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4 - ALCALOIDES

Los alcaloides son compuestos nitrogenados, que se comportan como bases frente a los cidos, formando sales. En su gran mayora son de origen natural, sobre todo del reino vegetal, aunque se encuentren algunos semisintticos y otros exclusivamente sintticos. Presentan notables propiedades fisiolgicas y toxicolgicas, que se ejercen fundamentalmente sobre el sistema nervioso central, con predominio en alguno de sus niveles. Por estas razones pueden ser usados como frmacos. El uso prolongado de alguno de estos de estos compuestos produce en el hombre acostumbramiento, que constituyen verdaderas toxicomanas, con dependencia fsica y psquica y un aumento de la tolerancia. Propiedades fisicoqumicas Son sustancias que presentan en su constitucin N, generalmente formando parte de heterociclos. De acuerdo a su estructura pueden agruparse en distintos grupos qumicos.

Bases acclicas Aminas aromticas Aminoalcoholes Bases pirrlicas Bases pirdicas Derivados de glioxalina Derivados del grupo tropano Derivados indlicos Bases quinoleicas Bases isoquinoleicas alcaloides fenantrenicos derivados del cido lisrgico derivados de la tropolona derivados de la aconina Derivados de purina cafena,

colina, muscarina efedrina, mescalina Veratrina, solanina nicotina, higrina coniina, lobelina pilocarpina cocana, atropina, hiosciamina eserina, estricnina,toxiferinas Quinina papaverina,narcotina, hidrastina morfina, tebana, codena ergotamina, ergobasina colchicina aconitina teobromina

La presencia de oxgeno en la estructura determina que la sustancia sea un slido blanco, de sabor amargo y cristalizables. La ausencia de oxgeno en la estructura del alcaloide hace que ste sea aceitoso, voltil u odorante. La mayora de los alcaloides son insolubles o muy poco solubles en agua, pero se disuelven bin en alcohol, ter, cloroformo u otros solventes orgnicos. Se combinan con cidos para dar sales, comportndose entonces como bases. Las sales son bastante solubles en agua e insolubles en solventes orgnicos.

En la diferencia de solubilidades de la base alcaloidea y de sus sales en agua y en solventes orgnicos se basa el mtodo general de extraccin.

Todos los alcaloides son activos a la luz polarizada. Presentan una fluorescencia caracterstica bajo al luz UV o IR, dando lugar a espectros caractersticos. Aislamiento y caracterizacin. Para la investigacin de txicos alcaloidicos en materiales biolgicos se requiere de extraccin desde una determinada muestra, una posterior purificacin y la aplicacin de metodologas de identificacin. Dentro de estas ltimas se consideran reacciones generales para alcaloides, reacciones de caracterizacin de alcaloides y tcnicas de identificacin y cuantificacin mediante CG y HPLC. Extraccin. El objetivo de la extraccin es el aislamiento de los txicos de la muestra problema. que puede ser sangre, vsceras, orina, lavado gstrico, vmitos o, eventualmente, restos de alimentos y bebidas, preparados farmacuticos. Si la muestra constituye un material slido se proceder con el mtodo de extraccin continua. En caso de ser una muestra lquida se tiene el mtodo clsico de extraccin en ampolla. Mtodo de extraccin continua. Es aplicable a material slido o semislido. Permite efectuar una extraccin cuantitativa y reduce el tiempo de operacin requerido por las tcnicas clsicas. Unos 25 gramos del material se desmenuza y se procura obtener una papilla homognea, agregando 1 a 2 gramos de cido tartrico. La papilla obtenida se mezcla en una proporcin 1:2 con sulfato de sodio anhidro obteniendo una masa homognea que se deja secar al aire en un lugar templado y a una temperatura menor a 50oC. El material obtenido se disgrega y se deposita en un cartucho de papel de filtro para depositar en extractor Soxhlet. El extracto se recoge en baln o erlenmeyer esmerilado con ter a reflujo. Se agregan unos 5 mililitros de amonaco para producir la hidrlisis y liberar as los txicos extrables en medio alcalino. Eliminacin de protenas.

