerida con el compuesto de
interés. Los solventes más aptos para los carotenoides son aquellos de baja polaridad, como
éter de petróleo y hexano, aunque las mezclas con otros solventes con polaridad mayor como
acetona pueden mejorar las tasas de extracción. Sin embargo, los aceites vegetales también son
buenos solventes para la extracción de carotenoides.

Un aspecto importante es que la mayoría de las fuentes de carotenoides se caracterizan por sus
altos niveles de humedad, lo cual es un impedimento en general para la extracción debido al
carácter no polar de los solventes. Por este motivo en la mayoría de los casos la deshidratación
o secado es una etapa previa a los procesos de extracción, lo cual conlleva a pérdidas parciales
de carotenoides, en especial si se emplea aire a altas temperaturas.

Convencionalmente el método empleado para la extracción de carotenoides es la extracción

Soxhlet o por reflujo de solventes orgánicos, basada en el principio de que el solvente se
difunde en la matriz y disuelve los compuestos solubles. En el caso de aceites como vegetales,
el reflujo no es posible debido a la alta temperatura de ebullición de los mismos. Por este
motivo se pueden emplear métodos de extracción convencional sólido-líquidi (tipo lixiviación)
o métodos asistidos por ultrasolido y microondas. Por ejemplo, se demostró que la extracción
de carotenoides asistida por ultrasonido empleando aceite de girasol como solvente mostró
rendimientos similares a los obenidos con hexano y permitió la simplificación del proceso, ya
que no era necesario realizar la etapa de evaporación o separación del solvente, adicional a que
representó ventajas en costos, tiempo y energía13.

En la literatura se pueden encontrar diferentes metodologías de extracción de carotenoides con

aceites vegetales, en las cuales nos basaremos para plantear el proceso y los materiales a utilizar.
De acuerdo con Salazar et al. (2019)14 mayores contenidos de matriz vegetal (polen apícola) en
relación al solvente (aceite de girasol) mejoran la concentración final de carotenoides en el
extracto pero con eficiencias ligeramente menores de extracción. Asimismo, se observó que
tiempos de hasta 8 días pueden ser necesarios para una extracción total.

Para esta práctica empleará ahuyama como fuente de carotenoides. Debido a su alta humedad,
se requiere un secado previo, para lo cual se necesitará un horno (preferiblemente con
convección forzada de aire, pero no es necesario). Posteriormente se obtendrá una harina de
ahuyama y se empleará aceite vegetal en relación 30:70 (ahuyama:aceite) y un tiempo de
extracción de 24 horas. Alternativamente se puede emplear polen apícola, en cuyo caso no es
necesario hacer la deshidratación dado que el producto se comercializa deshidratado.

12 Albanese, D., et al. (2014). Tomato peel drying and carotenoids stability of the extracts. International Journal of Food
Science and Technology, 2458–2463.
13 Li, Y., Fabiano-Tixier, A., Tomao, V., Cravotto, G., y Chemat, F. (2013). Green ultrasound-assisted extraction of

carotenoids based on the bio-refinery concept using sunflower oil as an alternative solvent. Ultrasonics Sonochemistry, 12-18.
14 Salazar-Gonzalez, C., Diaz-Moreno, C., & Fuenmayor, C. A. (2019). Extraction of Carotenoids from Bee Pollen Using

Sunflower Oil: Evaluation of Time and Matrix-solvent Ratio. Chemical Engineering Transactions, 75, 541-546..

17
 PRIMERA PARTE: PREPARACIÓN DEL EXTRACTO

Emplearemos como matriz fuente de carotenoides la ahuyama o zapayo (Cucurbita sp.), y como
solvente aceite de girasol refinado o algún otro aceite vegetal buscando que sea lo más incolor
posible.

Primero se requiere deshidratar la ahuyama, para lo cual esta será cortada en láminas delgadas o
“rayada” empleando un rayador de cocina. Posteriormente, la ahuyama seca será empleada para
preparar una harina, moliendo a través de un procesador de alimentos. Si no se dispone de un
procesador o licuadora, se puede emplear un cuchillo para reducir lo más finamente posible la
ahuyama.

La relación harina de ahuyama:solvente (aceite) será de aproximadamente 30:70 m/m, por lo

tanto, para 50-55 g de harina de ahuyama se emplearán aproximadamente 120 g de la solución
de aceite, que equivalen aproximadamente a 130 ml (asumiendo una densidad de 0.92 g/ml),
aproximadamente un pocillo de café.

Procedimiento:

1. Lavar la ahuyama, secarla y separar la pulpa. Con cuidado de no cortarse,

empleando un cuchillo, separar la pulpa de la ahuyama de la cáscara y las semillas.
2. Aumentar el área de transferencia de la ahuyama para facilitar el secado.
Empleando un cuchillo, cortar la ahuyama en láminas finas de 1 a 2 mm de espesor.
Alternativamente, se puede rayar en láminas pequeñas empleando un rayador de
cocina.
3. Secar la ahuyama. Fijar la temperatura del horno lo más baja posible.
Normalmente en los hornos eléctricos domésticos la temperatura más baja es
de 70-75°C (incluso si no está demarcada en el control). Distribuir la ahuyama
rayada o laminada sobre bandejas cubiertas con papel aluminio, de manera homogénea
evitando que queden varias láminas sobrepuestas. Introducir las bandejas tratando de
que no queden muy cerca de la fuente de calor y dejar secar por 5 horas si es de
convección y por 7-8 horas en caso contrario.
4. Reducir el tamaño de la ahuyama deshidratada usando un procesador de cocina o
un cuchillo.
5. Iniciar el proceso de extracción. Para ello, mezclar en la proporción más
cercana a 30:70 m/m la harina obtenida y el aceite de girasol. Esto se puede
hacer en un vaso de vidrio cubierto con papel aluminio y almacenado en oscuridad por
24 horas. Con una cuchara limpia, agitar de vez en cuando para mejorar la transferencia
de masa.
6. Filtrar el extracto. Pasado el tiempo de extracción, emplear el sistema de extracción
descrito en el anexo (con papel absorbente reutilizable de cocina) para obtener un
extracto lo más translúcido posible.
7. Reservar el extracto almacenando en un vaso cubierto con papel aluminio y
película autoadherente para aislar de la luz y el oxígeno.

18
 Muestra del procedimiento:
A continuación se muestra un ejemplo de cómo se pueden llevar a cabo los pasos anteriores (si
no se dispone de estos materiales e instrumentos, recuerde que la mayoría se pueden reemplazar).

Pasos 1 y 2: Después de lavar y secar la ahuyama, su pulpa es separada de la cáscara y de las

semillas con la ayuda de un cuchillo (cuidando de no cortarse, lo cual es un riesgo, en especial
teniendo en cuenta la dureza de la ahuyama). Entre el 65% y el 80% del peso de la ahuyama
corresponde a la pulpa. Posteriormente, se deben obtener rodajas delgadas con un cuchillo, o
con un rayador casero. Nota: las semillas se pueden secar también y ser consumidas como pasabocas.

Paso 3: las rodajas obtenidas se disponen en bandejas cubiertas de papel aluminio, evitando
sobreponer varias rodajas con el fin de maximizar el área de transferencia de masa del agua
durante el secado. Si se corta en rodajas muy gruesas, algunos compuestos, en especial polisacáridos y
azúcares, formarán una capa externa que impedirá o ralentizará el secado. Se lleva al horno a la mínima
temperatura (idealmente inferior a 75°C, para minimizar la pérdida de carotenoides) durante
aproximadamente 6 a 7 horas.

Al finalizar las rodajas de ahuyama deben estar duras y crocantes, pero con el color anaranjado
característico de la hortaliza. En el proceso de secado se pierde alrededor del 80-90% del peso
de la pulpa de ahuyama, por lo que si se emplean, por ejemplo 500 g de ahuyama, al final se
recuperan aproximadamente entre 100 y 50 g de rodajas deshidratadas. A continuación se
muestra la diferencia entre rodajas deshidratadas adecuadamente y otras secadas por 3 horas
más de lo recomendado:

19
 Paso 4: Con la ayuda de un procesador de alimentos se reduce la ahuyama a una harina fina. Si
no se cuenta con un procesador, se puede reducir el tamaño de la ahuyama a la granulometría
más fina posible con la ayuda de un cuchillo, cuidando de no cortarse.

Paso 5: Para realizar la extracción se pesa una cantidad de la harina de ahuyama y se mezcla
con aceite en una proporción 30:70 m/m harina:aceite. Por ejemplo, si se pesan 50 g de harina,
se deben emplear 117 g de aceite (casi 120 g), que equivalen a 130 ml (un pocillo colmo de
café).

Esta mezcla se deja 24 horas, sellada y en oscuridad, mezclando cuando se pueda.

Extracto después de 24 h

Pasos 6 y 7: Con el fin de obtener un extracto translúcido (sin partículas que generen
turbidez), el extracto puede filtrarse empleando papel absorbente reutilizable doble, como se
muestra a continuación.