En los mtodos de extraccin directa, por ejemplo a trabajar con sangre, la presencia de protenas facilita la formacin de emulsiones entre el agua y los solventes de extraccin, que dificultan la separacin de los alcaloides. Por esta razn se procede a obtener filtrados libres de protenas, para lo cual hay varios mtodos. El ms simple y directo consiste en el tratamiento con cido clorhdrico concentrado y el calentamiento a baomara durante una hora a 90OC. Todas las sustancias unidas a protenas son liberadas pero el tratamiento es muy enrgico y no es adecuado para sustancias termolbiles como cocana, aconitina, atropina. Si se sospecha presencia de ellas, se intentar con cido clorhdrico 1N y calentamiento hasta 40OC que no lo resisten. Tambin se dispone de otras tcnicas menos enrgicas. Segn el mtodo de Stas-Otto, se procede a formar tartratos y oxalatos de alcaloides solubles en agua. La tcnica es laboriosa pero da buenos resultados. El mtodo del cido tngstico aprovecha la formacin de precipitados insolubles entre ste y las protenas. La precipitacin con sulfato de amonio es un muy buen mtodo para drogas muy metabolizadas y extrae bin estricnina y morfina. Se han probado mtodos que involucran el tratamiento con proteasas, como papana, tripsina y subtilisina-A, que muestran ventajas sobre los mtodos tradicionales, por ser menos enrgicos y presentar altos porcentajes de recuperacin. Tcnica de Stas Otto. Una porcin de papilla de la muestra se trata con dos volmenes de etanol acidificando con cido tartrico, dejando en maceracin una noche. Si se sospecha que no estn presentes alcaloides lbiles en la muestra, se mantiene la mezcla a 60/70C durante al maceracin. A continuacin se filtra y se procede a la evaporacin del etanol, obtenindose un residuo siruposo. Se trata nuevamente con un volumen de etanol absoluto tibio, se filtra y se evapora, obtenindose un residuo granular seco. Finalmente se trata con una porcin de cido sulfrico al 5%, obtenindose un filtrado acuoso libre de protenas. Tcnica del cido tngstico. Una porcin de la papilla obtenida de la muestra, se trata con una parte de tungstato de sodio al 25%, dos partes de agua y una parte de sulfato cido de sodio al 50%, calentando la mezcla a 60/70C. Luego de obtener una preparacin homognea, se filtra por buchner, obtenindose un extracto libre de protenas. Precipitacin por sulfato de amonio. Una porcin de la papilla se trata con una parte de cido clorhdrico diluido, y una parte de solucin saturada de sulfato de amonio. La mezcla ase calienta y luego de enfriar ser procede a la filtracin. Extraccin en ampolla. Es aplicable a material lquido o en general, toda sustancia lquida o posible de ser solubilizada fcilmente. Se agrega bicarbonato de sodio hasta reaccin alcalina al papel tornasol. Se procede a la extraccin con ampolla de decantacin con tres porciones de 15 mililitros de ter etlico. Se obtienen dos fases, una acuosa y otra orgnica. La fase acuosa se alcaliniza con hidrxido de amonio y se procede a la extraccin con tres porciones de cloroformo. La fase orgnica obtenida luego de reunir los tres extractos , se filtra sobre sulfato de sodio

anhidro y se evapora hasta sequedad. Se resuspende con unos mililitros de etanol, constituyendo ste el extracto cloroformo alcalino. La fase orgnica original, la de la primera extraccin, se filtra sobre sulfato de sodio anhidro, se evapora hasta casi sequedad, constituyendo ste el extracto ter alcalino. En el extracto ter alcalino se encontrarn la mayora de los alcaloides, mientras que en el extracto cloroformo alcalino se encontrarn a la morfina, estricnina, brucina y atropina. Purificacin. Consiste en los procedimientos que tienen como finalidad la eliminacin de impurezas que puedan enmascarar resultados. Los extractos cloroformo alcalino y ter alcalino se evaporan a sequedad y ser tratan con una porcin de cido sulfrico diluido a 1/5 v/v, se lava luego con tres porciones de 10 mililitros cada una de solvente, se trata luego con una porcin de hidrxido de amonio hasta reaccin alcalina, realizndose nuevamente una extraccin con tres porciones de 10 mililitros de solvente. El extracto se evapora a sequedad. Las extracciones del extracto ter alcalino se realizan con ter etlico y las del extracto cloroformo alcalino se harn con cloroformo. El residuo obtenido se redisuelve en etanol absoluto, obtenindose una muestra adecuada para los anlisis de identificacin. Identificacin. Los alcaloides, junto a otras drogas bsicas de inters toxicolgico, tienen un comportamiento anlogo frente a un grupo de reactivos de precipitacin que permiten sospechar su presencia. en una pericia toxicolgica se hace uso de estas reacciones como primer paso de identificacin, y a que una reaccin positiva excluye la presencia de estos txicos, aunque una reaccin positiva no asegura su presencia. La reaccin con el Reactivo de Mayer (tetraiodo mercuriato de potasio) da lugar a la formacin de un precipitado amarillento amorfo o cristalino. El Reactivo de Draggendorf (yodo bismutato de potasio) forma precipitados de dolor rojo anaranjado y en general amorfos. El Reactivo de Bouchardat (triioduro) genera precipitados de color rojo pardo. El procedimiento para estos reactivos generales comienza con la evaporacin de 2 a 3 gotas del extracto etanlico en vidrio de reloj. Se agregan luego 2 a 3 gotas de cido clorhdrico 5% hasta solubilizar los residuos. A esta solucin se agrega una gota del reactivo correspondiente. Caracterizacin. La caracterizacin del alcaloide presente en la muestra problema permite descartar a un conjunto de sustancias alcaloideas y aproximarnos con relativa precisin a la identidad del alcaloide en cuestin. Dependiendo del objetivo del anlisis que se efecta, en funcin de los resultados de las pruebas de caracterizacin, se proceder a la aplicacin de una tcnica de confirmacin. La caracterizacin puede llevarse a cabo por diversas tcnicas cromatogrficas (en columna, en papel, en placa delgada, en fase gaseosa), espectrofotomtricas (U.V., I.R.), por ensayos biolgicos o por reacciones qumicas. Marcha sistemtica de Banford. Constituye una tcnica tradicional para la identificacin de alcaloides. Las reacciones qumicas que la componen tienen valor relativo y sus resultados no deben tomarse como concluyentes. Adems la presencia de impurezas puede inhibir o alterar los resultados. Marcha de Bandford