20
 extracto 24 h solvente

Puede servirse en copas con el fin de obtener una fotografía y comparar el color y medirlo en
coordenadas CIELAB como se indicón en la sección anterior de la práctica.

Solución Descripción Coordenada Coordenada Coordenada Color simulado

L a b
1 Extracto de X ± SD X ± SD X ± SD
carotenoides
de ahuyama
en aceite de
girasol (24 h)
2 Aceite de X ± SD X ± SD X ± SD
girasol
(solvente)

X corresponde al promedio, SD corresponde a la desviación estándar, las cuales

pueden calcularse fácilmente en Excel o cualquier software estadístico

21
 SEGUNDA PARTE: ESTABILIDAD DE LOS CAROTENOIDES A ALTAS
TEMPERATURAS

Como se mencionó anteriormente, las degradación de los carotenoides durante el

almacenamiento se acelera a altas temperaturas, en especial si se encuentran en presencia de
oxígeno, lo cual en últimas se ve reflejado en el color producido por los mismos. Las
principales reacciones son de oxidación, pero también puede presentarse reacciones de
isomerización de los carotenoides trans a conformación cis15.

En esta parte del experimento, el extracto rico en carotenoides será sometido a dos
condiciones de almacenamiento (temperatura ambiente y 100°C por 5 horas) con el fin de
comparar el efecto de este factor sobre el color.

Procedimiento:

1. Servir partes iguales del extracto en dos vasos o copas de vidrio pequeños
transparentes incoloros.
2. Cubrir uno de los dos vasos completamente con papel aluminio y película
autoadherente. Almacenar en un lugar oscuro. Esta será la muestra almacenada a
temperatura ambiente.
3. Cubrir el otro vaso con papel aluminio. Llevar al horno a 100°C por al menos 5
horas. Esta será la muestra sometida a altas temperaturas.
4. Servir las dos muestras en vasos de tipo aguardiente y repetir los pasos 4 a 9 de la
segunda parte de la práctica E1 (con antocianinas).

A través de sus observaciones y de una revisión bibliográfica intente responder las siguientes
preguntas de forma objetiva:

 ¿Cuáles son los carotenoides predominantes en la ahuyama o la matriz seleccionada

para la práctica?
 ¿Existen diferencias entre el color de los extractos debidas a las altas temperaturas? ¿En
qué coordenadas del color es verificable esta diferencia?
 ¿Cuál de los dos extractos es más luminoso o más tendiente al blanco (valores mayores
de “L”) y cuál más oscura o más tendiente al negro (valores menores de “L”)?
 ¿Qué cambios químicos en la estructura de los carotenoides predominantes explican
los cambios observados a mayores temperaturas? Descríbalo a través de reacciones
químicas con las estructuras moleculares involucradas.

15Albanese, D., et al. (2014). Tomato peel drying and carotenoids stability of the extracts. International Journal of Food
Science and Technology, 2458–2463.

22
 Muestra del procedimiento:

Paso 1. Se separa el extracto en dos vasos al mismo volumen y se cubren con papel aluminio.

Pasos 2 y 3. Uno de los vasos es cubierto totalmente con papel aluminio y guardado a
temperatura ambiente. El otro es llevado al horno a 100°C por 5 horas.

Pasos 4. De la misma forma que en la parte anterior, pasado el tiempo de experimentación, se

hace una fotografía y con la ayuda de las aplicaciones en línea, se calcula el valor promedio de
color CIELAB para las dos muestras, con el fin de observar si hay diferencias cualitativas y
semi-cuantitativas.

Temp. ambiente 100°C x 5 horas

23
 Solución Descripción Coordenada Coordenada Coordenada Color simulado
L a b
1 Extracto X ± SD X ± SD X ± SD
almacenado a
temperatura
ambiente
2 Extracto X ± SD X ± SD X ± SD
sometido a
100°C x 5 h
X corresponde al promedio, SD corresponde a la desviación estándar, las cuales
pueden calcularse fácilmente en Excel o cualquier software estadístico.

24
 ANEXO: MUESTRA DE MATERIALES EMPLEADOS

Arándanos Alcohol para extracción (70°)

Elementos para filtración: filtro de celulosa, Sistema de filtración:

copas o vasos, cauchito para fijar.

25
 Vasos pequeños de plástico (tipo aguardiente) 1.5 Bicarbonato de sodio:
onzas

Cucharas y tazas medidoras: Vinagre blanco:

Aceite de girasol: Ahuyama o zapayo:

26
 Vasos y copas: Papel absorbente reutilizable:

Papel aluminio

Película autoadherente

27