Grupo I

Tebaina Narcotina Morfeolicos (morfina, apomorfina, codeina) Sinteticos (diluadid, dionina, heroina) Morfina, heroina Morfina Heroina

Rojo sangre a anaranjado Amarillo limon violeta de tonalidad variable violeta de tonalidad variable rojo brillante azul no desarrolla color rojo intenso rojo anaranjado violeta azulado

H2SO4 (c)
Grupo II

Reactivo de Marquis Reaccion de Oliver Fe3Cl 1%

Grupo III

HNO3 fumante

Brucina Eserina Atropina, hiosciamina, escopolamina

Ensayo de Vitali
Grupo IV

H2SO4 + Cr2O7K2 Estricnina Yohimbina Curare Reactivo de Frhde Estricnina Yohimbina Curare Reactivo de Mecke Estricnina Yohimbina Curare Reactivo de Mandelin Estricnina Yohimbina Curare
Grupo V

azul violaceo a rojo violaceo estrias azules , violetas y verdes rojo a violeta no da color azul marron no da color azul verdoso marrn azul violceo azul brillante violeta

Reactivo alcohlcido

Novocana Nicotina, mezcalina


Grupo VI

amarillo (en fro) rosado violceo (en caliente) rojo, con vapores NH3prpura amarillo, con vapores NH3 verde.

Cl2 y vapores de NH3

Cafena

Quinina
Grupo VII

Cocana, aconitina

El procedimiento para las reacciones de la marcha de Bandford, es el mismo que el utilizado en las reacciones generales, en vidrio reloj, agregando directamente el reactivo correspondiente sobre el residuo seco. Cuando hay una variacin se indica lo contrario. Para cada grupo se describe un reactivo de grupo, para el cual aparece una reaccin cromtica caracterstica. En algunos grupos existen reactivos de diferenciacin que permiten discriminar, con alguna certeza, cual de los alcaloides del grupo se encontr. En la realizacin de la reaccin general para el Grupo I pueden detectarse interferencias debidas a falta de purificacin (color pardo), por carbonizacin de la materia orgnica. La quinina presenta, en medio cido, fuerte fluorescencia azulada al U.V., lo que permite identificarla con cierta seguridad. Los alcaloides del Grupo VII se caracterizan por no dar reacciones cromticas netas. Por ello es necesario proceder a identificarlos por otras tcnicas. La reaccin de Oliver consiste en agregar al extracto seco del alcaloide una gota de solucin de SO4Cu al 1% y una gota de agua oxigenada 10 vol., alcalinizando con amonaco. El ensayo de Vitali consiste en la evaporacin a sequedad el bao mara una pequea fraccin del extracto del alcaloide con una gota de cido ntrico fumante. El residuo pardusco obtenido se trata, una vez fro, con una o dos gotas de potasa alcohlica. Reacciones de confirmacin. Una vez que se efectu la marcha de Bandford, puede ser necesario confirmar la presencia de alguno de los alcaloides encontrados. Para ello se dispone de las llamadas reacciones confirmatorias. Reaccin del picrato para cocana. Colocar una gota de la solucin a ensayar sobre un portaobjetos y llevar a sequedad. Adicionar una gota de ClH al 1% y evaporar nuevamente. Finalmente agregar una gota de cido pcrico saturado y observar al microscopio la formacin de microcristales caractersticos con forma de plumeritos.

Reaccin de Da Silva. Usada para la confirmacin de cocana. Sobre el extracto del ter alcalino evaporado en vidrio reloj, se agregan 2-3 gotas de potasa alcohlica, se calienta a bao mara y se observar la aparicin de un caracterstico olor a benzoato de etilo. Reaccin de Kieffer. Se evaporan unas gotas del extracto clorofrmico, dejando enfriar. Se agrega luego una solucin al 1% de (Fe(CN)6)K3. La aparicin de un color azul intenso por formacin de azul de prusia (Fe(CN)6)3Fe4 , da cuenta del poder reductor de la morfina por la presencia de una funcin fenlica.

Reaccin de la tetrahidroestricnina Se colocan en un tubo dos o tres gotas del extracto de cloroformo alcalino y se seca en bao de agua . Se agregan entonces dos granallas de zinc y 0.5 mililitros de la solucin de cloruro mercrico. Calentar en bao durante cinco minutos En una cpsula de porcelana colocar un pequeo cristal de nitrito de sodio, volcando a continuacin el producto de la reduccin. Calentar en bao y observar la aparicin del color rosado en caso de presencia en la muestra original de estricnina. Reaccin para nicotina. La reaccin con el p-dimetilamino-benzaldehido que caracteriza a la nicotina como parte del Grupo V en la marcha de Bandford, no siempre se verifica adecuadamente. Por ello se procede a confirmar con la siguiente tcnica. Se coloca en un tubo de ensayo un mililitro del reactivo vainillina clorhdrico., agregando luego, cuidadosamente por las paredes del tubo dos a tres gotas de la solucin acuosa de nicotina. Aparecer en la interfase un color rosado que se ir intensificando con el tiempo. Reaccin de la talioquinina. Se evaporan en un tubo de ensayo, dos o tres gotas del extracto, disolviendo con 0.5 mililitros de cido actico al 2% y 0.5% de agua destilada. Se agregan entonces dos o tres gotas de agua de bromo al 50%, cuidando de no agregar en exceso. Luego, alcalinizar con amonaco al 20% observndose la aparicin de un color verde caracterstico. Cromatografa en capa fina. La tcnica es similar a la utilizada para las drogas psicotrpicas de naturaleza alcalina. En ocasiones se asla un alcaloide desde la marcha de rutina para identificacin de un psicotrpico en general, y se identifica recin en la cromatografa por comparacin con testigos. La fase fija a utilizar es slica gel G y el solvente de corrida habitual es la mezcla metanol:amonaco (99/1)El revelado de la placa se realiza con yodoplatinato de potasio, determinando entonces los Rf. Reactivos. Potasa alcohlica: Se disuelven 5 gramos de KOH en 100 mililitros de etanol absoluto. Reactivo alcohol-cido: Se disuelve 1 gramo de p-dimetilaminobenzaldehdo en 100 mililitros de etanol absoluto, con 20 gotas de cido sulfrico concentrado. Reactivo de Frdhe: Disolver 1 gramo de molibdato de amonio en 100 mililitros de cido sulfrico concentrado. El reactivo se prepara en el momento de usar. Reactivo de Mandelin: Disolver 1 gramo de vanadato de sodio en 100 mililitros de cido sulfrico concentrado. Se prepara en el momento de usar. Reactivo de Mecke: 1 gramo de cido selenioso se disuelve en 200 mililitros de cido sulfrico concentrado. El reactivo se prepara en el momento se usar. Yodoplatinato de potasio: Se disuelven 45 mililitros de yoduro de potasio al 10% y 5 mililitros de cido cloroplatnico al 5% en 100 mililitros de agua destilada. Reactivo de vainillina:Se disuelven 0.04 gramos de vainillina en 100 mililitros de ClH concentrado. Cloro naciente: Agregar unos cristales de clorato de potasio a una solucin concentrada de ClH. Reactivo de Marquis: Formol concentrado.

CUESTIONARIO: 1- Indique situaciones en las que sea procedente investigar alcaloides en una muestra de origen biolgico. 2.- Por que razn se necesita de la eliminacin de las protenas en la determinacin de alcaloides y en que situaciones estima que este procedimiento no sera necesario. 3.- Cul es el fundamento de la marcha sistemtica de Bandford. Por que tcnicas se ve reemplazada actualmente?